一种新型眼部药物递送体系的制备方法

本发明涉及生物材料领域,尤其涉及一种新型眼部药物递送体系的制备方法。

背景技术：

青光眼是全世界失明的第二大主要原因，据估计，到2040年，全世界受青光眼影响的人数将增加到1.118亿。眼内压升高通常会导致视网膜神经节细胞进行性死亡和视神经病变。尽管使用滴眼剂降低眼压是青光眼的首选治疗方法，但该药物的眼内生物利用度非常低，通常仅为1-5％。为了达到更好的治疗效果，临床上经常给予高频和联合的给药方案。但是，长期频繁使用各种滴眼液不仅增加了药物的副作用，而且降低了患者的依从性。

目前，许多研究提出了用于结膜下给药的缓释体系，例如脂质体，热敏性水凝胶等。与传统的滴眼剂相比，这些体系虽然有效延长了药物在眼内的保留时间，但是一方面结膜下的植入不仅增加了感染的风险，而且植入后通常难以保证有效药物剂量的释放。另一方面，大多数眼科缓释体系主要用于单一药物的释放，无法满足联合给药的需求。

基于上述现状，理论上说，理想的青光眼药物缓释系统应该兼顾可以调控药物的释放，有效降低眼压和预防感染等特点。因此以雄性新西兰大白兔为前期实验对象,我们研发了一种微创的眼部药物递送体系。

技术实现要素：

本发明的目的之一是建立一种新型可调节的眼部药物递送体系。

本发明的目的之二是建立一种可以同时释放多种药物的载药体系。

本发明的目的之三是提供一种不仅可以降低眼压,而且可以控制感染的方法。

为实现上述目的,技术方案如下：

一种新型的眼部药物递送体系的制备方法为:

a.生物碳-氧化锌的制备：

(a)将秸秆剪成小段，放入管式炉中，并在300-500℃下通氮气煅烧1-5小时直至完全碳化，最后研磨成粉末以获得生物碳质；

(b)将0.1-0.5g步骤a-a制备的粉末加入到100ml的蒸馏水中，然后超声1-3小时；

(c)再将0.5-2g氯化锌和0.01-0.2g羧甲基纤维素钠缓慢加入至步骤a-b制备的溶液中，并加入50-100μl的浓硝酸将溶液的ph调至1-5；

(d)将2-5g硼氢化钠溶解在50-100ml的蒸馏水中；

(e)将a-c制备的溶液加热至80-100℃，并往其内逐渐滴加a-d制备的溶液，静置1-5小时；

(f)将a-e制备的溶液以5000-10000r的离心5-30分钟，并丢弃上清液；

(g)分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤a-f获得的粉末两遍，然后进行冻干，最后获得生物碳-氧化锌粉末。

b.水凝胶的制备

(a)首先配制5-10％(w/v)的冰醋酸溶液，然后将20-100mg的壳聚糖溶于10ml已配制的冰醋酸溶液中，最后加入100-300mg的氯化钙搅拌均匀；

(b)将步骤a制备的粉末加入至蒸馏水中,配制成0.1-0.5％(w/v)的生物碳-氧化锌溶液；

(c)配制1-5％(w/v)的海藻酸钠溶液,然后与步骤b-b制备的溶液1：1至1：5混合并搅拌均匀；

(d)将100-500mg的马来酸噻吗洛尔药物溶解在蒸馏水和步骤b-c配制的混合溶液中，并且搅拌均匀；

(e)将0.5-5g的左氧氟沙星粉末溶解在5-10ml步骤b-b配制的溶液中，并且搅拌均匀；

(f)在室温下将b-d溶液逐滴加入到b-a溶液中，交联反应1-5小时，然后用滤纸吸干表面的液体，获得水凝胶球；

(g)将步骤b-f获得的凝胶球放入步骤b-d制备的溶液中，然后取出凝胶球并加入b-a的溶液中,交联反应1-5小时，然后用滤纸吸干表面液体，以获得单层凝胶球；

(h)将步骤b-g获得的凝胶球放入步骤b-d制备的溶液中，取出凝胶球并加入b-a的溶液中,交联反应1-5小时，然后用滤纸吸干表面液体，以获得2层含马来酸噻吗洛尔的凝胶球；

(i)将步骤b-h获得的水凝胶放入至b-d制备的溶液中，再将其移入中b-a的溶液中反应1-5小时，然后用滤纸吸干表面液体；

(j)将步骤b-i获得的水凝胶放入至b-c制备的溶液中，再将其移入中b-a的溶液中反应1-5小时，然后用滤纸吸干表面液体；

(k)将步骤b-j获得的水凝胶放入至b-e制备的溶液中，再将其移入中b-a的溶液中反应1-5小时，然后用滤纸吸干表面液体；

(l)配制0.5-2％的戊二醛溶液；

(m)将步骤b-k获得的水凝胶放入至b-l制备的溶液中,反应1-5小时，最后用蒸馏水冲洗水凝胶，并其保存于阴凉通风处晾干备用。

进一步地，将步骤a中制备的生物碳-氧化锌均匀分散在步骤b制备凝胶球中。

进一步地，将左氧氟沙星和马来酸噻吗洛尔同时负载于不同层的凝胶球中,且可应用于眼部疾病的治疗。

上述方法得到的眼部药物递送体系在制备治疗眼部疾病的药物中的用途。所述眼部疾病为高眼压症或青光眼相关的疾病。

本发明合成的水凝胶生物相容性较好,而且海藻酸钠与壳聚糖交联后形成疏松多孔的网状结构,有利于药物的负载。生物碳-氧化锌的负载,使其具有一定的光热转化作用,从而调节药物的释放效率。另外,戊二醛和氧化锌可作为交联剂增加了水凝胶的交联密度,从而实现了药物的缓慢释放和提高了药物的生物利用度。

本发明提供了一种新型的眼部药物递送体系,以及其在治疗青光眼模型中的应用。本发明的有益效果在于:

(1)本发明合成的新型眼部载药体系可以同时负载不同的药物,并且延长了药物在眼部的保留时间。

(2)本发明合成的新型眼部载药体系可以通过近红外调节药物释放剂量。

(3)本发明合成的新型眼部载药体系不仅可以有效降低眼压,而且可以避免植入后的眼部感染。

附图说明

图1中,图a为凝胶球粒径图,图b为凝胶球切面扫描电镜图片，图c为凝胶球内部扫描电镜图片。

图2为凝胶球光热效率的测定。

图3为凝胶球不同药物释放效率的测定。

图4为凝胶球抗感染效果的评估。

图5为载药凝胶球降眼压效果的评估。

具体实施方式

下面结合具体实施例,对本发明进一步解释说明。

实施例1:凝胶球的形貌表征

a.生物碳-氧化锌的制备：

(a)将秸秆剪成小段，放入管式炉中，并在400℃下通氮气煅烧2小时直至完全碳化，

最后研磨成粉末以获得生物碳质；

(b)将0.25g步骤a-a制备的粉末加入到100ml的蒸馏水中，然后超声至少1小时；

(c)再将0.8178g氯化锌和0.05g羧甲基纤维素钠缓慢加入至步骤a-b制备的溶液中，

并加入80μl的浓硝酸将溶液的ph调至2；

(d)将2.2698g硼氢化钠溶解在50ml的蒸馏水中；

(e)将a-c制备的溶液加热至90℃，并往其内逐渐滴加a-d制备的溶液，静置4小时；

(f)将a-e制备的溶液以9000r的离心10分钟，并丢弃上清液；

(g)分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤a-f获得的粉末两遍，然后进行冻干，最后获得生物碳-氧化锌粉末。

b.水凝胶的制备:

(a)首先配制5％(w/v)的冰醋酸溶液，然后将50mg的壳聚糖溶于10ml已配制的冰醋酸溶液中，最后加入200mg的氯化钙搅拌均匀；

(b)将步骤a制备的粉末加入至蒸馏水中,配制成0.3％(w/v)的生物碳-氧化锌溶液；

(c)配制3％(w/v)的海藻酸钠溶液,然后与步骤b-b制备的溶液1：1混合并搅拌均匀；

(d)在室温下将b-c溶液逐滴加入到b-a溶液中，交联反应2小时，然后用滤纸吸干表面的液体，获得水凝胶球；

(e)将上一步骤获得的凝胶球放入步骤b-c制备的溶液中，然后取出凝胶球并加入b-a的溶液中,交联反应1小时，然后滤纸吸干表面的液体，以获得单层凝胶球；

(f)重复步骤b-e，以获得5层结构的凝胶球；

(g)配制0.5％的戊二醛溶液；

(h)将步骤b-f获得的水凝胶放入至b-g制备的溶液中,反应1小时，最后用蒸馏水冲洗凝胶球，并其保存于阴凉通风处晾干备用。

通过扫描电镜表征制备得到的凝胶球。结果如图1所示,凝胶球的粒径大小约2mm(图1-a),呈5层洋葱状结构的球形(图1-b),并且其内部为疏松多孔的结构(图1-c),有利于药物的负载。

实施例2:凝胶球光热转化效率的测定

(a)实验组共分为3组，每组取50mg实施例1中干燥后的凝胶球放入5ml的pbs

溶液中；

(b)对照组也分为3组，每组为5ml的pbs溶液；

(c)用808nm，功率为0.8w/cm²的近红外激光分别照射实验组和对照组，每隔5分钟记录温度变化。

结果如图2光热效率图所示，照射40分钟后，实验组凝胶球水溶液的平均温度可以达到48℃左右，而对照组平均温度只有37℃左右，表明本发明制备的凝胶球具有一定的光热转化效应。

实施例3:凝胶球不同药物释放效率的测定

1.载左氧氟沙星凝胶球的制备

a.生物碳-氧化锌的制备：

(a)将秸秆剪成小段，放入管式炉中，并在400℃下通氮气煅烧2小时直至完全碳化，最后研磨成粉末以获得生物碳质；

(b)将0.25g步骤a-a制备的粉末加入到100ml的蒸馏水中，然后超声至少1小时；

(c)再将0.8178g氯化锌和0.05g羧甲基纤维素钠缓慢加入至步骤a-b制备的溶液中，并加入80μl的浓硝酸将溶液的ph调至2；

(d)将2.2698g硼氢化钠溶解在50ml的蒸馏水中；

(e)将a-c制备的溶液加热至90℃，并往其内逐渐滴加a-d制备的溶液，静置4小时；(f)将a-e制备的溶液以9000r的离心10分钟，并丢弃上清液；

(g)分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤a-f获得的粉末两遍，然后进行冻干，最后获得生物碳-氧化锌粉末。

b.水凝胶的制备:

(a)首先配制5％(w/v)的冰醋酸溶液，然后将50mg的壳聚糖溶于10ml已配制的冰醋酸溶液中，最后加入200mg的氯化钙搅拌均匀；

(b)将步骤a制备的粉末加入至蒸馏水中,配制成0.3％(w/v)的生物碳-氧化锌溶液；

(c)配制3％(w/v)的海藻酸钠溶液,然后与步骤b-b制备的溶液1：1混合并搅拌均匀；(d)将1g的左氧氟沙星粉末溶解在10ml步骤b-c配制的溶液中，并且搅拌均匀；

(e)在室温下将b-c溶液逐滴加入到b-a溶液中，交联反应2小时，然后用滤纸吸干表面的液体，获得水凝胶球；

(f)将上一步骤获得的凝胶球放入步骤b-c制备的溶液中，然后取出凝胶球并加入b-a的溶液中,交联反应1小时，然后用滤纸吸干表面的液体，以获得单层凝胶球；

(g)重复步骤b-f，以获得4层结构的凝胶球；

(h)将步骤b-g获得的水凝胶放入至b-d制备的溶液中，再将其移入中b-a的溶液中反应1小时，然后用滤纸吸干表面的液体，；

(i)配制0.5％的戊二醛溶液；

(j)将步骤b-h获得的水凝胶放入至b-k制备的溶液中,反应1小时，最后用蒸馏水冲洗水凝胶，并其保存于阴凉通风处晾干备用；

2.凝胶球中左氧氟沙星释放效率的测定

(a)首先取载有左氧氟沙星凝胶球放入5mlpbs溶液中,随机分成光照的实验组和无光照的对照组,每组样品中含10mg/ml的凝胶球；

(b)其中光照组每天同一时间在808nm，功率为0.8w/cm²的近红外激光下照射5分钟,照射完后将其置于在37℃的恒温箱中保存；

(c)无光照组每天均置于37℃的恒温箱中保存；

(d)每隔24小时分别收集每个样品中3ml的上清液用于测定药物的释放效率,并重新加入等量的pbs溶液；

(e)每组实验重复3次。

3.载马来酸噻吗洛尔凝胶球的制备

a.生物碳-氧化锌的制备：

(a)将秸秆剪成小段，放入管式炉中，并在400℃下通氮气煅烧2小时直至完全碳化，最后研磨成粉末以获得生物碳质；

(b)将0.25g步骤a-a制备的粉末加入到100ml的蒸馏水中，然后超声至少1小时；

(c)再将0.8178g氯化锌和0.05g羧甲基纤维素钠缓慢加入至步骤a-b制备的溶液中，并加入80μl的浓硝酸将溶液的ph调至2；

(d)将2.2698g硼氢化钠溶解在50ml的蒸馏水中；

(e)将a-c制备的溶液加热至90℃，并往其内逐渐滴加a-d制备的溶液，静置4小时；(f)将a-e制备的溶液以9000r的离心10分钟，并丢弃上清液；

(g)分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤a-f获得的粉末两遍，然后进行冻干，最后获得生物碳-氧化锌粉末。

b.水凝胶的制备:

(a)首先配制5％(w/v)的冰醋酸溶液，然后将50mg的壳聚糖溶于10ml已配制的冰醋酸溶液中，最后加入200mg的氯化钙搅拌均匀；

(b)将步骤a制备的粉末加入至蒸馏水中,配制成0.3％(w/v)的生物碳-氧化锌溶液；

(c)配制3％(w/v)的海藻酸钠溶液,然后与步骤b-b制备的溶液1：1混合并搅拌均匀；

(d)将450mg的马来酸噻吗洛尔药物溶解在5ml蒸馏水和10ml步骤b-c配制的溶液中，并且搅拌均匀；

(e)在室温下将b-d溶液逐滴加入到b-a溶液中，交联反应2小时，然后用滤纸吸干表面的液体，获得水凝胶球；

(f)将步骤b-e获得的凝胶球放入步骤b-d制备的溶液中，然后取出凝胶球并加入b-a的溶液中,交联反应1小时，然后用滤纸吸干表面液体，以获得单层含马来酸噻吗洛尔的凝胶球；

(g)将步骤b-f获得的凝胶球放入步骤b-d制备的溶液中，取出凝胶球并加入b-a的溶液中,交联反应1小时，然后用滤纸吸干表面液体，以获得2层含马来酸噻吗洛尔的凝胶球；

(h)将步骤b-g获得的水凝胶放入至b-d制备的溶液中，再将其移入中b-a的溶液中反应1小时，然后用滤纸吸干表面液体，以获得3层含马来酸噻吗洛尔的凝胶球；

(i)将步骤b-h获得的水凝胶放入至b-c制备的溶液中，再将其移入中b-a的溶液中反应1小时，然后用滤纸吸干表面液体，获得4层凝胶球；

(j)将步骤b-i获得的水凝胶放入至b-c制备的溶液中，再将其移入中b-a的溶液中反应1小时，然后用滤纸吸干表面液体，获得5层凝胶球；

(k)配制0.5％的戊二醛溶液；

(l)将步骤b-j获得的水凝胶放入至b-k制备的溶液中,反应1小时，最后用蒸馏水冲洗水凝胶，并其保存于阴凉通风处晾干备用。

4.凝胶球中马来酸噻吗洛尔释放效率的测定

(a)首先取载马来酸噻吗洛尔凝胶球放入5mlpbs溶液中,随机分成光照的实验组和无光照的对照组,每组样品中含10mg/ml的凝胶球；

(b)其中光照组每天同一时间在808nm,功率为0.8w/cm²的近红外激光下照射5分钟,

照射完后将其置于在37℃的恒温箱中保存；

(c)无光照组每天均置于37℃的恒温箱中保存；

(d)每隔24小时分别收集每个样品中3ml的上清液用于测定药物的释放效率,并重新加入等量的pbs溶液；

(e)每组实验重复3次。

结果如图3所示,无光照组的凝胶球可以较稳定的释放药物,而且在内层的马来酸噻吗洛尔释放时间较外层左氧氟沙星释放时间更长。并且,与无光照组相比,近红外光照组的药物释放量明显增加。以上结果表明，本发明合成了较稳定的光控型凝胶球，且具有较好的药物释放效率。

实施例4:一种新型眼部药物递送体系的制备方法为:

a.生物碳-氧化锌的制备：

(a)将秸秆剪成小段，放入煅烧炉中，并在400℃下通氮气煅烧2小时直至完全碳化，

最后研磨成粉末以获得生物碳质；

(b)将0.25g步骤a-a制备的粉末加入到100ml的蒸馏水中，然后超声至少1小时；

(c)再将0.8178g氯化锌和0.05g羧甲基纤维素钠缓慢加入至步骤a-b制备的溶液中，

并加入80μl的浓硝酸将溶液的ph调至2；

(d)将2.2698g硼氢化钠溶解在50ml的蒸馏水中；

(e)将a-c制备的溶液加热至90℃，并往其内逐渐滴加a-d制备的溶液，静置4小时；

(f)将a-e制备的溶液以9000r的离心10分钟，并丢弃上清液；

(g)分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤a-f获得的粉末两遍，然后进行冻干，最后获得生物碳-氧化锌粉末。

b.水凝胶的制备:

(a)首先配制5％(w/v)的冰醋酸溶液，然后将50mg的壳聚糖溶于10ml已配制的冰醋酸溶液中，最后加入200mg的氯化钙搅拌均匀；

(b)将步骤a制备的粉末加入至蒸馏水中,配制成0.3％(w/v)的生物碳-氧化锌溶液；

(c)配制3％(w/v)的海藻酸钠溶液,然后与步骤b-b制备的溶液1：1混合并搅拌均匀；

(d)将450mg的马来酸噻吗洛尔药物溶解在5ml蒸馏水和10ml步骤b-c配制的溶液中，并且搅拌均匀；

(e)将1g的左氧氟沙星粉末溶解在10ml步骤b-c配制的溶液中，并且搅拌均匀；

(f)在室温下将b-d溶液逐滴加入到b-a溶液中，交联反应2小时，然后用滤纸吸干表面的液体，获得水凝胶球；

(g)将步骤b-f获得的凝胶球放入步骤b-d制备的溶液中，然后取出凝胶球并加入b-a的溶液中,交联反应1小时，然后用滤纸吸干表面的液体，以获得单层凝胶球；

(h)将步骤b-g获得的凝胶球放入步骤b-d制备的溶液中，取出凝胶球并加入b-a的溶液中,交联反应1小时，然后用滤纸吸干表面的液体，以获得2层含马来酸噻吗洛尔的凝胶球；

(i)将步骤b-h获得的凝胶球放入步骤b-d制备的溶液中，取出凝胶球并加入b-a的溶液中,交联反应1小时，然后用滤纸吸干表面的液体，以获得3层含马来酸噻吗洛尔的凝胶球；

(j)将步骤b-i获得的水凝胶放入至b-c制备的溶液中，再将其移入中b-a的溶液中反应1小时，然后用滤纸吸干表面的液体；

(k)将步骤b-j获得的水凝胶放入至b-e制备的溶液中，再将其移入中b-a的溶液中反应1小时，然后用滤纸吸干表面的液体；

(l)配制0.5％的戊二醛溶液；

(m)将步骤b-k获得的水凝胶放入至b-l制备的溶液中,反应1小时，最后用蒸馏水冲洗水凝胶，并其保存于阴凉通风处晾干备用。

实施例5:载药凝胶球对新西兰大白兔治疗效果的评价

1.抗感染疗效的评估

(1)将正常雄性新西兰大白兔随机分成空载凝胶组和载药凝胶组,每组各3只；

(2)使用动物麻醉机麻醉兔子,然后将实施例3中制备得到的载左氧氟沙星的凝胶球植入到兔子的球结膜下；

(3)每天同一时间用无菌棉签拭取术后切口处的分泌物,然后用5ml无菌生理盐水稀释并进行涂板,重复5次；

(4)将涂好后的琼脂板置于37℃的恒温箱内孵育24小时后拍照并计数；

(5)连续3天观察切口并拭取术后切口处的分泌物进行培养。

结果如图4所示,其中图a为连续3天培养各组兔眼结膜分泌物的琼脂平板菌落数图像,图b是各组培养结膜分泌物后菌落数的统计图。结果显示将凝胶球植入后,结膜未见明显感染,但是载左氧氟沙星组的菌落数明显少于空载组。这些结果表明该凝胶球有较好的生物相容性,并且载有左氧氟沙星的凝胶球具有较明显的抗感染效果。

2.降眼压效果的评估

a.兔子高眼压模型的建立：

(a)将卡波姆溶解在无菌的pbs溶液中，并充分摇匀，最终配制成0.3％的卡波姆溶液；

(b)使用动物呼吸麻醉机麻醉兔子后，再用丁卡因滴眼液对眼睛进行局部表麻；

(c)将0.1ml步骤a-a配制的无菌卡波姆溶液注射到兔子的前房内，以诱导兔子眼压的升高；

(d)每两天监测并记录眼压，连续监测两周；

(e)然后将建模成功的兔子随机分成3组，每组3只兔子，且各组之间的眼压无明显差异；

(f)在3只高眼压兔子的结膜下分别植入10mg的空载凝胶球，另外6只高眼压兔子的结膜下植入载有马来酸噻吗洛尔的凝胶球；

(g)进一步将载药组兔子随机分成2组，一组为近红外照射组，另一组为无近红外照射组。光照组每天同一段在808nm和功率为0.8w/cm²的近红外激光下照射5分钟；

(h)每两天监测并记录眼压，连续监测两周。

结果如图5所示,空载凝胶组兔子眼压一直维持在30mmhg左右，而载药凝胶组兔子的眼压均有明显的下降。并且如图所示，近红外照射组的降压效果与无近红外照射组对比，具有更明显的降压效果。

通过上述实验表明：本发明所述的基于水凝胶的新型眼部药物递送体系，不仅可以加载和稳定释放不同的药物，而且可以通过光控调节药物的释放量，以达到更好的治疗效果。

以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。