本发明属于生物医学材料
技术领域：
：，涉及一种微凝胶材料，具体涉及一种用于治疗骨科疾病的可注射水凝胶微球及其制备方法与应用。
背景技术：
：：骨科疾病是人们经常面临的一种临床性病症，例如恢复大量的骨质流失和缺陷即是现代骨科面临的挑战，在衰老和其他疾病(例如糖尿病或骨质疏松症)的情况下，这种骨科疾病修复的困难会加剧，这使难治性骨质修复成为极为棘手的医疗问题，严重危害着全球个人的健康。另外，骨关节炎(oa)也是常见的一种骨科疾病，其是一种使人衰弱的关节疾病，它的发病率随着年龄的增长而增加，主要表现为持续的疼痛和行动不便，这严重损害了个人的身体机能和生活质量。广大学者对于骨科常见疾病的治疗方法进行了大量研究，目前，间充质干细胞(msc)移植是骨组织工程最有前途的方法之一。然而msc的低递送效率和移植部位的低保留率阻碍了其临床应用。有学者发现，在难治性大量骨质流失和严重骨缺损情况下，会发生氧化应激诱导产生过量的ros，从而破坏氧化还原平衡，进而导致干细胞的结构损伤和功能障碍。由于大块水凝胶中的细胞之间的距离欠佳且小分子物质扩散程度较低，导致细胞缺乏足够的营养，细胞之间缺乏必要的相互作用，这些都不利于细胞的存活和功能发挥。另外，尽管可以通过利用剪切稀化交联方式实现大块水凝胶注射，但在注射过程中产生的剪切力也会损害细胞活力。目前，通过关节内注射递送药物，增加局部药物浓度，减少全身不良反应，是oa治疗中最具吸引力的方法之一。然而，大多数药物的递送效率不高，且在关节中的保留时间短。重复给药会严重削弱该药的功效，并增加不良事件(例如关节内出血、感染以及全身性副作用)的发生率。尽管止痛药和抗炎药(例如皮质类固醇和透明质酸)可以缓解oa症状，但它们不能逆转oa的进展。目前，在临床前阶段广泛研究的基于干细胞的疗法有望治疗oa。但是水溶液中的药物剂量相对较低，这严重降低了临床中关节内注射药物的递送效率。显然，以上问题可以通过制作水凝胶微球来解决。通过水凝胶微球递送干细胞为组织工程提供了一种极有潜力的策略，与大块水凝胶相比具有显著优势，比如灵活的可注射性和更好的细胞存活微环境。这些水凝胶微球具有大的表面积与体积之比，可以改善营养物质的转移和细胞-细胞/与细胞-基质之间的接触，从而促进种植细胞的长期存活和生长。更重要的是，使用水凝胶微球进行细胞递送可以降低细胞注射过程中剪切力的损害。由于这些优点，水凝胶微球目前在生物医学应用中引起了极大的关注。然而，疾病状态下的ros微环境不仅损害机体固有干细胞的再生潜能，而且降低了骨缺损区种植的干细胞的治疗效果。产生的过量ros或者抗氧化剂不足使得这些骨缺损难以愈合。因此，对于难治性骨愈合的治疗，迫切需要新的策略来优化干细胞递送，从而促进ros微环境中的骨再生。微流体是指体积在10-18～10-9的流体，使用的通道尺寸从几十到几百μm不等，近十几年来，微流体技术的化学合成和材料合成技术得到迅猛发展。自2005年起研究发现采用乳化法能够制备各种具有不同组成的单分散片状聚合物颗粒，先将单体与光引发剂及各种添加剂混合，再乳化，或固化液滴前驱体，或直接由光引发聚合，可以合成微凝胶，其颗粒粒径在几十纳米到几百微米之间，比液滴的直径小5％～10％。由于细胞的行为受细胞之间的距离及其结构排列的影响，因此必须将这些水凝胶微球的大小和大小分布严格控制在一定范围内，以维持促进高细胞活力的微环境。微流体技术具有更好的粒径控制、更窄的粒径分布和更高的可重复性，在制备具有一定尺寸的单分散水凝胶微球方面具有显着优势，这对于维持有利于细胞存活的微环境至关重要。明胶甲基丙烯酰(gelma)是一种具有出色生物相容性的光敏水凝胶材料，由于其固有的生物活性和可调节的理化性质而被广泛用于组织工程中。通过调节明胶和甲基丙烯酰基的比例可以实现调控gelma的化学性质。在紫外线或可见光照射下，gelma通过光化学交联反应形成块状水凝胶，其外部整体结构是毫米级，而内部网络多孔基质处于纳米级，可以有效将纳米材料(例如脂质体)缠结其中，同时允许小分子在其中扩散。但是，如果没有特别的技术改进(例如原位交联或剪切稀化交联)，块状的gelma水凝胶很难实现微创注射应用。结合以上背景，如何提供一种基于微流控技术制备的新型可注射水凝胶微球，以将其很好应用于骨科疾病的修复和治疗，不仅实现有效清除过量ros，为间充质干细胞的存活创造良好的微环境，促进间充质干细胞的成骨分化；同时还能够实现提高药物负载的稳定性，实现药物的控制释放，以期能够很好用于骨科疾病的治疗，成为现阶段亟待解决的技术问题。技术实现要素：本发明目的就是为了解决上述现有技术中的问题，而提供一种用于治疗骨科疾病的可注射水凝胶微球及其制备方法与应用。本发明提供了一种针对骨科常见疾病能够有效进行治疗和修复的可注射水凝胶微球，且本发明的制备方法简单，所制得的水凝胶微球能够有效清除ros，为间充质干细胞的存活创造良好的微环境，促进间充质干细胞的成骨分化；同时还能提高药物负载的稳定性，实现药物的控制释放，能够起到很好的治疗和修复骨科疾病的作用。本发明的目的之一是提供一种用于治疗骨科疾病的可注射水凝胶微球的制备方法，其包括以下步骤：以光交联水凝胶gelma微球作为基质，将具有增强生物反应活性的物质掺入gelma微球中，采用微流控技术制备得到功能化的水凝胶微球；其中，所述骨科疾病包括难治性骨愈合或骨关节炎；所述具有增强生物反应活性的物质包括富勒醇纳米晶体、负载有kgn的脂质体、由多巴胺甲基丙烯酰胺与磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯得到的共聚物中的任一种；其中，所述富勒醇纳米晶体的结构式如下式(ⅰ)所示：所述kgn的结构式如下式(ⅱ)所示：所述共聚物的结构式如下式(ⅲ)所示：其中，x:y＝1:4。本发明的上述制备方法所得可注射水凝胶微球是专门针对骨科疾病的，具体包括难治性骨愈合和骨关节炎。本发明的上述三种不同复合水凝胶微球，是基于微流控技术实现的。通过控制溶剂流速、热传导效率、通道长度及形状，制备得到高度分散、大小均一和粒径可控的水凝胶微球。本发明的方案之一是将微流体技术用于促进富勒醇的反应活性，同步实现制备单分散水凝胶微球和高度分散的富勒醇纳米晶体。因此，本发明通过制备含有高度分散的富勒醇纳米晶体的水凝胶微球来优化富勒醇/水凝胶体系，通过该水凝胶微球体系不仅有利于干细胞的递送，而且还提高了富勒醇的反应活性，从而促进ros微环境中的骨缺损修复。富勒醇是一种很强的抗氧化剂，是c60的衍生物之一。与其他碳纳米材料(比如碳纳米管和石墨烯)相比，富勒醇的细胞毒性低得多。富勒醇的抗氧化性能很大程度上取决于羟基及其在c60球上的位置。尽管目前还不清楚富勒醇清除ros的具体机制，但主流的“内笼捕获”理论认为ros通过π-π作用粘附在富勒醇缺电子表面，并通过将电子转移到内笼而被破坏。与超氧化物歧化酶的ros清除机制相似。通过清除病理状态下的过量ros，富勒醇在对细菌感染、化疗副作用和急性心肌梗塞等多种疾病模型表现出很好的治疗效果。同时，富勒醇可以增强间充质干细胞的成骨分化，促进骨组织再生修复。由于存在多个羟基，富勒醇在水溶液中的溶解性较好，这有利于制备制备均质水凝胶。但是，由于c60球的大尺寸和高刚度，水溶液中的富勒醇纳米晶体倾向于自组装成较大的聚集体。c60球团聚后，局部形成疏水域，导致可用于反应的表面积减少，从而削弱了其在水溶液中的反应活性。因此，基于微流控技术制备的富勒醇/水凝胶微球体系为提高富勒醇反应活性提供了一种高效简便的方法。本发明的方案之二中，脂质体是典型的双层膜结构，既可以将亲水性药物包裹在核心中，又可以将疏水性药物包裹在双层脂膜中。但传统脂质体在体内容易被网状内皮系统清除，并在生理条件(例如温度和ph)改变时易于聚集成团，从而导致结构不稳定和药物快速泄漏。尽管修饰的脂质体(例如聚乙二醇修饰的脂质体)在体内具有更好的稳定性并具有较长的体内循环时间，但它们不能在局部长时间滞留。相反，水凝胶的结构稳定，生物相容性好，适合局部给药。然而，亲水性水凝胶不能包封疏水性kgn，也不能实现kgn的缓慢控释。本发明通过负载有kgn的脂质体与水凝胶微球交联，获得的水凝胶/脂质体复合系统可以有效地兼顾两者的优点，即：(i)脂质体的存在增强了kgn的包封率和缓慢控释；(ii)水凝胶基质的缠结增强了脂质体的结构稳定性，提高了局部kgn的浓度，同时降低全身不良反应。纳米级大小的脂质体以均匀分散的状态被缠结在水凝胶微球基质中，避免了脂质体之间的聚集和融合。另外，水凝胶基质中的某些元素(例如氮和氧)可与脂质体的磷脂形成氢键。这些氢键可以进一步将脂质体固定在水凝胶中。利用该方案，获得了可以有效治疗和缓解骨关节炎的水凝胶/脂质体复合微球长效递药体系。本发明的方案之三，是使用微流体乳液法和光化学交联法制备了粒径可控、大小均一和高度分散的水凝胶微球，然后通过表面接枝多巴胺甲基丙烯酰胺-磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(dma-sbma)共聚物，增强了水凝胶微球的润滑性能，同时实现了对抗炎药物的缓慢控释。制得了可以用作缓解骨关节的新型高效的可注射生物润滑剂。具体的，本发明的方案之一中，所述骨科疾病为难治性骨愈合；所述具有增强生物反应活性的物质为富勒醇纳米晶体；所述富勒醇通过水凝胶微球基质网络的物理缠结和水凝胶基质与富勒醇之间的非共价作用，实现固定于水凝胶微球内部之中。具体的，所述功能化的水凝胶微球为富勒醇功能性微流控球，记为fms。本发明的方案之二中，所述骨科疾病为骨关节炎；所述具有增强生物反应活性的物质为负载有kgn的脂质体；所述脂质体通过物理网络缠结和非共价相互作用固定于在水凝胶微球内部。本发明的方案之三中，所述骨科疾病为骨关节炎；所述具有增强生物反应活性的物质为由多巴胺甲基丙烯酰胺与磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯得到的共聚物，所述共聚物接枝在水凝胶微球的表面。进一步的是，本发明中所述水凝胶(gelma)的结构式如下式(ⅴ)所示：本发明的目的之二是提供一种用于治疗骨科疾病的水凝胶微球，其是由上述方法制备得到。本发明的目的之三是提供上述用于治疗骨科疾病的可注射水凝胶微球的应用，所述应用是将该水凝胶微球应用于制备骨相关疾病的药物中。具体的，所述应用包括将该水凝胶微球作为干细胞载体制备成用于原位调节难治性骨愈合中的氧化还原稳态的药物。本发明的水凝胶微球可以用作具有骨诱导特性和ros清除能力的治疗药剂，并能在体内发挥促进骨愈合效果。具体的，所述应用还包括将该水凝胶微球负载相关药物后制备成用于治疗骨关节炎的药物。本发明的水凝胶微球可以用作缓解骨关节炎进展的有效可注射关节内制剂。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)本发明提供的微凝胶材料中的fms能够有效清除ros，为间充质干细胞的存活创造良好的微环境；同时还能提高药物负载的稳定性，实现药物的控制释放，能够很好的治疗和修复难治性骨愈合；(2)本发明的水凝胶微球可以用作制备具有骨诱导特性的治疗药剂，具有在体内发挥促进骨愈合的效果；(3)本发明的水凝胶微球可以用于制备治疗骨关节炎的有效可注射关节内制剂。附图说明图1为富勒醇功能化水凝胶微球的制备和应用示意图。图2为fms理化表征的结果图。图3为fms体外降解的结果图。图4为fms的细胞相容性测试的结果图。图5为fms的抗氧化活性测试的结果图。图6为fms促进矿化细胞外基质形成的结果图。图7为fms增强alp活性的结果图。图8为fms促进成骨特异分子表达和foxo1信号激活的结果图。图9为micro-ct评估负载间充质干细胞的fms体内修复骨缺损的结果图。图10为组织形态学评估负载间充质干细胞的fms体内修复骨缺损的结果图。图11fms上间充质干细胞的成骨分化的机制示意图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述
发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例1一种水凝胶微球的制备方法，其是使用一步微流控技术和光化学交联反应将具有增强生物反应活性的高度分散的富勒醇纳米晶体掺入水凝胶微球中，构建富勒醇功能性微流控球(fms)作为干细胞载体，以原位调节难治性骨愈合中的氧化还原稳态(具体步骤如图1)。如图1所示，a)中从左到右依次为fms的三维结构、富勒醇的分子结构和明胶甲基丙烯酰基(gelma)的结构示意图。为了显示三维结构，在图中将fms的水凝胶基质网络渲染为不同的颜色。通过水凝胶基质网络的物理缠结和gelma与富勒醇之间的非共价作用，将富勒醇固定在水凝胶微球内。b)为fms的制备以及bmsc(骨髓间充质干细胞)在fms上的生长和分化的示意图。c)为负载bmscs的fms修复大鼠颅盖缺损的示意图。d)为富勒醇功能化水凝胶微球的制作和修复难治性骨愈合的示意图，图中显示富勒醇抗氧化活性和促成骨能力均得到增强，可原位调节难治性骨愈合中的氧化还原稳态。通过将上述制备得到的fms用于培养bmsc，并研究了fms的生物相容性和抗氧化活性，结果表明它们可以有效清除ros，从而为骨髓间充质干细胞(bmsc)的存活创造良好的微环境。此外，还分析了骨髓间充质干细胞的体外成骨分化，结果表明fms具有固有的骨诱导特性。最后，通过将负载bmsc的fms植入大鼠颅骨缺损模型中，研究了体内骨愈合效果，表明其能够促进体内骨愈合。实施例2对fms进行表征，结果如图2。如图2所示，a)为fms的sem图像；b)为嵌入茜素红(i)和钙黄绿素(ii)的fms的lscm图像。将茜素红和钙黄绿素掺入gelma预溶液中，然后通过光化学交联成染料标记fms。c)为fms的光镜图像。d)为fms的粒径分布。e)为fms中富勒醇纳米晶体的tem图像。将fms通过二型胶原酶溶液降解，使用tem检测水溶液中游离的富勒醇纳米晶体。f)含有不同浓度富勒醇(0、1、10、100和200μm)fms的大体照片。fms是通过改良的微流控装置制备的[1]。该装置包括水相和油相，其中水相由富勒醇和含0.5wt％光引发剂的5wt％的gelma预溶液组成，而油相则由石蜡油和5wt％span80组成。使用5wt％的gelma是考虑该浓度既不会阻碍水凝胶形成，也不会抑制细胞在水凝胶中的生长[2]。通过调整水相和油相的比例，获得直径在140μm和170μm之间的fms，该粒径范围有利于bmsc的生长[3]。水凝胶微球的多孔表面增加了细胞附着的表面积，并为细胞向内生长提供了内部空间[4]。为了研究这些fms的表面形态，将fms用液氮速冻然后冻干。通过这一过程，fms的表面形貌很大程度上得到了的保留，几乎接近于湿态。如图2a所示，fms的表面孔隙范围从几微米到几十微米不等，这适合于细胞附着和长入。但是，由于冻干的fms的易碎特性，在sem检查的样品制备过程中，大多数fms的结构都被破坏了。为了解决这个问题，在lscm下进一步观察了染料标记的fms，其中大多数fms的结构是完整的。lscm结果类似于sem检测，再次证实了fms的多孔表面形态(图2b)。使用微流控装置，获得了具有较小尺寸(平均直径约为40nm)的高度单分散的富勒醇纳米晶体(图2e)。在这种条件下，富勒醇纳米晶体的比表面积增加，获得更大的c60球暴露面积，这有利于提高富勒醇反应活性。通过目测观察，纯gelma微球是半透明的，而fms颜色随着富勒醇浓度增加而加深(图2f)，这与富勒醇水溶液相似。参考文献：[1]w.jiang,m.li,z.chen,k.w.leong,cell-ladenmicrofluidicmicrogelsfortissueregeneration,labchip16(2016)4482-4506.[2]x.zhao,etal.,injectablestemcell-ladenphotocrosslinkablemicrospheresfabricatedusingmicrofluidicsforrapidgenerationofosteogenictissueconstructs,adv.funct.mater.26(2016)2809-2819.[3]a.k.chen,s.reuveny,s.k.oh,applicationofhumanmesenchymalandpluripotentstemcellmicrocarrierculturesincellulartherapy:achievementsandfuturedirection,biotechnologyadvances31(2013)1032-1046.[4]h.tavassoli,etal.,large-scaleproductionofstemcellsutilizingmicrocarriers:abiomaterialsengineeringperspectivefromacademicresearchtocommercializedproducts,biomaterials181(2018)333-346.实施例3用胶原酶孵育fms，进行降解分析，其结果如图3。图3中，a)显微镜图像显示了5周内fms的形态变化。在早期，fms周围的细颗粒增加，后期在fms附近出现了裂纹或断裂。b)为fms的剩余重量(n＝3)。c)为5周后降解溶液中富勒醇纳米晶体的tem图像。为了评估fms作为干细胞载体修复骨缺损的能力，研究了其降解性能。先前的研究使用2uml-1的胶原酶溶液研究gelma水凝胶的降解性能[1]。但是，在2uml-1的胶原酶溶液中，fms在数小时内迅速降解，原因可能是与块状水凝胶相比，fms具有更大的比表面积，从而加快了酶降解反应。实际上，几个小时太快了，无法在体外观察到fms的动态变化，也不能代表其在体内逐渐降解的过程。通过模拟体内愈合环境[2]，将fms在低浓度(0.1uml-1)的胶原酶溶液中孵育五周(图3a)，在第一周，fms表面出现细小的降解颗粒；在第二周，fms的边缘开始破裂，裂缝增加；fms数量在第三周明显减少，在第五周完全消失。另外，fms粒径随时间延长逐渐增加，这表明fms是整体降解的。总之，fms的降解是一个缓慢，渐进和动态的过程。fms的残留重量随时间减少，这与形态变化是一致的(图3b)。另外还研究了富勒醇纳米晶体的变化，fms降解后，游离的富勒醇纳米晶体暴露于水溶液中，5周后变成了较大的颗粒(平均直径约为200nm)(图3c)，这类似于直接在水溶液中形成的纳米颗粒。这种变化的潜在机制可能是纳米颗粒本身的生长和或纳米颗粒的聚结[3，4]。参考文献：[1]x.zhao,etal.,injectablestemcell-ladenphotocrosslinkablemicrospheresfabricatedusingmicrofluidicsforrapidgenerationofosteogenictissueconstructs,adv.funct.mater.26(2016)2809-2819.[2]m.inoue,g.kratz,a.haegerstrand,m.stahle-backdahl,collagenaseexpressionisrapidlyinducedinwound-edgekeratinocytesafteracuteinjuryinhumanskin,persistsduringhealing,andstopsatre-epithelialization,j.investdermatol.104(1995)479-483.[3]n.t.thanh,n.maclean,s.mahiddine,mechanismsofnucleationandgrowthofnanoparticlesinsolution,chem.rev.114(2014)7610-7630.[4]e.m.hotze,j.y.bottero,m.r.wiesner,theoreticalframeworkfornanoparticlereactivityasafunctionofaggregationstate,langmuir26(2010)11170-11175.实施例4fms的细胞相容性测试，其结果如图4。图4中，a)为在第3、7和14天接种在fms上的bmsc的活/死染色图像。活细胞为绿色，死细胞为红色(黑白图未标出)。b)为在第14天接种在fms上的bmsc的lscm图像。核为蓝色(dapi)，细胞骨架为红色(phalloidin)(黑白图未标出)。c)为cck-8分析显示在第1、4和7天接种在fms上的bmsc的增殖状态。d)为在第1、4、7和14天负载bmsc的fms的光镜图像。(n＝3，*和#分别表示第7天与第1天和第4天相比，p<0.05)。先前研究表明富勒醇对多种细胞具有剂量依赖性的细胞毒性[1]。实际上，多种因素(例如，细胞类型，溶解介质，纳米颗粒的大小和富勒烯衍生基团的数量)会影响富勒醇的细胞毒性，其中细胞类型被认为是影响细胞毒性的最重要因素[2，3]。但是，多数先前的研究是关于富勒醇水溶液的细胞毒性，这与富勒醇在水凝胶中的细胞毒性不一样的。为了研究接种在具有不同浓度富勒醇的fms上的bmsc的生存活力，采用活/死细胞测定法检测活细胞和死细胞(图4a)。结果表明，在第3天时，与含有100和200μm富勒醇的fms相比，bmsc在含有0、1和10μm富勒醇的fms上保持了更好的活力，这表明高剂量富勒醇的具有一定的细胞毒性。ful0，ful1和ful10中的bmsc在第7天扩展良好，在第14天几乎覆盖了fms表面。相比之下，ful100和ful200组中的bmsc数量在第7天和第14天几乎没有增加。f-肌动蛋白染色也证实了这些结果，该染色显示了第14天fms上bmsc的形态和伸展(图4b)。此外，cck-8分析表明，在ful0，ful1和ful10组中，bmsc的增殖活性相似，而在ful100和ful200组中，bmsc的增殖活性明显削弱(图4c)。此外，在不同培养时间里，光镜下也观察到了接种在fms(ful10)上的bmsc的形态变化(图4d)。在第1天，bmsc均匀分布在fms周围；在第4天和第7天，在fms上扩展并逐渐融合；在第14天从fms向周边生长。显然，fms上的bmsc具有很高的增殖活力。这些结果表明，含有一定浓度富勒醇(1和10μm)的fms没有细胞毒性，可以用作bmsc递送的有效载体。参考文献：[1]y.su,etal.,cellularuptakeandcytotoxicevaluationoffullerenolindifferentcelllines,toxicology269(2010)155-159.[2]c.m.sayes,etal.,thedifferentialcytotoxicityofwater-solublefullerenes,nanolett.4(2004)1881-1887.[3]n.lewinski,v.colvin,r.drezek,cytotoxicityofnanoparticles,small4(2008)26-49.实施例5fms的抗氧化活性测试，其结果如图5。图5中，a)为富勒醇纳米晶体清除细胞内和细胞外ros示意图。fsm内的富勒醇纳米晶体一方面可以清除细胞外ros，另一方面可以进入细胞清除细胞内ros。b)为不含细胞的fms的总抗氧化能力。c)为h2o2(100um)处理2h后种植在fms上的bmsc的细胞内ros(dcfh-da)的荧光图像。d)为dcfh-da荧光染色的定量分析。e)为h2o2(100um)处理12h和24h后，接种在fms上的bmsc的活/死细胞染色图像。0小时是指未经h2o2处理的对照组。f)为活/死细胞染色中的活细胞定量分析。(n＝3，*和#表示ful10组分别与ful0组和ful1组相比，p<0.05)。组织中过量ros会引起氧化应激从而损害细胞功能，导致各种疾病发生[1]。在难治性骨愈合状态下，缺损部位的ros微环境会损害机体固有和植入的干细胞。图5a显示的是ros产生的来源。除了外源性ros，ros还可以在细胞内的多个部位生成，包括线粒体、细胞质、内质网和质膜，其中线粒体不仅是细胞内ros的主要来源，还是细胞内ros的主要攻击目标[2]。为了检查fms对细胞外ros的清除能力，进行了总抗氧化能力(taoc)测定。结果表明，随着富勒醇浓度的增加，fms的toac显着增强：ful10>ful1>对照(ful0)(图5b)。然后，通过2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)氧化研究了fms对细胞内ros的清除能力。众所周知，包括富勒烯在内的纳米材料可以通过胞吞作用(受体介导和/或直接渗透)轻易进入细胞，然后易位到不同的细胞器中，从而调节细胞的生物学行为[3]。如图5a所示，富勒醇纳米晶体可以进入干细胞消除细胞内ros。结果表明，在h2o2(100μm)处理2h后，ful0组中观察到了强烈的荧光(绿色)，表明产生了大量的细胞内ros。相比之下，ful1和ful10组的荧光强度显着降低，表明fms可以有效清除细胞内ros(图5c)。同样，dcfh-da的荧光强度随富勒醇浓度的增加而降低：ful10>ful1>对照(ful0)(图5d)。此外，在h2o2(100μm)处理12h和24h后，检测bmscs的存活率，表明fms在ros环境下对bmscs具有保护作用(图5e和5f)。总之，这些结果表明了fms对细胞外和细胞内ros具有强大的清除能力，可用于改善受损组织中的氧化应激微环境，从而提高植入bmsc的存活率。参考文献：[1]s.joshi-barr,c.degracialux,e.mahmoud,a.almutairi,exploitingoxidativemicroenvironmentsinthebodyastriggersfordrugdeliverysystems,antioxid.redoxsign.21(2014)730-754.[2]f.wauquier,l.leotoing,v.coxam,j.guicheux,y.wittrant,oxidativestressinboneremodellinganddisease,trendsmol.med.15(2009)468-477.[3]l.c.cheng,x.jiang,j.wang,c.chen,r.s.liu,nano-bioeffects:interactionofnanomaterialswithcells,nanoscale5(2013)3547-3569.实施例6fms对矿化细胞外基质形成的影响，结果如图6，图中颜色越深，矿化细胞外基质形成越多。图6中，a)为在第7和14天负载bmsc的fms的光镜图像。b)为在第7和14天用茜素红s染色后负载bmsc的fms的大体照片。c)为在第7天和第14天用茜素红s染色后负载bmsc的fms的光镜图像。d)为茜素红染色的矿化细胞外基质的定量分析。(n＝3，*，#和$表示om+ful10组与gm+ful0组，om+ful0组和om+ful1组相比，p<0.05)先前研究表明了氧化应激与骨组织再生之间的联系，氧化应激会抑制成骨细胞分化，而抗氧化剂能促进成骨[1]。如图6a所示，在光镜下，矿化细胞外基质加深了fms的颜色。fms在第7天为棕黄色，在第14天变为黄褐色，表明产生了更多的矿化细胞外基质。使用茜素红s染色，矿化的结节被染成红色(图6b)，在光镜下更能清楚地观察到(图6c)。矿化细胞外基质的量随培养时间和富勒醇浓度而增加。与纯gelma微球组相比，接种在fms(ful1和ful10)上的bmsc可以产生更多的矿化细胞外基质。对矿化细胞外基质的定量分析得到一致的结果(图6d)。参考文献：[1]f.atashi,a.modarressi,m.s.pepper,theroleofreactiveoxygenspeciesinmesenchymalstemcelladipogenicandosteogenicdifferentiation:areview,stemcellsdev.24(2015)1150-1163.实施例7fms对bmsc的alp活性的影响，其结果如图7，其中颜色越深，代表alp活性越高。图7中，a)为在第4天和第7天，对负载bmsc的fms进行alp染色的光镜图像。b)为在第4天和第7天，对负载bmsc的fms进行alp染色的大体照片。c)为bmsc的alp活性的定量分析。(n＝3，*，#和$表示om+ful10组分别与gm组，om组和om+ful1组相比，p<0.05)在第4天和第7天，对负载bmsc的fms进行alp染色(图7a和7b)。观察到随着培养时间延长，alp表达增加。ful10组的alp表达最高，其次是ful1组。在alp活性的定量分析中得到了一致的结果(图7c)。这些结果表明了fms具有优异的骨诱导性能，可用于促进bmsc的成骨作用。实施例8fms对成骨分子表达和foxo1信号通路激活的影响，其结果如图8。图8中，a)为在fms上培养7天的bmsc中的荧光标记的ocn(绿色)，bmp2(红色)和col1a1(黄色)的lscm图像(黑白图未标出)。b)为对成骨基因的qrt-pcr定量分析，包括碱性磷酸酶(alp)，i型胶原(col2a1)，矮子相关转录因子2(runx2)，骨钙素(ocn)和骨形态发生蛋白2(bmp2)。c)为在fms上培养7天的bmsc中的叉头盒o1(foxo1)和超氧化物歧化酶2(sod2)的qrt-pcr定量分析。d)为在fms上培养7天的bmsc中foxo1和sod2的wb图像(cful＝10μm，n＝3，*和#表示om+ful组分别与gm组和om组相比，p<0.05)。作为骨细胞特异性标志分子(比如alp，col2a1，ocn等)，在骨组织再生中起着重要作用[1]。通过测量这些骨细胞特异性基因和蛋白质的表达，以检测在fms上培养的bmsc的成骨分化效果。如图8b所示，与gelma微球组(om)相比，fms组(om+ful)中的成骨分化相关基因(包括alp，col2a1，ocn，bmp2和runx2)的表达均明显上调。此外，还检查了骨细胞特异性蛋白(ocn，bmp2和col2a1)(图8a)。结果表明，gm中的bmsc很少表达这些蛋白，而om中的表达增加。同样的，同在gelma微球上相比，接种在fms上的bmsc表现出更高的骨细胞特异性蛋白表达。为了进一步阐明fms促进成骨的潜在机制，研究了几种关键分子的表达。众所周知，过量的ros会损害干细胞的成骨，而靶向ros是改变这一过程的有效策略。在一定程度上，fms通过清除过量的ros促进bmsc的成骨作用。但是，调控间充质干细胞分化的途径是复杂的，并且还没有被完全阐释。对于大多数细胞，ros的增加会诱导细胞上调抗氧化酶(例如sod)，反之亦然。这是抵抗氧化应激的典型ros依赖性途径。然而，通过这种机制的细胞自我保护能力是有限的，不能长期抵抗ros引起的氧化应激。对于长期暴露于氧化应激的成骨细胞，还存在另外一种不依赖于ros的途径。叉头箱o1(foxo1)是重要的叉头转录因子，可通过调节超氧化物歧化酶2(sod2)来清除成骨细胞中的ros[2]。同时，它可以通过与runx2结合促进干细胞的成骨细胞分化[3]。在本研究中，分析了foxo1和sod2基因的表达(图8c)。结果表明，与在om中培养的相比，在gm中培养的bmsc呈现出较低的foxo1和sod2表达。fms中foxo1和sod2的表达明显高于gelma微球中的表达。与基因表达一致，foxo1和sod2的蛋白表达也获得了相同的趋势(图8d)。综上，这些结果初步表明，fms可以通过ros依赖性和/或非依赖性信号通路促进bmsc的成骨作用(图11)。但具体机制还需要进一步深入的研究。参考文献：[1]x.yang,c.j.li,y.wan,p.smith,g.shang,q.cui,antioxidativefullerolpromotesosteogenesisofhumanadipose-derivedstemcells,int.j.nanomedicine9(2014)4023-4031.[2]m.t.rached,a.kode,l.xu,y.yoshikawa,j.h.paik,r.a.depinho,s.kousteni,foxo1isapositiveregulatorofboneformationbyfavoringproteinsynthesisandresistancetooxidativestressinosteoblasts,cellmetab.11(2010)147-160.[3]c.c.teixeira,y.liu,l.m.thant,j.pang,g.palmer,m.alikhani,foxo1,anovelregulatorofosteoblastdifferentiationandskeletogenesis,j.biol.chem.285(2010)31055-31065.实施例9采用micro-ct评估负载bmsc的fms的体内骨修复效果，所得结果如图9所示。图9中，a)为缺损区域中新骨的micro-ct的3d重建图像(由红色虚线围起来)。b)为第8周时不同组缺损区域的骨体积分数(bv/tv)。c)为骨缺损区域的骨矿物质密度(bmd)。(cful＝10μm，n＝3，*，#和$表示gelma/ful+bmscs组分别与空白组，bmscs组和gelma+bmscs组相比，p<0.05)如图9a所示，四个组的缺损区域从边缘到中心都或多或少出现了新生骨。但空白组的缺损区域大部分是空的。相反，在其他组中，尤其是在负载bmsc的fms组中，新骨的形成显着增加。与bmscs组(12.6±2.1％)，gelma+bmscs组(23.7±2.9％)和gelma/ful+bmscs组(38.5±2.8％)相比，空白组的bv分数最低(4.1±1.5％)。表明bmscs植入可以有效促进骨愈合。gelma+bmscs组的bv分数是bmscs组的1.89倍，表明水凝胶微球在bmsc递送中具有明显优势。可能与以下因素有关：(i)gelma微球可保护bmsc免受注射过程中的剪切应力损害；(ii)提供细胞粘附和生长的部位。此外，gelma/ful+bmscs组的bv分数是gelma+bmscs组的bv分数的1.62倍，充分证明了载有bmsc的fms具有出色的体内骨缺损修复效果。这可能与以下因素有关：(i)fms促进bmsc的成骨作用；(ii)fms通过清除过量的ros改善受损的组织微环境，从而利于植入bmsc的生存和自我骨组织的修复。与bv系数一样，骨矿物质密度(bmd)在四组中表现出相似的趋势(图9c)。实施例10对负载了bmsc的fms的体内骨修复作用的组织形态学进行评价，其结果如图10。图10中，a)为脱钙骨缺损区域的h&e染色的图像。所选区域显示了纤维组织(f)，新骨(nb)和血管状结构(黑色箭头)。b)为脱钙的骨缺损区域的免疫组化图像，显示了每组中foxo1，sod2，ocn和bmp2的表达。c)为每组中foxo1，sod2，ocn和bmp2表达的半定量分析。(cful＝10μm，n＝6，*，#和$表示gelma/ful+bmsc组分别与与空白组，bmscs组和gelma+bmscs组相比，p<0.05)h&e染色可提供有关缺损修复区域的更多信息，比如新生骨，纤维组织和血管样结构。如图10a所示，可以观察到，所有组的颅骨缺损区域都有一些新生骨，这与micro-ct的结果一致。具体而言，空白组的缺损区域大部分被纤维组织覆盖，并且仅在邻近宿主骨处观察到新生骨。相比之下，在其他三个bmscs植入组中观察到了更多新形生骨和血管样结构，表明具有更好的骨组织修复效果。此外，gelma/ful+bmscs组中新生骨最多，其次是gelma+bmscs组和bmscs组。这些结果表明，负载bmsc的fms可以显着促进体内骨缺损的修复。为了进一步验证在负载bmsc的fms植入后的骨愈合过程中成骨相关分子的激活，对四组缺陷区域进行了免疫组化分析(图10b和10c)。箭头表示蛋白质的阳性表达。可以观察到，空白组很少表达骨细胞特异性蛋白(包括ocn和bmp2)，其他三组中bmp2和ocn的表达均高于空白组，这与放射学和组织学评价的结果是一致的。负载bmsc的fms组的ocn和bmp2表达量最高。此外，在fms植入后，还研究了foxo1信号通路的体内激活，空白组中foxo1和sod2的表达相对较低，其他三组中的bmsc植入增强了foxo1和sod2的表达，表明干细胞本身一定程度上可以改善氧化应激微环境。尽管bmscs和gelma+bmscs组中foxo1和sod2的表达较高，但与gelma/ful+bmscs组相比则相对较低，这表明fmss在改善体内ros微环境方面具有更出色的表现。图11为通过调节ros依赖性和/或ros非依赖性(foxo1)信号通路来调节fms上bmsc的成骨分化的示意图。示意图显示：将细胞接种在fms上，一方面，fms中的富勒醇纳米晶体可以清除细胞外和细胞内ros，从而调节ros依赖性信号传导(例如hedgehog信号通路和β-catenin/wnt信号通路)；另一方面，富勒醇可以直接进入细胞来调节ros非依赖性的foxo1/sod2信号通路。实施例11将gelma基质与负载kgn的脂质体预混在一起，通过微流控技术和光化学交联方法制备得到单分散脂质体锚定的水凝胶微球，将其用于治疗骨关节炎(oa)，表现出很好的治疗效果，该水凝胶/脂质体混合微球能够有效延缓kgn的释放，并能延长药物在关节内保留时间，对骨关节炎有很好的疗效。实施例12使用微流体乳液法和光化学交联反应制备了粒径可控、高度分散的水凝胶微球，然后表面接枝多巴胺甲基丙烯酰胺-磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(dma-sbma)共聚物。增强了水凝胶微球的润滑性能，同时实现了对抗炎药物的缓慢控释。制备了可用作缓解骨关节的新型高效的可注射生物润滑剂。当前第1页12当前第1页12