一种PEI/ON复合物及其制备方法和用途与流程

一种pei/on复合物及其制备方法和用途
技术领域
[0001]
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种pei/on复合物及其制备方法和用途。


背景技术：

[0002]
乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)感染引起的严重危害人类生命健康的转染性疾病。据估计，全世界有超过2.9亿人患有慢性hbv感染，并且有死于hbv相关肝硬化和肝细胞癌并发症的风险。在hbv携带者中，被hbv感染的肝细胞会产生大量非感染性(球形或丝状)进入外周血循环中，其数量通常比感染性dane颗粒大1000：1至10,000：1。仅包含包膜糖蛋白(hbsag)和宿主来源的脂质的亚病毒颗粒(subviral paticle，svp)过量生产会导致免疫耐受并导致hbv感染的慢性化。目前的临床上的抗病毒策略主要是使用核苷类药物和基于干扰素的疗法，但是很少能从血液中完全清除hbsag而达到hbv的功能性治愈即hbsag阴性。这突出表明开发慢性乙型肝炎病毒感染的治疗策略中，如何降低hbsag水平是一个重要的问题。
[0003]
目前基于寡核苷酸(oligonucleotide，on)的疗法正在成为治疗病毒感染，肿瘤和遗传性疾病的潜在策略。最近几十年来，已经开发出许多不同类型的治疗性寡核苷酸，包括反义寡核苷酸，与rna结合的小干扰rna(sirna)，与dna结合的抗基因寡核苷酸以及与蛋白质结合的核酸适体，诱饵寡合苷酸及cpg寡核苷酸。
[0004]
另一方面，成功地将外源基因或寡核苷酸传递到细胞中也是有效地将它们用于医学治疗的前提条件。


技术实现要素：

[0005]
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种pei/on复合物及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
[0006]
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种pei/on复合物，包括寡核苷酸片段，所述寡核苷酸片段上负载有聚乙烯亚胺。
[0007]
在本发明一些实施方式中，所述寡核苷酸片段的长度为10～50nt，优选为15～45nt，更优选为25～45nt。
[0008]
在本发明一些实施方式中，所述寡核苷酸片段的多核苷酸序列包括如seq id no.1～4其中之一所示的序列。
[0009]
在本发明一些实施方式中，所述寡核苷酸片段为dna片段和/或rna片段。
[0010]
在本发明一些实施方式中，所述寡核苷酸片段为单链的和/或双链的。
[0011]
在本发明一些实施方式中，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为20k～30kda，数均分子量为8k～12k。
[0012]
在本发明一些实施方式中，所述pei/on复合物中，每1ug的pei负载于≤400nm的on，优选的，每1ug的pei负载于100～300nm的on，更优选的，每1ug的pei负载于150～250nm的on。
[0013]
在本发明一些实施方式中，所述聚乙烯亚胺通过静电结合负载于寡核苷酸片段。
[0014]
本发明另一方面提供上述的pei/on复合物的制备方法，包括：将聚乙烯亚胺负载于寡核苷酸片段上，以提供所述pei/on复合物。
[0015]
在本发明一些实施方式中，所述将聚乙烯亚胺负载于寡核苷酸片段上的方法具体包括：将寡核苷酸片段和聚乙烯亚胺在溶剂存在的条件下共孵育。
[0016]
本发明另一方面提供上述的pei/on复合物在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于：
[0017]
a)乙肝表面抗原抑制剂；和/或，
[0018]
b)抗乙型肝炎病毒；和/或，
[0019]
c)治疗与乙型肝炎病毒相关、或与乙肝表面抗原异常表达相关的疾病。
[0020]
在本发明一些实施方式中，所述疾病选自乙型肝炎。
附图说明
[0021]
图1显示为本发明实施例1中pei/on复合物的制备和鉴定结果示意图。
[0022]
图2显示为本发明实施例2中pei/on复合物转染hepad38细胞的检测示意图。
[0023]
图3显示为本发明实施例3中pei/on复合物对hepad38细胞毒性的检测示意图。
[0024]
图4显示为本发明实施例4中不同浓度的pei/on复合物降低hbsag的结果示意图。
[0025]
图5显示为本发明实施例5中不同长度的寡核苷酸与pei形成的复合物降低hbsag的结果示意图。
[0026]
图6显示为本发明实施例6中不同长度的、随机双链的寡核苷酸与pei形成的复合物降低hbsag的结果示意图。
具体实施方式
[0027]
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
[0028]
本发明第一方面提供一种pei/on复合物，包括寡核苷酸片段，所述寡核苷酸片段上负载有聚乙烯亚胺。本发明所提供的pei/on复合物是将聚乙烯亚胺负载于寡核苷酸片段上形成的，所形成的复合物能够有效转染细胞，从而可以降低或消除细胞上清中的hbsag的表达水平，从而可以用于降低乙肝表面抗原(hbsag)表达水平、或抗乙型肝炎病毒(hbv)。具体来说，pei/on复合物中pei作为表面活性剂和脂质改变剂的非特异性作用有可能会影响参与svp的脂质代谢，从而有可能干扰svp在肝细胞内的组装，阻碍其合成并分泌的通路，进而表现为分泌的hbsag抗原检测水平下调。
[0029]
本发明所提供的pei/on复合物中，寡核苷酸片段的长度通常不宜过长、也不宜过短，否则可能会导致pei/on复合物活性的降低。例如，所述寡核苷酸片段的长度可以为10～50nt、10～15nt、15～20nt、20～25nt、25～30nt、30～35nt、35～40nt、40～45nt、或45～50nt，优选可以为15～45nt，更优选可以为25～45nt。pei/on复合物活性的变化可能与核酸序列所带的电荷量有关，寡核苷酸片段越长，寡合酸片段所携带的负电荷的量就越多。比如，10nt以下的寡核苷酸片段所携带的负电荷的量可能太少，不足以和pei形成稳定的复合
物以进入细胞内并起到相应的作用。而太长的寡核苷酸片段虽然有足够的负电荷量，但是推测过长的寡核苷酸与pei形成的复合物(纳米颗粒)的尺寸可能过大，反而降级了转染效率，导致进入细胞的复合物的量过少，不足以产生相应作用，又或者所形成的这种复合物的理化性质就是使其不能够起到相应作用。寡核苷酸片段的序列可以是各种随机的序列，其可以是dna片段，也可以是rna片段，可以是单链的寡核苷酸片段，也可以是双链的寡核苷酸片段。在本发明一具体实施例中，所述寡核苷酸片段可以是单链的，多核苷酸序列可以包括如seq id no.1～5其中之一所示的序列。在本发明另一具体实施例中，所述寡核苷酸片段可以是双链的，其中一链的多核苷酸序列可以包括如seq id no.6～15其中之一所示的序列。
[0030]
本发明所提供的pei/on复合物中，聚乙烯亚胺通常需要具有合适的分子量，其原因在于过低分子量的pei可能不具备有效的转染特性，相对较高高分子量的pei会更加适合转染。例如，所负载的聚乙烯亚胺的重均分子量可以为20k～30kda、20k～22kda、22k～24kda、24k～26kda、26k～28kda、或28k～30kda。再例如，所负载的聚乙烯亚胺的数均分子量可以为8k～12k、8k～9k、9k～10k、10k～11k、或11k～12k。
[0031]
本发明所提供的pei/on复合物中，pei和on之间通常需要有合适的比例，pei和on之间的比例通常不宜过高、也不宜过低，否则可能会导致pei/on复合物活性的降低。例如，所述pei/on复合物中，每1ug的pei可以负载于≤400nm、50～100nm、100～150nm、150～200nm、200～250nm、250～300nm、300～350nm、或350～400nm的on，优选的，每1ug的pei负载于100～300nm的on，更优选的，每1ug的pei负载于150～250nm的on。
[0032]
本发明所提供的pei/on复合物中，pei通常可以通过静电结合到带负电荷的寡核苷酸片段上，从而形成具有疏水核(部分中和的dna)和亲水壳(阳离子聚合物链)的两亲性二元复合物。
[0033]
本发明第二方面提供本发明第一方面所提供的pei/on复合物的制备方法，包括：将聚乙烯亚胺负载于寡核苷酸片段上，以提供所述pei/on复合物。本领域技术人员可选择合适的方法将聚乙烯亚胺负载于寡核苷酸片段上，例如，可以包括：将寡核苷酸片段和聚乙烯亚胺在溶剂存在的条件下共孵育。
[0034]
本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的pei/on复合物在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒可以用于：a)乙肝表面抗原(hbsag)抑制剂。所述乙肝表面抗原抑制剂通常指可以抑制乙肝表面抗原的表达和/或功能的物质。例如，所述乙肝表面抗原抑制剂可以部分抑制，即降低乙肝表面抗原的表达和/或功能，也可为完全抑制，即完全消除乙肝表面抗原的表达和/或其功能。本发明所提供的pei/on复合物能够有效转染细胞，对hbsag的分泌有一定抑制作用，可以降低或消除细胞上清中的hbsag的表达水平，且随着寡核苷酸浓度的增加，其抑制作用明显增强，而在一定的工作浓度范围内，对细胞没有明显的毒性作用，从而可以作为乙肝表面抗原抑制剂，用于降低细胞中乙肝表面抗原(hbsag)表达水平的药物或试剂盒。
[0035]
所述药物或试剂盒还可以用于：b)抗乙型肝炎病毒(hbv)。如上所述，本发明所提供的pei/on复合物对hbsag的分泌有一定抑制作用，可以降低或消除细胞上清中的hbsag的表达水平，而hbsag表达水平的降低通常意味着外周血液循环中的表面抗原量下调，预期可改善机体免疫的状态，从而可以被用于抗乙型肝炎病毒。
[0036]
所述药物或试剂盒还可以用于：c)治疗与乙型肝炎病毒相关、或与hbsag异常表达相关的疾病。如上所述，本发明所提供的pei/on复合物对hbsag的分泌有一定抑制作用，可以降低或消除细胞上清中的hbsag的表达水平，有效降低乙型肝炎病毒的活性，从而作为用于治疗与乙型肝炎病毒相关、或与hbsag异常表达相关的疾病的药物或试剂盒，所述疾病可以是例如，乙型肝炎等。
[0037]
本发明所提供的药物或试剂盒中，所述pei/on复合物可以是作为单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，共同地组成有效成分用于上述用途。
[0038]
现有技术中所公开的药物核苷(酸)类似物可有效地减少hbv dna，但是却无法功能性治愈乙型肝炎(定义为持续的hbsag消失)，而本发明所提供的pei/on复合物，在体外细胞实验中，可以有效要降低细胞上清中hbsag的表达水平，从而可以被用于恢复患者的病毒特异性免疫应答，为抗hbv治疗的发展提供新的潜在途径，具有良好的产业化前景。
[0039]
下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
[0040]
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecular cloning：a laboratory manual，second edition，cold spring harbor laboratory press，1989and third edition，2001；ausubel等，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，new york，1987and periodic updates；the series methods in enzymology，academic press，san diego；wolffe，chromatin structure and function，third edition，academic press，san diego，1998；methods in enzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarman and a.p.wolffe，eds.)，academic press，san diego，1999；和methods in molecular biology，vol.119，chromatin protocols(p.b.becker，ed.)humana press，totowa，1999等。
[0041]
实施例1
[0042]
pei/on复合物的制备和鉴定：
[0043]
将不同体积的100um的40nt寡核苷酸水溶液(0.5ul，1.0ul，1.5ul，2.0ul，seq id no.1，单链片段)与2μl的pei水溶液(浓度1ug/ul，average mw～25000)混合在50μl的opti-mem中，孵育15分钟(室温)后，再加入450ul opti-mem，寡核苷酸终浓度为(100nm，200nm，300nm，400nm)，即可用于转染细胞。
[0044]
吸取20ul制备好的pei/on复合物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果如图1所示，其中，lane1-4分别为不同浓度寡核苷酸与pei共孵育后的产物，lane5为maker，lane6-9为仅含有不同浓度的寡核苷酸的opti-mem。由图1可知，随着复合物中寡核苷酸浓度的增加，pei/on的复合物中的寡核苷酸的电泳迁移均被阻滞。
[0045]
acacacacacacacacacacacacacacacacacacacac(seq id no.1)
[0046]
实施例2
[0047]
pei/on复合物转染hepad38细胞的检测：
[0048]
hepad38细胞株在正常条件下培养，当细胞融合度达到90％时，先倒去培养液，用无菌pbs缓冲液洗1次，加入0.25％的胰酶和0.2％edta溶液，使细胞充分消化3分钟，37℃消
化3min，加培养液轻轻吹打成单细胞悬液，然后后1:4的比例传代，继续培养。细胞培养时，所有的培养基均含10％fbs(胎牛血清)，100iu/ml青霉素和100mg/ml链霉素，置于37℃，5％co2的培养箱，在饱和湿度条件下培养。hepad38细胞是一种hbv基因表达的肝细胞癌系，用dmem/f12培养基，培养补充有10％fbs和终浓度100mg/l的g418(gibco)。待细胞长满后再次消化，用细胞计数板计数后，加培养液稀释成一定浓度的细胞悬液，接种于12孔细胞培养板中，置于37℃，5％co
2
培养24h，细胞贴壁生长成单层后进行实验。
[0049]
所制备的寡核苷酸先标上fttc(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)的荧光基团，吸取1ul体积(浓度为100um)的标记有fttc的寡核苷酸与2ug的pei(ug/ul)室温共孵育15min，然后加入无血清细胞培养基中(pei/on复合物中的寡核苷酸on终浓度为100nm，pei/on复合物的制备方法参照实施例1，制备方法稍有不同，只是40nt的on(ac重复序列)上带有fitc荧光标签，用于观测on复合物是否进入细胞内)，置于37℃，5％co
2
培养箱，转染5h。然后吸弃无血清转染液，加上含10％fbs的细胞培养液，置于37℃，5％co
2
培养箱48h。换培养基之后在荧光显微镜下观察绿色荧光信号，阳性细胞发出明亮的绿色荧光，表明pei/on复合物成功转染进细胞，结果如图2所示。
[0050]
实施例3
[0051]
pei/on复合物对hepad38细胞毒性的检测：
[0052]
参照cck-8检测试剂盒的方法检测pei/on复合物对hepad38细胞生长的抑制作用。将对数期的hepad38消化后，用细胞计数板计数，加培养液稀释成浓度1x10
4
个细胞/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，37℃，5％co
2
培养24h。细胞贴壁生长成单层后，分别设置细胞培养液孔内寡核苷酸终浓度为100nm、200nm、300nm、400nm的浓度梯度组(pei/on复合物的制备方法参照实施例1)，每个浓度设置3个复孔，并设有空白对照组(不含测试复合物的培养液)。pei/on复合物转染作用5h后，各孔加入10μlcck-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。将培养板在培养箱内孵育1小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，比较不同组的od450值来反映活细胞数量，结果如图3所示。由图3可知，pei/on复合物对hepad38细胞生长没有抑制作用。
[0053]
实施例4
[0054]
不同浓度的pei/on复合物降低hbsag：
[0055]
以2ug的pei转染不同体积的100um的40nt寡核苷酸(40nt的重复ac序列，seq id no.1)进行hepad38细胞hbsag、hbeag分泌的影响实验。将对数期的hepad38细胞悬液(5xl0
5 cell/ml)接种到12孔板中(lml培养液/孔)，培养24小时后，吸去培养液，加入500ul含有多种浓度的待测pei/on复合物的无血清的培养液进行转染(由实施例1制备获得)，5h后，吸弃转染液，换上1ml的10％新鲜培养液，培养48h，收集细胞上清。实验浓度设置3个复孔，并设空白对照组(不含测试复合物的培养)。最后测定hepad38细胞上清液hbsag和hbeag的表达量，计算pei/on复合物对hbsag和hbeag分泌的抑制率，结果如图4所示，其中，*表示p<0.05为具有明显统计学差异，**表示p<0.01，***表示p<0.001。测定结果显示pei/on复合物在转染hepad38细胞株后，对hbsag的分泌有一定抑制作用，且随着寡核苷酸浓度的增加，其抑制作用增强，但不是呈剂量依赖的关系，而对hbeag的分泌没有明显抑制作用。
[0056]
实施例5
[0057]
不同长度的寡核苷酸与pei形成的复合物降低hbsag：
[0058]
将hepad38细胞按5x10
5
细胞/孔的细胞密度接种于12孔板中。制备不同长度(10nt、20nt、30nt、40nt，序列分别为seq id no.2～5)、以及不同浓度(浓度为100nm、200nm、300nm、400nm)的寡核苷酸所对应的pei/on复合物，pei/on复合物的制备方法参照实施例1。
[0059]
将制备好pei/on复合物加入hepad38细胞，置于37℃，5％co2的培养箱，孵育转染5h后，吸弃培养液，换上1ml的10％新鲜培养液，培养48h，收集细胞上清。检测hbsag和hbeag的分泌水平，复合物实验组设置生物学3个复孔，使用abbott architect免疫测定系统(abbott laboratories)对hbsag和乙型肝炎病毒e抗原(hbeag)进行了定量测量，结果如图5所示，其中，*表示p<0.05为具有明显统计学差异，**表示p<0.01。由图5可知，结果均显示除了20nt、30nt和40nt长度的寡核苷酸，pei/on(10nt)复合物转染hepad38细胞后，并不能有效降低hbsag和hbeag的水平，相对较长的寡核苷酸抑制效果更佳。而对于20nt的寡核苷酸来说，相对于pei来说更高的on比例对于hbsag的抑制效果更加明显，而对于30nt和40nt长度的寡核苷酸来说，相对于pei来说过高或过低的on比例均会弱化对于hbsag的抑制效果。
[0060]
acacacacac(seq id no.2)
[0061]
acacacacacacacacacac(seq id no.3)
[0062]
acacacacacacacacacacacacacacac(seq id no.4)
[0063]
acacacacacacacacacacacacacacacacacacacac(seq id no.5)
[0064]
实施例6
[0065]
随机序列的双链寡核苷酸与pei形成的复合物降低hbsag：
[0066]
将1ul体积的100um的随机的双链寡核苷酸(double stranded oligonucleotide，dson，一共五个样品，各样品的多核苷酸序列详见表1)水溶液与2ul的pei(1ug/ul)混合在50ul的opti-mem中，孵育15分钟(室温)后，再加入450ul opti-mem，寡核苷酸终浓度为200nm，即可用于转染细胞。
[0067]
将hepad38细胞按5x10
5
细胞/孔的细胞密度接种于12孔板中，培养24小时后，吸去培养液，加入500ul opti-mem含有pei/dson复合物的无血清培养液进行转染，培养箱内静置孵育5h后，吸弃转染液，换上1ml的10％新鲜培养液，培养48h，收集细胞上清。实验浓度设置3个复孔，并设空白对照组(不含测试复合物的培养)。测量hbsag和hbeag，统计结果并作图，结果如图6所示，其中，*表示p<0.05为具有明显统计学差异，**表示p<0.01，***表示p<0.001。由图6可知，寡核苷酸片段可以是各种随机的序列，且当寡核苷酸片段为双链片段时，同样对hbsag的分泌有非常明显的抑制作用，而对hbeag的分泌没有明显抑制作用。
[0068]
表1
[0069][0070]
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0071]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。