本发明属于医用敷料技术领域，具体是指一种基于干细胞培养上清的液体创可贴的制备方法。
背景技术：
创面愈合是一个复杂的过程，涉及皮肤缺损部位的再上皮化、肉芽组织的增生、炎症反应、血管增生和创面重塑等，其中任何一个过程出现问题，都会导致创面愈合障碍。大量研究表明，细胞因子在伤口愈合的各个阶段均发挥重要的作用，这是由于它们在体外具有独特的、能够刺激静止期细胞持续进行有丝分裂的能力，它们能对伤口愈合的各个时期产生影响，从而加快愈合速度。已知多种因子参与了组织损伤修复过程，包括趋化因子，白细胞介素，生长因子等。其中发挥较为关键作用的主要有白细胞介素6(il-6)，白细胞介素8(il-8)，单核细胞趋化蛋白1(mcp-1)，血管内皮生长因子(vegf)，组织基质金属蛋白酶抑制剂1(timp-1)等。对不同个体人脐带间充质干细胞培养上清液中因子分泌水平进行分析，结果发现干细胞培养上清液中高表达伤口愈合相关因子il-6，il-8，mcp-1和timp-1，其中mcp-1和timp-1的分泌量最高，mcp-1的平均分泌量约为4.5μg/l，timp-1的平均分泌量约为1450μg/l。由于金属蛋白酶能降解胞外基质和生长因子，因此其在溃疡伤口处的过量表达能导致伤口的持续不愈，而timp-1可以中和金属蛋白酶的作用，促进伤口的愈合。
传统创可贴在处理皮肤伤口的便捷性上己有近百年的历史，做出了巨大的贡献，但是在遇到特殊复杂的伤口表面时，传统创可贴显得捉襟见肘。相比下，近年来，在敷料市场上出现的液体创可贴就显得更加行之有效。与传统创可贴相比，液体创可贴不但可以处理不规则的创口，在生物分解自溶性、伤口表面不结痂，保护创面促进创伤愈合，防水防渗防感染快速吸收功能性，以及临床疗效方面都更可靠，适合表浅皮肤创伤或伤口干净、出血不多，不需缝合小伤口等使用，细胞因子在伤口愈合的各个阶段均发挥重要的作用，在体外加入细胞因子有利于伤口的愈合。但是，在敷料中加入细胞因子将存在几个技术问题：(1)如何在使用和存储时使干细胞培养上清中各活性因子都保持较高的活性；(2)目前液体敷料使用的成膜组分都是基于有机溶剂的，有机溶剂容易引起细胞因子变性使其丧失活性，如何在保证细胞因子活性的同时又保证成膜速度快；(3)在伤口部位存在的蛋白酶以及环境容易降解细胞因子使其失去活性。
技术实现要素：
为了解决上述难题，本发明提供了一种可以快速成膜、缓慢释放活性物质，具有持续、高效修复创口、抑制疤痕形成的功能的基于干细胞培养上清的液体创可贴。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种基于干细胞培养上清的液体创可贴，包括成膜液、活性物质和溶剂，所述成膜液包括壳聚糖盐酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸和硫酸软骨素，所述壳聚糖盐酸盐2-10份、聚乙烯吡咯烷酮0.5-5份、透明质酸0.05-5份和硫酸软骨素0.05-5份，所述活性物质为自制干细胞培养上清冻干粉，所述溶剂为无菌水。
进一步地，所述壳聚糖盐酸盐5份、聚乙烯吡咯烷酮2.5份、透明质酸2.5份和硫酸软骨素2.5份。
进一步地，所述成膜液的制备方法，包括如下步骤：
1)称量6-10份壳聚糖盐酸盐加入到50份离心管中，加入50份无菌水，使其充分溶解得到壳聚糖盐酸盐溶液；将0.5-2份聚乙烯吡咯烷酮溶于20份无菌水中得到聚乙烯吡咯烷酮水溶液；
2)将步骤1)中的两种溶液混合，置于45-60℃恒温水浴锅中，1500-2000rpm机械搅拌混匀，然后降低搅拌速度为200-500rpm，混合液恒温控制在37℃，边搅拌边加2-5份硫酸软骨素、0.05-0.1份透明质酸，得到成膜液。
进一步地，所述干细胞培养上清冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
1)利用无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，当细胞融合度达到85％-90％时，收集培养上清，使用新鲜的无血清培养基继续扩大培养，如此反复至细胞传代至第5代，收集全部培养上清；
2)将收集的全部培养上清反复冻融，进行细胞裂解后，低速离心，温度4℃，转速5000rpm，时间30min，去除碎片后，利用0.22μm滤膜过滤得到纯化的间充质干细胞培养上清；
3)向步骤2)中得到的纯化的间充质干细胞培养上清中添加0-5％人血白蛋白、0-10％海藻糖作为冻干保护剂、0-20％甘露醇作为赋形剂，混匀，得到冻干混合原液，置于-20℃冰箱中备用；
4)将步骤3)获得混合原液融化后分装至西林瓶中，置于-80℃冰箱中快速预冻2-5h后置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到冻干粉成品。
进一步地，本发明所述一种基于干细胞培养上清的液体创可贴的制备方法，包括如下步骤：
1)用30份无菌水将干细胞培养上清冻干粉溶解为浓度0.5-20g/l的蛋白凝缩液；
2)将30份蛋白浓缩液，滴加入到上述成膜液中边加边搅拌，得到所述液体创可贴，搅拌速度为400-1000rpm，搅拌温度为常温20-40℃。
本发明采取上述结构取得有益效果如下：本发明一种液体创可贴，采用冷冻干燥法处理干细胞培养上清冻干粉，有效的防止了培养上清中细胞因子生物学特性的改变，提高了其稳定性，即有利于常温运输又可以延长细胞因子保存期限；在冻干粉中加入人血白蛋白作为保护剂，可以延长冻干粉中活性因子的保存期限，提高抗氧化活性，同时，不易引起过敏及其他排斥反应，更易吸收；海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下可以在细胞表面形成独特的保护膜，在冻干粉中加入海藻糖可以有效地防止冻干粉中活性因子变性失活，维持生命体的生命过程和生物特征。使用甘露醇作为赋型剂可以形成硬质的均匀骨架，保证冻干粉均质性的同时改善了冻干粉的结构形态。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于干细胞培养上清的液体创可贴，包括成膜液、活性物质和溶剂，所述成膜液包括壳聚糖盐酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸和硫酸软骨素，所述壳聚糖盐酸盐2-10份、聚乙烯吡咯烷酮0.5-5份、透明质酸0.05-5份和硫酸软骨素0.05-5份，所述活性物质为干细胞培养上清冻干粉，所述溶剂为无菌水。
所述成膜液的制备方法，包括如下步骤：
1)称量6-10份壳聚糖盐酸盐加入到50份离心管中，加入50份无菌水，使其充分溶解得到壳聚糖盐酸盐溶液；将0.5-2份聚乙烯吡咯烷酮溶于20份无菌水中得到聚乙烯吡咯烷酮水溶液；
2)将步骤1)中的两种溶液混合，置于45-60℃恒温水浴锅中，1500-2000rpm机械搅拌混匀，然后降低搅拌速度为200-500rpm，混合液恒温控制在37℃，边搅拌边加2-5份硫酸软骨素、0.05-0.1份透明质酸，得到成膜液。
所述干细胞培养上清冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
1)利用无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，当细胞融合度达到85％-90％时，收集培养上清，使用新鲜的无血清培养基继续扩大培养，如此反复至细胞传代至第5代，收集全部培养上清；
2)将收集的全部培养上清反复冻融，进行细胞裂解后，低速离心，温度4℃，转速5000rpm，时间30min，去除碎片后，利用0.22μm滤膜过滤得到纯化的间充质干细胞培养上清；
3)向步骤2)中得到的纯化的间充质干细胞培养上清中添加0-5％人血白蛋白、0-10％海藻糖作为冻干保护剂、0-20％甘露醇作为赋形剂，混匀，得到冻干混合原液，置于-20℃冰箱中备用；
4)将步骤3)获得混合原液融化后分装至西林瓶中，置于-80℃冰箱中快速预冻2-5h后置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到冻干粉成品。
一种基于干细胞培养上清的液体创可贴的制备方法，包括如下步骤：
1)用30份无菌水将干细胞培养上清冻干粉溶解为浓度0.5-20g/l的蛋白凝缩液；
2)将30份蛋白浓缩液，滴加入到上述成膜液中边加边搅拌，得到所述液体创可贴，搅拌速度为400-1000rpm，搅拌温度为常温20-40℃。
实施例2
一种基于干细胞培养上清的液体创可贴，包括成膜液、活性物质和溶剂，所述成膜液包括壳聚糖盐酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸和硫酸软骨素，所述壳聚糖盐酸盐4份、聚乙烯吡咯烷酮1.1份、透明质酸0.06份和硫酸软骨素4.5份，所述活性物质为干细胞培养上清冻干粉，所述溶剂为无菌水。
所述成膜液的制备方法，包括如下步骤：
1)称量4份壳聚糖盐酸盐加入到50份离心管中，加入50份无菌水，使其充分溶解得到壳聚糖盐酸盐溶液；将1.1份聚乙烯吡咯烷酮溶于20份无菌水中得到聚乙烯吡咯烷酮水溶液；
2)将步骤1)中的两种溶液混合，置于45-60℃恒温水浴锅中，1500-2000rpm机械搅拌混匀，然后降低搅拌速度为200-500rpm，混合液恒温控制在37℃，边搅拌边加4.5份硫酸软骨素、0.06份透明质酸，得到成膜液。
所述干细胞培养上清冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
1)利用无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，当细胞融合度达到85％-90％时，收集培养上清，使用新鲜的无血清培养基继续扩大培养，如此反复至细胞传代至第5代，收集全部培养上清；
2)将收集的全部培养上清反复冻融，进行细胞裂解后，低速离心，温度4℃，转速5000rpm，时间30min，去除碎片后，利用0.22μm滤膜过滤得到纯化的间充质干细胞培养上清；
3)向步骤2)中得到的纯化的间充质干细胞培养上清中添加0-5％人血白蛋白、0-10％海藻糖作为冻干保护剂、0-20％甘露醇作为赋形剂，混匀，得到冻干混合原液，置于-20℃冰箱中备用；
4)将步骤3)获得混合原液融化后分装至西林瓶中，置于-80℃冰箱中快速预冻2-5h后置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到冻干粉成品。
一种基于干细胞培养上清的液体创可贴的制备方法，包括如下步骤：
1)用30份无菌水将干细胞培养上清冻干粉溶解为浓度0.5-20g/l的蛋白凝缩液；
2)将30份蛋白浓缩液，滴加入到上述成膜液中边加边搅拌，得到所述基于干细胞培养上清的液体创可贴，搅拌速度为400-1000rpm，搅拌温度为常温20-40℃。
实施例3
一种基于干细胞培养上清的液体创可贴，包括成膜液、活性物质和溶剂，所述成膜液包括壳聚糖盐酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸和硫酸软骨素，所述壳聚糖盐酸盐8份、聚乙烯吡咯烷酮2份、透明质酸0.05份和硫酸软骨素5份，所述活性物质为干细胞培养上清冻干粉，所述溶剂为无菌水。
所述成膜液的制备方法，包括如下步骤：
1)称量8份壳聚糖盐酸盐加入到50份离心管中，加入50份无菌水，使其充分溶解得到壳聚糖盐酸盐溶液；将2份聚乙烯吡咯烷酮溶于20份无菌水中得到聚乙烯吡咯烷酮水溶液；
2)将步骤1)中的两种溶液混合，置于45-60℃恒温水浴锅中，1500-2000rpm机械搅拌混匀，然后降低搅拌速度为200-500rpm，混合液恒温控制在37℃，边搅拌边加5份硫酸软骨素、0.05份透明质酸，得到成膜液。
所述干细胞培养上清冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
1)利用无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，当细胞融合度达到85％-90％时，收集培养上清，使用新鲜的无血清培养基继续扩大培养，如此反复至细胞传代至第5代，收集全部培养上清；
2)将收集的全部培养上清反复冻融，进行细胞裂解后，低速离心，温度4℃，转速5000rpm，时间30min，去除碎片后，利用0.22μm滤膜过滤得到纯化的间充质干细胞培养上清；
3)向步骤2)中得到的纯化的间充质干细胞培养上清中添加0-5％人血白蛋白、0-10％海藻糖作为冻干保护剂、0-20％甘露醇作为赋形剂，混匀，得到冻干混合原液，置于-20℃冰箱中备用；
4)将步骤3)获得混合原液融化后分装至西林瓶中，置于-80℃冰箱中快速预冻2-5h后置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到冻干粉成品。
一种基于干细胞培养上清的液体创可贴的制备方法，包括如下步骤：
3)用30份无菌水将干细胞培养上清冻干粉溶解为浓度0.5-20g/l的蛋白凝缩液；
1)将30份蛋白浓缩液，滴加入到上述成膜液中边加边搅拌，得到所述基于干细胞培养上清的液体创可贴，搅拌速度为400-1000rpm，搅拌温度为常温20-40℃。
实施案例4
液体创可贴的组分中活性物质间充质干细胞培养上清冻干粉占0-0.06％；成膜剂壳聚糖盐酸盐占比2-10％，聚乙烯吡咯烷酮占0.5-5％；其他组分：透明质酸0.05-5％，硫酸软骨素0.5-5％。溶剂无菌水占比75％-90％。
所述液体创可贴的制备过程具体包括以下步骤：
1)成膜液的制备：称量8g壳聚糖盐酸盐加入到50ml离心管中，加入50ml无菌水，使其充分溶解得到壳聚糖盐酸盐溶液；将2g聚乙烯吡咯烷酮溶于20ml注射用水中得到聚乙烯吡咯烷酮水溶液；将上述两种溶液混合，置于50℃恒温水浴锅中，1500rpm机械搅拌混匀；降低搅拌速度为600rpm，混合液恒温控制在37℃，边搅拌边加5g硫酸软骨素、0.05g透明质酸，即为得到成膜液。
2)干细胞培养上清冻干粉的制备：利用无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，当细胞融合度达到85％-90％时，收集培养上清，用新鲜的无血清培养基继续扩大培养，如此反复至细胞传代至第5代，收集全部培养上清，反复冻融，使细胞裂解，低速离心(4℃，5000rpm，30min)去除碎片，利用0.22μm滤膜过滤后得到纯化的间充质干细胞培养上清，添加1％的人血白蛋白、5％的海藻糖作为冻干保护剂、20％的甘露醇作为赋形剂，得到冻干混合原液，置于-20℃冰箱中备用。
3)将步骤3)获得混合原液融化后分装至西林瓶中，置于-80℃冰箱中快速预冻2-5h后置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到冻干粉成品。
4)液体创可贴的制备：用30ml无菌水将15mg干细胞培养上清冻干粉溶解为浓度0.5g/l的蛋白凝缩液；将30ml蛋白浓缩液，滴加入到所制成膜液中边加边搅拌，得到所述液体创可贴；搅拌速度为400rpm，搅拌温度为20-40℃。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。