BAFF抗体在制备脓毒血症药物中的应用的制作方法

本发明属于医疗技术领域，尤其涉及baff(b淋巴细胞刺激因子)抗体在脓毒血症药物中的应用。

背景技术：

脓毒血症是一个全身性的感染。也就说化脓性细菌侵入血流后，在其中大量繁殖，并通过血液扩散至宿体的其他组织或器官，产生新的化脓病灶。脓毒血症属于病情较重的全身化脓感染之一，由一个局部感染，导致全身的感染，有时局部感染、病灶不太清楚，但是也可以造成全身感染，最后引起所谓的脓毒血症。脓毒血症早期是局部存在化脓病灶，发病后出现高热、烦躁不安、恶心呕吐、嗜睡、头痛、脱水、酸中毒等症状。到了中后期出现皮下多发脓肿，同时这些脓肿好发于躯干，开始为单个。后呈多发，脓肿初期为硬结样，约一周后才出现波动，此时穿刺物为脓性液。

目前阻断baff生物学活性的制剂主要有抗baff抗体和baff的可溶型受体两大类，其中baff抗体包括lymphostat-b、egfp/scfvf8、anti-baffscfv、anti-baffscfv-fc等。

目前尚无baff在脓毒血症及相关疾病治疗药物中的应用。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供baff抗体在制备脓毒血症药物中的应用，主要为治疗脓毒血症及相关疾病提供了一种新的方案，也给baff抗体提供了一种新的应用。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

baff抗体在制备治疗脓毒血症药物中的应用。

baff抗体在制备预防脓毒血症药物中的应用。

baff抗体在制备防治脓毒血症引起的器官损伤药物中的应用。

baff抗体在制备控制脓毒血症引起的炎症反应药物中的应用。

治疗脓毒血症药物，其中，有效成分为baff抗体。

一种情况，所述baff抗体为抗人baff单克隆抗体。

一种情况，所述器官损伤包括肠道、肝脏、肾脏和心肌的损伤。

一种情况，所述肠道损伤包括肠道黏膜屏障功能损伤、肠道黏膜通透性损伤。

一种情况，所述炎症反应包括肠道炎症反应。

一种情况，所述炎症反应由促炎细胞因子tnf-α、il-6、il-1β的其中一种或多种分泌所引起。

一种情况，所述baff抗体在药物中作为抑制促炎细胞因子tnf-α、il-6、il-1β中一种或多种物质分泌的成分的应用。

术语“抗体”取其最广泛的含义，包括单一的baff单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、以及中和抗体)以及具有多表位特异性的抗baff抗体组合物。本文中实用的“单克隆抗体”指从一组基本上均一的抗体中得到抗体，即除了可能存在极少量天然发生的突变外，抗体个体之间是相同的。

本发明也包括与baff-配体或其受体特异性反应的baff抗体；可通过标准方法制备抗-蛋白质/抗-肽抗血清或单克隆抗体。可用免疫原形式的肽免疫哺乳动物，如小鼠，仓鼠或兔。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包括与载体偶联，或本领域众所周知的其它技术。

可在佐剂的存在下施用baff-配体或其受体的免疫原性部分。可通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测免疫的进程。将免疫原用作抗原时，可使用标准的elisa或其它免疫分析来评估抗体的水平。

本文所述baff抗体欲包括也能与baff-配体或其受体特异性反应的抗体片断；可使用常规技术使抗体片断化，并使用与上文所述的筛选完整抗体相同的方法来筛选抗体片断以供使用。例如，通过用胃蛋白酶处理抗体可产生f(ab’)2片段。可处理所得f(ab’)2片段以还原二硫键，产生fab’片段。本发明的抗体进一步包括生物特异性的和嵌合的分子，所述分子具有抗-baff-配体或抗-baff-配体-受体活性。因此，可使用抗baff-配体，肿瘤-配体及其受体的单克隆和多克隆抗体(ab)，以及诸如fab’和f(ab’)2等抗体片段来阻断所述配体与其各自受体的作用。

另外，可合成识别baff-配体或其受体的重组“人源化抗体”。人源化抗体是主要含有人igg序列的嵌合体，其中插入了负责特异性抗原-结合的区域。用所需抗原免疫动物，分离相应的抗体，除去负责特异性抗原结合的可变区序列部分。然后将来自动物的抗原结合区域克隆至人抗体基因中已缺失了抗原结合区域的相应位置。

本发明的有益效果是：

提供了一种针对脓毒血症新的治疗药物，能够有效的抑制脓毒血症引起的如器官损伤、炎症等关联性疾病；也为baff抗体提供了一种新的用途。

附图说明

图1为baff在lps诱导的脓毒血症小鼠中表达情况示意图；

图2为baff抗体干预对脓毒血症小鼠存活率和组织损伤影响情况示意图；

图3为baff抗体干预对脓毒血症小鼠血清中炎症因子表达影响；

图4为baff抗体干预对脓毒血症小鼠肠道组织损伤影响结果示意图；

图5为baff抗体干预对脓毒血症小鼠肠道炎症、肠黏膜通透性影响示意图；

图6为baff抗体干预调控nf-κb/mlck/mlc信号通路上调zo-1和occludin蛋白表达。

具体实施方式

下面通过一些具体的实例对本发明进行进一步的说明：

baff抗体在制备治疗脓毒血症药物中的应用。

baff抗体在制备预防脓毒血症药物中的应用。

baff抗体在制备防治脓毒血症引起的器官损伤药物中的应用。

baff抗体在制备控制脓毒血症引起的炎症反应药物中的应用。

治疗脓毒血症药物，其中，有效成分为baff抗体。

一种情况，所述baff抗体为抗人baff单克隆抗体。

一种情况，所述器官损伤包括肠道、肝脏、肾脏和心肌的损伤等。

一种情况，所述肠道损伤包括肠道黏膜屏障功损伤、肠道黏膜通透性损伤等。

一种情况，所述炎症反应包括肠道炎症反应等。

一种情况，所述炎症反应由促炎细胞因子tnf-α、il-6、il-1β的其中一种或多种分泌所引起。

验证方法

1.材料

1.1实验动物

雄性c57bl/6j小鼠，6-8周龄，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，于spf级动物实验中心进行饲养。

1.2主要设备、试剂

低温及-80℃超低温冰箱(panasonic)，荧光光度计(thermofisherscientific)，光学显微镜(nikon)，mini-cycler热循环仪(roche)，多功能酶标仪(tecan)，pcr仪(roche)，低温离心机(eppendorf)，western显影仪(azurebiosystem)，全自动低温组织匀浆仪(上海豫明仪器有限公司)，全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技公司)，涡旋震荡仪(上海净信科技公司)，摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)。

lps(sigma-aldrich)；baff中和抗体(sandy-2，adipogen)(baff(d7i1u)rabbitmab#19944，adipogen)(humanbaff/tnfsf13b(hbaff)#89628，adipogen)均具有类同的实验结果，结果差异较小，近似为相同结果，由于实验结果相近，为了避免赘述在下述结果中采用sandy-2，adipogen作为代表，同时也代表着其他类型抗体结果；trizo(ltakara)；逆转录及pcr试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；蛋白裂解液、一抗稀释液和二抗稀释液(碧云天)；上样缓冲液和bca试剂盒(thermofisherscientific)；page凝胶快速制备试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司)；组织固定液(武汉赛维尔生物科技有限公司)；zo-1抗体(thermofisher)；occludin抗体、p65抗体、p-p65抗体、iκbα抗体、p-iκbα抗体、兔gapdh抗体(abclonal)；mlc、p-mlc抗体(cellsignalingtechnology)；mlck抗体(immunoway)；bsa、驴抗兔二抗和ecl试剂盒(武汉安特捷生物技术有限公司)；小鼠baffelisa试剂盒(r&d)；小鼠il-1β、il-6、il-10、tnf-α、d-lactate、dao、mpoelisa试剂盒(武汉华联科生物技术有限公司)。

2.方法

2.1构建lps诱导的小鼠脓毒血症模型及baff中和抗体干预

1)实验分组：雄性c57bl/6小鼠70只，随机分为对照组、lps4h组、lps8h组、lps+anti-baff组，其中lps8h组为10只小鼠，其余三组均为20只/组。小鼠于spf级动物房中适应性喂养7天后进行后续实验。

2)实验干预：对照组:予腹腔注射400ulpbs溶液；lps4h组和lps8h组：予腹腔注射lps(30mg/kg)+对照抗体(2mg/kg)；lps+anti-baff组：予腹腔注射lps(30mg/kg)+baff抗体(2mg/kg)。

3)小鼠处死及标本采集：对照组、lps4h组、lps+anti-baff组于干预后4h处死小鼠，0.5％戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠后进行眼球取血，室温静置2h，3000rpm4℃低温离心15min后取上层血清储存于-80℃备用。沿腹中线打开腹腔及胸腔，留取结肠、空肠、回肠、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏。取一段回肠组织于组织固定液中常温固定24h后行石蜡切片及h&e染色；其余组织取下并洗净后迅速保存于-80℃冰箱中，用于后续elisa、rt-qpcr和westernblot检测。

2.2多器官损伤的血清生化标志物检测

用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中谷丙转氨酶(glutamicpyruvictransaminase，alt)、谷草转氨酶(glutamicoxalacetictransaminase，ast)、肌酐(creatinine，cr)、乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase，ldh)的水平。

2.3苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，h&e)

1)回肠组织在组织固定液中固定24h，经梯度浓度的乙醇脱水，二甲苯中透明后，用石蜡包埋并切片；

2)脱蜡：依次将玻片置于二甲苯、100％乙醇、95％乙醇及80％乙醇中脱蜡；

3)染色：入苏木素染液10分钟，至细胞核为紫红色，再用流水冲洗1min至细胞核为鲜亮的蓝色—0.5％盐酸酒精分色3～10seconds，镜下观察—流水冲洗5～10s—饱和碳酸锂水溶液复蓝15～20s—流水冲洗1min—70％乙醇5min，80％乙醇5min—1％伊红染液1～3min—95％乙醇5min，100％乙醇5min—二甲苯+乙醇(1：1)5min，纯二甲苯5min；

4)封片：滴加一小滴中性树脂并用盖玻片封片，自然风干。

2.4小肠组织病理评分

chiu’s病理评分评价小鼠回肠黏膜损伤程度，具体如下：

2.5baff抗体干预对lps诱导的脓毒血症小鼠生存率的影响

雄性c57bl/6小鼠30，分为对照组、lps组、lps+anti-baff组，10只/组，适应性喂养7天后分别予上述相同干预，予自由饮水和进食，每隔12h观察并记录各组小鼠死亡率，共观察72h至lps组小鼠全部死亡。

2.6肠黏膜通透性检测

雄性c57bl/6小鼠30只，分为对照组、lps组、lps+anti-baff组，10只/组，各组分别予上述相同干预后，予200ulfitc-dextran4kd(25mg/ml)灌胃，4h后处死各组小鼠，并取约500ul全血标本，室温静置2h后3000rpm4℃低温离心15min后取上层血清，使用荧光分光光度计在490nm和520nm处检测血清中的荧光水平。

2.7小肠原代上皮细胞的提取

1)取小鼠回肠段标本约5cm，纵行剪开肠段，于经高压灭菌的冰pbs中充分漂洗，洗去肠段表面残留血迹及肠腔内容物。

2)将肠段在冰上快速剪碎后置于含1mmol/ldtt、1mmol/ledta的40ml高压灭菌的冰pbs中，于37℃水浴箱中孵育20min，同时持续轻轻震荡。

3)200目滤布过滤经步骤2)处理的组织悬液，去除未消化完全的肠组织，收集含有肠上皮细胞的细胞滤液，重复该步骤2次。

4)细胞滤液于800g4℃离心3min，小心弃去上清液，10ml0.1％bsa/pbs溶液重悬细胞沉淀，并轻柔地上下颠倒以清洗细胞。

5)细胞悬液于800g4℃离心5min，后重复步骤4)和5)共2次。

6)用灭菌的冰pbs重悬细胞沉淀制成细胞悬液，细胞计数板计数后备用。

2.8组织匀浆液的准备

1)各组小鼠均剪取约50mg回肠、结肠、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏组织，用pbs(0.01m,ph7.4)冲洗，洗去组织表面残留的血液或杂质。

2)将组织块剪碎，碎块应尽量小，便于匀浆得更充分。

3)将组织加入预冷的450ulpbs(组织重量：pbs体积＝1:9，临用前加入蛋白酶抑制剂)，在全自动研磨仪中低温匀浆。

4)吸取匀浆液到离心管，4℃10000rpm离心5～10min，取上清，-80℃保存，用于后续baff的elisa检测。

2.9酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)

检测血清和各组织中的baff、回肠组织mpo(myeloperoxidase)以及血清中il-1β、il-6、il-10、tnf-α、d-lactate、dao(diamineoxidase)水平，根据试剂盒说明书操作，以baff试剂盒为例，操作步骤简述如下：

1)复温：取出试剂盒及样本于室温下放置20min，摇匀试剂；

2)试剂溶液及样本的准备：

①baff捕获抗体：用0.5mlpbs配置baff捕获抗体，并用移液器轻轻吹打混匀，放置15min使其充分溶解，再用reagentdiluent将其稀释至工作浓度。

②baff检测抗体：用1ml试剂稀释剂配置baff检测抗体，并用移液器轻轻吹打混匀，放置15min使其充分溶解，再用试剂稀释剂将其稀释至工作浓度。

③标准品：用0.5ml试剂稀释剂配置baff标准品，并用移液器轻轻吹打混匀，根据说明书依次进行倍比稀释。

④streptavidin-hrp：用试剂稀释剂将其稀释至工作浓度。

3)从铝箔袋中取出所需板条，剩余密封后放回4℃储存；

4)每孔加入100ulbaffcaptureantibody包被，用封板膜封板，温育过夜；

5)洗板：弃掉板条内液体，每孔加入洗板液400ul/，静置1min，共重复洗3次后在干净滤纸上拍干板条；

6)每孔加入300ulreagentdiluent，用封板膜封板，温育1小时。

7)重复步骤5)；

8)加入标准品和待测样本，100ul/孔，封板膜密封，温育2小时；

9)重复步骤5)；

10)加入baffdetectionantibody，100ul/孔；封板膜密封，室温孵育2小时；

11)重复步骤5)；

12)加入工作浓度的streptavidin-hrp，100ul/孔；封板膜密封，室温避光孵育20分钟；

13)重复步骤5)；

14)加入底物溶液，100ul/孔；封板膜密封，室温避光孵育20分钟；

15)加入终止液，50ul/孔，避光；

16)立即用酶标仪在450nm和570nm波长处测定od值，570nm波长的od值用以矫正；

17)用标准品od值绘制4参数logistic回归曲线，根据标准曲线计算待测样品浓度，再乘以样品稀释倍数。

2.10实时定量聚合酶链式反应(realtimequantitativepolymerasechainreaction，rt-qpcr)

2.10.1组织rna的提取

1)用经高压灭菌的眼科剪和镊子剪取小鼠回肠组织约20mg，迅速置入含1mltrizol的高压灭菌的2mlep管中，并加入3颗小磁珠，于研磨仪中65hz120sec低温匀浆2次；

2)向组织匀浆液中加入200ul氯仿，用力上下颠倒摇晃ep管15s后室温静置5min，低温离心15min(12000rpm)。离心后液体分为三层，其中上层无色溶液为rna相；

3)用移液器吸取300ul上层无色溶液，加入300ul异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5min，低温离心15min(12000rpm)；

4)使用移液器小心弃除ep管中所有溶液，ep管底部沉淀即为提取的rna沉淀，将1ml预冷的75％乙醇加入ep管中，用移液器轻轻地吹打清洗rna沉淀，低温离心5min(12000rpm)；

5)弃掉上清后倒置ep管于干净的滤纸上，干燥1min，使残留的乙醇挥发。

6)根据rna沉淀量用移液器加入适量的depc水溶解沉淀，并轻轻吹打使沉淀充分溶解。

7)rna浓度检测：使用分光光度计测定rna浓度，首先用高压的清洗比色杯后加入100ulddh2o调零。于比色杯中加入2ul提取的rna溶液和98ulddh2o，于280nm吸光度处测定rna浓度，记录rna的纯度及浓度。

2.10.2逆转录

1)cdna合成根据逆转录试剂盒说明书进行，根据需要合成cdna的量和提取的rna浓度计算所需rna用量。

2)配制反应体系：以10ul反应体系为例

3)逆转录：在minipcr仪中进行逆转录，程序为37℃15min～85℃15sec～4℃，即可得到相应的cdna。

2.10.3实时定量pcr

1)配pcr反应体系：10ul扩增体系组成：tbgreen5ul，引物1ul、cdna1ul、ddh2oul；

2)加样：将配好的反应体系加入96孔pcr板中，加样完毕后用封板膜封闭96孔板并离心。

3)扩增程序：95℃10min—95℃30s—60℃30s—72℃1min，40个循环扩增—溶解曲线，95℃0s、65℃15s、95℃0s。

4)结果分析：以β-actin作为内参，采用2^-△△ct方法进行计算和分析。

2.11蛋白免疫印迹(westernblot，wb)

2.11.1组织总蛋白的提取

1)总蛋白提取：用无菌眼科剪和镊子剪取约50mg回肠组织迅速置入2ml无菌ep管中，加入250ul蛋白裂解液(蛋白裂解液：蛋白酶抑制剂＝100：1)和2颗磁珠。在组织匀浆机中进行低温匀浆后，每间隔5min于涡旋震荡仪上震荡，反复震荡6次后，低温离心15min(12000rpm)，吸取上清即为提取的组织蛋白。

2)测定蛋白浓度：根据bca试剂盒说明书操作：1)倍比稀释标准品；2)在96孔板中加入样品(24ulpbs和1μl步骤1)中所得待测蛋白样品)以及25ul稀释好的各浓度的标准品；3)配制工作液:取50份试剂a和1份试剂b混合均匀，在每孔中加入工作液200μl，将96孔板放在37℃的恒温箱中温育30min；4)在酶标仪中用570nm波长测定各孔od值，根据标准品的od值和浓度作标准曲线，将待测样品od值代入标曲方程式中计算待测蛋白浓度；

3)蛋白变性：向提取的蛋白上清液中以4:1的比例加入上样缓冲液，置于仪器中在100℃时反应10min，样本保存于-80℃超低温冰箱。

2.11.2wb实验步骤

1)洗涤玻璃板、组装制胶器。

2)配制分离胶：按照说明书配制适量10％分离胶，每块玻璃板加入约7ml分离胶，然后在分离胶上缓慢地加入蒸馏水进行水封，室温静置30min等待分离胶凝固。弃掉上层水后用滤纸将水吸干。

3)配制浓缩胶：依照说明书配5％浓缩胶，向玻璃板中加入浓缩胶后，迅速将梳子插入浓缩胶中，室温下静置30min待浓缩胶凝固。

4)加样：按配方配置电泳液，向电泳槽中倒满电泳液，根据样本蛋白浓度计算上样量后进行上样。

5)电泳：用150v电压电泳至溴酚蓝到达玻璃板底端后终止电泳。

6)切胶&转膜：将pvdf膜置于甲醇中活化15s。根据蛋白marker以及待测蛋白分子量用小刀片在相应位置切胶，将pvdf膜置于转膜夹的黑色面，将相应的胶贴在对应的pvdf膜上，注意不能产生气泡，在整个操作过程中注意胶和pvdf膜需要保持湿润；转膜：用橡皮筋捆紧转膜夹后将其置于转膜槽中，将转膜槽置于冰水混合物中以降温，用350ma恒流转膜，不同目的蛋白转膜时间不同，根据分子量确定具体转膜时间。

7)封闭：将转膜后的pvdf膜放置于封闭液(5％bsa)中，在室温下于摇床上缓慢摇动封闭至少1h。

8)孵育一抗：根据抗体说明书以合适的比例用一抗稀释液稀释一抗，将条带置于抗体孵育盒中，在4℃冰箱中于摇床上缓慢摇动孵育过夜。

9)洗涤一抗：次日取出条带，用tbst溶液置于室温摇床上快速摇动洗涤条带，10min/次，共洗3次，每次洗涤后均需更换新的tbst溶液。

10)孵二抗：根据抗体说明书以1：2000的比例用二抗稀释液稀释兔二抗，将条带置于抗体孵育盒中在室温下于摇床上缓慢摇动孵育1h。

11)洗涤二抗：取出条带，用tbst溶液置于室温摇床上快速摇动洗涤条带，10min/次，共洗3次，每次洗涤后均需更换新的tbst溶液。

12)化学发光：将ecl试剂盒中a液和b液等体积充分混匀配制曝光液，条带均匀的孵上曝光液后铺在显影板上，置于凝胶成像仪中曝光。

13)图像分析：用aic.alphaview软件进行灰度值分析。

2.12统计学分析

使用graphpadprism7.0进行实验数据统计学分析和绘图，统计结果用均数±标准差表示。各组小鼠生存率曲线采用kaplan-meier方法进行统计分析。根据实验数据类型，组间差异分析采用单因素方差分析(one-wayanova)或mann–whitney检验。p<0.05时认为组间差异具有统计学意义。

结果

1.baff在lps诱导的脓毒血症小鼠中表达升高

通过elisa检测了baff在lps诱导的脓毒血症小鼠的血清及各器官中的表达情况。如图1所示，与对照组相比，脓毒血症小鼠的血清、小肠、结肠、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏中baff表达均明显升高(p<0.05)。在肾脏和肝脏中baff浓度在lps干预4h时高于lps干预8h组，但此差异无统计学意义，而在lps干预4h组小鼠的血清及其他各器官组织中baff表达均明显高于lps干预8h组(p<0.05)，lps8h组小鼠的脾脏和肺脏中baff含量与对照组无明显差异，说明在脓毒血症早期，血液循环中的baff和局部器官组织中baff表达即开始升高并达到高峰，之后会逐渐下降。

图1baff在脓毒血症小鼠血清及各组织器官中表达升高。control：对照组；lps4h：腹腔注射lps造模4h组；lps8h：腹腔注射lps造模8h组；lps+anti-baff4h：予腹腔注射lps和baff抗体干预4h组。与control组相比，*p<0.05，**p<0.01；与lps4h组相比，##p<0.01；ns表示与control组或lps4h组相比，p>0.05。

2.baff抗体干预增加了脓毒血症小鼠存活率，并减轻了器官组织损伤

图2a各组小鼠生存率曲线图，与模型组相比，**p<0.01；图2b各组小鼠血清alt、ast、cr、ldh，与control组相比，**p<0.01；与lps组相比，#p<0.05，##p<0.01。

图1结果表明，baff抗体干预后，小鼠血清及各器官组织中baff含量明显降低，说明baff中和抗体效果显著。结果显示(图2a)，阻断baff可显著增加lps诱导的脓毒血症小鼠的72h存活率。由于脓毒血症的死亡与多器官功能障碍密切相关，进行了各组小鼠血清中alt、ast、cr、ldh等器官损伤的生化指标检测，上述血清标志物分别反映了肝脏、肾脏和心肌损伤的程度。结果如图2b所示，与对照组相比，lps诱导的脓毒血症小鼠血清中alt、ast、cr和ldh均显著升高，而baff抗体干预可明显降低上述四种血清标志物表达水平，说明阻断baff对多器官损伤具有保护作用。

图2baff抗体干预可提高脓毒血症小鼠生存率，减轻多器官损伤程度。

3.baff抗体干预抑制了脓毒血症小鼠血清中炎症因子表达

过度的炎症反应是导致脓毒血症多器官功能衰竭和不良预后的重要机制之一。脓毒血症时血清中il-1β、il-6、tnf-α等炎症介质产生显著增加。结果显示(图3)，脓毒血症小鼠血清中上述炎症因子水平明显高于对照组，而baff抗体干预可逆转该效应，baff抗体干预组小鼠血清中il-1β、il-6、tnf-α表达水平相较于lps组显著降低，但阻断baff对血清il-10水平没有明显影响，说明阻断baff抑制了脓毒血症小鼠的系统性炎症因子表达。

图3baff抗体干预可降低脓毒血症小鼠系统性炎症因子表达。与control组相比，**p<0.01；与lps组相比，#p<0.05，ns表示p>0.05。

4.baff抗体干预减轻脓毒血症小鼠肠道组织损伤

脓毒血症时肠道黏膜屏障功能受损是导致多器官功能衰竭和死亡的重要原因，评估了baff抗体干预对脓毒血症小鼠肠道组织炎症和损伤程度的影响。将回肠部分节段做h&e染色(图4a)，并对其进行chiu’s病理损伤评分(图4b)，结果显示，对照组小鼠小肠黏膜完整、小肠绒毛排列整齐，lps组小肠黏膜严重损伤，表现为炎症细胞大量浸润、小肠绒毛缩短或断裂、黏膜固有层暴露、毛细血管扩张等，而lps+anti-baff组小肠黏膜损伤程度较lps组明显减轻。脓毒血症早期小肠黏膜局部中性粒细胞大量浸润，小肠组织mpo活性增加是脓毒血症时小肠组织损伤的重要炎症标志物。如图4c所示，lps干预使小肠组织mpo浓度显著增加，而baff抗体干预可降低脓毒血症小鼠小肠组织mpo浓度。上述结果表明，baff抗体干预可缓解脓毒血症小鼠肠道组织炎症和黏膜损伤程度。

图4baff抗体干预可减轻脓毒血症小鼠回肠组织损伤。(a)小鼠回肠组织病理切片h&e染色，100x；(b)回肠组织chiu’s病理评分；(c)回肠组织mpo。与control组相比，**p<0.01；与lps组相比，#p<0.05。

5.baff抗体干预减轻了脓毒血症小鼠肠道炎症，改善了肠黏膜通透性

阻断baff可降低脓毒血症小鼠血清中il-1β、il-6、tnf-α等炎症因子水平，改善全身性炎症反应，通过h&e染色也发现baff抗体干预组脓毒血症小鼠小肠黏膜损伤也显著减轻。

检测小鼠小肠组织il-1β、il-6、tnf-α、il-10的mrna水平表达，结果如图5a所示，相较于对照组，lps干预使小肠局部炎症因子表达明显升高，而baff抗体干预则可使il-1β、il-6、tnf-α、il-10mrna表达均显著降低。肠黏膜上皮细胞在肠道损伤炎症反应中起重要作用，也是肠道局部炎症因子的重要来源之一，提取了各组小鼠原代肠上皮细胞，检测了原代肠上皮细胞中il-1β、il-6、tnf-α、il-10mrna表达水平(图5b)，结果显示，lps组原代肠上皮细胞中上述四种炎症介质mrna表达水平均升高，而baff抗体干预则可逆转该效应。上述结果表明，baff抗体干预可通过下调小肠局部il-1β、il-6、tnf-α、il-10mrna表达水平从而减轻肠道炎症反应。

脓毒血症时，肠道黏膜通透性受损，使得肠道细菌和内毒素移位入血，加剧全身炎症反应和多器官功能障碍。在健康生理状态下，fitc-dextran不能透过肠道黏膜屏障入血，而当肠黏膜完整性受损时，fitc-dextran则可通过肠道黏膜屏障，从而在血液中可检测到。dao表达于小肠绒毛上皮细胞，当肠黏膜受损时，黏膜上皮细胞脱落，dao被释放进入血液循环。d-lactate是肠道细菌代谢产物，当肠道黏膜屏障功能受损时可透过肠黏膜入血。检测小鼠血清中fitc-dextran、dao、d-lactate水平来反映小肠黏膜通透性和屏障功能受损情况。结果如图5c所示，与对照组相比，lps诱导的脓毒血症小鼠血清中fitc-dextran、dao、d-lactate水平显著升高，而baff抗体干预可使血清中上述三种指标降低，说明阻断baff可改善小肠黏膜通透性，减轻小肠黏膜屏障功能损伤。

图5baff抗体干预可缓解脓毒血症小鼠回肠组织炎症，改善肠黏膜通透性。

(a)小鼠回肠组织il-1、il-6、tnf-α、il-10mrna表达；(b)小鼠原代肠上皮细胞il-1、il-6、tnf-α、il-10mrna表达；(c)小鼠血清fitc-dextran、dao、d-lactate。与control组相比，**p<0.01；与lps组相比，#p<0.05，##p<0.01。

6.baff抗体干预通过调控nf-κb/mlck/mlc信号通路上调zo-1和occludin蛋白表达

肠道黏膜通透性和屏障功能的完整性与肠道紧密连接蛋白密切相关。采用westernblot检测了zo-1和occludin两种紧密连接蛋白的表达水平。结果显示，lps干预使zo-1和occludin蛋白表达减少，baff抗体干预则使zo-1和occludin蛋白表达回升(图6a和6b)。结果如图6c和6d所示，脓毒血症时mlck/mlc通路显著活化，而baff抗体干预则抑制了lps诱导的mlck/mlc通路活化。

利用westernblot检测了脓毒血症小鼠小肠组织中p65和iκbα磷酸化蛋白的表达，探究nf-κb通路是否参与了baff对肠黏膜屏障功能的调节作用。结果显示，p-p65和p-iκbα在lps小鼠中表达显著升高，而baff抗体干预可下调p-p65和p-iκbα的表达水平，说明baff抗体抑制了nf-κb信号通路的激活(图6e和6f)。上述结果表明，baff抗体干预可通过抑制nf-κb/mlck/mlc信号通路，上调zo-1和occludin表达，从而改善肠黏膜屏障功能。

图6baff抗体干预可上调小肠组织zo-1和occludin表达。(a)zo-1；(b)occludin；(c)p-mlc/mlc；(d)mlck；(e)p-p65/p65；(f)p-iκbα/iκbα。与control组相比，*p<0.05，**p<0.01；与lps组相比，#p<0.05，##p<0.01。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。