E184L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用的制作方法

e184l基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种e184l基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用。


背景技术：

[0002]
非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus， asfv)引起的猪的一种接触传染性、广泛出血性烈性传染病，患病猪出现体温升高、呼吸困难、黏膜广泛出血等临床症状，具有发病病程短、病死率高等特征，强毒株可导致家猪在感染后5-14天内死亡，死亡率接近100％，是危害世界养猪业健康发展最严重的传染病之一。 asf疫情在全球呈流行扩大趋势，周边国家疫情逐年增多，存在自然疫病病源地。目前，仍然缺乏有效的疫苗和疾病控制措施，一旦发生非洲猪瘟疫情，要彻底根除，对疫区的隔离和对受感染动物进行扑杀仍然是主要应对方法。因此，研究病毒结构，免疫逃逸机制，以及免疫保护机制的阐明，进而研发出安全有效的疫苗十分重要。
[0003]
asfv属于双链dna病毒，是非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)，非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是唯一通过节肢动物，即软蜱传播的dna病毒。asfv结构复杂、是一种大型包膜病毒，平均直径约为200nm，病毒基因组庞大，为线性双链dna，全长170～194kb，编码大约150～200种蛋白，其中许多蛋白对病毒复制非必须的，但在病毒逃逸宿主免疫防御方面有着重要作用，涉及的免疫逃逸机制复杂。
[0004]
天然免疫(innate immunity)是宿主抵抗外来病原感染的必不可少的第一道防线，主要由生理屏障、化学屏障和免疫细胞、分子构成。天然免疫通过模式识别受体(prrs)识别侵入宿主机体的病原相关分子模式(pamps)。dna病毒入侵猪体内产生的病原dna可被受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic gmp-amp synthase，cgas)识别并通过接头蛋白髓样细胞分化因子88(myeloid differentiation factor 88，myd88)和干扰素刺激基因(stimulator of i nterferon genes，sting)，激活转录因子干扰素调节因子3(ifn regulatory factor 3，irf3) 和nf-κb(nuclear factorκb)，irf3在此过程中聚合形成二聚体并和nf-κb一起转移至细胞核内诱导产生i型干扰素(type i interferon，ifn-i或ifnα/β)抵御病原入侵。
[0005]
asfv主要感染单核-吞噬细胞系统，包括高度分化的组织巨噬细胞和淋巴结、脾、肾、肝等器官的网状细胞的特定亚类，并在其内进行复制，这种感染机制有利于asfv抑制或控制宿主免疫应答。asfv成功入侵的重要前提是跨越巨噬细胞自身针对病原体的免疫防线，因此鉴定参与免疫抑制的蛋白及其在病毒复制过程中的作用刻不容缓。大约30％的asfv基因组编码一系列的旁系同源基因，如多基因家族mgf100、110、300、360、505/530和p22，它们在基因组中都有多个拷贝。mgfs位于基因组左40kb和右20kb的可变区内。已有研究表明，巨噬细胞中，mgf360和mgf530家族的多个基因缺失导致病毒滴度呈100或者1000 倍降低，并且上调-型干扰素及-型干扰素刺激基因的表达。这些结果表明这两个家族中有
某些基因参与了免疫抑制。cn106459931a专利公开了缺失多基因家族360基因9l，10l，11 l，12l，13l和14l以及多基因家族505基因1r，2r，3r和4r的功能性形式的减毒非洲猪瘟病毒：还提供了缺乏dp148r基因的功能性形式的减毒非洲猪瘟病毒。
[0006]
通过敲除毒力基因、免疫抑制基因等获得减毒非洲猪瘟疫苗是目前疫苗研究的重点方向。但是不同基因型采用相同的基因缺失策略，致弱效果差别较大；同时，缺失不彻底可能引起免疫副反应及田间散毒；删除有些基因可能导致病毒无法复制；以及多基因缺失造成的过度致弱会使致弱毒株失去保护作用等问题也限制了非洲猪瘟疫苗的研制进度。因此在具体研究过程中需要设计考虑好疫苗的安全性和有效性的平衡。
[0007]
本发明首先研究鉴定发现非洲猪瘟病毒e184l蛋白能够抑制poly(da:dt)诱导的ifn-β、 nf-κb及isre启动子的激活，抑制poly(da:dt)诱导的ifn-β及其下游因子isg15、isg54、 il-6、mcp1和tnf-α等细胞因子的产生，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；其次本发明通过基因工程手段在非洲猪瘟亲本毒株asfv/cn/gs/2018中缺失了e184l 基因编码蛋白的免疫抑制功能，降低了亲本毒株的免疫抑制活性，获得了一株安全性高的减毒非洲猪瘟候选疫苗株；所述减毒非洲猪瘟候选疫苗株免疫猪后，降低了猪的免疫抑制活性和致病性，其免疫后能够诱导显著的抗体产生，可作为安全和有效的防控非洲猪瘟疫情的候选疫苗，具有极大的社会价值。


技术实现要素：

[0008]
首先本发明发现，非洲猪瘟病毒e184l蛋白能够抑制poly(da:dt)诱导的ifn-β、nf-κb 及isre启动子的激活，抑制poly(da:dt)诱导的ifn-β及其下游因子isg15、isg54、il-6、 mcp1和tnf-α等细胞因子的产生，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用。因此，本发明的目的在于：
[0009]
提供一种非洲猪瘟病毒e184l蛋白作为免疫抑制剂的应用。
[0010]
优选地，所述免疫抑制剂包括i型干扰素抑制剂、促炎性因子抑制剂、干扰素刺激基因 isgs抑制剂。
[0011]
提供一种非洲猪瘟病毒e184l蛋白在制备用于抑制i型干扰素产生的药物或药物组合物中的应用。
[0012]
提供一种非洲猪瘟病毒e184l蛋白在制备用于抑制促炎性因子产生的药物或药物组合物中的应用。
[0013]
提供一种非洲猪瘟病毒e184l蛋白在制备用于抑制干扰素刺激基因isgs表达的药物或药物组合物中的应用。
[0014]
优选地，所述非洲猪瘟病毒e184l蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0015]
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒e184l蛋白的核苷酸序列如seq id no：2所示。
[0016]
其次，本发明通过在亲本非洲猪瘟病毒asfv/cn/gs/2018分离株中缺失了e184l基因编码蛋白的功能，构建获得了一种e184l基因编码蛋白的功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株，所述减毒非洲猪瘟病毒株对天然免疫的抑制能力显著减弱，可作为重组疫苗株应用。因此，本发明的另一目的在于：
[0017]
提供一种通过缺失非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用。所述缺失非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病
毒e184l 基因的全部或部分核苷酸序列使非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能丧失。
[0018]
优选地，所述缺非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒 e184l基因的全部核苷酸序列使非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能丧失。
[0019]
优选地，所述非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0020]
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒e184l基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
[0021]
提供一种通过缺失非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能制备减毒非洲猪瘟疫苗株的应用。所述缺失非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒e184l 基因的全部或部分核苷酸序列使非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能丧失。
[0022]
优选地，所述缺非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒 e184l基因的全部核苷酸序列使非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能丧失。
[0023]
优选地，所述非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0024]
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒e184l基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
[0025]
提供一种e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株，所述减毒非洲猪瘟病毒株包括将亲本非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能丧失。所述缺失非洲猪瘟病毒e184l 基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒e184l基因的全部或部分核苷酸序列使非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能丧失。
[0026]
优选地，所述缺非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒 e184l基因的全部核苷酸序列使非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的功能丧失。
[0027]
优选地，所述非洲猪瘟病毒为asfv/cn/gs/2018分离株。
[0028]
优选地，所述非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0029]
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒e184l基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
[0030]
优选地，所述减毒非洲猪瘟病毒株相较于asfv/cn/gs/2018分离株全长序列缺失了第 161650-162204位核苷酸。
[0031]
优选地，所述减毒非洲猪瘟病毒株还包括cd2v基因、mgf-360-12l基因、mgf-360-13l 基因、mgf-360-14l基因、mgf-360-505r基因等中一种或几种基因序列的缺失。
[0032]
提供一种非洲猪瘟疫苗，所述疫苗包含e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。
[0033]
提供一种e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株的制备方法，所述方法为：通过基因工程手段将亲本毒株的e184l基因编码蛋白功能进行丧失。
[0034]
优选地，所述非洲猪瘟病毒为asfv/cn/gs/2018分离株。
[0035]
优选地，所述方法为同源重组技术，所述方法包括以下步骤：
[0036]
(1)设计asfv e184l基因上下游序列作为左右同源重组臂，并分别克隆入puc19载体中，获得重组转移载体；
[0037]
(2)在步骤(1)所述重组转移载体左、右臂基因序列中插入筛选表达盒基因片段，获得同源重组转移载体；
[0038]
(3)将步骤(2)所述同源重组转移载体转染至感染了亲本非洲猪瘟毒株的bmdm细
胞，纯化筛选获得e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。
[0039]
优选地，所述非洲猪瘟病毒e184l基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0040]
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒e184l基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
[0041]
优选地，所述减毒非洲猪瘟病毒株相较于asfv/cn/gs/2018分离株全长序列缺失了第 161650-162204位核苷酸。
[0042]
提供一种根据上述方法制备获得的e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。
[0043]
本发明的有益效果是：
[0044]
①
本发明首先发现非洲猪瘟e184l蛋白能够抑制poly(da:dt)诱导的ifn-β、nf-κb及 isre启动子的激活，抑制poly(da:dt)诱导的ifn-β及其下游因子isg15、isg54、il-6、mcp1 和tnf-α等细胞因子的产生，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；
[0045]
②
其次本发明通过基因工程手段在非洲猪瘟亲本毒株asfv/cn/gs/2018中缺失了e184l 基因编码蛋白的免疫抑制功能，降低了亲本毒株的免疫抑制活性，获得了一株安全性高的减毒非洲猪瘟候选疫苗株；所述减毒非洲猪瘟候选疫苗株免疫猪后，降低了猪的免疫抑制活性和致病性，其免疫后能够诱导显著的抗体产生，可作为安全和有效的防控非洲猪瘟疫情的候选疫苗，具有极大的社会价值。
附图说明
[0046]
图1 asfv e184l蛋白抑制ifn-β、nf-κb及isre启动子的激活的结果；其中a为共转染pifn-β-luc质粒、prl-tk质粒和不同剂量的e184l表达质粒(0-vector、50、100、200ng/ 孔)的结果；b为共转染pisre-luc质粒、prl-tk质粒和不同剂量的e184l表达质粒(0-vector、 50、100、200ng/孔)的结果；c为共转染pnf-κb-luc质粒、prl-tk质粒和不同剂量的e184l 表达质粒(0-vector、50、100、200ng/孔)的结果；control为不转染poly(da:dt)，vector为不转染e184l表达质粒，只转染空载体质粒；
[0047]
图2 asfv e184l蛋白抑制ifn-β蛋白表达的检测结果；其中mock为不转染poly(da:dt)， vector为不转染e184l表达质粒；
[0048]
图3 asfv e184l蛋白抑制ifn-β及下游细胞因子mrna表达的检测结果；其中a为ifn-βmrna检测结果；b为isg15 mrna检测结果；c为isg54 mrna检测结果；d为il-6 mrna检测结果；e为mcp1 mrna检测结果；f为tnf-αmrna检测结果；
[0049]
图4制备e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株使用的同源重组转移载体构建示意图；
[0050]
图5 e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l的p11代重组病毒荧光检测结果；
[0051]
图6 e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l基因缺失pcr 鉴定图；
[0052]
图7 e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l与亲本毒株在细胞中的复制比较结果；
[0053]
图8 e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l与亲本毒
株在动物中诱导干扰素表达的比较结果；
[0054]
图9 e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l与亲本毒株在动物中的致病能力比较结果；
[0055]
图10 e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l与亲本毒株感染动物后体内带毒水平比较结果。
[0056]
图11 e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l与亲本毒株感染动物后体内中和抗体水平比较结果。
具体实施方式
[0057]
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
[0058]
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
[0059]
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(bsl-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业农村部关于开展高致病性asfv病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
[0060]
以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：
[0061]
原代猪肺泡巨噬细胞(pam)及原代骨髓巨噬细胞(bmdm)取自2-4月龄健康长白猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％fbs(购自pan公司)的rpmi 1640完全培养基(购自gibco 公司)中，置于37℃、5％co
2
培养箱中培养。bmdm细胞培养需在rpmi 1640完全培养基中额外添加10ng/ml终浓度的gm-csf(购自r&d systems公司)，置于37℃、5％co
2
培养箱中诱导，每2-3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞皿中，换液继续诱导，经3-7天后冻存或使用。利用pam细胞扩增asfv，并进行病毒含量的滴定，bmdm细胞用于质粒转染和病毒重组实验。
[0062]
asfv/cn/gs/2018分离株为中国农业科学院兰州兽医研究所非洲猪瘟区域实验室分离株，属于基因ii型，病毒效价为5
×
10
7
tcid
50
/ml，为pam细胞扩繁后的第4代种毒，分装保存于-80℃备用。
[0063]
pegfp-n1载体、puc57载体均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司；无内毒素的质粒提取试剂盒，购于omega公司。
[0064]
hek-293t细胞，购于atcc公司；pifn-β-luc质粒、pisre-luc质粒、pnf-κb-luc质粒、prl-tk质粒、poly(da:dt)由兰州瑞博莱生物科技有限公司构建。
[0065]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域知晓的操作方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
[0066]
定义
[0067]
术语“蛋白功能丧失”是指通过对编码蛋白的基因进行敲除、突变或在编码蛋白的基因片段中插入部分基因，使得基因编码蛋白发生移码突变，导致基因编码蛋白的功能丧失。本发明的目的在于通过对非洲猪瘟病毒中asfv e184l基因的部分或全部核苷酸序列进
id n o：6所示)；以pegfp-n1载体为模板，扩增egfp基因，备用，扩增引物为：正向引物5
’-ꢀ
atggtgagcaagggcgaggag-3
’
(seq id no：7所示)和反向引物5
’-
accacaacta gaatgcagtg-3
’
(seq id no：8所示)；
[0106]
参照文献(borca mv,holinka lg,berggren ka,gladue dp.crispr-cas9,a tool toefficiently increase the development of recombinant african swine fever viruses.sci rep.20 18；8(1):3154.)，将上述步骤扩增获得的p72启动子和egfp两个基因通过融合pcr的方法连接，获得egfp筛选表达盒基因片段，命名为p72-egfp-sv40polya(seq id no：9)，该表达盒序列含sv40polya终止序列。
[0107]
2.同源重组转移载体的构建
[0108]
利用puc57载体作为骨架载体，构建e184l基因敲除用同源重组转移载体。具体步骤为：设计e184l基因上下游序列约1kb作为同源重组臂，左臂(left arm，seq id no：10所示) 和右臂(right arm，seq id no：11所示)，分别克隆入骨架载体puc57载体中，在e184 l的重组转移载体的左、右臂基因序列中间插入p72-egfp-sv40polya筛选表达盒基因片段。经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为puc-lrδe184l-egfp；用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒dna，测定浓度，-20℃保存备用。所述e184l基因的氨基酸序列见seqid no：1，其核酸序列如seq id no：2所示。所述缺失的e184l基因序列为非洲猪瘟病毒asfv/cn/gs/2018分离株全基因序列第161650-162204位的核苷酸序列，构建策略见图4。
[0109]
3.细胞转染和重组病毒筛选
[0110]
将同源重组转移质粒puc-lrδe184l-egfp(2μg)用-macrophage dna转染试剂转染至猪bmdm细胞(细胞数约为10
6
个/孔)，转染6h后，直接感染asfv/cn/gs/ 2018，不换液，至感染48小时，在荧光显微镜下观察荧光细胞数，消化细胞，挑取所有单孔中的荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1小时，挑取所有单个荧光细胞，反复冻融后，接种预先铺好的96孔板bmdm细胞，每12小时观察一次，观察出现荧光的细胞孔，标记后，继续观察至72小时；结果如图5所示，在荧光显微镜下可见有零星绿色荧光，即视为可疑重组毒感染的细胞。挑取荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1小时，挑取单个荧光细胞，收集后反复冻融3次，接种预先铺好的96孔板pam细胞中，每12小时观察一次，观察出现荧光的细胞孔并标记，继续观察至72小时。荧光细胞数量比例达100％的为全阳性孔，这说明重组毒构建基本成功。
[0111]
4.重组病毒pcr鉴定
[0112]
对该全阳性孔进行10次有限稀释扩大培养，挑取第11代重组病毒孔消化成单个细胞，小心吸取10个荧光细胞，分别接种于预先铺好的96孔板pam细胞中，继续生长72小时。挑取gfp荧光较多的细胞，用病毒基因组提取试剂盒(购自北京天根生物科技公司)提取a sfv和基因缺失asfv的基因组，用针对e184l-f/r的引物进行pcr鉴定，确认是否缺失成功，其中e184l-f：5
’-
catgcacttcggtgaaaaact-3
’
(seq id no：12)，e184l-r：5
’ꢀ-
gagaatacataagggtttgcgt-3
’
(seq id no：13)。
[0113]
结果如图6所示，当以野生型asfv基因为模板时，e184l-f/r引物可以扩增出明显的条带(图6，asfv wt)，当以获得的asfv e184l的基因缺失的病毒基因为模板时，e184 l-f/r引物扩增不出条带(图6，asfvδe184l)，结果表明重组毒中asfv e184l蛋白的编码基因已缺失并已纯化，并命名其为减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l。为证实asfvδe18 4l发生
了复制，同时利用mgf505-7r引物对野生型asfv和asfvδe184l毒株提取的核酸进行pcr检测，其中mgf505-7r-f：5
’-
ggagaagagggaaacaa-3
’
(seq id no：14)， mgf505-7r-r：5
’-
ccagcacaaagggtaa-3
’
(seq id no：15)。结果均扩增到了mgf5 05-7r条带，表明了asfv和asfvδe184l病毒均进行了复制。
[0114]
实施例3减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l在pam细胞中的病毒滴度测定
[0115]
非洲猪瘟病毒的滴定分别采用半数血球吸附量(50％haemadsorption，had
50
)两种方法进行操作。将上述重组病毒进行10倍梯度稀释，取100μl接种预先铺好的96孔中形成单层的猪原代pam细胞，每孔加25μl的1％红细胞悬液，病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的玫瑰花环进行判定，培养12-16h可进行第一次读板，连续观察7天，根据reedand muench方法计算半数血球吸附剂量(had
50
)。结果显示：在感染后48小时，减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l的平均滴度为10
4.5
/ml，而亲本毒株asfv/cn/gs/2018亲本毒平均滴度为10
5
/ml。减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l的滴度低于亲本毒株asfv/cn/gs/2018。
[0116]
实施例4减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l的细胞感染结果
[0117]
分别用10had
50
p12代的亲本毒株asfv/cn/gs/2018及减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe 184l接种感染pam细胞，分别在接种后0、3、18、36、48、72h后收取细胞样品，提取细胞总rna，用asfv p30特异性引物进行q-pcr实验，检测asfv p30 mrna含量。
[0118]
结果如图7所示，其中，mock为空白对照；亲本毒株asfv/cn/gs/2018(asfv wt) 接种感染pam细胞后，asfv p30 mrna含量表达随接种时间的延长而逐渐增加；相较于亲本毒株asfv/cn/gs/2018，虽然减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l接种感染pam细胞后 asfv p30 mrna含量表达随接种时间的延长也逐渐增加，但是相对于同一时间对应的亲本毒株asfv/cn/gs/2018，减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l接种感染pam细胞后asfv p 30mrna含量显著降低。表明，与野生毒株相比，缺失e184l基因后的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l的复制能力减弱，但并不完全抑制病毒的复制。
[0119]
实施例5减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l的动物攻毒实验结果
[0120]
为了检测e184l基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l的致病变能力，在中国农业科学院兰州兽医研究所生物安全三级实验动物房中进行引进8头7周龄健康大三元仔猪。待猪适应2-3天后，分为3组，分别经肌肉注射相同感染剂量的减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l和亲本毒株asfv/cn/gs/2018进行攻毒，利用pbs注射作为未感染对照。攻毒后，持续观察动物的精神状况、采食情况，监测动物体温，采集抗凝血液和分离血清，观察至20天终止。实验方案如表1所示。
[0121]
表1动物攻毒实验方案
[0122][0123]
实验结果：通过致病性评价发现，接种亲本毒株asfv/cn/gs/2018后的所有仔猪均出现体温升高，精神沉郁，7天左右开始死亡，并在9天内全部死亡；血清中干扰素应答非常
弱 (图8)，其剖检可见淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏等部位严重出血(图9)，心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、膀胱、淋巴结等脏器均带毒(图10)。而接种减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l 后，三头猪体温均在正常范围内且未见任何异常临床表现，剖检存活猪只病理变化不显著(图 9)，组织器官病毒含量与亲本毒株接种猪相比显著降低(图10)。此外，asfvδe184l接种猪血清中干扰素含量与亲本毒株asfv/cn/gs/2018感染猪的血清中干扰素ifn-β含量相比显著升高(图8)，其免疫后能够诱导显著的p30中和抗体产生(图11)，表明asfvδe184l免疫应答能力显著提升。
[0124]
上述结果表明，减毒非洲猪瘟病毒株asfvδe184l对猪的免疫抑制作用充分减弱，对猪的致病性显著下降，能够诱导高效中和抗体产生，所述δe184l可以作为构建基因缺失疫苗的靶标。
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以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出其它改进，这些都属于本发明的保护范围。