丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应用。

背景技术：

丹参(salivamiltiorrhiza)为唇形科鼠尾属植物丹参的干燥根茎。《明理论载》言：“一味丹参，功兼四物”，《本草纲目》云：“活血，通心包络。治通”，具有祛瘀止痛、活血通经等功效，是中药学中应用较广、价值较高的药物之一。近年来，随着对丹参化学成分及药理作用与临床研究的广泛深入，鉴定出丹参中包括脂溶性以及水溶性成分共约30余种，其中的脂溶性成分主要为丹参酮类，水溶性成分为丹参酸类，主要包括丹参素、原儿茶醛和丹参酸甲、乙、丙等。丹参的脂溶性成分一直是研究热点，被报道具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤以及类雌激素样作用等，近年来发现丹参水溶性成分具有抗凝血、抗缺血、抗炎症、抗菌以及增强免疫力等作用，尤其是水溶性含量最高的药效成分丹参素在多种生理过程中皆具有杰出功效，受到越来越多的重视。

丹参素(salvianicacida，saa)化学名称为[d-(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸]即[d-(+)-β-(3,4-dihydroxyphenyl)lacticacid]，分子量及分子式分别为198.17和c9h10o5，是一种游离酸，性质容易不稳定，故研究中常将其制成钠盐即丹参素钠(salvianicacidasodium，saas)以提高其稳定性和纯度。研究表明丹参素可通过tgf-β-smad3通路抑制肺动脉平滑肌细胞增殖进而预防大鼠缺氧性肺动脉高血压；也有报道丹参素通过抑制jak2/stat3通路而抑制肝纤维化，以及通过激活sirt1/foxo1/rab7信号通路改善心肌缺血再灌注损伤。这些研究说明丹参素可通过调节机体内不同的信号通路而影响众多生理进程，但是目前关于丹参素对于腰椎小关节骨关节炎(lfjoa)的作用以及机制并不清楚。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应用，腰椎小关节骨性关节炎及下腰痛患者提供安全且效果显著的治疗手段

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应用。

优选的，所述丹参素能够提高软骨细胞数量，保持软骨表面光滑，降低腰椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子的表达量。

优选的，所述炎症因子包括il-1β、tnf-α和il-6。

优选的，所述丹参素能够抑制软骨细胞凋亡以及成纤维样滑膜细胞炎症反应。

本发明还提供了一种缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物，所述药物的有效成分包括丹参素。

优选的，所述丹参素包括丹参素盐。

本发明提供了丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应用。本发明实施例通过在体实验观察到丹参素钠处理后可显著提高软骨细胞数量，软骨表面相对光滑，并且腰椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子如il-1β、tnf-α、il-6等表达显著降低；离体细胞实验进一步证实丹参素钠能够抑制tnf-α诱导的软骨肉瘤细胞sw1353凋亡，并且能够缓解tnf-α刺激的原代成纤维样滑膜细胞的炎症反应。因此丹参素能够起到抑制软骨细胞凋亡以及成纤维样滑膜细胞炎症反应的协同干预作用，从而缓解lfjoa的发生发展。另外，丹参素可通过上调腰椎小关节内trip的表达，促进rip1蛋白的降解，进而抑制软骨细胞中tnfr1通路介导的软骨细胞凋亡，以及成纤维样滑膜细胞中nf-κb通路介导的炎症反应，从而发挥协同干预作用缓解腰椎小关节骨关节炎(lfjoa)。

附图说明

图1为番红固绿染色检测丹参素钠对在体lfjoa模型关节软骨的影响，其中左侧图为对照组，中间图为退变组，右侧图为丹参素钠干预组；

图2为qpcr与elisa法检测丹参素钠对在体lfjoa模型成纤维样滑膜细胞中炎症因子的影响；

图3为流式细胞检测丹参素钠抑制tnf-α诱导的软骨肉瘤细胞sw1353的凋亡；

图4为qpcr与elisa法检测丹参素钠对tnf-α诱导的原代成纤维样滑膜细胞中炎症因子的影响；

图5为丹参素钠对调控炎症反应关键性e3连接酶的表达影响。

具体实施方式

本发明提供了丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应用。

本发明所述丹参素能够提高软骨细胞数量，保持软骨表面光滑，降低腰椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子的表达量；所述炎症因子优选包括il-1β、tnf-α和il-6。

本发明所述丹参素能够抑制软骨细胞凋亡以及成纤维样滑膜细胞炎症反应，更具体的，所述丹参素能够抑制tnf-α诱导的软骨肉瘤细胞sw1353凋亡，并且能够缓解tnf-α刺激的原代成纤维样滑膜细胞的炎症反应。

在本发明中，所述丹参素优选包括丹参素盐，更优选包括丹参素钠。

本发明还提供了一种缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物，所述药物的有效成分包括丹参素。本发明所述丹参素优选包括丹参素盐，更优选包括丹参素钠。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，利用本领域的常规药物剂型即可。本发明所述药物中优选还包括药学上可接受的辅料。

下面结合实施例对本发明提供的丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

丹参素钠(saas)对在体腰椎小关节骨关节炎(lfjoa)模型软骨与滑膜组织的影响

(1)在体lfjoa模型分组与造模

分组：30只标记好的sd大鼠随机分3组，每组10只，分别为：对照组(sham组)、处理组(clg组)、实验组(clg+saas组)

造模：通过ii型胶原酶诱导建立lfjoa大鼠模型。将腹腔注射水合氯醛麻醉后的大鼠固定于手术台上，碘伏常规消毒。手术时在背部正中切开3cm左右切口，剥离右侧椎旁肌肉，显露右侧l3-l4,l4-l5,l5-l6三个小关节。用带有33号针头容量为10μl的微量注射器分别向处理组以及实验组的上述三个关节腔内注射6u的ii型胶原酶。逐层缝合肌肉和皮肤。

其中对照组仅暴露三个小关节然后缝合，术后大鼠返回饲养间并恢复自由饮食，6小时后处理组腹腔注射生理盐水；实验组腹腔注射saas60mg/kg，每两天注射一次，saas腹腔注射剂量为60mg/kg/2天；处理组注射等剂量生理盐水。

取材：8周后，使用小动物麻醉机(2％异氟烷)进行麻醉，直到身体全身变软，用注射器针头刺入从枕骨大孔刺入大鼠大脑将其处死。处死后，在无菌条件下取完整腰椎小关节，分离出软骨组织以及滑膜组织。

(2)检测指标：

①软骨组织：常规包埋切片后，采用番红固绿、甲苯胺蓝、he染色和免疫组化方法，观察腰椎小关节内软骨组织变化。采用经典的mankin评分系统(表1)，小关节软骨染色后切片进行组织学评分。

表1mankin评分标准

②滑膜组织：

炎症因子表达情况：qpcr法检测tnf-α、il-1β、il-6的mrna表达：收集各组滑膜组织，加入适量trizol裂解液，将样品置于冰上以30％振幅超声，工作3s后间歇暂停2s，每个样品累积超声约30s左右。随后陆续以氯仿、异丙醇、酒精等试剂对总rna进行提取，并测定rna的浓度；用rt试剂盒将rna反转录为cdna，然后以cdna第1链作为模板行pcr扩增。以quantitecktmsybrgreenpcr试剂盒进行qpcr反应，qpcr反应条件：94℃预变性5min，94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；72℃延伸10min。经2^-δδct法进行数据分析。

westernblot法检测滑膜组织内nf-κb通路中的接头分子ikkβ、iκbα、p65等的蛋白磷酸化变化情况。

结果如图1和图2所示，在体实验番红固绿染色观察到丹参素钠处理后可显著提高软骨细胞数量，软骨表面相对光滑(图1)，并且腰椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子如il-1β、tnf-α、il-6等表达显著降低(图2)。

实施例2

丹参素钠(saas)对软骨细胞凋亡tnfr1通路及成纤维样滑膜细胞炎症nf-κb通路的调控作用

(1)体外细胞模型建立

①软骨瘤细胞sw1353凋亡模型

人软骨肉瘤细胞sw1353细胞以10％fbs血清+dmem培养基于37℃、5％co2培养箱中培养，50ng/mltnf-α刺激12小时后经流式细胞术、tunel染色术、caspase3/8激酶活性实验以及wb检测凋亡相关关键蛋白的表达，从而观察sw1353细胞凋亡情况。

②成纤维样滑膜细胞(flss)炎症模型

1)成纤维样滑膜细胞的分离及培养：

大鼠经麻醉处死后于超净台中暴露腰椎小关节处滑膜组织，提出多余脂肪与结缔组织后置于离心管中并用眼科剪将滑膜组织剪碎成糊状，hanks液冲洗后加入2ml0.25％胰蛋白酶并充分混匀后置于37℃、5％co2培养箱中消化20分钟。以含血清dmem培养基终止消化后，1000转/分钟离心5分钟并弃掉上清。再在离心管中加入1mg/ml胶原酶并充分混匀后置于培养箱中消化1.5小时。吹打混匀后过200目细胞筛网过滤，1000转/分钟离心5分钟后离心管底部可见白色细胞沉淀，于其中加入10％fbs+dmem培养基础重悬并置于培养瓶中培养。4小时后细胞完全贴壁即可换液，贴壁细胞即为成纤维样滑膜细胞。

2)通过tnf-α诱导成纤维样滑膜细胞(flss)炎症模型：

从正常未处理的大鼠腰椎小关节分离出滑膜组织并体外培养成纤维细胞，培养条件同上。50ng/mltnf-α刺激8小时后利用qpcr、elisa以及wb等检测fls细胞炎症情况。

③分组

1)软骨瘤细胞sw1353凋亡模型：对照组(sw1353细胞)，tnf-α刺激组(tnf-α+sw1353细胞)，saas处理组(2.5、5、10μmsaas+tnf-α+sw1353细胞)

2)成纤维样滑膜细胞(flss)炎症模型：对照组(flss)，tnf-α刺激组(tnf-α+flss)，saas处理组(2.5、5、10μmsaas+tnf-α+flss)

(2)检测指标：

①软骨细胞凋亡检测

流式细胞术、tunel试剂盒测定软骨细胞凋亡情况如图3所示。

②成纤维样滑膜细胞炎症及nf-κb信号通路检测

qpcr与elisa法检测flss细胞模型中，各处理flss内炎症相关蛋白il-1β、il-6、mmp1表达情况如图4所示。

综上可知，在体实验番红固绿染色观察到丹参素钠处理后可显著提高软骨细胞数量，软骨表面相对光滑，并且腰椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子如il-1β、tnf-α、il-6等表达显著降低。

实施例3

体外细胞实验进行e3连接酶及靶点筛选，明确丹参素钠(saas)对trip的调控作用，以及saas发挥协同作用的分子机制

(1)e3连接酶及靶点筛选

在sw1353细胞及原代fls细胞培养基中，加入10μmsaas后，经qpcr检测骨关节炎及凋亡相关的e3连接酶如cbl-b，trim22，trim25，trim38，trim41，trim56以及trip的mrna表达变化情况。同时在sw1353细胞以及fls细胞培养基中，加入saas梯度剂量(2.5，5，10μm)后利用wb检测e3连接酶的蛋白表达变化情况。筛选出特异性受saas调控表达的e3连接酶，即trip。

①免疫共沉淀(co-ip)

在sw1353细胞凋亡模型与flss细胞炎症模型中分别检测trip与目的靶点分子(如rip1)的结合情况。将构建好的带有flag标签的trip分子与myc标签的靶点分子，经脂质体转染入两种细胞。24小时后收集细胞并经co-ip细胞裂解液裂解，提取总蛋白后经bca蛋白测定试剂盒确定蛋白浓度并调齐，之后每个样品预留50μl作为input以确定蛋白总量一致，向剩余管体中加入flag抗体1μl后于4℃冷柜中混匀1h,再向每管中加入proteina/gagrouse珠子40μl，继续于冷柜中混匀12小时。再经离心后弃掉上清，trip-flag蛋白与目的靶点蛋白此刻应结合于珠子表面，经洗涤及重悬后，再经离心得到珠子，加入sds上样缓冲液煮沸后可进行wb检测以确定二者是否结合。

②泛素化实验

转染时同时转染泛素质粒(ha标签)，由于目的靶点分子带有myc标签，则可以通过裂解细胞后加入myc抗体，再经免疫共沉淀，待wb检测时以ha抗体或泛素抗体进行孵化并显色，得到泛素化结果。

(2)saas对trip的调控作用

在tnf-α诱导的sw1353细胞凋亡模型与flss细胞炎症模型中，通过qpcr和westernblot检测saas对于trip蛋白表达升高的调控，明确调控发生在转录水平还是蛋白修饰水平。

结果如图5所示，在sw1353细胞及原代成纤维样滑膜细胞中加入saas，saas可以特异性显著提高trip蛋白表达，且成剂量依赖趋势，而对其余几种e3连接酶表达水平无明显影响。

综上可知，丹参素通过上调腰椎小关节内trip的表达，促进rip1蛋白的降解，进而抑制软骨细胞中tnfr1通路介导的软骨细胞凋亡，以及成纤维样滑膜细胞中nf-κb通路介导的炎症反应，从而发挥协同干预作用缓解腰椎小关节骨关节炎(lfjoa)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。