青花椒挥发油在制备抗炎或镇痛药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及九叶青花椒挥发油部位在制备抗炎或镇痛药物中的应用。

背景技术：

疼痛是与实际存在或潜在存在的组织损伤相关联的不愉快的感受或情绪体验，属于人体的主观感受。而炎症性疼痛是指由创伤、感染或关节炎所引起的组织损伤导致炎症反应发生时所引起的疼痛，主要表现为痛觉异常、自发痛、弥漫性疼痛、痛觉过敏以及伴随着一定程度的组织水肿。有数据表明，我国的慢性疼痛患者超过1亿，且人数呈上升趋势。而炎性疼痛作为一种复杂难治的慢性疼痛，病因复杂，机制不明确。它不仅会造成患者身体不适和机体障碍，长时间发作甚至会引起患者焦虑，产生不健康的心理状态，严重干扰患者正常的工作和生活，其逐渐成为一个日益严重的全球性的健康问题。

目前针对炎性疼痛主要以药物治疗为主，临床上常用的镇痛药是非甾体抗炎药(nonsteroidalantiinflammatorydrugs，nsaids)，主要是通过抑制前列腺素的合成，抑制白细胞的聚集，减少缓激肽的形成等作用发挥抗炎镇痛作用。但是由于长期服用非甾体抗炎药会产生胃肠道或过敏等一系列不良反应限制了其在临床上的应用。有数据显示，在长期口服非甾体抗炎药的患者中，大约有10％～25％的病人发生消化性溃疡，其中有小于1％的患者出现严重的并发症如出血或穿孔。中国传统中医药经过数百年的临床检验，其有效性和安全性有着十分充足的保障，因此，从天然药物中寻找高效、低毒的抗炎镇痛类药物具有十分广阔的应用前景。

花椒为芸香科植物青椒(zanthoxylumschinifoliumsieb.etzucc.)或花椒(zanthoxylumbungeanummaxim.)的干燥成熟果皮，有着药食同源的特点。其浓郁的芳香味和麻舌的口感，使其成为烹调常用的佐料；同时作为一味传统中药,花椒性味辛、温，入脾肾经，有温中散寒、除湿止痛、杀虫解毒、利尿消肿、止痒解腥等功效。其中，花椒的挥发油主要来自于花椒的果皮部分，作为评价花椒质量的一种重要的指标性成分，它不仅是花椒香气的主要来源，而且在药效方面也有很大的用途，使其成为花椒相关研究关注的重点。

九叶青花椒(zanthoxylumarmatumdc.var.novemfoliushongpingdeng)为花椒属植物竹叶花椒(z.armatum)的变种，因其幼苗与幼树叶片多至九片故得名“九叶青”。九叶青花椒为国家地理标志产品，果实清香，果皮青绿，麻味醇正，主产于重庆市江津区，是江津区的主要经济作物之一，种植面积约为3.33万公顷，产量超过4万吨，总收入超过20亿元。

但现阶段针对于九叶青花椒的研究主要集中于栽培技术方面，未见九叶青花椒挥发油在抗炎镇痛的药理活性方面的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种青花椒挥发油在制备抗炎或镇痛药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

青花椒挥发油在制备抗炎或镇痛药物中的应用。

优选的，所述青花椒挥发油为青花椒粉碎后，加入水，然后在油浴下提取，提取物蒸馏除水制得。

优选的，所述青花椒挥发油为青花椒粉碎后，加入相当于青花椒量6倍的水，然后在130℃油浴下提取6h，提取物蒸馏除水制得。

优选的，青花椒挥发油在制备改善二甲苯致耳肿胀或角叉菜胶致足肿胀的药物中的应用。

优选的，青花椒挥发油在制备改善角叉菜胶诱导足肿胀动物足部组织中炎症因子异常中的应用。

优选的，所述炎症因子指标包括tnf-α、il-6和il-1β。

优选的，青花椒挥发油在制备改善醋酸诱导的扭体反应和福尔马林诱导的舔足反应中动物行为学的应用。

优选的，青花椒挥发油在制备降低福尔马林致痛动物模型血清中致痛因子含量中的应用。

优选的，所述致痛因子指标包括5-羟色胺、缓激肽、p物质和前列腺素e2。

优选的，所述青花椒挥发油化学成分主要化合物为烷烃类化合物，包括芳樟醇和d-柠檬烯，β-月桂烯，1-甲基-3-(1-甲基乙基)-苯，侧柏酮，乙酸芳樟酯，石竹烯，葎草烯，β-古巴烯，1,6,10-dodecatrien-3-ol,3,7,11-trimethyl-,(e)-，α-松油醇，3-cyclohexen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)-,(r)-，4-isopropyl-1-methylcyclohex-2-enol，γ-松油烯，bicyclo[3.1.0]hex-2-ene，2-methyl-5-(1-methylethyl)-，(1r)-2,6,6-trimethylbicyclo[3.1.1]hept-2-ene，bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-(1-methylethyl)-，bicyclo[3.1.1]heptane,6,6-dimethyl-2-methylene-,(1s)-。

本发明的有益效果在于：本发明公开了青花椒挥发油部位在制备抗炎镇痛药物中的应用，研究发现青花椒挥发油部位可以减轻二甲苯诱导的耳肿胀，以及角叉菜胶诱导的足肿胀，并改善角叉菜胶诱导的tnf-α、il-6、il-1β等炎症因子表达异常的情况，表明九叶青花椒挥发油部位具有直接抗炎作用。同时，九叶青花椒挥发油部位对醋酸引起的扭体反应和福尔马林引起的舔足反应具有抑制作用，并降低福尔马林诱导的5-羟色胺、缓激肽、p物质和前列腺素e2等致痛因子的释放，表明九叶青花椒挥发油部位具有镇痛作用，其镇痛作用可能与其具有抗炎作用和抑制炎性物质的释放有关，以上研究结果为抗炎镇痛药物的应用提供了新选择。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为九叶青花椒挥发油部位经gcms分析后得到的总离子图及化学成分表，色谱-质谱条件：采用rtx-5毛细管柱，柱始温度50℃，保持2min，以3℃/min程序升温至130℃，保持2min，再以4℃/min升温至200℃，保持2min，再以20℃/min升温至230℃，保持5min；载气为高纯度氦，柱前压53kpa，分流比80：1，进样口与接口温度均为230℃，电离方式ei，扫描范围(m/z)50-550，采集方式为全扫描模式。

图2为九叶青花椒挥发油部位对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀的影响(n＝8)(control：空白对照组，model：二甲苯模型组，indometacin：5mg/kg吲哚美辛组，oil-l：九叶青花椒挥发油部位低剂量组(100mg/kg)，oil-m：九叶青花椒挥发油部位中剂量组(200mg/kg),oil-h：九叶青花椒挥发油部位高剂量组(300mg/kg)；++p<0.01，与空白组相比；*p<0.05，与模型组相比；**p<0.01，与模型组相比)。

图3为九叶青花椒挥发油部位对角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀的影响(++p<0.01，与空白组相比；*p<0.05，与模型组相比；**p<0.01，与模型组相比；a：足肿胀图；b：统计数据)。

图4为九叶青花椒挥发油部位对角叉菜胶诱导的小鼠足部组织中炎症因子表达量的影响(++p<0.01，与空白组相比；*p<0.05，与模型组相比；**p<0.01，与模型组相比；a：tnf-α；b：il-6；c：il-1β)。

图5为九叶青花椒挥发油部位对醋酸所致小鼠扭体反应的影响(++p<0.01，与空白组相比；*p<0.05，与模型组相比；**p<0.01，与模型组相比；a：扭体潜伏期；b：扭体次数)。

图6为九叶青花椒挥发油部位对福尔马林致痛小鼠舔足反应总时间的影响((control：空白对照组，model：模型组，celecoxib：25mg/kg塞来昔布组，oil-l：九叶青花椒挥发油部位低剂量组(100mg/kg)，oil-m：九叶青花椒挥发油部位中剂量组(200mg/kg),oil-h：九叶青花椒挥发油部位高剂量组(300mg/kg)；++p<0.01，与空白组相比；*p<0.05，与模型组相比；**p<0.01，与模型组相比；a：第一时相；b：第二时相)。

图7为九叶青花椒挥发油部位对福尔马林诱导的小鼠模型血清中致痛因子含量的影响(++p<0.01，与空白组相比；*p<0.05，与模型组相比；**p<0.01，与模型组相比；a：5-ht；b：bradykinin；c：substancep；d：pge2)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、九叶青花椒挥发油部位的制备方法

九叶青花椒粉碎成粗粉，加入相当于药材重量6倍的去离子水，在130℃油浴条件下，采用水蒸馏装置加热回流提取6小时，得挥发油部位提取物。对该部位进行gcms分析，谱图结果如图1和表1所示，共分离得到了19个化合物，可反映九叶青花椒挥发油主要化学成分情况，主要化合物为烷烃类化合物，芳樟醇和d-柠檬烯。

表1、九叶青花椒挥发油主要化学成分

实施例2、九叶青花椒挥发油部位抗炎镇痛的药效学研究

1、二甲苯致耳肿胀实验(抗炎实验)

(1)选取体重为(18-22g)的spf级昆明雄性小鼠48只，进行为期一周的适应性喂养，饲养期间温度25±1℃，循环光照12h，黑暗12h。适应性喂养一周后，随机选取其中一组作为正常对照组(control)，其余组分别为模型组(model)、阳性药吲哚美辛组(indometacin)、oil-l组(挥发油部位提取物低剂量组)、oil-m组(挥发油部位提取物中剂量组)、oil-h组(挥发油部位提取物高剂量组)剂量分别设置为100mg/kg、200mg/kg和300mg/kg，阳性药吲哚美辛的剂量为5mg/kg。

(2)分别按照上述给药剂量在相同的时间连续灌胃小鼠7天，control组和model组则给予相同体积的1.5％的吐温80生理盐水溶液。

(3)第8天，各组末次给药1h后，除control组，每组小鼠右耳耳廓处涂抹约30μl二甲苯，control组小鼠右耳耳廓处均涂抹约相同体积的生理盐水；1h后，脊椎脱臼法处死小鼠，剪下小鼠的左耳和右耳；用直径为7mm的圆形打孔器切下相同面积的耳片，然后称量；耳肿胀程度可通过右耳片重量减去左耳片重量进行评估。

二甲苯诱导的小鼠耳肿胀程度由涂抹二甲苯的右耳与涂抹生理盐水的左耳重量的差值作为参数，实验结果表明九叶青花椒挥发油部位可以有效改善二甲苯致小鼠耳肿胀的情况。如图2所示，与control组相比，model组中小鼠两耳片重量差值显著增高(++p<0.01)；而与model组相比，oil-l、m、h组和吲哚美辛阳性药组均能有效降低小鼠两耳片重量的差值(*p<0.05；**p<0.01)。

2、角叉菜胶致足肿胀实验(抗炎实验)

基础实验操作如1中(1)、(2)所述，在第8天末次给药1h后，除control组，每组小鼠右足足跖处均皮下注射50μl1％角叉菜胶，control组每只小鼠右足足跖处注射50μl的生理盐水，各组小鼠于注射后第5h用游标卡尺小鼠右足足趾厚度，测量时，用记号笔分别绕每只小鼠右后足相同部位处做记号，读数时每只小鼠右后足读取两次，取平均值。

脊椎脱臼法处死小鼠后，取小鼠右足足跖部位组织，采用玻璃匀浆器进行组织匀浆后按照elisa试剂盒说明书检测炎症因子tnf-α，il-6，il-1β的表达量。

角叉菜胶诱导的足肿胀小鼠的肿胀率由注射角叉菜胶的右足与注射生理盐水的左足重量的差值除以左足重量作为参数，实验结果表明九叶青花椒挥发油部位可以有效改善角叉菜胶致小鼠足肿胀的情况。如图3所示，与control组相比，model组中小鼠肿胀率显著增高(++p<0.01)；而与model组相比，oil-l、m、h组和吲哚美辛阳性药组均能有效降低小鼠的肿胀率(*p<0.05；**p<0.01)。

同时，九叶青花椒挥发油部位可以降低角叉菜胶诱导的小鼠足部组织中炎症因子tnf-α，il-6，il-1β的表达来改善小鼠的炎症状态。如图4显示，与control组相比，model组足部组织中tnf-α，il-6，il-1β的表达量显著性的升高(++p<0.01)；与model组比较，九叶青花椒挥发油部位各剂量组和吲哚美辛阳性药组的tnf-α，il-6，il-1β的表达量显著性的降低(*p<0.05；**p<0.01)。

以上实验结果表明，九叶青花椒挥发油部位可明显降低角叉菜胶诱导的足肿胀小鼠的肿胀率，并逆转角叉菜胶诱导的炎症因子的异常表达，来改善小鼠的验证状态，并呈剂量依赖性关系。

3、醋酸扭体实验(镇痛实验)

基础实验操作如1中(1)、(2)所述，在第8天末次给药1h后，除control组，每组小鼠腹腔注射0.6％的醋酸(0.1ml/10g)溶液造模，记录注射后20min内各组小鼠第一次出现完整扭体反应的时间的扭体次数(以腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高为标准)。

醋酸经腹腔注射后会引起小鼠出现扭体反应，具体表现为腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高等，以小鼠腹腔注射醋酸后第一次出现扭体反应的时间为扭体潜伏期，并以20min内小鼠出现完整扭体反应的次数作为参数。结果表明九叶青花椒挥发油部位能够显著增加小鼠的扭体潜伏期和减少小鼠的扭体次数。实验结果如图5所示，与control组相比，model组中小鼠的扭体潜伏期显著降低，扭体次数显著增加(++p<0.01)；而与model组相比，oil-l、m、h组和吲哚美辛阳性药组均能有效增长小鼠的扭体潜伏期和减少扭体次数(*p<0.05；**p<0.01)。

4、福尔马林实验(镇痛实验)

(1)选取体重为(18-22g)的spf级昆明雄性小鼠48只，进行为期一周的适应性喂养，饲养期间温度25±1℃，循环光照12h，黑暗12h。适应性喂养一周后，随机选取其中一组作为正常对照组(control)，其余组分别为模型组(model)、阳性药塞来昔布组(celecoxib)、oil-l组、oil-m组、oil-h组，低(l)，中(m)，高(h)剂量分别设置为100、200和300mg/kg，阳性药塞来昔布的剂量为25mg/kg。

(2)分别按照上述给药剂量在相同的时间连续灌胃小鼠7天，control组和model组则给予相同体积的1.5％的吐温80生理盐水溶液。

(3)第8天，各组末次给药1h后，将小鼠置于一个透明玻璃大烧杯(专门装置或大烧杯)中任其自由活动探寻适应环境30min。造模开始时，control组小鼠注射20ul生理盐水，其余各组用微量注射器在每只小鼠右足足底皮下注射20μl2％的福尔马林溶液进行造模，之后立即置于透明玻璃大烧杯中，记录注射福尔马林溶液之后小鼠舔足或者咬足的时间，福尔马林试验包括两个阶段，0-5分钟，属于第一时相的中枢镇痛活性，10-40分钟，属于第二时相的外周镇痛活性，记录0～5min和10～40min内各组小鼠的舔足或咬足的总时间。

(4)血清样本制备：收集到的小鼠血液静置45分钟，用台式冷冻离心机在4℃、10000r/min条件下离心10min，取上清液，得到血清样本。

(5)血清生化指标测定：采用elisa试剂盒测定血清中5-ht、bradykinin、substancep和pge2的含量。

小鼠足部注射福尔马林溶液后会引起持续性的组织损伤，导致小鼠出现舔足或者咬足的现象，以小鼠右足后足注射福尔马林溶液后在0-5min和10-40min两个阶段舔足或咬足的总时间作为参数。实验结果表明九叶青花椒挥发油部位能够有效降低福尔马林诱导的小鼠在第二时相的舔足时间。如图6所示，与control组相比，model组小鼠在第一时相和第二时相中的舔足时间均显著升高，(++p<0.01)；而与model组相比，九叶青花椒挥发油部位对第一时相小鼠的舔足行为仅在高剂量中表现出显著性(*p<0.05)，但对第二时相小鼠的舔足行为，所有剂量均表现出显著性(*p<0.05；**p<0.01)。

同时，九叶青花椒挥发油部位可以降低福尔马林致痛小鼠模型血清中致痛因子5-ht、bradykinin、substancep和pge2的含量来改善小鼠的疼痛状态。如图7显示，与control组相比，model组血清中5-ht、bradykinin、substancep和pge2的含量显著性的升高(++p<0.01)；与model组比较，九叶青花椒挥发油部位各剂量组和塞来昔布阳性药组的5-ht、bradykinin、substancep和pge2的含量显著性的降低(*p<0.05；**p<0.01)。

以上实验结果表明，九叶青花椒挥发油部位可明显抑制福尔马林诱导的致痛小鼠模型在第二时相中的舔足行为，并降低福尔马林诱导的致痛因子在血清中的含量，来改善小鼠的疼痛状态，并呈剂量依赖性关系。

综上所述，本发明表明九叶青花椒挥发油部位具有抗炎镇痛的作用。主要是通过降低炎症因子tnf-α，il-6，il-1β和致痛因子5-ht、bradykinin、substancep、pge2的表达，来改善炎性疼痛状态，起到抗炎镇痛的作用。本发明拓宽了九叶青花椒极其挥发油部位的应用范围，为抗炎镇痛药物提供了新选择。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。