一种抗过敏组合物及其在制备抗过敏制剂中的应用

24小时，即得mif-algaas/gaas hemt生物传感器；
8.(2)待测样品溶液的制备：
9.升麻苷标准品溶液：精密称取升麻苷标准品(分子量为468.45)2.3mg于5ml容量瓶中，用浓度为0.1m的pbs溶液定容，混匀，即得浓度约为1.0mm的升麻苷标准品溶液；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm升麻苷标准品溶液，备用；
10.苦杏仁苷标准品溶液：精密称取苦杏仁苷标准品(分子量为457.45)2.3mg于5ml容量瓶中，用浓度为0.1m的pbs溶液定容，混匀，即得浓度约为1.0mm的升麻苷标准品溶液；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm升麻苷标准品溶液，备用；
11.5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量组合物溶液：分别配制浓度均为0.2m的5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品pbs(0.1m)溶液和苦杏仁苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm升麻苷标准品溶液，备用；
12.升麻苷与苦杏仁苷等物质的量组合物溶液：分别配制浓度均为2.0mm的升麻苷标准品pbs(0.1m)溶液和苦杏仁苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm升麻苷标准品溶液，备用；
13.5-o-甲基维斯阿米醇苷与升麻苷苷等物质的量组合物溶液：分别配制浓度均为0.2m的5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品pbs(0.1m)溶液和苦杏仁苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm升麻苷标准品溶液，备用；
14.(3)待测样品与mif相互作用测定：
15.以制备好的mif-algaas/gaas hemt生物传感器为反应器件，按浓度由低到高(0.1pm至1.0mm)依次向mif-algaas/gaas hemt器件上加入5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量组合物溶液，采用探针平台和电化学工作站记录源极-漏极间的电流强度(i
ds
)，不同浓度下的i
ds-v
ds
信号如图1(a)所示；由图可知，当浓度范围为1.0pm-0.1mm时，i
ds
信号的绝对值呈规律性下降；以5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量组合物溶液浓度的对数(lg[ag])为横坐标，以i
ds
变化相对值(i-i0)/i0为纵坐标，进行线性拟合，结果表明当浓度范围为1.0pm-0.1mm时，线性关系较好；取1.0pm-10nm五个浓度点进行线性拟合，结果如图1(b)所示，由图可知，线性关系良好，方程为y＝-0.05910x-0.8778(r2＝0.9936)；根据此浓度范围，以5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量组合物溶液的浓度([ag])为横坐标，以浓度([ag])/电流变化(i-i0,δi)为纵坐标，进行线性拟合，结果如图1(c)所示，得到线性方程为y＝616.96x+4e-08(r2＝0.9996)；根据公式
[0016][0017][0018][0019]
其中[ab]为syk浓度，[ag]为5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量组合物溶液的浓度[c]，k及ka为结合常数，kd为解离常数，δi为电流变化值，δi
max
为电流最大变化值。
[0020]
计算5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量组合物与mif相互作用的解离常数kd，得kd＝6.483
×
10-11
m。
[0021]
(4)同理测定并计算升麻苷与mif的相互作用强度为kd＝4.531
×
10-11
m，苦杏仁苷与与mif的相互作用强度为kd＝7.959
×
10-11
m；升麻苷与苦杏仁苷组合物溶液(1:1)与mif的相互作用强度为kd＝7.027
×
10-11
m；升麻苷与5-o-甲基维斯阿米醇苷混合溶液(1:1)与mif的相互作用强度为kd＝4.869
×
10-11
m，结果分别见图2-图5。
[0022]
本发明进一步提供了基于斑马鱼实验的抗过敏中药有效成分组合物的抗过敏活性检测方法。
[0023]
(1)样品溶液制备：
[0024]
升麻苷标准品溶液：精密称取升麻苷标准品(分子量为468.45)4.7mg于10ml容量瓶中，用浓度为0.1m的pbs溶液定容，混匀，即得浓度约为1.0mm的升麻苷标准品溶液；按2倍浓度梯度稀释4次，依次得500μm、250μm、125μm、62.5μm升麻苷标准品溶液，备用；
[0025]
苦杏仁苷标准品溶液：精密称取苦杏仁苷标准品(分子量为457.45)4.6mg于10ml容量瓶中，用浓度为0.1m的pbs溶液定容，混匀，即得浓度约为1.0mm的苦杏仁苷标准品溶液；按2倍浓度梯度稀释4次，依次得500μm、250μm、125μm、62.5μm苦杏仁苷标准品溶液，备用；
[0026]
5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品与苦杏仁苷标准品等物质的量混合溶液：分别配制浓度均为0.2m的5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品pbs(0.1m)溶液和苦杏仁苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按2倍浓度梯度稀释4次，备用；
[0027]
升麻苷标准品与苦杏仁苷标准品等物质的量混合溶液：分别配制浓度均为2.0mm的升麻苷标准品pbs(0.1m)溶液和苦杏仁苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按2倍浓度梯度稀释4次，备用；
[0028]
(2)斑马鱼胚胎获取：雌、雄斑马鱼分开喂养，照明14h和黑暗10h交替进行，以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体定时喂养。采卵时取健康性成熟的斑马鱼按雌、雄1:1的比例放入交配缸内，次日9-10时获得受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0mm nacl，0.17mm kcl，0.4mm cacl2，0.16mm mgso4)中，28℃下控光培养；
[0029]
(3)斑马鱼分组、药物处理及图像获取：在斑马鱼胚胎发育至3dpf(days post fertilization)时，挑选健康斑马鱼，小心随机吸入24孔板各孔中，每孔10枚胚胎。设定空白对照组、模型组、阳性药组和药物处理组，其中阳性药物为布洛芬(blf)，药物处理组分别为苦杏仁苷组(a)、升麻苷组(c)、5-o-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷等物质的量组合物组(a+m)、苦杏仁苷和升麻苷等物质的量组合物组(a+c)。阳性药组给予20μm布洛芬溶液。五个给药组分别给予62.5、125、250、500和1000μm四种溶液(苦杏仁苷溶液、升麻苷溶液、5-o-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷组合物溶液、苦杏仁苷和升麻苷组合物溶液)。空白对照组和模型组给予斑马鱼养殖水。给药24h后，用20μm 5h2o
·
cuso4处理模型组、阳性药组和药物处理组。5h2o
·
cuso4处理1h后，从各组中随机取6条斑马鱼，用0.22％三卡因麻醉1min，置于体式荧光显微镜(axio zoom.v16,zeiss,oberkochen,germany)下拍照。
[0030]
(4)数据处理：5h2o
·
cuso4可引起斑马鱼急性炎症，其特征是巨噬细胞迅速迁移到侧线神经丘。使用image-pro plus软件记录各组斑马鱼巨噬细胞迁移数量。
[0031]
(5)斑马鱼巨噬细胞迁移数量：斑马鱼巨噬细胞迁移数量以相对于模型组数量的百分比进行归一化。
[0032]
(6)各组给药组结果见图6和图7。由图可知，相比模型组，升麻苷在五个浓度下
(62.5、125、250、500和1000μm)均具有抑制作用，且在250μm时抑制作用最强，甚至强于阳性对照组，这表明浓度为250μm的升麻苷溶液具有较好的抑制巨噬细胞迁移的抗过敏作用；同样地，苦杏仁苷的五个给药浓度(62.5、125、250、500和1000μm)也均具有较好的抑制巨噬细胞迁移的抗过敏作用，其中也是在250μm浓度下作用最强；升麻苷和苦杏仁苷等物质的量组合物在125μm时具有抑制作用，而5-o-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷等物质的量组合物在125μm、250μm、500μm三个浓度下均具有抑制作用，但是抑制作用较单体而言均相对较弱。
[0033]
本发明还提供了抗过敏有效成分组合物在抗过敏制剂制备中的应用，包含有效成分及其组合物或其药学上可接受的盐或前药；用于治疗由过敏引起的巨噬细胞浸润、迁移、释放炎症因子而导致的与过敏相关的疾病；所述的过敏症状包括过敏体质引起的过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性皮疹、过敏性紫癜。
[0034]
进一步优选地，所述抗过敏有效成分组合物还包含药学上可接受的辅料或载体。
[0035]
不同剂型制备步骤如下：
[0036]
(1)丸剂：取5-o-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、升麻苷三者中任意一种单体或其中两种单体等物质的量组合物作为药物，取淀粉、交联羧甲基纤维素钠分别粉碎过100目筛，混合均匀，用水泛丸，干燥，每丸含药物为0.1～500mg，检验合格，包装即得。
[0037]
(2)口服液：取5-o-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、升麻苷三者中任意一种单体或其中两种单体等物质的量组合物作为药物，取适量矫味剂，加活性炭适量，加热30min，滤过，加水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，每毫升含药物0.1～500mg，检验合格，包装即得。
[0038]
(3)糖浆：取5-o-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、升麻苷三者中任意一种单体或其中两种单体等物质的量组合物作为药物，取加水溶解，加蔗糖400-600g、防腐剂适量，煮沸溶解，滤过，加水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，每毫升含药物0.1～850mg，检验合格，包装即得。
[0039]
(4)散剂、片剂、胶囊、颗粒剂、浸膏剂：取5-o-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、升麻苷三者中任意一种单体或其中两种单体等物质的量组合物作为药物，按此四种剂型的常规工艺制备，每片或每颗胶囊中含药物0.1～850mg；散剂或颗粒剂每小袋为1g含药物为0.1～850mg，经检验合格后，包装即得。
[0040]
本发明所述药物中，所述作为抗过敏的活性成分，可以作为单独的活性成分，也可以作为活性成分之一。
[0041]
本发明所用的“药学上可接受的辅料或载体”指药学领域常规的药用辅料和药物载体，具体包括：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯叱咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅料如矫味剂β-环糊精、柠檬酸等。
[0042]
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。所述药物的制剂形式包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂、喷雾剂、软膏剂、栓剂、膜剂、控释剂、缓释剂或纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式给予患者。口服制剂包括常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，液体制剂包括水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酗剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注
hydrochloride，edc)和浓度为50mm的n-羟基丁二酰亚胺(n-hydroxysuccinimide，nhs)的等体积混合水溶液，活化反应15-30min，生成稳定的胺类活化产物，用于活化羧基；用磷酸盐缓冲溶液(pbs)清洗algaas/gaas hemt器件，加入mif蛋白的pbs溶液，置4℃冷藏反应2-24小时，即得mif-algaas/gaas hemt生物传感器；电化学工作站测试结果显示，mif修饰之后，相比巯基丙酸修饰后的器件，i
ds-v
ds
曲线发生显著变化，表明蛋白成功修饰于hemt器件之上。
[0062]
(2)待测样品溶液的制备：
[0063]
升麻苷标准品溶液：精密称取升麻苷标准品(分子量为468.45)2.3mg于5ml容量瓶中，用浓度为0.1m的pbs溶液定容，混匀，即得浓度约为1.0mm的升麻苷标准品溶液；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm升麻苷标准品溶液，备用；
[0064]
苦杏仁苷标准品溶液：精密称取苦杏仁苷标准品(分子量为457.45)2.3mg于5ml容量瓶中，用浓度为0.1m的pbs溶液定容，混匀，即得浓度约为1.0mm的升麻苷标准品溶液；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm升麻苷标准品溶液，备用；
[0065]
5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量组合物溶液：分别配制浓度均为0.2m的5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品pbs(0.1m)溶液和苦杏仁苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm 5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量组合物标准品溶液，备用；
[0066]
升麻苷与苦杏仁苷等物质的量组合物溶液：分别配制浓度均为2.0mm的升麻苷标准品pbs(0.1m)溶液和苦杏仁苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm升麻苷与苦杏仁苷等物质的量组合物标准品溶液，备用；
[0067]
5-o-甲基维斯阿米醇苷与升麻苷等物质的量组合物溶液：分别配制浓度均为0.2m的5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品pbs(0.1m)溶液和升麻苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按10倍浓度梯度稀释10次，依次得0.1mm至0.1pm5-o-甲基维斯阿米醇苷与升麻苷等物质的量组合物溶液，备用；
[0068]
(3)以制备好的mif-algaas/gaas hemt生物传感器为反应器件，按浓度由低到高(0.1pm至1.0mm)依次向mif-algaas/gaas hemt器件上加入5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品与苦杏仁苷标准品溶液，采用探针平台和电化学工作站记录源极-漏极间的电流强度(i
ds
)，不同浓度下的i
ds-v
ds
信号如图1(a)所示；由图可知，当浓度范围为1.0pm-0.1mm时，i
ds
信号的绝对值呈规律性下降；以5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品与苦杏仁苷标准品溶液浓度的对数(lg[ag])为横坐标，以i
ds
变化相对值(i-i0)/i0为纵坐标，进行线性拟合，结果表明当浓度范围为1.0pm-0.1mm时，线性关系较好；取1.0pm-10nm五个浓度点进行线性拟合，结果如图1(b)所示，线性关系良好，方程为y＝-0.05910x-0.8778,r2＝0.9936；根据词浓度范围，以5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品与苦杏仁苷标准品溶液的浓度([ag])为横坐标，以浓度([ag])/电流变化(i-i0,δi)为纵坐标，进行线性拟合，结果如图1(c)所示，得到线性方程为y＝616.96x+4e-08,r2＝0.9996；根据公式
[0069][0070]
[0071][0072]
其中[ab]为syk浓度，[ag]为5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量溶液的浓度[c]，k及ka为结合常数，kd为解离常数，δi为电流变化值，δi
max
为电流最大变化值。
[0073]
计算5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量组合物与mif相互作用的解离常数kd，得kd＝6.483
×
10-11
m。
[0074]
(4)同理测定升麻苷、苦杏仁苷等与mif相互作用强度，结果分别如图2-图5所示。计算升麻苷与mif的相互作用强度为kd＝4.351
×
10-11
m，苦杏仁苷与与mif的相互作用强度为kd＝7.959
×
10-11
m；升麻苷与苦杏仁苷混合溶液(1:1)与mif的相互作用强度为kd＝7.027
×
10-11
m；5-o-甲基维斯阿米醇苷与升麻苷混合溶液(1:1)与mif的相互作用强度为kd＝4.869
×
10-11
m。
[0075]
实施例6基于斑马鱼实验的抗过敏组合物的抗过敏活性研究
[0076]
(1)待测样品溶液的制备：
[0077]
升麻苷标准品溶液：精密称取升麻苷标准品(分子量为468.45)4.7mg于10ml容量瓶中，用浓度为0.1m的pbs溶液定容，混匀，即得浓度约为1.0mm的升麻苷标准品溶液；按2倍浓度梯度稀释4次，依次得500μm、250μm、125μm、62.5μm升麻苷标准品溶液，备用；
[0078]
苦杏仁苷标准品溶液：精密称取苦杏仁苷标准品(分子量为457.45)4.6mg于10ml容量瓶中，用浓度为0.1m的pbs溶液定容，混匀，即得浓度约为1.0mm的苦杏仁苷标准品溶液；按2倍浓度梯度稀释4次，依次得500μm、250μm、125μm、62.5μm苦杏仁苷标准品溶液，备用；
[0079]
5-o-甲基维斯阿米醇苷与苦杏仁苷等物质的量混合溶液：分别配制浓度均为0.2m的5-o-甲基维斯阿米醇苷标准品pbs(0.1m)溶液和苦杏仁苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按2倍浓度梯度稀释4次，备用；
[0080]
升麻苷与苦杏仁苷等物质的量混合溶液：分别配制浓度均为2.0mm的升麻苷标准品pbs(0.1m)溶液和苦杏仁苷pbs(0.1m)溶液，两者等体积混合；按2倍浓度梯度稀释4次，备用；
[0081]
(2)斑马鱼胚胎获取：雌、雄斑马鱼分开喂养，照明14h和黑暗10h交替进行，以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体定时喂养。采卵时取健康性成熟的斑马鱼按雌、雄1:1的比例放入交配缸内，次日9-10时获得受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0mm nacl，0.17mm kcl，0.4mm cacl2，0.16mm mgso4)中，28℃下控光培养；
[0082]
(3)斑马鱼分组、药物处理及图像获取：在斑马鱼胚胎发育至3dpf(days post fertilization)时，挑选健康斑马鱼，小心随机吸入24孔板各孔中，每孔10枚胚胎。设定空白对照组、模型组、阳性药组和药物处理组(苦杏仁苷组、升麻苷组、5-o-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷混合组、苦杏仁苷和升麻苷混合组)。阳性药组给予20μm布洛芬溶液。五个给药组分别给予62.5、125、250、500和1000μm五种溶液(5-o-甲基维斯阿米醇苷溶液、苦杏仁苷溶液、升麻苷溶液、5-o-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷混合溶液、苦杏仁苷和升麻苷混合溶液)。空白对照组和模型组给予斑马鱼养殖水。给药24h后，用20μm 5h2o
·
cuso4处理模型组、阳性药组和药物处理组。5h2o
·
cuso4处理1h后，从各组中随机取6条斑马鱼，用0.22％三卡因麻醉1min，置于体式荧光显微镜(axio zoom.v16,zeiss,oberkochen,germany)下拍照。
[0083]
(4)数据处理：5h2o
·
cuso4可引起斑马鱼急性炎症，其特征是巨噬细胞迅速迁移到侧线神经丘。使用image-pro plus软件记录各组斑马鱼巨噬细胞迁移数量。
[0084]
(5)斑马鱼巨噬细胞迁移数量：斑马鱼巨噬细胞迁移数量以相对于模型组数量的百分比进行归一化。
[0085]
(6)各组给药组结果见图6和图7。由图可知，相比模型组，升麻苷在五个浓度下(62.5、125、250、500和1000μm)均具有抑制作用，且在250μm时抑制作用最强，甚至强于阳性对照组，这表明浓度为250μm的升麻苷溶液具有较好的抑制巨噬细胞迁移的抗过敏作用；同样地，苦杏仁苷的五个给药浓度(62.5、125、250、500和1000μm)也均具有较好的抑制巨噬细胞迁移的抗过敏作用，其中也是在250μm浓度下作用最强；升麻苷和苦杏仁苷等物质的量组合物在125μm时具有抑制作用，而5-o-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷等物质的量组合物在125μm、250μm、500μm三个浓度下均具有抑制作用，但是抑制作用较单体而言均相对较弱。
[0086]
实施例7抗过敏组合物不同剂型的制备
[0087]
(1)丸剂：取5-o-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、升麻苷三者中任意一种单体或其中两种单体等物质的量组合物作为药物，取淀粉、交联羧甲基纤维素钠分别粉碎过100目筛，混合均匀，用水泛丸，干燥，每丸含药物为0.1～500mg，检验合格，包装，即得。
[0088]
(2)口服液：取5-o-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、升麻苷三者中任意一种单体或其中两种单体等物质的量组合物作为药物，取适量矫味剂，加活性炭适量，加热30min，滤过，加水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，每毫升含药物0.1～500mg，检验合格，包装，即得。
[0089]
(3)糖浆：取5-o-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、升麻苷三者中任意一种单体或其中两种单体等物质的量组合物作为药物，取加水溶解，加蔗糖400g、防腐剂适量，煮沸溶解，滤过，加水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，每毫升含药物0.1～850mg，检验合格，包装，即得。
[0090]
(4)散剂、片剂、胶囊、颗粒剂、浸膏剂：取5-o-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、升麻苷三者中任意一种单体或其中两种单体等物质的量组合物作为药物，按此五种剂型的常规工艺进行制备，片剂、胶囊规格为每片或每颗胶囊中含药物0.1～850mg；散剂或颗粒剂规格为每小袋为1g含药物为0.1～850mg，经检验合格后，包装，即得。