一种异喹啉类化合物在杀灭或预防水产动物体外寄生虫中的应用的制作方法

本发明属于化学产品用途
技术领域：
，具体为一种异喹啉类化合物在杀灭或预防水产动物体外寄生虫中的应用。
背景技术：
：小瓜虫病是一种危害严重的寄生虫病，几乎可以感染所有淡水鱼类，最严重时曾造成年均20-30万吨鱼死亡，年均损失达20-30亿元，给我国的淡水鱼类养殖业造成巨大的经济损失。治疗小瓜虫病效果较好的药物主要是硝酸亚汞和孔雀石绿，由于对人体有致癌性和毒性已被禁止在食用鱼上使用。目前，没有治疗小瓜虫病特效的药物，而主要利用甲醛、敌百虫、硫酸铜等药物，虽有一定的功效，但长期使用带来的是环境污染、药物残留、耐药性等一系列问题，也成为当前食品安全和水产品出口的绿色贸易壁垒问题，开展小瓜虫病的防治研究，对保障水产养殖业健康发展以及食品安全等方面具有重要的社会和经济效益。因此，研制开发环境友好型、高效的杀虫活性药物已成为一项迫在眉睫的任务。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种异喹啉类化合物，用于杀灭或预防水产动物体外小瓜虫。为实现上述技术目的，本发明提供一种异喹啉类化合物在杀灭或预防水产动物体外寄生虫中的应用，所述异喹啉类化合物为(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸，其结构式为优选的，所述水产动物体外寄生虫为淡水小瓜虫或海水刺激隐核虫中的一种或多种。本发明还提供了一种杀虫剂，包括上述的异喹啉类化合物、表面活性剂、溶解剂和水。优选的，所述杀虫剂包括下列重量百分比的原料：异喹啉类化合物20-30％，表面活性剂5-10％，溶解剂5-10％，其余为水。优选的，所述溶解剂为二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺。优选的，所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。本发明还提供了一种杀虫剂在杀灭或预防水产动物体外寄生虫中的应用。本发明还提供了一种杀虫剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将溶解剂加入异喹啉类化合物中搅拌，直至异喹啉类化合物完全溶解；(2)将表面活性剂加入到步骤(1)溶解后的异喹啉类化合物中，搅拌均匀，得到混合溶液；(3)在步骤(2)混合溶液中加水，搅拌均匀，即得杀虫剂。杀虫剂使用时，用水稀释后泼洒于养殖塘中，使用剂量为0.2-0.6g/m3。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首次发现(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸具有较好的杀虫作用，其毒性浓度是其最低有效浓度80倍以上，使用安全高效，毒性小，同时该化合物对小瓜虫的杀灭效果显著；杀虫剂的制备简单、使用方便，生产成本低。附图说明图1为实施例1杀虫剂作用小瓜虫掠食体前后的电镜结构图；图2为实施例1杀虫剂作用小瓜虫包囊前后的电镜结构图；图3为实施例1杀虫剂浓度与草鱼死亡率关系；图4为实施例1杀虫剂浓度与刺激隐核虫幼虫死亡率关系。具体实施方式现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。本发明杀虫剂可直接泼洒于池塘中，以池塘水量为参考，使用剂量为0.2-0.6ml/m3均可。实施例1称取(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸25g，在10gn,n-二甲基甲酰胺中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-2010g，加入55g的水混合搅拌均匀即得杀虫剂。实施例2称取(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸30g，在10gn,n-二甲基甲酰胺中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-805g，加入55g的水混合搅拌均匀即得杀虫剂。实施例3称取(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸28g，在10g二甲基亚砜中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-2010g，加入52g的水混合搅拌均匀即得杀虫剂。实施例4称取(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸25g，在30g二甲基亚砜中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-8010g，加入35g的水混合搅拌均匀即得杀虫剂。一、以下是本发明的药效分别对小瓜虫的试验：1材料与方法1.1试验鱼严重感染小瓜虫的草鱼(由本实验室传代感染，虫源来自开化县某清水鱼养殖场)。随机选取10尾鱼，取全鳃镜检观察统计鳃上小瓜虫数量，试验鱼小瓜虫感染率为100％，每尾鱼平均感染小瓜虫约80个。试验用药为按照实施例1的杀虫剂。1.2体外杀虫试验将严重感染小瓜虫的草鱼放入烧杯中，待小瓜虫游出后，用吸管将成熟小瓜虫收集放入平皿中，一部分虫体用于小瓜虫掠食体的培养，一部分用于包囊的收集。1.2.1体外杀小瓜虫掠食体的药效试验试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入约2ml不同浓度的杀虫剂(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.3g/m3)和约100个小瓜虫掠食体，于用药后15min、1h、2h、3h、4h镜检观察一次，4h后统计各孔的小瓜虫死亡率。试验设置和充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。小瓜虫死亡判断标准：虫体纤毛不运动，胞质不流动，胞膜破裂，细胞核破碎。1.2.2体外杀小瓜虫包囊虫的药效试验试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入约2ml不同浓度的杀虫剂(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5g/m3)和30个小瓜虫包囊，于用药后4h镜检观察一次，24h后统计各孔的小瓜虫包囊死亡率。试验设置充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。小瓜虫包囊死亡判断标准：包囊未分裂或包囊未孵出掠食体。1.3体内杀灭小瓜虫的药效试验在一个体积为1m3的水泥池中放入120尾健康未感染任何寄生虫的草鱼，暂养一周后，放入600000个小瓜虫掠食体进行感染，感染24h后，将感染有小瓜虫的草鱼进行分组，每组10尾鱼，并放入100l的鱼缸中。根据体外杀虫试验设置杀虫剂的杀虫试验浓度0.2、0.4和0.6g/m3。于体积为80cm×60cm×40cm的玻璃缸内盛入充分曝气的自然水，ph7.0～7.5，水温25±1℃。按照设定好的浓度向水体中加入不同浓度的杀虫剂，并搅拌均匀，并在第3天和第5天，每个试验组重新加换新的杀虫剂。试验第5天时，每个浓度组取出3尾草鱼，并放入烧杯中，按照体外杀虫试验的方法收集包囊，并观察包囊的死亡和分裂情况。试验第10天，将所有组内的草鱼取出，全鳃制片、镜检，统计每尾草鱼在鳃部小瓜虫存活数量以及鳍条存活的虫体数量，计算平均杀虫率。杀虫率(％)＝(对照组的小瓜虫平均存活数量－试验组的小瓜虫平均存活数量)/对照组的小瓜虫平均存活数量×100％鱼平均死亡率(％)＝(投放的鱼数量-镜检时的鱼存活数量)/投放的鱼数量×100％1.4.(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对草鱼的急性毒性试验试验在体积为80l的玻璃缸中进行，每个缸中放置健康的草鱼10尾，并加入浓度为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0和30.0g/m3杀虫剂，96h后统计草鱼死亡数量，并计算(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸对草鱼的半致死浓度。每个浓度组做3个重复，试验设置一个对照组。2结果试验数据用spss16.0统计学软件进行处理，所有参数均用均数±标准差(x±sd)表示。2.1体外杀小瓜虫试验(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对小瓜虫掠食体的体外杀灭作用见图1。(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对小瓜虫具有较强的杀灭作用，并且随着浓度的增加其杀灭作用逐渐增强，他对小瓜虫掠食体15min、1h、2h、3h和4h半数致死有效浓度(ec50)(95％ci)分别为0.26(0.24-0.28)、0.22(0.20-0.24)、0.18(0.17-0.19)、0.15(0.13-0.17)和0.10(0.08-0.12)g/m3，其浓度为0.25g/m3和0.3ml/m3时，4h以内即可100％杀死对小瓜虫掠食体。由图1中可以看出，正常掠食体细胞结构完整，纤毛整齐，而用药组细胞结构不完整，纤毛脱落。(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对小瓜虫包囊的体外杀灭作用见附图2，其灭杀结果见表1。由表1可知：(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂在浓度为0.5g/m3包囊未分裂，也未孵出掠食体，其对包囊的杀虫率为100％。其浓度为0.4、0.3、和0.2g/m3时对包囊的杀灭率分别为83.3％、67.7％和43.3％，而0.1g/m3浓度组对包囊作用效果最差，杀灭率仅为26.7％。表1(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对小瓜虫包囊的杀灭率及对孵化的影响(6h)浓度(g/m3)包囊死亡率(％)每个包囊孵化虫数(个)0.126.7±6.7b589.5±25.6a0.243.3±6.7c418.5±36.5b0.367.7±3.3d269.2±29.8c0.483.3±6.7e144.3±33.7d0.5100±0.0f0.0±0.0e对照0.0±0.0a603.5±32.5a注：不同字母表示差异显著(p＜0.05)由图2可以看出，正常掠食体细胞结构完整，包膜清晰、可见，而用药组细胞结构不完整，包囊破裂。2.2(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂的体内杀虫试验(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对寄生于草鱼上的体内杀虫试验结果如表2。由表2可知：(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对小瓜虫具有较强的杀灭作用，使用药物后，草鱼体表和鳃上的小瓜虫数量明显减少，且其掉落后的包囊的掠食体孵化率明显减少。当其浓度为0.6g/m3时，草鱼的死亡率为33.3％，其鳃上和鳍条的小瓜虫数为112.8±22.2。而对照组的草鱼死亡率为100％，鳃和鳍条上小瓜虫的数量为516.2±45.6。结果表明(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对感染有小瓜虫的试验鱼具有较强的保护作用。表2(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对小瓜虫的体内杀虫效果注：不同字母表示差异显著(p＜0.05)2.3(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对草鱼的急性毒性试验s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对草鱼的毒性结果如图3。浓度为5.0g/m3(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂用药96h后草鱼死亡率为0，且草鱼活性正常，也未见异常反应。浓度为30.0g/m3(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂用药4h后草鱼即出现呼吸急促，跳跃等异常反应，96h后草鱼全部死亡。(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对草鱼的96hld50为16.75g/m3。二、以下是(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀灭寄生鱼类刺激隐核虫的药效试验1材料与方法1.1试验鱼严重感染刺激隐核虫的大黄鱼来自福建福鼎某苗种基地。试验用药为按照实施例1的杀虫剂。1.2体外杀虫试验将严重感染刺激隐核虫的大黄鱼放入体积为1m3圆桶中，于第二天上午放水用刷子轻轻刷桶底，收集底部的刺激隐核虫。并用吸管将成熟虫体收集放入烧杯中，一部分虫体用于幼虫的培养，一部分用于包囊试验。1.2.1(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸对刺激隐核虫幼虫的体外杀灭试验试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入约2ml不同浓度的药液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6g/m3)和约100个幼虫，于用药后4h统计各孔的幼虫死亡率。试验设置dmso对照组和充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。幼虫死亡判断标准：虫体纤毛不运动，胞质不流动，胞膜破裂，细胞核破碎。1.2.2(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸对包囊的体外杀灭试验试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入约2ml不同浓度的药液(0.2、0.3、0.4、0.5和0.6g/m3)和30个包囊，于用药后6h镜检观察一次，24h后统计各孔的刺激隐核虫包囊死亡率。试验设置dmso对照组和充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。包囊死亡判断标准：包囊未分裂或包囊未孵出幼虫。1.3(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸体内杀刺激隐核虫的药效试验取严重感染刺激隐核虫的大黄鱼(32.6±5.4g)随机分成4组，即0.2g/m3浓度组、0.4g/m3浓度组、0.6g/m3浓度组和空白对照组。每组放置15尾实验鱼，每个浓度组设置3个平行重复。使用药物后每天观察鱼体的死亡情况，并统计累计死亡率。试验第5天时，每个浓度组取出3尾大黄鱼，并放入烧杯中，按照体外杀虫试验的方法收集包囊，并观察包囊的死亡和分裂情况。试验第10天，将所有组内的大黄鱼取出，全鳃制片、镜检，统计每尾鱼在鳃部和鳍条刺激隐核虫存活数量，计算平均杀虫率。杀虫率(％)＝(对照组的刺激隐核虫平均存活数量－试验组的刺激隐核虫平均存活数量)/对照组的刺激隐核虫平均存活数量×100％1.4数据处理试验数据用spss16.0统计学软件进行处理，所有参数均用均数±标准差表示。2结果2.1(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸的体外杀虫试验(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸对刺激隐核虫幼虫的体外杀灭作用见图4。由图可知：(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸对刺激隐核虫幼虫具有较强的杀灭作用，随着浓度的增加其杀灭作用逐渐增强，他对幼虫的4h-半数致死有效浓度(ec50)(95％ci)的浓度分别为0.28(0.27-0.29)g/m3,其浓度为0.5g/m3和0.6g/m3时，作用4h对幼虫的杀灭率为100％。(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸对小瓜虫包囊的体外杀灭作用见表3。由表3可知：(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸在浓度为0.6g/m3包囊未分裂，也未孵出幼虫，其对包囊的杀虫率为100％。其浓度为0.5,0.4和0.3g/m3时对包囊的杀灭率分别为93.3％,70.0％和36.7％,而0.3g/m3对包囊的杀灭作用效果最差。而对照组的包囊全部孵化出膜，未见包囊死亡。表3(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸对刺激隐核虫包囊的体外杀灭效果浓度(g/m3)包囊死亡率(％)每个包囊孵化虫数(个)0.223.3±3.3b448.1±74.8a0.336.7±6.7c417.3±53.7a0.470.0±3.3d323.8±67.2b0.593.3±6.7e202.4±53.6c0.6100±0.0e0.0±0.0d对照0.0±0.0a469.5±102.9a注：不同字母表示差异显著(p＜0.05)2.2(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸的体内杀刺激隐核虫作用(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对寄生于大黄鱼的刺激隐核虫的体内杀虫试验结果如表4。由表4可知：(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对刺激隐核虫具有较强的杀灭作用，使用药物后，大黄鱼体表和鳃上的小瓜虫数量明显减少，且其掉落后的包囊的掠食体孵化率明显减少。当其浓度为0.6g/m3时，大黄鱼的死亡率为30.0％，其鳃上和鳍条的小瓜虫数为187.6±34.5。而对照组的大黄鱼死亡率为95.6％，鳃和鳍条上小瓜虫的数量为524.4±63.2，而0.6g/m3浓度组的死亡率为43.3％，其鳃上和鳍条的小瓜虫数为288.2±43.8，显著低于0.2g/m3浓度组和对照组。结果表明(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸杀虫剂对感染有刺激隐核虫的试验鱼具有较强的保护作用。表4(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸体内杀虫试验结果对比例1同实施例1，区别在于，表面活性剂替换成水。研究结果发现，小瓜虫的杀灭效果和死亡率无明显变化，说明本发明中的表面活性剂仅具有溶解作用，其起杀虫作用的物质是(s)-2-叔丁氧羰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12