一种花椒毒酚水溶性纳米新剂型的制备方法及应用与流程

[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体为一种花椒毒酚水溶性纳米新剂型的制备方法及应用。


背景技术：

[0002]
目前我国冠心病发病率总体上呈现上升态势,该病最常见也是最严重的后果就是发生急性心肌梗死,虽然及时进行血运重建挽救了部分急性缺血患者,在此过程中不可避免会发生心肌缺血/再灌注损伤。心肌i/r损伤削弱了血运重建治疗的疗效,而且多数心肌梗死患者最终都会进展为心力衰竭；严重危害着国人的身体健康,并给社会和家庭带来沉重的负担。
[0003]
花椒毒酚是一种线型呋喃香豆素，存在于伞形科、芸香科、桑科、爵床科以及鼠李科植物，主要来源于伞形科植物蛇床、白芷等。熔点为252～254℃，分子量为202.16，分子式为c11h6o4，金黄色或米色结晶，可溶于氯仿、乙酸乙酯、dmso等溶剂，不溶于水。研究发现花椒毒酚具有抗炎、扩张血管平滑肌、抗心律失常和阻滞钙通道的作用。xt对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤具有保护作用，主要通过抑制黏附分子icam-1和e-selectin表达，抑制髓过氧化物酶活性，降低脑mi/r后中性粒细胞在脑组织中的浸润，抑制局部脑组织炎症反应；增强na+,k+,ca2+相关的atpase活性，降低脑mi/r后脑组织水肿和神经原损伤。本研究通过纳米载体技术,解决花椒毒酚不溶于水的重大技术问题,使之在临床中得到更为广泛和有效的应用。
[0004]
由于花椒毒酚难溶于水，药物提炼效果差，生物利用度低，通过纳米粒子载体来提高其生物利用度，解决其水溶性和靶向性问题，并使其有效克服皮肤，黏膜，细胞膜等生理屏障，避免产生继发性耐药现象，降低免疫应答水平，同时也可用于其他中药成分载体，提高其生物利用度和药效。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种花椒毒酚水溶性纳米新剂型的制备方法及应用，解决了花椒毒酚难溶于水，药物提炼效果差，生物利用度低的问题。
[0006]
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种花椒毒酚水溶性纳米新剂型的制备方法，具体包括以下步骤：
[0007]
s1、将泊洛沙姆和右旋糖肝溶于100ml盐酸中，用乳化器高速乳化，缓慢逐滴加入1g钠盐，继续乳化，然后转移至磁力搅拌器以1000rpm搅拌20h，通过正交试验发现ph为4，泊洛沙姆为0.5，右旋糖肝为0.5时所制备的pbca纳米颗粒最优；
[0008]
s2、称取处方量的xt、聚乳酸、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶溶于一定量的二氯甲烷，用注射器加入到1％pva水溶液中，超声乳化数分钟，乳液于30℃搅拌挥发3-4小时，挥去有机溶剂，将所得液体放入离心器中于4000r/min离心15分钟，收集上清液即得浅蓝色纳米胶体溶液；
[0009]
s3、将制得的xt-pca-np混悬液置于超滤离心管上4℃离心，5000g离心10min，用重蒸水离心洗涤3次后，用移液枪将膜上的纳米粒浓缩溶液全部取出，用少量重蒸水洗涤膜上残留的纳米粒，合并上述液体并用重蒸水补足至1ml，超声10min后，20000g离心5min，采用hplc-ms/ms法测定药物含量，按下式计算包封率和载药量包封率＝w1/wtotal
×
100％；载药量＝w1/wnp
×
100％。
[0010]
优选的，所述步骤s3中w1为超滤膜上浓缩纳米粒中花椒毒酚的总量；wtotal为加入纳米粒中花椒毒酚的总量；wnp为纳米粒总重量。
[0011]
优选的，所述步骤s1中加入1g钠盐的装置为胶头滴管，所述步骤步骤s1中的乳化时间为5分钟。
[0012]
优选的，得到的花椒毒酚水溶性纳米新剂型在改善心肌缺血、再灌注损伤中的应用。
[0013]
有益效果
[0014]
本发明提供了一种花椒毒酚水溶性纳米新剂型的制备方法及应用。与现有技术相比具备以下有益效果：
[0015]
该花椒毒酚水溶性纳米新剂型的制备方法及应用，通过在s1、将泊洛沙姆和右旋糖肝溶于100ml盐酸中，用乳化器高速乳化，缓慢逐滴加入1g钠盐，继续乳化，然后转移至磁力搅拌器以1000rpm搅拌20h，通过正交试验发现ph为4，泊洛沙姆为0.5，右旋糖肝为0.5时所制备的pbca纳米颗粒最优；s2、称取处方量的xt、聚乳酸、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶溶于一定量的二氯甲烷，用注射器加入到1％pva水溶液中，超声乳化数分钟，乳液于30℃搅拌挥发3-4小时，挥去有机溶剂，将所得液体放入离心器中于4000r/min离心15分钟，收集上清液即得浅蓝色纳米胶体溶液；s3、将制得的混悬液置于超滤离心管上4℃离心，5000g离心10min，用重蒸水离心洗涤3次后，用移液枪将膜上的纳米粒浓缩溶液全部取出，用少量重蒸水洗涤膜上残留的纳米粒，合并上述液体并用重蒸水补足至1ml，超声10min后，20000g离心5min，采用hplc-ms/ms法测定药物含量，按下式计算包封率和载药量包封率＝w1/wtotal
×
100％；载药量＝w1/wnp
×
100％，通过纳米粒子载体来提高其生物利用度，解决其水溶性和靶向性问题，并使其有效克服皮肤，黏膜，细胞膜等生理屏障，避免产生继发性耐药现象，降低免疫应答水平，同时也可用于其他中药成分载体，提高其生物利用度和药效。
附图说明
[0016]
图1为本发明xt-pca-np在重蒸水中的体外释放曲线。
具体实施方式
[0017]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0018]
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种花椒毒酚水溶性纳米新剂型的制备方法，具体包括以下步骤：
[0019]
s1、将泊洛沙姆和右旋糖肝溶于100ml盐酸中，用乳化器高速乳化，缓慢逐滴加入
1g钠盐，继续乳化，然后转移至磁力搅拌器以1000rpm搅拌20h，通过正交试验发现ph为4，泊洛沙姆为0.5，右旋糖肝为0.5时所制备的pbca纳米颗粒最优；
[0020]
s2、称取处方量的xt、聚乳酸、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶溶于一定量的二氯甲烷，用注射器加入到1％pva水溶液中，超声乳化数分钟，乳液于30℃搅拌挥发3-4小时，挥去有机溶剂，将所得液体放入离心器中于4000r/min离心15分钟，收集上清液即得浅蓝色纳米胶体溶液；
[0021]
s3、将制得的混悬液置于超滤离心管上4℃离心，5000g离心10min，用重蒸水离心洗涤3次后，用移液枪将膜上的纳米粒浓缩溶液全部取出，用少量重蒸水洗涤膜上残留的纳米粒，合并上述液体并用重蒸水补足至1ml，超声10min后，20000g离心5min，采用hplc-ms/ms法测定药物含量，按下式计算包封率和载药量包封率＝w1/wtotal
×
100％；载药量＝w1/wnp
×
100％。
[0022]
本发明实施例中，步骤s3中w1为超滤膜上浓缩纳米粒中花椒毒酚的总量；wtotal为加入纳米粒中花椒毒酚的总量；wnp为纳米粒总重量。
[0023]
本发明实施例中，步骤s1中加入1g钠盐的装置为胶头滴管，步骤步骤s1中的乳化时间为5分钟。
[0024]
本发明实施例中，得到的花椒毒酚水溶性纳米新剂型在改善心肌缺血、再灌注损伤中的应用。
[0025]
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
[0026]
体外释放实验
[0027]
采用动态透析法测定纳米粒的体外释药，精密量取新制备的载药纳米粒1ml 3份，置于事先在蒸馏水中浸泡24h的透析袋中，两端用透析夹夹紧，置于250ml锥形瓶中，加入200ml重蒸水中。将锥形瓶放入(37
±
0.5)℃恒温的振荡器中，100r
·
min振荡，于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72h取样0.5ml，同时加入新鲜介质0.5ml，取出的溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液用hplc-ms/ms测定花椒毒酚的浓度。
[0028]
药物代谢动力学实验
[0029]
健康雄性wistar大鼠12只，体重约220g，随机分成2组，每组6只，实验前大鼠禁食过夜(不禁水)，乙醚麻醉后分别用灌胃器灌胃：
①
单独给予花椒毒酚溶液(3mg
·
kg-1，对照组)；
②
花椒毒酚纳米粒(3mg
·
kg-1，实验组)。给药前取空白血，于给药后第0、0.08、0.17、0.33、0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、24h取血0.3ml，置于涂有肝素的离心试管中，10000g离心10min，分离出血浆，置于－20℃冰箱中保存待测。根据血药浓度，计算药物代谢动力学数据。
[0030]
花椒毒酚pca-np在小鼠心肌缺血、再灌注损伤中药效学测定
[0031]
实验动物：40只6-8周龄雄性balb/c小鼠随机分为4组,每组10只小鼠。
[0032]
a组:生理盐水+假手术；
[0033]
b组:普通制剂花椒毒酚+假手术处理小鼠；
[0034]
c组:生理盐水+手术处理；
[0035]
d组:纳米化花椒毒酚+手术处理小鼠。
[0036]
小鼠缺血、再灌注损伤模型建立及实验动物预处理：应用阻断/开放左冠状动脉前降支血流建立缺血再灌注模型。缺血45分钟,再灌注12小时,观察各组小鼠存活率和测定小
鼠心功能。其中a，c两组小鼠术前给予生理盐水5ml灌胃，b，d两组小鼠术前给予3mg/kg花椒毒酚灌胃预处理。其中假手术组仅开胸，不结扎冠状动脉。
[0037]
指标检测
[0038]
采用实时定量rt-pcr和western bolt法分别检测bax,bcl-2,caspase-3,cytc表达。
[0039]
心肌组织形态检测：采用he染色观察心肌组织形态改变情况。
[0040]
心肌梗死面积检测：采用伊文思蓝-ttc染色评价心肌梗死范围。
[0041]
心肌梗死标志物检测：采用酶联免疫吸附测定法(elsa)检测血清中乳酸脱氢酶，肌酸激酶及同工酶，肌钙蛋白水平。
[0042]
心功能检测：采用millar压力传导导管(model spr-839,size 1.4f)经右侧颈动脉送至左心室,采用powerlab chart5(ad1nstruments,colorado spring,usa)连续记录信号,应用心脏压力-容积分析软件(pvan3.2,millar 1nstruments,usa)分析心功能各项参数。
[0043]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0044]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。