一种重组腺病毒在制备预防病毒的药物中的用途的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组腺病毒在制备预防病毒的药物中的用途。


背景技术：

2.人腺病毒(humanadenovirus,hadv)是1953年首次从急性呼吸道疾病病人身上分离、鉴定出来的一类病原体，可以感染人类呼吸道、胃肠道、泌尿系统或眼部等多种组织，导致急性呼吸道感染(ari)、急性胃肠炎、肾炎、眼角膜结膜炎等多种不同疾病。
3.腺病毒是一类上呼吸道亲和性高的非整合性病毒。它能够通过car受体(coxsackie/adenovirus receptor，柯萨奇/腺病毒受体)进入上皮细胞，较容易引起呼吸道粘膜免疫反应，产生igm抗体。另外，e1与e3基因缺失的腺病毒，无法在普通细胞中扩增，能够作为携带大分子的载体。
4.目前腺病毒已经应用于多种疫苗的研发中并取得了较好的效果。
5.中国专利201610696322.3中公开了一种基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗。其公开的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒adc68基因组序列，其中e1缺失。该专利采用的黑猩猩腺病毒具有高免疫原性，不仅能诱导特异性体液免疫反应，而且能诱导特异性细胞免疫反应，此外，不会受人体内预存抗人血清型腺病毒中和抗体的影响，因此是一种理想的疫苗载体。
6.中国专利201811262788.8中公开了一种腺病毒载体系统及重组腺病毒构建方法，包括：pcr扩增获得两侧含有同源重叠区的目的基因片段，与pmei线性化的腺病毒质粒进行dna组装，得到含有外源目的基因的腺病毒质粒；或者先将多个基因片段克隆到穿梭质粒，再使用限制性内切酶切下含全部目的基因的片段，与pmei线性化的pkad5f11pes-pmei进行dna组装，获得含有外源目的基因的腺病毒质粒。
7.但目前将腺病毒应用与冠状病毒疫苗的生产中的研究较少。
8.中国专利202010193587.8中公开了一种以人5型复制缺陷腺病毒为载体的新型冠状病毒疫苗。所述疫苗以e1、e3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒e1基因的hek293细胞为包装细胞系，携带的保护性抗原基因是经过优化设计的2019新型冠状病毒(sars-cov-2)s蛋白基因(ad5-ncov)。该疫苗对2019新型冠状病毒具有良好的免疫保护效果。


技术实现要素：

9.本发明利用携带分泌肽的缺陷型腺病毒载体，使目的基因在体内表达后，能被分泌至细胞外，从而激活体液免疫。本发明可用于sars-cov-2冠状病毒疫苗的开发。
10.一方面，本发明提供了一种重组腺病毒在制备预防病毒的药物中的用途。
11.所述的重组腺病毒为e1、e3区完全缺失、部分缺失或不缺失的c亚类的5型腺病毒；所述的预防病毒的药物为预防冠状病毒的药物。
12.所述的药物中还包括所预防的冠状病毒的基因片段；所述的冠状病毒为sars-cov-2，hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov或mers-cov。
13.所述的复制缺陷型腺病毒内装cmv启动子和bgh基因polya序列。
14.所述的预防冠状病毒的药物为预防sars-cov-2冠状病毒的药物，所述的药物中包括来自sars-cov-2冠状病毒s基因的序列。
15.所述的s基因的序列为seq id no：3。
16.所述的药物中包括来自sars-cov-2冠状病毒s基因的截短体s1c序列，所述截短体的pcr引物为v1和v2，其中v1的序列为seq id no：1，v2的序列为seq id no：2。
17.所述的s1c序列的pcr产物经smai/hindiii酶切后连接至pshuttle质粒中。
18.所述的pshuttle质粒转化并经氨苄抗性筛选后，再将其与腺病毒骨架质粒pbhglox(delta)e1,3cre重组结合。
19.所述的重组结合后的腺病毒骨架质粒转染hek293细胞后表达。
20.优选地，所述的预防病毒的药物为疫苗。
21.另一方面，本发明提供了一种预防病毒的药物的制备方法。
22.所述的制备方法包括以下步骤：
23.(1)设计并合成预防的目的病毒的基因，并提取目的片段；
24.(2)将步骤(1)的基因片段与缺陷型腺病毒重组结合；
25.(3)转染包装细胞；
26.(4)空斑挑选重组腺病毒；
27.(5)经扩增、分离、纯化后，制成制剂。
28.所述的步骤(1)中的预防的目的病毒的基因为sars-cov-2冠状病毒s基因的片段。
29.可选择地，所述的步骤(1)中的提取目的片段的手段为pcr。
30.优选地，所述的sars-cov-2冠状病毒s基因的片段。所述的片段来自sars-cov-2冠状病毒s基因的截短体s1c序列，所述截短体的pcr引物为v1和v2，其中v1的序列为seq id no：1，v2的序列为seq id no：2。
31.所述的步骤(2)中复制性缺陷型病毒为e1、e3区完全缺失、部分缺失或不缺失的c亚类的5型腺病毒。
32.所述的步骤(2)为将提取的目的片段克隆到携带分泌肽的pshuttle质粒，再将其与腺病毒骨架质粒连接结合。
33.优选地，所述的腺病毒骨架质粒为pbhglox(delta)e1,3cre。
34.所述的步骤(3)中的包装细胞为整合了c亚类5型腺病毒e1区基因的细胞系或细胞株。
附图说明
35.图1为重组pshuttle的测序结果。
36.图2为sars-cov-2疫苗mrna表达情况。其中，m为marker；1为空白对照(不加模板)；2为阴性对照(模板为不接种疫苗的细胞提取的rna)；3为实验组1(模板为接种5
×
108vp/ml ad/s1c 48h后细胞提取的rna)；4为实验组2(模板为接种1
×
109vp/ml ad/s1c 48h后细胞提取的rna)；5为实验组3(模板为接种2
×
109vp/ml ad/s1c 48h后细胞提取的rna)。
37.图3为sars-cov-2疫苗蛋白表达情况。其中control为不接种疫苗的全细胞裂解液；e10a为接种其它腺病毒产品的全细胞裂解液，ad/s1c为接种2
×
109vp/ml ad/s1c 48h后的全细胞裂解液。
38.图4为sars-cov-2疫苗分泌至细胞外蛋白水平。其中，control为不接种疫苗的细胞；e10a为接种其它腺病毒产品的细胞；ad/s1c为接种2
×
109vp/ml ad/s1c 48h后的细胞；medium为细胞培养上清；whole cell为全细胞裂解液。
39.图5为sars-cov-2疫苗动物免疫中和抗体效价。
40.图6为sars-cov-2疫苗动物免疫特异抗体效价。
具体实施方式
41.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.以下实施例中：
43.pshuttle载体与病毒骨架质粒pbhglox(delta)e1,3cre购自microbix biosystems，货号为pd-01-64。
44.293细胞购自atcc，货号为crl-1573。
45.balb/c小鼠购自广东省实验动物中心。
46.实施例1sars-cov-2冠状病毒疫苗的前期构建
47.(1)对sars-cov-2冠状病毒的s基因进行优化，优化后的s基因的序列为seq id no：3。
48.(2)取得sars-cov-2s基因的优化序列后，用pcr方法对进行扩增。扩增引物为v1与v2，其各自的序列如seq id no：1-2所示，vi和v2为一对，扩增s1基因c端片段s1c。
49.(3)pcr产物经跑胶鉴定与切胶回收后，用smai与hindiii在37℃条件下进行酶切。同时用这两种酶对pshuttle载体进行酶切。
50.(4)用t4连接酶将酶切后的pcr产物与pshuttle在16℃条件进行过夜连接。
51.(5)将连接产物转化大肠杆菌dh5a，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，并挑选克隆进行菌落pcr鉴定。阳性菌落经培养后提取质粒，并送测序以确认序列。重组pshuttle的测序结果如图1所示。
52.ad/s1c：克隆到腺病毒载体中的为sars-cov-2s基因的s1c片段(955-2055)。
53.实施例2sars-cov-2冠状病毒疫苗的制备
54.(1)根据实施例1的方法获得正确的重组sars-cov-2s1c基因的pshuttle质粒后，将其与腺病毒骨架质粒pbhglox(delta)e1,3cre共同转染至293细胞中以包装重组腺病毒。
55.(2)病毒的收集采用挑空斑的方式：在培养液中加入低溶点琼脂糖，转染后一般在第10-21天可以在显微镜下看到小的空斑。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。
56.(3)将培养基中病毒加入新鲜293细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出
现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为p1代病毒。
57.(4)以p1代病毒感染293细胞，连续进行三代感染，至p4代进行病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行柱层析纯化和浓缩。
58.(5)纯化后获得的产物即为sars-cov-2疫苗。sars-cov-2疫苗包含sars-cov-2病毒s1c基因和缺陷型腺病毒。缺陷型腺病毒为e1与e3区完全缺失的c亚类的5型腺病毒，不能在普通的人体细胞内复制。
59.实施例3sars-cov-2疫苗体外表达试验
60.将实施例2中纯化获得的sars-cov-2疫苗以5
×
108vp/ml、1
×
109vp/ml、2
×
109vp/ml感染a549细胞2h后，弃去病毒悬液，加入细胞培养液，37℃、5％co2条件下培养。感染后48h收集细胞裂解液，分别用rt-pcr法检测其mrna表达水平，设置空白对照(不加模板)和阴性对照(模板为不接种疫苗的细胞提取的rna)。用western blot法检测其蛋白表达水平，设置不接种疫苗的全细胞裂解液和接种其它腺病毒产品的全细胞裂解液(广州达博生物制品有限公司)为对照。用elisa分别检测细胞培养上清和全细胞裂解液中的蛋白表达水平，设置不接种疫苗的全细胞裂解液和接种其它腺病毒产品的全细胞裂解液(广州达博生物制品有限公司)为对照。
61.结果见图2-4。
62.结果表明：sars-cov-2疫苗以1
×
109vp/ml与2
×
109vp/ml感染a549细胞后，能够检测到相应s1c抗原的mrna(图2)。此外，sars-cov-2疫苗以2
×
109vp/ml感染a549细胞后，能够检测到s1c抗原蛋白表达(图3)，且该蛋白大小为40-55kd之间。而且，elisa结果显示，本疫苗体内表达的抗原主要被分泌至细胞外(图4)，有利于诱导体液免疫。
63.实施例4sars-cov-2疫苗诱导的中和抗体效价
64.本实施例选用实施例2得到的sars-cov-2疫苗。
65.将试验对象balb/c小鼠按照下述方式分组：
66.疫苗组与生理盐水对照组。
67.给药方式：大腿内侧肌肉注射。
68.疫苗原液浓度：1
×
10
11
vp/ml。
69.小鼠剂量：1
×
109vp/只。
70.免疫程序：每6天免疫一次，共3次；分别取第12天，第18天、第24天小鼠血清。
71.安乐死取血程序：分别取第12天，第18天、第24天小鼠血清。
72.中和抗体效价检测方法：sars-cov-2假病毒中和法。
73.结果见图5。
74.该结果表明：将小鼠免疫血清稀释25倍后，小鼠免疫12天的血清能够中和59％的sars-cov-2假病毒，免疫18天的血清能够中和65％的sars-cov-2假病毒，免疫24天的血清能够中和91％的sars-cov-2假病毒。总体而言，ad/s1c疫苗能够在小鼠体内诱导出高效价的sars-cov-2中和抗体，且第12天即能够检测到中和抗体的产生。
75.实施例5sars-cov-2疫苗体内表达试验
76.本实施例选用实施例2得到的sars-cov-2疫苗。
77.将试验对象balb/c小鼠按照下述方式分组：
78.低剂量疫苗+胸腺五肽组：疫苗原液2
×
108vp/只+胸腺五肽；
79.高剂量疫苗+胸腺五肽组：疫苗原液1
×
109vp/只+胸腺五肽；
80.低剂量疫苗组：疫苗原液2
×
108vp/只；
81.高剂量疫苗组：疫苗原液1
×
109vp/只；
82.生理盐水对照组：注射与其他组别的试剂同等体积的生理盐水。
83.疫苗原液浓度：1
×
10
11
vp/ml。
84.胸腺五肽在疫苗注射液中浓度为1.6mg/ml。
85.给药方式：大腿内侧肌肉注射。
86.免疫程序：每6天免疫一次，共3次；分别取第18天、第24天小鼠血清。
87.安乐死取血程序：分别取第18天、第24天小鼠血清。
88.免疫原性检测方法：用elisa法测定小鼠针对s蛋白rbd区域的特异结合抗体效价，结果见图6。
89.该结果表明：
90.(1)针对新冠spike rbd的血清效价：免疫后18天血清效价约为2500-3400。免疫后24天血清效价约为8000-32000。
91.(2)胸腺五肽的添加大大增强了小鼠体内抗体的滴度。免疫后18天，小鼠血清效价从2500增至3400；免疫后24天，血清效价从8000增至32000。
92.实施例6sars-cov疫苗携带抗原序列的免疫原性检测
93.将实施例2的sars-cov-2疫苗以1
×
107pfu/ml感染a549细胞2h后，弃去病毒悬液，加入细胞培养液，37℃、5％co2条件下培养。感染后48h收集细胞裂解液，用间接elisa检测各个sars-cov-2疫苗表达的抗原与covid-19患者恢复期血清的交叉反应。
94.结果表明：sars-cov-2疫苗以1
×
107pfu/ml感染a549细胞后，表达的抗原能够与covid-19患者恢复期的血清发生交叉反应。这表明，实施例2的sars-cov-2疫苗具有良好的免疫原性。