23-羟基白桦酸在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途的制作方法

本发明涉及天然药物领域，具体提供了23-羟基白桦酸在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的用途，包含23-羟基白桦酸的药物组合物，以及制备所述药物组合物的方法。

背景技术：

溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，uc)，又称慢性非特异性溃疡性结肠炎，是一种结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾。uc是胃肠道较为常见的疾病之一，可发生于任何年龄，但以20～30岁年龄多见。uc发病机理复杂，至今尚不明确，可能与遗传、环境尤其是炎症免疫密切相关。uc病变多涉及大肠黏膜和黏膜下层，累及直肠和乙状结肠，呈连续性弥漫性分布。uc病程漫长，常反复发作，临床表现轻重不一，主要为腹痛、血性腹泻、体重减轻、里急后重；内镜下结肠呈糜烂、溃疡等弥漫性炎症；组织病理学表现为黏膜或黏膜下弥漫性炎症反应、杯状细胞减少、隐窝结构破坏等。严重的uc患者可出现中毒性结肠扩张、肠穿孔、大出血、肠癌等并发症。目前对溃疡性结肠炎除手术切除之外，尚缺乏根治方法。

目前，临床上用于治疗溃疡性结肠炎的药物主要有：水杨酸类如柳氮磺胺吡啶、糖皮质激素如强的松、免疫调节剂如硫唑嘌呤等。这些药物虽具有一定疗效，但经治疗后仍经常复发并存在较严重的不良反应。因此临床亟待新型抗uc的药物。

23-羟基白桦酸(23-hydroxybetulinicacid,简称hba)是从paeoniajaponica、anemonechinensis、pulsatillachinensis等植物中分离到的一种五环三萜皂苷类化合物。其cas登录号为85999-40-2，分子式为c30h48o4，分子量为472.70。药理学研究显示，hba具有抗肿瘤、降低阿霉素毒性、抑制血管生成等方面的作用。hba化学结构式如下。

目前关于hba的中国发明专利主要有：专利cn200710130738.x、专利cn200710130741.1、专利cn200710130739.4和专利cn03152904.6分别公开了hba在制备治疗或预防肠道肿瘤、肺癌、肝癌、脑神经胶质瘤药物中的应用；专利cn200710130740.7公开了hba在制备治疗或预防艾滋病药物中的应用；专利cn200810020381.4公开了hba在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用；专利cn200510038469.5公开了在制备血管生成抑制剂类药物中的应用；专利cn201010514113.5公开了hba降低阿霉素所致心脏毒性方面的用途；专利cn201710055361.x公开了hba在制备防治流感药物中的用途等等。本申请涉及hba在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。

技术实现要素：

一方面，本申请提供了23-羟基白桦酸(简称hba)在抗溃疡性结肠炎方面的用途，以及hba用于制备抗溃疡性结肠炎药物的用途。实验显示hba能有效改善实验性溃疡性结肠炎小鼠的包括体重下降、腹泻、血便和精神状态等多方面的一般状态、明显改善肠道病理变化、显著减轻肠道炎症反应、降低血浆炎症因子的水平等，显示出hba具有明显的抗溃疡性结肠炎作用。

hba治疗溃疡性结肠炎的优点在于作用迅速、疗效确切且药效良好。hba为药用植物中提取到的天然成分，在实验过程中未见明显副作用及毒性反应，目前有多项关于hba的医药用途的发明专利，表明了hba是一种安全有效的抗溃疡性结肠炎的药物。

另一方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含hba或其溶剂合物，以及药学上可接受的载体，所述药物组合物用于治疗溃疡性结肠炎。

再一方面，本申请提供了一种包含hba的药物组合物的制备方法，其特征在于，将hba或其药学上可接受的溶剂合物与药学上可接受的载体混合来制备，所述药物组合物用于治疗溃疡性结肠炎。

进一步详述

23-羟基白桦酸在本文中简称为hba。

本申请所述的hba的溶剂合物，是指hba与有机溶剂形成的稳定溶剂合物。有机溶剂包括常见的醇、酮、醚或水等。有效成分与水形成的溶剂合物，也称为该有效成分的水合物。

术语“药物组合物”表示包含治疗有效量的一种或多种所述有效成分及其药学上可接受的溶剂合物，与其他药学上可接受的载体的混合物。将所述化合物制备成药物组合物的目的是为了更方便地向对象给药。

本申请所述的药物组合物可以为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、糖浆剂、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂。

本申请所述的药学上可接受的载体，是药学上可接受的成分或者介质，包括但不限于溶剂、赋形剂、稀释剂、佐剂、填充剂等。常见的药学上可接受的载体包括生理盐水，缓冲剂、糖类、明胶、淀粉、林格氏溶液、纤维素等。所述载体的ph通常为3-11，优选5-9，更优选7-8。

除非在本申请中另有说明，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。

本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。

附图说明

图1为hba对葡聚糖硫酸钠(dextransulfatesodiumsalt,dss)诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重变化和dai评分的影响结果图。其中，a图为体重变化趋势的曲线图；b图为dai评分的曲线图，图中*和**为hsa组与模型组相比较，p<0.05和p<0.01。

图2为hba对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠长度影响。其中，a图为各组结肠的照片；b图为统计图，图中*和**为hsa组与模型组相比较，p<0.05和p<0.01。

图3为hba对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠h&e染色图。其中con为空白对照组，model为模型组，hba-l为低剂量hba组，hba-h为高剂量hba组。各组均是×40、×100、×200照片。

图4为hba对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠血浆炎症因子水平的影响。a图为tnf-α；b图为il-10；c图为il-6，图中*和**为hsa组与模型组相比较，p<0.05和p<0.01。

具体实施方式

本申请描述了优选的实施方式，本领域技术人员在阅读本申请的基础上，可以对本申请所述的实施方式和实施例进行适当的改变。因此，本申请请求保护的内容包括法律允许范围内对本申请权利要求书中主题的所有等同的修改和变化。

实施例

葡聚糖酸钠(简称为dss)是一种人工合成的类肝素硫酸多糖，目前常用于构建动物的实验性急慢性溃疡性结肠炎模型，因其引起的临床表现及病理改变类似于人类结肠炎而被广泛采用。

实验动物及药品：32只雄性spf级c57bl/6j小鼠(18-22g)，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：scxk(京)2014-0004。小鼠分笼饲养。适应性饲养1周，实验期间自由饮高压水和进食无菌饲料。饲养环境温度为22±2℃，相对湿度为60％，每天12小时光照和12小时黑夜循环。

供试药品：23-羟基白桦酸(hba)购自宝鸡市辰光生物科技有限公司(纯度大于98％)，溶于吐温80。葡聚糖硫酸钠(dss)购自美国mpbiomedicals公司。

实验分组：空白对照组给予1％吐温80；模型组给予4％dss；hba低、高剂量组给予4％dss以及同时给予hba(低剂量组：5mg/kg，高剂量组：10mg/kg)。每组8只小鼠。

实验过程：动物适应性喂养1周后，按体重随机分组如上所述。实验期间每日上午称重1次，记录并计算相应给药体积(0.1ml/20g)。

自实验第1天开始，连续7天：模型组小鼠自由饮用4％dss；hba低、高剂量组小鼠自由饮用4％dss以及灌胃给予低(5mg/kg)和高(10mg/kg)剂量的hba；空白对照组只给予1％吐温80。hba给予每日1次。

测试一：实验小鼠的疾病活动指数(diseaseactivityindex，dai)评分测定：每天观察小鼠精神状态、体重变化、大便性状(稀便、腹泻、血便)及死亡情况等。

dai评分按以下标准进行：

体重变化评分：体重未变化，记为0分；体重下降1-5％，记为1分；5-10％，记为2分；10-20％，记为3分；体重变化大于20％，记为4分。

大便性状评分：正常，0分；粪便较软，1分；粪便湿软2分；半稀便，3分；稀便，4分。

便潜血评分：无血便，0分；便血检测阳性，2分；肉眼血便，4分。

评分后计算3部分评分并求得平均值。dai评分的范围为0分(健康状态)-4分(严重结肠炎)。

实验结果：图1为hba对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重变化和dai评分的影响结果图。其中，图a为体重变化趋势的曲线图；图b为dai评分的曲线图，图中*和**为hsa组与模型组相比较，分别是p<0.05和p<0.01。

结果显示，hba对实验性溃疡性结肠炎模型小鼠一般状态的影响是：给予dss造模后，小鼠从第3天开始体重下降。到第4天，dss组小鼠体重明显下降且呈持续下降状态。给药组小鼠体重下降程度较模型组有所降低，如图1中a图所示。

给予dss造模期间发现，模型组小鼠出现血便，而给药组明显缓解血便症状。根据每天记录小鼠体重变化及血便症状等进行dai评分，结果如图1b所示，hba处理可显著降低dai评分。

结论：hba可显著改善dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠的dai，延缓模型小鼠体重降低。

测试二：实验小鼠的结肠观察结肠取材：实验第8天处死小鼠，剖取结肠观察结肠有无水肿、粘连、溃疡、坏死等。然后测量结肠长度并拍照，对结肠长度进行统计分析。

实验结果：图2显示了hba对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响。其中，图2中a图为处死后各组小鼠的结肠照片，每组随机抽取一只小鼠结肠为代表。图2中b图为小鼠结肠长度差异的条形图。

图2中a图、图2中b图显示：与空白对照组相比，模型组小鼠结肠显著缩短；而给予hba治疗后情况有明显改善，小鼠结肠长度均较模型组显著增长。

结论：hba可显著增加dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠长度。测试三：实验小鼠结肠h&e染色观察

实验第8天处死小鼠，剖取结肠。每只小鼠结肠取一小段置于10％甲醛中固定、石蜡包埋，用于h&e染色。

h&e染色：脱蜡(二甲苯i10min—二甲苯ii10min—无水乙醇5min—95％乙醇5min—80％乙醇5min)；蒸馏水洗10min；苏木素染10min；流水冲洗苏木素液，1％盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗10min；伊红染2min，蒸馏水稍洗；脱水(80％乙醇—95％乙醇—95％乙醇—无水乙醇—无水乙醇)；中性树胶封片，显微镜观察，拍照。

实验结果：图3为hba对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠h&e染色图。其中con为空白对照组(分别为×40、×100、×200)，小鼠结肠组织外膜、浆膜层、肌层结构完整，粘膜层杯状细胞排列整齐，形态完整；粘膜下层无水肿，无炎性细胞浸润；model为dss模型组(分别为×40、×100、×200)，结肠组织结构完整性被破坏、肌层组织水肿增大、粘膜层细胞坏死脱落、杯状细胞排列紊乱且数量减少、粘膜下层大量炎性细胞浸润，腺体结构部分甚至完全消失；hba-l和hba-h分别为hba低剂量组(5mg/kg)(分别为×40、×100、×200)和hba高剂量组(10mg/kg)(分别为×40、×100、×200)，上述结肠病变均有明显改善，病理变化明显减轻。

结论：hba可改善dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠的病理变化。

测试四：elisa法测定结肠组织的炎症因子(tnf-α、il-10和il-6)

测定方法按照试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)说明书：提前20min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。稀释标准品，按照说明书要求配置最高浓度的标准品(1000pg/ml)，随后依次倍比稀释标准品(1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0pg/ml)。样品稀释5倍(22μl品+88μl准品&标本通用稀释液)。洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30s后甩尽液体，在厚吸水纸上拍干。

空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度的标准品(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵育90min。提前20min准备生物素化抗体工作液；洗板5次。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵育60min。提前20min准备酶结合物工作液，避光室温(22-25℃)放置。洗板5次。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加酶结合物工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃避光孵育30min。洗板5次。加入显色底物(tmb)100μl/孔，36℃避光孵育15min。加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量od450值(3min内)。

实验结果：图4为hba对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠血浆炎症因子水平的影响。a图为tnf-α；b图为il-10；c图为il-6。如图4，小鼠血浆中炎症因子测定显示：与空白对照组相比，模型组的促炎炎症因子(tnf-α，il-6)水平显著增加，hba处理可显著抑制二者的升高。与空白对照组相比，模型组抗炎炎症因子il-10明显降低，hba处理可明显恢复il-10的水平。tnf-α，il-6是溃疡性结肠炎发生发展中的重要的促炎因子，而il-10是溃疡性结肠炎发生发展中的重要的抗炎因子。

结论：hba可显著改善dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠的炎症反应。

以上测试中，数据的统计学分析：各数据以均数±标准差表示，应用graphpadprism6软件制图，spss16.0软件进行统计学分析，各组间差异比较，采用单因素方差分析(one-wayanova)，方差齐时，组间两两多重比较采用lsd法；方差不齐时，组间两两多重比较采dunnett’st3法，以p<0.05为有显著性差异。

实验显示，hba能有效改善实验性溃疡性结肠炎小鼠的包括体重下降、腹泻、血便和精神状态等多方面的一般状态，明显改善病理变化、显著减轻炎症反应、降低血浆炎症因子的水平等，显示出hba具有明显的抗溃疡性结肠炎作用。