丹参茎叶酚酮有效部位的制备及其质量检测方法与流程

本发明涉及到一种中药材丹参的地上部位丹参茎叶的酚酮有效部位的制备方法和质量检测方法。
背景技术：
：中药丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(salviamiltiorrhizabge.)的干燥根及根茎，是最常用的活血化瘀中药之一，始载于《神农本草经》，具有祛瘀止痛、养血安神的功效。研究发现丹参中丹酚酸类和丹参酮类有效成分具有良好的药理活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病等。丹参临床用量较大，国内已大量栽培，其地上茎叶未被有效利用而废弃，造成资源浪费及环境污染，因此对丹参茎叶的有效利用有着重要价值。研究表明丹参茎叶与丹参的根和根茎具有相似的化学成分和病理作用。丹参茎叶中含有丰富的丹酚酸和黄酮类成分，具有改善血瘀，抗氧化，抗动脉粥样硬化，改善糖尿病，调节糖脂代谢等多种生物学活性。但当前的研究多聚焦于丹参地下部分的开发利用，未着眼于丹参非药用部位的资源利用，因此对丹参茎叶有效部位的提取纯化可挖掘丹参废弃部位的价值。本发明确定丹参茎叶的酚酮有效部位制备和质量标准，促进丹参茎叶的资源利用最大化。技术实现要素：发明目的：本发明目的是得到一种从丹参茎叶中获取酚酮有效部位的制备工艺及其质量标准，为丹参茎叶酚酮有效部位的开发利用提供科学依据，有助于生产的规范化。技术方案：本发明采用以下技术方案：丹参茎叶酚酮有效部位的制备方法，包括以下步骤：(1)提取：取丹参茎叶药材粉碎过筛，加8-20倍量体积浓度30-90％的乙醇，提取1-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液，得提取液，备用；(2)上样液制备：将步骤(1)所得提取液，减压浓缩至浓度为0.1-1.0g/ml作为上样液；(3)纯化：将步骤(2)所得上样液，上大孔吸附树脂，先用水洗脱除杂，然后用乙醇洗脱，得乙醇洗脱物，冷冻干燥至粉末或浸膏，即得总丹参茎叶酚酮有效部位。作为优选方案，以上所述的丹参茎叶中酚酮有效部位的制备方法，步骤(3)所述丹参茎叶与树脂用量比为0.25g/g，用3-4大孔树脂柱体积水除杂后，再用1-5大孔树脂柱体积的10-90％乙醇洗脱，冷冻干燥至粉末或浸膏，即得丹参茎叶酚酮有效部位。作为优选方案，以上所述的丹参茎叶酚酮有效部位的制备工艺，步骤(1)提取过程中，加入的丹参茎叶药材的重量与乙醇的体积比为1:10g/ml。作为优选方案，以上所述的丹参茎叶酚酮有效部位的制备工艺，步骤(1)所用乙醇浓度为60％。作为优选方案，以上所述的丹参茎叶酚酮有效部位的制备工艺，步骤(1)提取方法为回流提取法，提取次数为3次，每次1h。作为优选方案，以上所述的丹参茎叶酚酮有效部位的制备方法，将步骤(1)所得提取液，减压浓缩至浓度为0.25g/ml作为上样液。作为优选方案，以上所述的丹参茎叶酚酮有效部位的制备方法，步骤(3)所述的大孔吸附树脂型号为nka-2型大孔吸附树脂。作为优选方案，以上所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的制备方法，洗脱剂乙醇的体积浓度为60％，洗脱剂的用量为4倍大孔吸附树脂柱体积。一种丹参茎叶酚酮有效部位的质量标准检测方法，包括以下步骤：丹参茎叶酚酮有效部位的质量标准检测方法包括水分、炽灼残渣、鉴别、含量测定和指纹图谱检测(1)水分测定：取丹参酚酮有效部位粉末，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定，开启瓶盖干燥，盖好瓶盖后，移至干燥器中，冷却，精密称定，再按上述方法再次干燥，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止，经测定6批丹参茎叶总酚酮有效部位样品水分均不超过6.0％；(2)炽灼残渣：取丹参酚酮有效部位粉末，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，于电炉上缓缓炽热至完全炭化，放冷，加硫酸lml使湿润，低温加热至除尽硫酸蒸气后，在800℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷，精密称定后，再在800℃炽灼至恒重，即得。按中国药典2015年版一部附录ⅸk炽灼残渣检查法分析。经测定6批丹参茎叶总酚酮有效部位样品炽灼残渣均不超过16.0％；(3)鉴别：供试品溶液的配制：取丹参茎叶酚酮有效部位粉末，精密称定，加入甲醇溶液超声溶解，过滤；对照品溶液的制备：称取丹酚酸b、迷迭香酸和芦丁对照品粉末，精密称定，加入甲醇配制成对照品溶液；吸取对照品和供试品溶液，分别点于同一硅胶gf254薄层色谱板上，以醋酸丁酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯下检视，样品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(4)含量测定：供试品溶液的配制：取丹参茎叶酚酮有效部位粉末，精密称定，加入甲醇溶液超声溶解，过滤；对照品溶液的制备：称取丹酚酸b、迷迭香酸和芦丁对照品粉末，精密称定，加入甲醇分别配制成对照品溶液；测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本品按干燥品算，含丹酚酸b、迷迭香酸的总量不得低于42.94％，芦丁含量不得低于1.45％；(5)指纹图谱供试品溶液的配制：取丹参茎叶酚酮有效部位粉末，精密称定，加入甲醇溶液超声溶解，过滤；对照品溶液的制备：称取丹酚酸b、迷迭香酸和芦丁对照品粉末，精密称定，加入甲醇配制成对照品溶液；测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录的色谱图，得到丹参茎叶酚酮有效部位的指纹图谱，丹参茎叶酚酮有效部位的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度应均大于0.90；丹参茎叶酚酮有效部位的指纹图谱有11个共有指纹峰，迷迭香酸色谱峰为s峰，11个共有指纹峰的相对保留时间应在规定值的±5％之内，规定值为：1号峰4.868、2号峰8.727、3号峰27.980、4号峰28.746、5号峰30.389、6号峰31.592、7号峰34.033(s号峰)、8号峰35.185、9号峰37.989、10号峰43.681、11号峰55.500。作为优选方案，以上丹参茎叶酚酮有效部位的质量标准检测方法，包括以下步骤：(1)水分取丹参酚酮有效部位粉末约2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定，开启瓶盖在105℃干燥5小时，盖好瓶盖后，移至干燥器中，冷却30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。(2)炽灼残渣：取丹参酚酮有效部位粉末约1g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，于电炉上缓缓炽热至完全炭化，放冷。加硫酸lml使湿润，低温加热至除尽硫酸蒸气后，在800℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷，精密称定后，再在800℃炽灼至恒重，即得。按中国药典2015年版一部附录ⅸk炽灼残渣检查法分析。(3)鉴别：供试品溶液的配制：取若干丹参茎叶酚酮有效部位粉末，精密称定，加入90％甲醇溶液超声溶解，过滤。对照品溶液的制备：称取丹酚酸b、迷迭香酸和芦丁对照品粉末，精密称定，加入90％甲醇分别配制成对照品溶液。吸取对照品和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶gf254薄层色谱板上，以醋酸丁酯-甲酸-水(10:2:3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视，样品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(4)含量测定：供试品溶液的配制：取丹参茎叶酚酮有效部位粉末若干，精密称定，加入90％甲醇溶液超声溶解，过滤。对照品溶液的制备：称取丹酚酸b、迷迭香酸和芦丁对照品粉末，精密称定，加入90％甲醇分别配制成对照品溶液。测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。(5)指纹图谱供试品溶液的配制：取若干丹参茎叶酚酮有效部位粉末，精密称定，加入90％甲醇溶液超声溶解，过滤。对照品溶液的制备：称取丹酚酸b、迷迭香酸和芦丁对照品粉末，精密称定，加入90％甲醇分别配制成对照品溶液。测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录65min的色谱图，得到丹参茎叶酚酮有效部位的指纹图谱，进行相似度分析。作为优选方案，以上所述的丹参茎叶酚酮有效部位的质量标准检测方法的应用中步骤(4)和(5)的色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水为流动相b，按表1规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm(丹酚酸类成分)和254nm(黄酮类成分)；柱温为30℃；流速为1ml/min；理论塔板数按迷迭香酸峰计算应不低于20000。表1流动相条件时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～510905～1010→1290→8810～2012→1488→8625～6020→3086→7060～6530→4070→60有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明通过实验筛选出丹参茎叶酚酮有效部位的制备工艺，并根据丹参茎叶酚酮有效部位所含化学成分的特点制定质量标准检测方法，为工业生产提供科学可靠的制备工艺及质量控制依据，且对丹参非药用的地上部位开发利用，提高资源利用率，减少环境污染和资源浪费。本发明提供的丹参茎叶酚酮有效部位的制备及质量标准，工艺简单易操作，方法稳定可靠，为丹参茎叶酚酮有效部位质量检测提供依据。附图说明图1丹参茎叶酚酮有效部位的薄层色谱图。图2丹参茎叶酚酮有效部位指纹图谱。图3丹参茎叶酚酮有效部位对照图谱。具体实施方式结合附图与实施例对本发明进一步说明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的工艺条件及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例1丹参茎叶酚酮有效部位制备，它包括以下步骤：步骤a：提取过程：取丹参茎叶的干燥粉末20g(过40目筛)，用10倍量60％乙醇回流提取酚酸和黄酮类成分，回流提取3次，每次提取1h，合并滤液，浓缩回收乙醇，得到提取液。大孔吸附树脂预处理：用2倍体积的95％乙醇浸泡树脂(nka-2型)24h，使其充分溶胀，湿法装柱，将2-4倍的乙醇通过树脂层，洗至洗出液加适量的水无白色浑浊现象，用约5倍体积的去离子水清洗至无醇味，备用。纯化过程：称取已处理好的nka-2型大孔吸附树脂80g，湿法装柱，取0.25g·ml-1丹参茎叶提取液80ml上柱，用3bv水洗除杂，4bv60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥至恒重。实验结果：纯化后样品中酚酸和黄酮的纯度可达到46.77％和4.72％。所得纯化物中酚酸类成分质量分数为46.77％，其中迷迭香酸、丹酚酸b分别占比57.68％、39.33％；黄酮类成分质量分数为4.72％，其中芦丁、异槲皮苷分别占比34.92％、39.85％。实施例2丹参茎叶酚酮有效部位质量标准，它包括以下步骤：取实施例1中得到的6批丹参茎叶酚酮有效部位粉末，样品详细信息见表2表26批不同产地丹参茎叶样品号产地收集时间s1陕西铜川2018.7s2山东2018.7s3山东临沂2018.8s4安徽亳州2018.8s5江苏南京(原产山东)2019.7s6江苏南京(原产陕西)2019.71.水分检查取供试品约2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定，开启瓶盖在105℃干燥5小时，盖好瓶盖后，移至干燥器中，冷却30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。结果显示：丹参茎叶总酚酮有效部位中水分含量范围为5.09％～5.81％。2.炽灼残渣检查取丹参酚酮有效部位粉末约1g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，于电炉上缓缓炽热至完全炭化，放冷。加硫酸lml使湿润，低温加热至除尽硫酸蒸气后，在800℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷，精密称定后，再在800℃炽灼至恒重，即得。结果显示：丹参茎叶总酚酮有效部位中炽灼残渣幅度范围为13.64％～15.73％。3.鉴别供试品溶液的配制：取10mg丹参茎叶酚酮有效部位粉末，精密称定，加入10ml90％甲醇溶液超声溶解，过滤。对照品溶液的制备：称取丹酚酸b、迷迭香酸和芦丁对照品粉末，精密称定，加入90％甲醇分别配制成浓度为0.3mg/ml的对照品溶液。吸取对照品和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶gf254薄层色谱板上，以醋酸丁酯-甲酸-水(10:2:3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视，结果见图1，样品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，其中1-丹酚酸b、2-迷迭香酸、3-紫草酸、4-芦丁、5异槲皮苷、6-11丹参茎叶酚酮有效部位样品s1-s6。4.含量测定供试品溶液的配制：取10mg丹参茎叶酚酮有效部位粉末，精密称定，加入10ml90％甲醇溶液超声溶解，过滤。对照品溶液的制备：称取丹酚酸b、迷迭香酸和芦丁对照品粉末，精密称定，加入90％甲醇分别配制成浓度为0.2mg/ml的对照品溶液。色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水为流动相b，按表3规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm(丹酚酸类成分)和254nm(黄酮类成分)；柱温为30℃；流速为1ml/min；理论塔板数按迷迭香酸峰计算应不低于20000。表3流动相条件时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～510905～1010→1290→8810～2012→1488→8625～6020→3086→7060～6530→4070→60测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品算，含丹酚酸b(c36h30o16)、迷迭香酸(c18h16o8)的总量不得低于42.94％，芦丁(c27h30o16)含量不得低于1.45％。5.指纹图谱供试品溶液的配制：取10mg丹参茎叶酚酮有效部位粉末，精密称定，加入10ml90％甲醇溶液超声溶解，过滤。对照品溶液的制备：称取丹酚酸b、迷迭香酸和芦丁对照品粉末，精密称定，加入90％甲醇分别配制成浓度为0.2mg/ml的对照品溶液。色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水为流动相b，按表4规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm(丹酚酸类成分)和254nm(黄酮类成分)；柱温为30℃；流速为1ml/min；理论塔板数按迷迭香酸峰计算应不低于20000。表4流动相条件时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～510905～1010→1290→8810～2012→1488→8625～6020→3086→7060～6530→4070→60测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录65min的色谱图，《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2012)》软件分析后得到丹参茎叶酚酮有效部位的指纹图谱和对照指纹图谱，见图2和图3，将生成的对照图谱的相似度值定为1，计算6批供试品间指纹图谱的相似度，进行相似度评价，结果见表5，丹参茎叶酚酮有效部位的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度应均大于0.90；丹参茎叶酚酮有效部位的指纹图谱有11个共有指纹峰。将迷迭香酸设为参照峰，其保留时间设为1.0，分别计算各峰相对保留时间。各共有峰的相对保留时间见表6表56批样品间的相似度样品编号相似度s10.997s20.963s30.994s40.934s50.994s60.989表66批丹参茎叶酚酸样品共有峰的相对保留时间以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12