匹多莫德和天然免疫激动剂复合物在制备抗肿瘤等药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一类由匹多莫德和sting免疫激动剂组成的免疫增强剂创新复合物，该创新复合物协同抑制肿瘤生长和转移，降低肿瘤化疗诱发的并发症或降低化疗诱发的毒副作用，预防和治疗炎症等。因此，该创新复合物在制备抗肿瘤、抗炎症及降低肿瘤化疗毒副作用等药物中具有重要应用。


背景技术：

2.肿瘤是一类严重危害人类生命健康的重大疾病之一，表现为细胞过度增殖和分化异常。who专家预测，2020年全球人口肿瘤发病将达到2000万人，死亡人数将达到1 200万人，肿瘤将成为本世纪人类第一杀手，对人类生存构成最严重的威胁。随着恶性肿瘤发病率和死亡率的逐年增加，恶性肿瘤治疗需求越来越大。
3.环二核苷酸cgamp作为二级信使分子通过激活内质网膜上的sting蛋白通路诱导干扰素ifn-β和其他细胞因子的产生，调节下游蛋白质表达，诱导细胞生长停滞和凋亡。sting通路可以调节免疫原性肿瘤的先天免疫识别，促进干扰素的抗肿瘤作用。ifn-γ在体内通过trail(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)发挥抗肿瘤作用，促进肿瘤细胞凋亡。cgamp是先天免疫反应的关键刺激物，是sting的内源性激动剂/激活剂，因此，cgamp具有免疫抗肿瘤作用。
4.匹多莫德(pidotimod)是一种免疫调节剂，适用于机体免疫功能低下的患者，并可用于预防急性感染，缩短病程，减少疾病的严重程度，可作为急性感染期的辅助用药，也用于慢性或反复发作的呼吸道感染和尿路感染的辅助治疗。但是，匹多莫德没有直接抗肿瘤、抗病毒、抗菌作用。匹多莫德面世至今已20多年，药物作用靶点不清楚，仍缺乏高质量的临床研究支持其功效，故有些医生公开质疑处方本药的疗效和必要性。
5.本发明报道了匹多莫德和sting激动剂复合物在协同增强免疫功能，协同抑制肿瘤生长、防治炎症和肿瘤化疗诱发的并发症或降低化疗诱发的毒副作用中的功能，在制备抗肿瘤等多种疾病药物中的应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一类免疫增强剂创新复合物，它包括屁多莫德和天然免疫通路(sting)激活剂2
’3’-
cgamp(或其衍生物激动剂)，该创新复合物协同增强免疫功能，协同抑制肿瘤生长和转移。该创新复合物协同预防和治疗多种免疫相关疾病的药物中具有潜在应用前景：包括肿瘤化疗/放疗诱发的并发症或降低化疗/放疗诱发的毒副作用药物，预防和治疗炎症药物等。因此，该类匹多莫德/sting免疫激动剂创新复合物药具有很好的临床应用前景。发明内容特征包括：
7.1、创新复合物由匹多莫德与天然免疫sting激动剂及过渡金属离子组成,该复合物使用纳米脂质体制剂。具体特征为：
8.(1)匹多莫德为3—l—焦谷氨酸四氢噻唑啉羧酸，英文名称是(r)-3-((s)-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)thiazolidine-4-carboxylic acid。
9.(2)天然免疫激动剂是指天然免疫通路(cgas-sting-cgamp-irf3通路)sting的激动剂/激活剂，包括但不限于环二核苷酸(如2
’3’-
cgamp)及其cgamp的衍生物。
10.(3)纳米脂质体的组成包括但不限于卵磷脂(hspc)、棕榈酰卵膦脂(dppc/dppg)、胆固醇(chol)、聚乙二醇等及其组成的复合物。如：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-n-马来酰亚胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000-mal)或1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(dppc)和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰甘油(dppg)等；在此基础上，脂质体表面通过化学键桥联制成叶酸靶向(或免疫靶向)纳米脂质体缓释给药体系。
11.(4)创新复合物混合摩尔配比
12.匹多莫德：sting激动剂：过渡金属离子盐的重量比范围是3:1:1。优选的复合物混合重量配比是(匹多莫德：cgamp：znso4：＝3:1:1)。
13.2、匹多莫德与sting激动剂创新复合物在制备各种抗肿瘤药物中的应用；
14.3、匹多莫德与sting激动剂创新复合物制备成的靶向脂质体(包括但不限于叶酸靶向脂质体和免疫靶向脂质体)缓释给药系统；
15.4、匹多莫德sting激动剂创新复合物在激活人体免疫系统，增强自身免疫力的功效，在制备肿瘤化疗/放疗诱发的并发症或降低化疗/放疗诱发的毒副作用药物中的应用；
16.6、该创新复合物在制备预防和治疗炎症药物中的应用；
17.7、该创新复合物，包含不同规格的单位制剂及药学上可接受的药物制剂，包括但不限于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、静脉滴注、鼻腔滴注、口服等中的一种或多种，进行上述相关疾病的预防或治疗。
具体实施方式
18.下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
19.实施例1：匹多莫德/sting激动剂创新复合物候选药的制备
20.(1)匹多莫德，3—l—焦谷氨酸四氢噻唑啉羧酸【(r)-3-((s)-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)thiazolidine-4-carboxylic acid】，购于sigma公司，分析纯。
21.(2)sting免疫激动剂(环二核苷酸cgamp)及其衍生物的制备
22.cgamp或其衍生物(环化-gmp-amp)按文献方法在结合dna后的活化条件下，由环化cgmp-amp二核苷酸合成酶(cgas)催化合成。(li p.w，et al.,immunity,2013,39(6),1019-1031.)
23.(3)免疫增强剂创新复合物靶向脂质体的制备
24.(3a)脂质体原料：卵磷脂(lipoid epcs)、胆固醇(ch)、聚乙二醇等均购买自sigma公司。
25.(3b)叶酸靶向脂质体按文献方法制备。(chen x.,et al.,int j nanomedicine,2012,7:1139-1148；waldrep j.c.,et al.,int j pharm,1998,160(2):239-249)。
26.(3c)匹多莫德-天然免疫激动剂创新复合物按如下重量配比反应制备：匹多莫德：sting激动剂(cgamp)：过渡金属离子(锌或锰)＝3:1:1，以上三种物质的混合物经加热搅拌
反应4小时，冷藏冰箱静止过夜，分离干燥，获得粉末复合物样品，产率为86％。
27.(3d)叶酸靶向脂质体包裹匹多莫德-免疫激动剂创新复合物向磷脂膜中加入120mmol/l的硫酸铵溶液，振摇(120rpm、5分钟)形成空白脂质体溶液，该空白脂质体溶液在超纯水中透析过夜。该上述匹多莫德免疫激动剂复合物溶解于超纯水中，加入到空白脂质体溶液中，65℃孵育20分钟，水浴超声减小粒径，用超滤管(mwco＝3000da)超滤除去未包封药物。
28.(3e)该上述创新复合物靶向脂质体的性质表征
29.(3ea)粒径表征
30.利用动态光散射(dynamic light scattering，dls)测量脂质体的粒径和粒径分布(pdi)。其基本原理为微小粒子悬浮在液体中会无规则地运动(布朗运动)，光通过胶体时，粒子会将光散射，在一定角度下可以检测到光信号。大颗粒运动缓慢，散射光斑的强度也将缓慢波动；小粒子运动快速，散射光斑的密度也将快速波动，最后通过光强波动变化和光强相关函数计算出粒径及其分布。pdi表示粒径的均一度，是方差的概念。所制备的脂质体粒径约100
±
5nm。
31.(3eb)zeta电位
32.zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差。一般用来评价或预测微粒分散体系的物理稳定性,一般zeta电位绝对值越高,其粒子间的静电斥力也就越大,物理稳定性也就越好。本发明制备的脂质体zeta电位绝对值为31mv，稳定性较好。
33.实施例2：匹多莫德/sting激动剂创新复合物候选药的抗肿瘤作用即对动物皮下移植瘤生长的抑制作用
34.动物
35.种属、品系、性别、体重、来源、合格证
36.balb/c鼠普通小鼠、c57/bl6普通小鼠，雄性，体重18-20g，7-8周龄，spf级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：scxk(沪)2007-0005]。
[0037]
饲养条件
[0038]
所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23
±
2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为spf级。
[0039]
剂量设置：
[0040]
腹腔注射小鼠，设置剂量：匹多莫德，20mg/kg；cgamp,20mg/kg；创新复合物候选药(含药46mg/kg)。
[0041]
试验对照：
[0042]
阴性对照：生理盐水溶液
[0043]
阳性对照：(1)匹多莫德，20mg/kg；
[0044]
(2)cgamp，剂量20mg/kg；
[0045]
给药方法
[0046]
给药途径：腹腔注射给药
[0047]
给药体积：100微升/只
[0048]
给药次数：连续21天给药，每天1次
[0049]
每组动物数：10只
[0050]
肿瘤细胞株
[0051]
小鼠结直肠癌细胞株ct26，小鼠乳腺癌细胞株4t1，小鼠肺癌lewis瘤株ll-2均购自中国科学院细胞库。
[0052]
试验主要步骤
[0053]
1.肿瘤模型鼠的建立与干预
[0054]
细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0
×
107)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2ml细胞悬液(细胞数目为2.0
×
106个/只)，10天左右肿瘤长至直径约5mm，致瘤成功，随机均分为5组。分别为a：阴性对照组；b：匹多莫德组；c：cgamp组；d：匹多莫德/cgamp复合物组；d：匹多莫德/cgamp复合物靶向脂质体组。连续给药21天。21天后，处死小鼠并称瘤体重量，计算抑瘤率＝[1-实验组平均瘤重/a组平均瘤重)]
×
100％。
[0055]
2.统计分析
[0056]
数据用x
±
s表示，利用spss10.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-way anova)检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a＝0.05。
[0057]
结果
[0058]
小鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功皮下移植瘤模型。匹多莫德单独给药没有抑制肿瘤生长药效；sting激动剂cgamp具有明显的抑瘤作用；匹多莫德与sting激动剂cgamp复合物具有比cgamp单用使用显著提高了抑制肿瘤效果，匹多莫德明显具有协同sting激动剂抗肿瘤药效。匹多莫德与sting激动剂cgamp复合物的靶向脂质体明显具有更优的抗肿瘤作用。给药21天后的瘤重显著低于阴性对照组(p《0.05，p《0.01)。具体结果见表1-3：
[0059]
表1、匹多莫德/cgamp复合物对balb/c小鼠结直肠癌细胞ct26皮下移植瘤的抑制作用
[0060]
(n＝10，mean
±
sd)
[0061][0062]
注：*p《0.05vs阴性对照组；**p《0.01vs阴性对照组.
[0063]
表2、匹多莫德/cgamp复合物对c57小鼠肺癌lewis瘤株ll-2皮下移植瘤的作用
[0064]
(n＝10，mean
±
sd)
[0065][0066]
注：*p《0.05vs阴性对照组；**p《0.01vs阴性对照组.
[0067]
表3、匹多莫德/cgamp复合物对balb/c鼠乳腺癌4t1皮下移植瘤的抑制作用
[0068]
(n＝10，mean
±
sd)
[0069][0070]
注：*p《0.05vs阴性对照组；**p《0.01vs阴性对照组.
[0071]
实施例3：匹多莫德/sting激动剂复合物候选药的对小鼠肺炎的抑制作用实验动物：c57bl/6小鼠，雄性，体重18-20g，7-8周龄，spf级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：scxk(沪)2007-0005]。
[0072]
饲养条件
[0073]
所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23
±
2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为spf级。
[0074]
动物分组：
[0075]
将36只小鼠随机分为6组(n＝6)，具体分组为：a组，正常对照组；b组，肺炎模型组，pbs；c组，给药匹多莫德(20mg/kg)；d组，给药cgamp(20mg/kg)；e组，给药复合物(46mg/kg)；f组，给药复合物脂质体(含药46mg/kg)。
[0076]
肺炎模型小鼠建立：
[0077]
鼻内滴注。使小鼠处于足够深的麻醉状态，将小鼠以背卧姿势固定，并慢慢地将vr－841病毒悬液通过小鼠鼻孔内壁逐滴滴入，为保证最大的肺部感染效率，滴入体积为60μl(每个鼻孔30μl)。将小鼠轻轻从工作台拿下，并将头部和胸部用折叠的纸巾小幅度垫高，以保证小鼠顺畅的呼吸。待小鼠苏醒后，放回鼠笼。
[0078]
小鼠肺泡灌洗液获得方法：
[0079]
取等体积pbs沿小鼠气管注射后吸出，反复几次，获得肺泡灌洗液。空白组和肺炎模型组腹腔注射等体积的dmem。收集的血清，于－80度保存。采用elisa法，按试剂盒说明书检测tnf-alpha、il-1beta浓度。终止反应后，将酶标板放入酶标仪槽内，选择450nm波长检
测，确定标准品和空白对照区域，检测相应的光密度值，然后绘制标准曲线并计算相应的浓度。在小鼠肺炎模型中，促炎性细胞因子il-1beta和tnf-alpha在血清和肺泡灌洗液中的含量都显著上升，免疫激动剂及其与匹多莫德德复合物给药后均不同程度地降低了两者的含量。但是，匹多莫德单独给药没有明显降低促炎性细胞因子il-1beta和tnf-alpha的降低。不同药物分别显示抑制小鼠肺炎作用的结果见表4.
[0080]
表4.新型匹多莫德/cgamp复合物对小鼠肺炎的抑制作用
[0081][0082]
实验结果表明，匹多莫德/cgamp复合物在抗小鼠肺炎促炎细胞因子的作用显著优于单独使用sting激动剂cgamp，而匹多莫德单独用药没有明显的抗小鼠肺炎作用。匹多莫德/cgamp复合物脂质体具有最好的抗小鼠肺炎损伤的作用。
[0083]
实施例4：创新匹多莫德/sting激动剂复合物诱发增强免疫能力研究
[0084]
小鼠饲养与病毒感染免疫、采血等见实施例3。同型对照流式抗体购自ebiosciences,抗体磁株购于militeny biotech,流式细胞仪购于bd公司，免疫14天后取小鼠脾脏、肺组织，分别研磨捣碎，过40微米孔脱过滤细胞，1000rpm离心10分钟，分离未被裂解的免疫细胞，用抗体磁株分离dc(cd40\cd80\cd86\mhcii)、t(cd8+)细胞，加入对应的fac抗体(用facs缓冲液稀释)，同型对照抗体作为阴性对照，抗体加入后孵育1小时后离心，用pbs清洗，用流式细胞仪分析样品，分选合适的细胞，测定选定细胞的荧光强度(mfi)，流式结果见表5.流式细胞测定结果显示，免疫激动剂cgamp及其与匹多莫德复合物均能显著活化树突状细胞dc和t细胞，药效作用均比匹多莫德单独用药效果好。新型cgamp与匹多莫德德复合物的效果显著高于sting激动剂cgamp，更好与匹多莫德。因此，匹多莫德具有协同sting激动剂cgamp增强免疫功能的药效作用。
[0085]
表5.匹多莫德/sting激动剂复合物诱发增强免疫细胞活化
[0086][0087]
实施例5：创新匹多莫德/sting激动剂复合物降低化疗药毒副作用研究
[0088]
动物
[0089]
种属、品系、性别、体重、来源、合格证
[0090]
balb/c普通小鼠，雄性，体重18-20g，7-8周龄，spf级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：scxk(沪)2007-0005]。
[0091]
饲养条件
[0092]
所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23
±
2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为spf级。
[0093]
剂量设置：
[0094]
腹腔注射小鼠，顺铂与匹多莫德、sting激动剂cgamp、创新匹多莫德/cgamp复合物以及设置剂量组：
[0095]
a：顺铂，5mg/kg；
[0096]
b：顺铂，5mg/kg+匹多莫德，20mg/kg；
[0097]
c：顺铂，5mg/kg+cgamp,20mg/kg；
[0098]
d：复合物：顺铂，5mg/kg+复合物(含药46mg/kg)；
[0099]
e：复合物脂质体：顺铂，5mg/kg+复合物脂质体(含药46mg/kg)；
[0100]
阴性对照：生理盐水溶液
[0101]
阳性对照：顺铂抗癌药，5mg/kg
[0102]
给药方法
[0103]
给药途径：腹腔注射给药
[0104]
给药体积：100微升/只
[0105]
给药次数：连续21天给药，每3天给药1次
[0106]
每组动物数：10只
[0107]
肿瘤细胞株
[0108]
小鼠结直肠癌细胞株ct26购自中国科学院细胞库。
[0109]
试验主要步骤
[0110]
1.肿瘤模型鼠的建立与干预
[0111]
细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0
×
107)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2ml细胞悬液(细胞数目为2.0
×
106个/只)，10天左右肿瘤长至
直径约5mm，致瘤成功，随机均分为7组，每组10只小鼠。分别为a：正常小鼠组；b：肿瘤模型阴性对照组；c：顺铂给药组；d：顺铂+匹多莫德组；e：顺铂+cgamp组；f：顺铂+复合物组；g：顺铂+复合物脂质体组。连续给药21天。21天后，小鼠取外周血，加1.5mg/mledta抗凝剂，采用迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪(bc-2800vet)检查顺铂及其与匹多莫德或匹多莫德复合物降低化药血液毒副作用的影响。
[0112]
2.统计分析
[0113]
数据用x
±
s表示，利用spss10.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-way anova)检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a＝0.05。
[0114]
结果
[0115]
顺铂化药具有严重毒副作用，包括：血液、肝、肾。顺铂与sting激动剂cgamp或(匹多莫德和cgamp的复合物)联用，显著降低了顺铂的毒副作用，匹多莫德显示出显著协同免疫激动剂cgamp抑制顺铂化药毒副作用的药效。匹多莫德与sting激动剂cgamp复合物的靶向脂质体明显具有更优的作用。具体结果见表6-7。
[0116]
表6.匹多莫德/sting激动剂复合物降低顺铂化药血液毒副作用结果
[0117][0118]
表7.匹多莫德/sting激动剂复合物降低顺铂化药肝肾损伤毒副作用结果
[0119][0120]
实施例6：匹多莫德/sting激动剂复合物的急性毒性研究
[0121]
实验材料
[0122]
icr小鼠30只(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：scxk(沪)2007-0005])，雌雄各半，体重20～25g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。匹
多莫德/免疫激动剂复合物候选药由实施例1制备，用生理盐水配制成浓度为200mg/ml的溶液。
[0123]
实验方法
[0124]
icr小鼠按体重单次腹腔注射2g/kg的复合物缓释药物，观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次腹腔注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。
[0125]
实验结果
[0126]
上述急性毒性实验结果表明，腹腔注射给药最大耐受量mtd不低于2g/kg，说明匹多莫德与sting激动剂cgamp复合物药物的急性毒性低。