本发明涉及中药材制备
技术领域：
，具体涉及一种炮制淫羊藿的制备方法。
背景技术：
：淫羊藿来源于小檗科植物淫羊藿epimediumbrevicomumaxim.、箭叶淫羊藿epimediumsagittatum(sieb.etzucc.)maxim.、柔毛淫羊藿epimediumpubescensmaxim.或朝鲜淫羊藿epimediumkoreanumnakai的干燥叶，其醇浸出物、总黄酮具有显著的药理活性。现代药理学研究表明，淫羊藿醇浸出物具有抗氧化和神经保护作用；淫羊藿总黄酮具有抗骨质疏松、抗氧化、增强免疫、神经保护作用、抗衰老和肾保护作用。研究表明淫羊藿的主要活性成分是黄酮类，其中朝藿定a-c、淫羊藿苷和宝藿苷i的含量较高，朝藿定a具有抗菌和抗氧化活性；朝藿定b具有抗骨质疏松、抗菌和抗氧化活性；朝藿定c具有抗骨质疏松、抗氧化、抗菌和抗肿瘤的活性；淫羊藿苷具有抗骨质疏松、保护神经、抗肿瘤、抗炎和抗氧化等活性；宝藿苷ⅰ具有抗肿瘤、抗骨质疏松、降血糖和抗氧化活性。影响淫羊藿有效成分含量的因素较多，包括品种、产地生境、采收时间、贮藏方法、产地加工方法，炮制方法等，其中淫羊藿炮制是对其采收后的一种处理，不同炮制方法对其化学成分含量的影响不同。淫羊藿的炮制方法，始载于《雷公炮炙论》，雷公云：“凡使(时呼仙灵脾)，须用夹刀夹去叶四畔花枝，每一斤用羊脂四两拌炒，待脂尽为度”。至清代止，历代记载淫羊藿的炮制方法有20种左右，涉及到古代医药文献不下40部。其中以羊脂拌炒法历代一直沿用，说明羊脂拌炒法在历代使用上具有普遍性，但历代本草中关于淫羊藿羊脂拌炒的方法记载均比较笼统，饮片炮制过程的控制历来以操作者的主观判断为标准，饮片质量的稳定性很难控制。2015年版《中国药典》仅仅收录了羊油炙淫羊藿饮片的工艺，目前大量文献均研究了羊油炙淫羊藿的工艺。本制备方法使用的辅料是酥油。元代的《瑞竹堂经验方》、明代的《普济方》以及清代的《良明汇集》中均有淫羊藿酥炙的记载。酥油是藏族食品之精华，是似黄油的一种乳制品，是从牛奶、羊奶中提炼出的脂肪。酥油能够增加体内的消化和吸收能力，润滑结缔组织，增加灵活性，改善脑部功能和记忆力，并将草药的药性运送到全身的组织内。此外，酥油在牛奶提炼的过程中已去除了全部的乳蛋白，因此，它是乳糖不耐症者极好的替代乳品。甘肃省中药炮制规范也有淫羊藿酥炙的记载，“取酥油，置锅内文火加热熔化，再将淫羊藿丝倒入，拌炒均匀，取出，摊开，晾凉。每100kg淫羊藿使用酥油25kg”，但是无温度、炒制时间的具体参数，本发明将淫羊藿酥炙的工艺具体化，优选出一种炮制淫羊藿的方法。技术实现要素：本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种炮制淫羊藿的制备方法；旨在以心叶淫羊藿(以下简称淫羊藿)为基础，以淫羊藿苷含量、总黄酮含量、5种主要黄酮(朝藿定a-c、淫羊藿苷和宝藿苷ⅰ，以下简称5种黄酮)含量和、醇浸出物含量和dpph自由基清除活性为指标，采用层次分析法-基于指标相关性的权重确定方法(ahp-critic)混合加权法确定各指标权重系数，通过正交实验设计优选淫羊藿最佳炮制工艺，以期为炙淫羊藿的工业化生产提供理论依据。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种炮制淫羊藿的制备方法，将淫羊藿药材加入酥油后炒制；酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为10％-20％，炒制温度为140℃-180℃，炒制时间为4-8分钟；所述淫羊藿药材为心叶淫羊藿。进一步的，上述的一种炮制淫羊藿的制备方法，所述酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为10％，炒制温度为140℃，炒制时间为4分钟。进一步的，上述的一种炮制淫羊藿的制备方法，所述酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为10％，炒制温度为160℃，炒制时间为6分钟。进一步的，上述的一种炮制淫羊藿的制备方法，所述酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为10％，炒制温度为180℃，炒制时间为8分钟。进一步的，上述的一种炮制淫羊藿的制备方法，所述酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为15％，炒制温度为140℃，炒制时间为6分钟。进一步的，上述的一种炮制淫羊藿的制备方法，所述酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为15％，炒制温度为160℃，炒制时间为8分钟。进一步的，上述的一种炮制淫羊藿的制备方法，所述酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为15％，炒制温度为180℃，炒制时间为4分钟。进一步的，上述的一种炮制淫羊藿的制备方法，所述酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为20％，炒制温度为140℃，炒制时间为8分钟。进一步的，上述的一种炮制淫羊藿的制备方法，所述酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为20％，炒制温度为160℃，炒制时间为4分钟。进一步的，上述的一种炮制淫羊藿的制备方法，所述酥油加入量为以淫羊藿药材重量百分比计为20％，炒制温度为180℃，炒制时间为6分钟。本发明的有益效果为：本发明提供的一种炮制淫羊藿的制备方法，是综合淫羊藿苷含量、总黄酮含量、5种主要黄酮含量、醇浸出物含量和dpph自由基清除活性等多种数据指标，通过正交实验设计优选出的淫羊藿最佳炮制工艺，其制备工艺参数清洗，误差小，可重复性强，能够有效促进炙淫羊藿的工业化生产。具体实施方式实施例1：1试剂、仪器与药材1.1试剂朝藿定a(110623-72-8)、朝藿定b(110623-73-9)、朝藿定c(110642-44-9)、淫羊藿苷(489-32-7)、宝藿苷ⅰ(113558-15-9)对照品，均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司；甲醇、乙腈(oceanpak，瑞典)，乙腈和乙酸均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。1.2仪器十万分之一分析天平(赛多利斯科学仪器，北京有限公司)；安捷伦1260ⅱ高效液相色谱仪；超声波清洗仪(kq-400kde型高功率数控超声波清洗仪)；紫外分光光度计(uv-1700，shimadzu)；fa2004分析电子天平(上海良华仪器仪表有限公司)。1.3药材淫羊藿药材采自甘肃省礼县中坝乡，采收时间：2019年6月10日，由礼县春天药业提供，由甘肃中医药大学附属医院杨锡仓主任中药师鉴定为心叶淫羊藿(epimediumbrevicomumaxim.)的叶。2方法及结果2.1五种黄酮含量和测定采用hplc法，按2015年版《中国药典》淫羊藿项下炙淫羊藿中淫羊藿苷和宝藿苷ⅰ含量的测定方法测定5种黄酮含量。2.1.1样品制备按药典规定制备样品溶液。取药材0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20ml，称定重量，超声提取(20℃，频率160hz)1小时，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μl滤膜过滤，即得。2.1.2色谱条件色谱柱：agilentzorbaxeclipsexdb-c18柱；柱温：30℃；进样量：20μl；检测波长：270nm；流动相：乙腈-水洗脱程序如表1所示。表1时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～29752529～3075～5925～4130～5559412.1.3含量测定精密称取朝藿定a、朝藿定b、朝藿定c、淫羊藿苷、宝藿苷i对照品适量，分别加甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中，分别吸取200μl，置于1ml容量瓶中，混合均匀，得含朝藿定a、b、c、淫羊藿苷、宝藿苷ⅰ分别为0.59、0.54、0.50、0.50和0.52mg/ml的混合对照品溶液，稀释成系列混合对照品溶液，将上述系列对照品溶液各注入液相色谱仪20μl，根据峰面积分别绘制标准曲线。取样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，根据各标准曲线测定黄酮含量。2.2总黄酮含量测定按2015年版《中国药典》淫羊藿项下总黄酮的测定方法测定。2.2.1样品制备同“2.1.1”。2.2.2对照品溶液的制备取淫羊藿苷对照品2.50mg，加甲醇制成每ml含0.50mg的溶液，得对照品溶液。分别取对照品原液0、100、200、300、400、500μl，置于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得标准品系列溶液。2.2.3标准曲线的绘制以空白溶剂较零，在270nm波长下测定系列对照品溶液的吸光值a，测定三次，取平均值，以淫羊藿苷对照品的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。2.2.4含量测定精密吸取供试品溶液50μl，置于5ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀。测定吸光值a，平行三份，根据吸光值a计算总黄酮含量。2.3醇浸出物含量测定按2015年版《中国药典》四部醇浸出物项下测定方法测定。2.4dpph自由基清除率测定提取方法：同“2.1.1”。测定方法：20mgdpph加无水乙醇定容于250ml容量瓶中，即为dpph储备液。样品液稀释10倍后取1ml；加入1mldpph储备液。混匀后，避光反应30min后，在517nm处测定吸光度a样品，用无水乙醇代替样品溶液测得空白组吸光值a空白。清除率＝(a空白-a样品)/a空白×100％2.5正交实验设计结合影响淫羊藿炮制过程中因素，选取加酥油量％(a)、炒制温度(b)、炒制时间(c)为考察因素，以淫羊藿苷含量、总黄酮含量、5种黄酮含量和、醇浸出物含量和dpph自由基清除活性为指标，设计三因素三水平的正交实验，因素水平见表2，正交实验设计及结果见表3。表2表32.6指标权重的确定2.6.1ahp法确定权重根据淫羊藿的活性成分调研，选取淫羊藿苷含量、总黄酮含量、5种黄酮含量、醇浸出物含量和dpph自由基清除率作为权重指标并予以量化，将评价指标分为5个层次，并确定各指标的优先顺序为：淫羊藿苷>总黄酮含量>5种黄酮含量和>醇浸出物含量>dpph自由基清除率，由此构建两两比较的优先判断矩阵，赋予各项指标相对评分，两两比较优先判断矩阵见表4。表4根据表4的评分结果，通过层次分析法算得淫羊藿苷含量、总黄酮含量、5种黄酮含量和、醇浸出物含量和dpph自由基清除率的权重系数分别为0.4241、0.2436、0.1414、0.1060和0.0848，算得最大特征值ci＝0.0423，查得随机一致行比例因子ri＝0.9，一致性比率cr＝0.01<0.1，说明两两比较判断矩阵一致性良好，所得权重系数合理有效。2.6.2critic法确定权重critic法(criteriaimportancethroughintercriacorrelation)是diakoulaki提出的一种客观权重赋权法，以某特征类间的对比强度和特征间的冲突性为基础，综合衡量评价指标的客观权重，本实验采用critic法确定各指标间的权重。将数据经线性插值进行标准化处理，指标成分值＝[(实测值－最小值)/(最大值－最小值)]×100，消除单位量纲后，根据spss22.0软件处理数据得到相关系数矩阵a，采用spss22.0软件计算各指标间的对比强度(si)、冲突性(δi)、综合权重(ci)与权重系数(ωi)，经critic法计算得到淫羊藿苷含量、总黄酮含量、5种黄酮含量和、醇浸出物含量和dpph自由基清除率的客观权重系数分别为0.1770、0.2841、0.1384、0.2714和0.1291。2.6.3ahp-critic混合加权法确定指标权重ahp法在一定程度上量化了两两指标间药理作用的强弱信息，得到以主观评价为基础的权重系数，但是主观性较强，忽略了实际样本数据的信息，即各个指标间相互作用对总体取效果的影响。critic法能体现客观数据信息，但却往往忽视了指标间的实际轻重关系，对样本的区分度不佳。ahp-critic混合加权法结合了ahp法和critic法两种方法的优点，结合两种方法计算综合权重，既考虑到主观，又兼顾客观，更能全面客观的评价数据信息。ahp-critic混合加权计算公式为：(ω综合ij)＝ωahpijωcriticij/∑ωahpijωcriticij按照公式算得淫羊藿苷含量、总黄酮含量、5种黄酮含量和、醇浸出物含量和dpph自由基清除率五项指标的复合权重系数分别为0.3687、0.3399、0.0961、0.1413和0.0538。2.7综合评价结果的比较分别采用经ahp法、critic法及ahp-critic混合加权法分析得到的权重系数对实验结果进行综合评分，三种赋权方法综合评分结果见表5。3种评分方法结果直观分析差异较小，通过相关系数分析，ahp法与critic法之间的相关系数为0.9941，ahp法与混合加权法之间的相关系数为0.9977，critic法与混合加权法之间的相关系数为0.9929，三者相关性显著(p<0.05)，说明3种权重法得到的评分结果具有一致性。不过从权重系数分析，ahp法与critic法之间的相关系数为0.0877，二者相关性不显著(p>0.05)，所反映的信息不具叠加性。综合来说，ahp-critic混合加权法从主观客观2个方面进行综合评价，所体现的信息量更为全面，因此综合评分结果更为科学合理。表52.8炮制工艺的确定直观分析结果表明，各因素对淫羊藿炮制工艺影响的顺序为a>c>b，即加酥油量>炒制时间>炒制温度。方差分析表明a、b、c因素均对炮制工艺没有显著性差异(p＞0.05)。优选的最佳炮制工艺为：a1b1c1，即加酥油量为10％，炒制温度为140℃，炒至时间为4min。直观分析结果如表6所示，方差分析结果如表7所示。表6表7来源平方和df均方f显著性a82.128241.06415.1220.179b98.003249.00118.0450.164c15.18727.5942.7960.389误差2.71622.7162.9酥油和羊油炮制淫羊藿中成分和dpph自由基清除率比较上述研究表明当酥油加入量为10％，有效成分含量最高，且dpph自由基清除率最强。《中国药典》记载羊油炙淫羊藿的羊油加入量为20％，本实验设计比较相同比例羊油和酥油炮制淫羊藿(10％，140℃，4min)，制备样品s10和s11，分别与淫羊藿生饮片s12进行比较。结果见表8，结果证明相比于淫羊藿生饮片，10％羊油和酥油炙淫羊藿的有效成分含量较高，且dpph自由基清除率较强。且证明酥油炙样品比羊油炙样品中的有效成分含量更高且dpph自由基清除率更强，炮制过程中发现酥油炙淫羊藿有特殊的香味而羊油炙淫羊藿有膻味，为了能让消费者的更容易接受，酥油炙淫羊藿是一种不错的选择。表82.9不同比例羊油加入量所得淫羊藿饮片比较《中国药典》规定1000g淫羊藿用酥油20g，上述正交试验证明当酥油加入量为10％时，淫羊藿苷、总黄酮、5种黄酮含量和、醇浸出物含量均最高，且dpph自由基清除率最强，为了验证上述结论是否适用于羊油炙淫羊藿，本实验设计了用不同羊油加入量(10％、15％和20％)下，采用最优温度和时间(140℃，4nin)制备样品s13、s14、s15，并测定淫羊藿苷、总黄酮、5种黄酮含量和、醇浸出物含量和dpph自由基清除率，数据证明当羊油加入量为10％时，淫羊藿苷、总黄酮、5种黄酮含量和、醇浸出物含量均最高，且dpph自由基清除率最强。结果见表9。表93小结本发明旨在以淫羊藿药材为基础，以淫羊藿苷、总黄酮、5种黄酮含量和、醇浸出物含量和dpph自由基清除率为指标，设计正交试验优选炮制工艺。权重系数的确立一直是中药炮制工艺中多指标评价需考虑的问题，目前较常用的有主观综合评分法、总评归一值法、ahp层次分析法、critic法，本发明实验所提ahp层次分析法容易受实验人员主观判断的影响，存在片面性有时会忽略实际样本数据的信息，critic法虽是客观利用数据信息，但却往往忽视各指标间的轻重关系，特别是成分复杂的中药，ahp-critic混合加权法则结合了不同类型赋权法的优点，既注重主观，又不失客观，比单一赋权法更能区分样本数据，体现的数据信息更全面，保证数据点均匀分散，结果稳定可靠，本发明实验所优选的工艺为加酥油量为10％，炒制温度为140℃，炒至时间为4min，此炮制方法简单可控，可为炙淫羊藿的工业化生产提供理论依据。本发明所提供的炮制淫羊藿制备方法与现有技术炮制淫羊藿制备方法的操作过程及最终产品效果的对比数据见表10。表10最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12