海参粉在制备促皮肤创面愈合药物中的应用的制作方法

[0001]
本发明涉及海参粉在制备促皮肤创面愈合药物中的应用，属于水产品利用领域。


背景技术：

[0002]
皮肤创伤是指皮肤的上皮完整性破损，并且可能伴有底层正常组织的结构和功能的破坏。创伤的类型和深度、受伤主体的健康状况、营养状况及其组织修复能力都会影响伤口愈合的速度，而伤口愈合过慢或者愈合不当均会影响受伤主体的生活质量，并存在引起细菌感染和其他并发症的风险。伤口愈合是一个复杂的动态过程，会经过止血期、炎症期、增殖期和重塑期四个阶段来完成修复，与许多炎症因子和生长因子的相互作用密不可分。研究发现，现有一系列的包括软膏、乳膏、凝胶剂和喷雾剂等外敷材料已经在促伤口愈合方面得到广泛应用。虽然及时封闭创面并提供适宜的修复环境是促创面愈合所必要的，但是受伤主体本身的营养状况也息息相关。创伤应激后机体会处于高代谢状态，蛋白质分解增强，负氮平衡和细胞总体水平下降，不及时补充营养会降低伤口的愈合速率，严重还会引起发烧、组织破损、组织溃烂、过度炎症等多种病理变化。现有研究发现，一些生物源性胶原蛋白及其酶解物能够促进细胞增殖、胶原生成和血管再生，此外，精氨酸、功能性多糖和皂苷、维生素及微量元素均能改善机体的炎症反应和氧化应激，这些都会影响伤口的愈合。
[0003]
现有文献已证实海参是一种高价值水产品，其含有多种生物活性成分，比如：海参胶原蛋白及其肽，具有抗疲劳、抗氧化、降血脂和降血压等生理功能；海参粘多糖和海参岩藻聚糖，具有抗肿瘤、抗放射性损伤和抗凝血等生理作用；海参皂苷，具有调节机体免疫能力、抗菌和抗细胞毒性等生理作用。此外，海参还含有fe、ca、mg、zn、se、ge、sr、cu等多种对人体有益的矿物质元素，是一种营养价值极高的海产品。
[0004]
目前关于海参在创伤愈合方面的研究较少，在文献调研过程中，仅发现两篇。一篇分析了海参多糖对小白鼠伤口愈合的影响，但是只有肉眼观察和伤口显微镜放大对比结果这些表观指标，对于内在指标没有涉及。另一篇分析了海参胶原低聚肽对糖尿病模型小鼠术后伤后愈合的影响，对象是糖尿病模型，不具备普适性。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述至少一个问题，本发明将海参粉应用于皮肤创面愈合中，能够显著调节皮肤创伤大鼠的炎症反应，促进大鼠创面处皮肤胶原纤维的新生，促进创面处vegf(血管内皮生长因子)、egf(表皮生长因子)和bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)的分泌，从而促进皮肤创面愈合。
[0006]
本发明的第一个目的是提供了海参粉在制备促皮肤创面愈合药物中的应用，所述的海参粉的制备方法包括如下步骤：
[0007]
(1)预处理：将新鲜的海参从腹部剖开，去除内脏和性腺，只保留海参体壁部分；先经清水浸泡，后用流水洗净海参体壁的内外表面；
[0008]
(2)匀浆：将步骤(1)处理后的海参体壁沥干，剪碎后进行匀浆；
[0009]
(3)酶解：将步骤(2)制备的匀浆液置于发酵瓶中，并加入水和复合酶进行酶解；
[0010]
(4)灭酶：将步骤(3)处理后的酶解液进行灭酶，冷却至室温；
[0011]
(5)离心：将步骤(4)处理后的酶解液离心，保留上清液；
[0012]
(6)旋蒸：将步骤(5)收集的上清液进行旋蒸，浓缩至原体积的5～15％；
[0013]
(7)冻藏：将步骤(6)处理后的浓缩液置于-90～-70℃中存储冻实；
[0014]
(8)冻干：将步骤(7)存储后的浓缩液置于冻干机中，冻干、研磨粉碎后即得到脱腥脱色的海参粉成品。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，所述的海参粉的制备方法包括如下步骤：
[0016]
(1)预处理：将新鲜的海参从腹部剖开，去除内脏和性腺，只保留海参体壁部分；先经清水浸泡3～5min，后用流水洗净海参体壁的内外表面；
[0017]
(2)匀浆：将步骤(1)处理后的海参体壁沥干，剪碎后置于多功能搅拌机内进行匀浆；
[0018]
(3)酶解：将步骤(2)制备的匀浆液置于发酵瓶中，并加入水和复合酶进行酶解，将匀浆液中的不溶蛋白酶解成溶解性较好的多肽；
[0019]
(4)灭酶：将步骤(3)处理后的酶解液进行灭酶，95～100℃沸水浴中加热10～15min，后置于凉水中冷却至室温；
[0020]
(5)离心：将步骤(4)处理后的酶解液离心，保留上清液；
[0021]
(6)旋蒸：将步骤(5)收集的上清液进行旋蒸，浓缩至原体积的1/10；
[0022]
(7)冻藏：将步骤(6)处理后的浓缩液置于-80℃超低温冰箱中存储冻实；
[0023]
(8)冻干：将步骤(7)存储后的浓缩液置于冻干机中，-80℃冷冻干燥24～48h，研磨粉碎后即可得到促皮肤创面愈合且脱腥脱色的海参粉成品。
[0024]
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中复合酶的复配比例为水产专用酶∶风味蛋白酶＝2～8∶2～8(u)，进一步优化为6～8∶2～4(u)，更进一步优化为6∶4(u)。
[0025]
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中的酶解条件为：复合酶的添加量为8000～20000u/g pro(pro＝底物蛋白含量)，酶解温度为50～55℃，ph为6.5～7.5，酶解时间为10min～6h。
[0026]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中所用的海参种类为仿刺参、梅花参、玉足海参、米氏海参、花刺参、糙海参中的一种。
[0027]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中具体操作为：将海参体壁剪成(1～2)cm
×
(1～2)cm的小碎片置于多功能搅拌机内，不超过容器体积的80％，在不加入水的条件下低速匀浆搅拌1min。
[0028]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中水产专用酶和风味蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司。
[0029]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的水产专用酶的酶活为300000u/g。
[0030]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的风味蛋白酶的酶活为30000u/g。
[0031]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的酶解条件为：复合酶的添加量为20000u/g pro，酶解温度为50～55℃，ph为6.5～7.5，酶解时间为30min～6h；更优选的，复合酶的酶解时间为30min。
[0032]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的酶解条件为：复合酶的添加量为
20000u/g pro，酶解温度为50～55℃，ph为6.5～7.5，酶解时间为1h～6h；更优选的，复合酶的酶解时间为5h。
[0033]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中匀浆液与水的质量比为1∶4(w/w)。
[0034]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中离心条件为：8000～12000rpm/min，4℃，离心15～20min。
[0035]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中离心条件为：10000rpm/min，4℃，离心20min，所得的酶解液具有脱脂除杂的特点。
[0036]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中旋蒸条件为：加入旋蒸容器的上清液量不超过容器体积的50％，转速设定为45～60rpm/min，真空度为80～120mbar，温度60～65℃，具体以溶液处于微沸状态为宜。
[0037]
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(7)中冻存操作为：将收集的浓缩液分装到底表面积较大的容器中，厚度不超过1.5cm，用保鲜膜封口，置于-80℃超低温冰箱内12～24h，将浓缩液冻实，便于低温冻干。
[0038]
本发明的第二个目的是提供一种促进创面愈合的药物，所述的药物以脱腥脱色的海参粉为活性物质。
[0039]
在本发明的一种实施方式中，所述的药物为以脱腥脱色的海参粉为活性成分按照常规工艺，加入药学上可接受的辅料制成临床上可接受的制剂。
[0040]
在本发明的一种实施方式中，所述的制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、油膏、乳霜、凝胶、敷剂、洗剂、泡沫剂、局部用溶液、糊剂或酊剂。
[0041]
在本发明的一种实施方式中，所述的促进创面愈合的药物是在创伤期间通过口服来进行机体内调。
[0042]
在本发明的一种实施方式中，口服的用量是5g/60kg(60kg的人需要服用含有5g海参粉的药物)，通过实验动物与人体的计量换算比例，大鼠∶人＝6∶1。
[0043]
本发明的第三个目的是海参粉在制备促进成纤维细胞增殖、抑制成纤维细胞凋亡、增强成纤维细胞黏附能力、促进成纤维细胞迁移能力或者促进胶原蛋白合成的药物中的应用，其中，所述的海参粉的制备方法包括如下步骤：
[0044]
(1)预处理：将新鲜的海参从腹部剖开，去除内脏和性腺，只保留海参体壁部分；先经清水浸泡，后用流水洗净海参体壁的内外表面；
[0045]
(2)匀浆：将步骤(1)处理后的海参体壁沥干，剪碎后进行匀浆；
[0046]
(3)酶解：将步骤(2)制备的匀浆液置于发酵瓶中，并加入水和复合酶进行酶解；
[0047]
(4)灭酶：将步骤(3)处理后的酶解液进行灭酶，冷却至室温；
[0048]
(5)离心：将步骤(4)处理后的酶解液离心，保留上清液；
[0049]
(6)旋蒸：将步骤(5)收集的上清液进行旋蒸，浓缩至原体积的5～15％；
[0050]
(7)冻藏：将步骤(6)处理后的浓缩液置于-90～-70℃中存储冻实；
[0051]
(8)冻干：将步骤(7)存储后的浓缩液置于冻干机中，冻干、研磨粉碎后即得到脱腥脱色的海参粉成品。
[0052]
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中复合酶的复配比例为水产专用酶：风味蛋白酶＝2～8∶2～8(u)，进一步优化为6～8∶2～4(u)，更进一步优化为6∶4(u)。
[0053]
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中的酶解条件为：复合酶的添加量为8000～
20000u/g pro(pro＝底物蛋白含量)，酶解温度为50～55℃，ph为6.5～7.5，酶解时间为10min～6h。
[0054]
本发明的有益效果：
[0055]
本发明将海参粉用于制备促皮肤创面愈合的药物，能够显著调节皮肤创伤大鼠的炎症反应，促进大鼠创面处皮肤胶原纤维的新生，促进创面处vegf(血管内皮生长因子)、egf(表皮生长因子)和bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)的分泌。
附图说明
[0056]
图1为不同种类酶的酶解液体外抗氧化效果，其中a是不同种类酶的酶解液对于dpph自由基的清除率；b是不同种类酶的酶解液的总还原能力；c是不同种类酶的酶解液对于自由基的清除率。
[0057]
图2为不同复配比例的复合酶的酶解液体外抗氧化效果，其中a是复合酶的酶解液对于dpph自由基的清除率；b是复合酶的酶解液的总还原能力；c是复合酶的酶解液对于自由基的清除率。
[0058]
图3为海参粉对sd大鼠创面伤口愈合率的影响；其中a是数据统计图，横坐标表示创伤后的天数(n＝5，不同横坐标内的不同字母代表显著性差异，p<0.05)；b是创面的直观对比图；model＝模型组，m+ynby＝阳性组，m+ldh＝低酶解度海参组，m+mdh＝中酶解度海参组，m+hdh＝高酶解度海参组。
[0059]
图4为海参粉对sd大鼠创面胶原纤维含量的影响(放大倍率，x100)；其中blank＝空白组，model＝模型组，m+ynby＝阳性组，m+ldh＝低酶解度海参组，m+mdh＝中酶解度海参组，m+hdh＝高酶解度海参组。
[0060]
图5为海参粉对sd大鼠创面hyp(羟脯氨酸)形成的影响；其中横坐标表示创伤后的天数(n＝5，不同横坐标内的不同字母代表显著性差异，p<0.05)；blank＝空白组，model＝模型组，m+ynby＝阳性组，m+ldh＝低酶解度海参组，m+mdh＝中酶解度海参组，m+hdh＝高酶解度海参组。
[0061]
图6为海参粉对sd大鼠血清中炎症因子分泌量的影响；其中a是第4天大鼠血清内il-6、il-8、il-10和tnf-α的含量；b是第8天大鼠血清内il-6、il-8、il-10和tnf-α的含量；c是第12天大鼠血清内il-6、il-8、il-10和tnf-α的含量(n＝5，不同横坐标内的不同字母代表显著性差异，p<0.05)；blank＝空白组，model＝模型组，m+ynby＝阳性组，m+ldh＝低酶解度海参组，m+mdh＝中酶解度海参组，m+hdh＝高酶解度海参组。
[0062]
图7为海参粉对sd大鼠血清抗氧化能力的影响(横坐标表示创伤后的天数(n＝5，不同横坐标内的不同字母代表显著性差异，p<0.05)；其中a是sod；b是mda；c是cat；d是gsh-px；blank＝空白组，model＝模型组，m+ynby＝阳性组，m+ldh＝低酶解度海参组，m+mdh＝中酶解度海参组，m+hdh＝高酶解度海参组。
[0063]
图8为海参粉对sd大鼠创面处生长因子分泌量的影响；其中a是vegf的含量，b是egf含量，c是bfgf含量，横坐标表示创伤后的天数(n＝5，不同横坐标内的不同字母代表显著性差异，p<0.05)；blank＝空白组，model＝模型组，m+ynby＝阳性组，m+ldh＝低酶
解度海参组，m+mdh＝中酶解度海参组，m+hdh＝高酶解度海参组。
具体实施方式
[0064]
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
[0065]
测试方法：
[0066]
1、水解度测定：
[0067]
本实验选用茚三酮比色法测定水解度，具体步骤如下：
[0068]
(1)检测波长确定：将标准甘氨酸溶液和多肽水解液进行适度稀释，作为待测样液备用。取10ml比色管，分别加入2ml样液和1ml茚三酮显色剂，震荡混匀，沸水浴反应15min，取出静置冷却5～10min，后加入5ml体积分数为40％乙醇，震荡混匀，静置15～20min，在紫外分光光度计下进行检测并选取最适吸收波长，检测波长范围为500～800nm。结果显示，最佳检测波长为570nm。
[0069]
(2)甘氨酸标准曲线的建立：准确称取10mg标准甘氨酸溶于超纯水，充分溶解后定容至100ml，即得浓度为100μg/ml的标准溶液。根据浓度梯度将标准溶液进行稀释，分别配制成50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml甘氨酸标准液。取10ml比色管，分别加入2ml各稀释度的标准液和1ml茚三酮显色剂，震荡混匀，沸水浴反应15min，取出静置冷却5～10min，后加入5ml体积分数为40％乙醇，震荡混匀，静置15～20min，在紫外分光光度计下测定吸光度，检测波长为570nm，用超纯水进行调零。根据结果建立甘氨酸标准曲线，纵坐标为吸光度，横坐标为甘氨酸浓度(μg/ml)。
[0070]
(3)水解液游离氨基氮含量的测定：分别取1ml不同水解度的海参酶解液，稀释50倍，取2ml稀释液于10ml比色管中，后续步骤如标曲建立部分所述，在570nm波长处检测吸光度，根据甘氨酸标曲计算样品中的游离氨基氮含量(μmol/ml)。
[0071]
(4)样品原液(未酶解)中游离氨基氮含量的测定：在酶解同时，取1份等质量的海参匀浆液于1个规格相同的发酵瓶中，唯一区别是不加酶，其他条件不变，然后置于恒温震荡培养箱中，分别于10min、30min和5h后依次取出10ml，离心和过滤条件也相同。取1ml滤液，稀释50倍，取2ml稀释液于10ml比色管中，后续步骤如标曲建立部分所述，在570nm波长处检测吸光度，根据甘氨酸标曲计算样品原液的游离氨基氮含量(mmol/l)。
[0072]
(5)水解度计算公式如式(1)：
[0073][0074]
其中：h为水解液的肽键的毫摩尔数，mmol；h
tot
为每克海参多肽的肽键毫摩尔数，mmol，可以根据其氨基酸组成计算，计算得出h
tot
＝8.5mmol/g；a为原液的游离氨基氮含量，mmol/g；b为水解液的游离氨基氮含量，μmol/ml；n为水解液的总氮含量，mmol/l，由凯氏定氮法测得。
[0075]
2、分子量分布测定：
[0076]
将海参粉用超纯水充分溶解，稀释成蛋白浓度为1mg/ml的澄清透明溶液。采用waters1525hplc(高效液相色谱仪)测定其分子量分布情况，该仪器配有2487紫外检测器和
em-power工作站中的gpc分析软件。
[0077]
色谱的设定参数如下：色谱柱tsk gel 2000swxl(300mm
×
7.8mm)；流动相：40％乙腈(含0.1％三氯乙酸)+60％超纯水(v/v)；检测波长220nm；流速0.5ml/min；柱温30℃；
[0078]
进样体积10μl；样品浓度1mg/ml；标品：细胞色素c(mw＝12384da)、抑肽酶(mw＝6500da)、杆菌酶(mw＝1422da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(mw＝451da)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(mw＝189da)；
[0079]
3、体外抗氧化实验
[0080]
(1)清除dpph
·
自由基能力的测定
[0081]
取10ml离心管，加入2ml酶解液和2ml 0.1mmol/l dpph
·
溶液(用95％乙醇制备)，充分混匀，室温下密闭静置30min，5000r/min离心10min，取上清液，于517nm处测吸光度。
[0082]
具体计算公式如式(2)：
[0083]
dpph
·
清除率(％)＝[1-(a
1-a2)/a0]
×
100％
ꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0084]
式中：a1—酶解液+dpph
·
溶液的吸光度；a2—酶解液+95％乙醇溶液的吸光度；a0—dpph
·
溶液+蒸馏水的吸光度。
[0085]
(2)总还原能力的测定
[0086]
采用铁氰化钾法测定。取10ml离心管，分别加入酶解液1ml、0.2mol/l磷酸缓冲液(ph＝6.6)2.5ml和5％铁氰化钾溶液2.5ml，充分混匀，于50℃静置20min。然后加入10％三氯乙酸溶液2.5ml终止反应，充分混匀，5000r/min离心10min。取上清液1.0ml，加入0.1％三氯化铁溶液0.2ml，于700nm处测吸光度。吸光度a值越大，说明样品的还原能力越强。
[0087]
(3)清除羟自由基能力的测定
[0088]
根据h2o2和fe
2+
混合后产生
·
oh，而水杨酸可以和其反应形成在510nm下有最大吸收的有色物质。取10ml离心管，加入酶解液1ml，9mmol/l feso4溶液1ml，9mmol/l水杨酸-乙醇溶液1ml和8.8mmol/lh2o2溶液1ml。从加入h2o2后启动反应，37℃放置30min，于510nm处测吸光度。
[0089]
清除率的计算公式如式(3)：
[0090]
·
oh清除率(％)＝[1-(a
1-a2)/a0]
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(3)
[0091]
式中：a1—加入样品溶液后的吸光度；a2—不加显色剂h2o2溶液的本底吸光度；a0—空白对照液(蒸馏水)的吸光度。
[0092]
4、动物实验设计：
[0093]
(1)分组及处理过程：
[0094]
共90只sd大鼠(5周龄)，检疫间适宜一周后，按体重随机分为6组，包括空白组(blank，n＝6)，模型组(model，n＝15)，阳性组(m+ynby，n＝15)，低酶解度海参粉组(m+ldh，n＝18)，中酶解度海参粉组(m+mdh，n＝18)，高酶解度海参粉组(m+hdh，n＝18)。将不同水解度的海参多肽粉复溶，按照蛋白含量进行配置，灌胃总浓度设定为0.50g pro/kg/bw，灌胃体积为0.1ml/10g/bw；阳性对照组是市售的云南白药颗粒(主要用于烧伤、骨折及术后伤口愈合不良)，剂量根据说明书的推荐剂量换算所得，灌胃体积同海参组；空白组灌胃等体积生理盐水，各组于相同时间灌胃。造模前先预防性灌胃一周，确保大鼠适应样品。
[0095]
对模型组、阳性组和3组海参组的sd大鼠进行皮肤创伤切除手术。采用浓度为1％的戊巴比妥钠溶液按35mg/kg对大鼠进行腹腔注射，使其麻醉。用电动剃毛器剃去大鼠背部
区域的毛发，并用70％酒精对手术区域进行消毒。在脊柱中部偏下的左右两侧相同位置，利用一次性圆形打孔器(10mm)制作圆形标记，配合手术剪剪去皮肤，制备全层皮肤切除伤口，并视为第0天。手术后，所有大鼠均接受1万单位的庆大霉素腹腔注射。手术结束，将苏醒的大鼠放回笼中。造模后第一天起，每日定时对大鼠进行灌胃，其余时间自由摄取食物和水。每4天对大鼠伤口创面进行等距拍照，用于后期创面观察和创面愈合率的计算。由于sd大鼠的伤口愈合能力很强，一般1-2周就可以完全愈合，所以在手术后第4天，第8天和第12天进行处死取样(每个时间点空白组n＝2、阳性组和模型组n＝5、三个海参组n＝6)。
[0096]
(2)创面愈合率计算：
[0097]
采用等距平衡光拍摄装置对大鼠创面进行拍照，皮肤伤口大小用直角尺对照显示。用adobe photoshop 2020软件中的套索工具对创面去进行准确选取，凸显创面，后用image-pro plus 6.0软件中的像素积分计算大鼠皮肤创面的面积。
[0098]
伤口愈合率是已愈合的伤口面积与原始伤口面积的比值，其中已愈合伤口面积可以用原始伤口面积减去现存伤口面积表示。具体计算公式如式(4)：
[0099][0100]
其中：a0为原始伤口面积，cm2；a为现存伤口面积，cm2。
[0101]
(3)创面masson染色
[0102]
masson染色是用2-3种阴离子染料混染，是显示组织中纤维状态的常用方法，不同的纤维会呈现不一样的染色结果。取皮肤创面，石蜡包埋切片后进行masson染色，在显微镜(100倍)下观察皮肤伤口的胶原纤维生成情况。
[0103]
(4)大鼠血清的炎症因子含量
[0104]
麻醉大鼠，待其失去知觉后立即进行心脏取血，血液采集选用一次性红头盖采血管(10ml，不含分离胶)，采血后于室温放置10～20min，自然凝固，4℃低温离心20min，转速2000～3000r/min，收集上清液。根据白介素6(il-6)、白介素8(il-8)、白介素10(il-10)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)联免疫分析试剂盒的使用说明书进行后续检测。
[0105]
(5)大鼠血清的抗氧化活性
[0106]
根据丙二醛(mda)生化试剂盒、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和过氧化物酶(cat)联免疫分析试剂盒的使用说明书进行后续检测。
[0107]
(6)大鼠创面的羟脯氨酸和生长因子含量
[0108]
根据羟脯氨酸(hyp)、血管内皮生长因子(vegf)、表皮生长因子(egf)和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)联免疫分析试剂盒的使用说明书进行后续检测。
[0109]
实施例1：不同种类酶的酶解液的制备
[0110]
(1)将新鲜的海参从腹部剖开，去除内脏和性腺，先经清水浸泡3～5min，后用流水洗净海参体壁的内外表面；
[0111]
(2)将洗净的海参体壁沥干，剪成(1～2)cm
×
(1～2)cm的小碎片后置于多功能搅拌机内，不超过容器体积的80％，在不加入水的条件下低速匀浆搅拌1min；
[0112]
(3)取160g匀浆液加入发酵瓶中，再加入640g水和112000u蛋白酶，酶解温度为50～55℃，ph为自然ph(6.5～7.5)，酶解时间为5h；
[0113]
(4)95～100℃沸水浴加热15min灭酶；
[0114]
(5)在10000rpm/min、4℃的条件下离心20min，收集上清液；得到酶解液；
[0115]
其中，步骤(3)所用的蛋白酶分别为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、水产专用酶和风味蛋白酶。按照上述水解度测定方法和分子量分布测定方法测定实施例1的酶解液的水解度和分子量分布，结果见表1，可知风味专用酶和水产蛋白酶的酶解效果较好，在相同酶解条件下可以获得更多的小分子肽。
[0116]
表1不同种类酶的酶解液的水解度及分子量分布
[0117][0118]
创面微环境中的许多细胞都能不同程度地产生活性氧等自由基，过量的自由基会造成氧化应激，所以提高创面的抗氧化能力有益于创面的愈合。对比了木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和水产专用酶的酶解液的体外抗氧化能力，筛选合适的酶进行后续实验。主要涉及dpph自由基清除率、总还原能力和羟自由基清除率，结果如图1所示。dpph
·
清除率：水产专用酶>中性蛋白酶>风味蛋白酶>木瓜蛋白酶；总还原能力：水产专用酶>风味蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶；
·
oh清除率：水产专用酶>中性蛋白酶>风味蛋白酶>木瓜蛋白酶。综合表1中这四种酶的水解度和分子量分布情况，酶解效果和体外抗氧化效果最好的为水产专用酶和风味蛋白酶。
[0119]
实施例2：不同比例复合酶的酶解液的制备
[0120]
(1)将新鲜的海参从腹部剖开，去除内脏和性腺，先经清水浸泡3～5min，后用流水洗净海参体壁的内外表面；
[0121]
(2)将洗净的海参体壁沥干，剪成(1～2)cm
×
(1～2)cm的小碎片后置于多功能搅拌机内，不超过容器体积的80％，在不加入水的条件下低速匀浆搅拌1min；
[0122]
(3)取160g匀浆液加入发酵瓶中，再加入640g水和总酶量为112000u的复合蛋白酶，酶解温度为50～55℃，ph为自然ph(6.5～7.5)，酶解时间为5h。
[0123]
(4)95～100℃沸水浴加热15min灭酶；
[0124]
(5)在10000rpm/min、4℃的条件下离心20min，收集上清液；得到酶解液；
[0125]
其中，步骤(3)所用的复合蛋白酶的比例分别为：水产专用酶∶风味蛋白酶＝0∶100；水产专用酶∶风味蛋白酶＝20∶80；水产专用酶∶风味蛋白酶＝40∶60；水产专用酶∶风味蛋白酶＝60∶40；水产专用酶∶风味蛋白酶＝80∶20以及水产专用酶∶风味蛋白酶＝100∶0。按照上述水解度测定方法和分子量分布测定方法，测定实施例2的海参酶解液的水解度和分子量分布。结果见表2，可见水产专用酶和风味蛋白酶的比例在60∶40和80∶20时酶解效果较好。
[0126]
表2不同比例复合酶的酶解液的水解度及分子量分布
[0127][0128]
将实施例2制备的各种酶解液进行体外抗氧化能力的测试，筛选最合适的样品进行后续功效验证动物实验，结果如图2所示。从图2可以看出：dpph
·
清除率、总还原能力和
·
oh清除率的效果上，水产专用酶:风味蛋白酶＝6:4的酶解液均显示最好的效果。
[0129]
实施例3：不同分子量海参粉的制备
[0130]
(1)将新鲜的海参从腹部剖开，去除内脏和性腺，先经清水浸泡3～5min，后用流水洗净海参体壁的内外表面；
[0131]
(2)将洗净的海参体壁沥干，剪成(1～2)cm
×
(1～2)cm的小碎片后置于多功能搅拌机内，不超过容器体积的80％，在不加入纯净水的条件下低速匀浆搅拌1min；
[0132]
(3)取160g匀浆液加入发酵瓶中，再加入640g纯净水和112000u复合酶(67200u水产专用酶+44800u风味蛋白酶)，酶解温度为50～55℃，ph为自然ph(6.5～7.5)；
[0133]
(4)95～100℃沸水浴加热15min灭酶；
[0134]
(5)在10000rpm/min、4℃的条件下离心20min，收集上清液；
[0135]
(6)上清液在转速45～60rpm/min、真空度80～120mbar、温度60～65℃的条件下旋蒸，具体以溶液处于微沸状态为宜，浓缩至原体积的1/10。
[0136]
(7)将浓缩液分装到大平板中，厚度约1cm，用保鲜膜封口，置于-80℃超低温冰箱内储存16h；
[0137]
(8)将冻实的浓缩液真空冷冻干燥48h，研磨粉碎后即得海参粉成品。
[0138]
其中，步骤(3)中的酶解时间分别为10min、30min、5h；酶解时间为10min的简称为低酶解度海参组；酶解时间为30min的简称为中酶解度海参组；酶解时间为5h的简称为高酶解度海参组。
[0139]
实施例4：创面愈合动物实验
[0140]
按照上述动物实验设计对比实施例3的海参粉促创面愈合的效果，同时增加了模型组(空白组)和阳性组(市售的云南白药胶囊，主要成分是草乌)进行对比，分析结果见图3～图8。
[0141]
据图3(a)数据统计图所示：创伤后第4天愈合率各组之间没有显著性；第8天阳性组显著高于模型组；第12天阳性组和三个海参组(低、中、高酶解度海参组)均显著高于模型组。同时从图3(b)直观图观察，创伤后第4天各剂量组均已结痂；第8天阳性组伤口明显小于其他组；第12天阳性组、海参中酶解度和海参高酶解度组痂壳基本脱落，出现粉嫩的新组织。故由图3可知，阳性组(市售的云南白药)确有促创面愈合的作用，实施例3中低、中、高酶解度海参组也具有促创面愈合的效果。
[0142]
伤口在愈合的过程中会有肉芽组织新生，主要是胶原纤维的增生，在伤口闭合期
促进胶原纤维生成可以促进伤口的愈合。masson染色的切片中，胶原纤维呈现蓝紫色，在灰度图中呈现出随着胶原纤维新生量的增加而从浅灰色变成深灰色的规律。从图4切片结果可知：随着愈合天数增加，创面处表皮之下的灰色区域逐渐加深，密度逐渐增大，说明胶原纤维大量合成，且呈现规则性排列；创伤后第4天阳性组和高酶解度海参组新生胶原纤维较密；第8天和第12天，除模型组外，其他各创伤组均新生了大量的胶原纤维，上皮组织重塑完整；对比正常组的皮肤切片，发现第12天阳性组和高酶解度海参组上皮化程度最优，瘢痕最薄，几乎无异与正常皮肤。
[0143]
据文献所述，羟脯氨酸是胶原蛋白的特有氨基酸，可以表征胶原含量。图5是创面组织的羟脯氨酸hyp含量，从数据看：创伤后第4天阳性组和3个海参组的分泌量显著高于模型组，且高酶解度海参组与阳性组极显著；第8天阳性组和中、高酶解度海参组显著高于模型组；第12天低酶解度组显著高于模型组，而阳性组和中、高酶解度海参组的分泌量开始降低。由图4和图5可知，海参粉对创面处羟脯氨酸和胶原纤维的形成具有调节作用。
[0144]
当机体受到损伤时，会引起炎症反应，在创面愈合过程中也会经历炎症阶段，而适度缩短炎症阶段可以促进创面的愈合。il-6，il-8，il-10和tnf-α是最常用于表示机体炎症水平的指标，其中il-10是抗炎因子，机体会通过上调其表达来抑制炎症反应，而剩下的是促炎因子，其含量大幅度提升代表机体存在炎症反应。由图6所示：三个时间段的空白组和模型组均存在显著差异，表明创伤引起机体的炎症反应，且愈合后期仍伴随炎症反应；阳性组和模型组相比，在创伤愈合前期可以显著下调促炎因子il-6，il-8和tnf-α的表达，上调抗炎因子il-10的表达，对炎症现象有抑制作用，而在第8天后开始回调至与空白组相似的水平；对比三个不同酶解度的海参组，发现中、高酶解度组存在与阳性组完全一致的趋势，而低酶解度组在前期也有抑制炎症现象的趋势，在后期的回调作用上略低于其他酶解度组。综上说明海参粉具有调节创面处炎症水平的作用。
[0145]
除了炎症，氧化应激和创面愈合也至关重要，因为氧化应激会造成细胞不同程度的损伤，延缓伤口愈合。其中，丙二醛(mda)是脂质过氧化物，其生成量可以反映机体脂质过氧化的程度，间接反应细胞损伤程度。同时，机体在面对氧化应激时可以通过提高抗氧化酶(sod、gsh-px、cat等)的活性来清除多余的自由基。从图7看，对比正常组，模型组抗氧化能力显著下降。而阳性组和三个实验组有上调抗氧化酶，下调mda的趋势，其中高水解度组有显著的作用，且到第12天，阳性组和高酶解度组恢复到正常组的水平。说明海参粉可以提高机体抗氧化能力，高酶解度组与阳性组效果一致。
[0146]
调研发现，皮肤创面愈合会伴随着多种生长因子共同调节来完成，比如：血管内皮生长因子vegf，是已知促血管生成的最强因子；表皮生长因子egf，是强有力的细胞分裂促进因子；碱性成纤维细胞生长因子bfgf，是成纤维细胞分泌的促进因子。由图8所示：模型组各生长因子在不同阶段均处于低分泌状态；在第4天，阳性组和中、高酶解度组的vegf、egf和bfgf的含量均显著高于模型组，低酶解度组也显示促进其分泌的趋势；到第12天，中、低酶解度的vegf、egf和bfgf的含量显著高于模型组，而阳性组和高酶解度组含量开始回调，且高酶解度组回调至与空白组无显著差异。综上说明海参粉具有调节创面处生长因子vegf、egf和bfgf分泌的作用，可以在促创面愈合的同时提高伤口的愈合质量，具体表现为：在创伤前期上调生长因子的分泌来促进创面闭合和表皮新生；在创伤后期下调生长因子的分泌来抑制表皮的过度增生。
[0147]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的技术和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。