一种马尾松树皮提取物及其制备方法和应用与流程

本发明属于植物有效成分的提取领域，具体涉及一种马尾松树皮提取物及其在抗光老化中的应用。

背景技术：

皮肤作为人体抵御外界侵害的第一道防线，易受紫外线辐射产生光老化。紫外线会诱导皮肤细胞产生大量自由基，由于自由基具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力,会导致细胞因子、受体和酶的表达水平失调，nf-kb和mapk途径过度激活，dna损伤等；从而会造成皮肤出现皱纹、色素沉积、松弛和晒伤等症状，更严重者可能引起基因突变，诱发皮肤癌。光老化的严重程度主要取决于所接受的紫外线暴露的累积剂量以及皮肤的色素沉着状态。皮肤的光老化主要是由uva和uvb辐射引起的。uva和uvb可渗透到皮肤中，并与不同深度的细胞相互作用，从而在表皮和真皮层中引起独特但有害的生物反应。

光老化的预防和治疗包括多种干预措施，如涂抹防晒霜、局部使用类维生素a和5-氟尿嘧啶、化学剥离、注射神经调节剂(肉毒杆菌毒素)等。但是，类维生素a和5-氟尿嘧啶可能引起皮炎等刺激性反应；化学剥离会引起色素沉着和疤痕形成；注射神经调节剂会引起瘀伤，并且持续效果短暂。因此，寻求活性强，无毒副作用的抗光老化天然活性成分，并将其应用于食品和化妆品中具有重大的研究价值和广泛的应用前景。

马尾松(学名：pinusmassonianalamb.)是松科，松属乔木，分布极广，北自河南及山东南部，南至两广，东自沿海，西至四川中部及贵州，遍布于华中华南各地。马尾松树皮中富含原花青素、酚酸类、木脂素类等天然活性成分，其提取物具有抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤、抑菌消炎以及抗病毒等多种生理功能。目前，大部分研究是针对马尾松树皮提取物的抗氧化、抗肿瘤、降血脂等功效，并未见其提取物具有抗光氧化作用的报道。

技术实现要素：

本发明涉及一种马尾松树皮提取物及其制备方法和应用，本发明所述的制备方法包括如下步骤：

1)将马尾松树皮粉碎后加入纤维素酶进行酶解，得预处理物料；

2)向所述预处理物料中添加甲醇或乙醇溶液，并对混合体系进行超声处理，以提取所述预处理物料中有效成分，收集提取液；

3)用乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次对所述提取液进行萃取，收集水饱和正丁醇的萃取液；

4)用弱极性的大孔吸附树脂对所述水饱和正丁醇萃取液中的有效成分进行分离纯化，纯化的过程中采用乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱，收集乙醇的体积分数大于30％的洗脱液，浓缩干燥后得所述马尾松树皮提取物。

优选的，所述步骤2)中加入乙醇溶液后，混合体系中乙醇的浓度为55～65％。

优选的，用所述乙酸乙酯对所述提取液进行萃取前，对所述提取液进行浓缩以挥干提取液中的甲醇或乙醇。

优选的，所述弱极性大孔树脂为ab-8、h-60、xda-1b或d101b大孔吸附树脂。

优选的，所述步骤4)洗脱的过程中收集乙醇的体积分数40～60％的洗脱液。

优选的，将收集得到的乙醇的体积分数40～60％的洗脱液进行干燥处理后用聚酰胺树脂进行分离纯化，纯化的过程中用乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱，收集乙醇的体积分数为50～70％的洗脱液，再次得提取物。

优选的，采用中压制备色谱对再次得到的提取物进行分离纯化，采用c18flash色谱柱，粒径为15μm，洗脱剂为甲醇的水溶液，得到高活性的提取物。

本发明的另一目的是保护本发明所述方法制备得到的马尾松树皮提取物。

本发明还保护一种马尾巴松树皮提取物，其中含有如下3种有效成分：

优选的，所述有效成分

的质量百分数为8～12％；

有效成分的质量百分数为25～35％；

有效成分的质量百分数为40～50％。

优选的，上述有效成分由本发明所述的方法制备得到。

本发明还保护本发明所述的马尾松树皮提取物在制备具有抗光氧化作用的产品中的应用。

优选的，具有抗光氧化作用的产品为化妆品或食品。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明通过对马尾松中有效成分进行提取，首次发现了马尾松提取物具有抗光老化的作用。

2)本发明通过对提取物进行进一步的提取和分析，得出其中主要起抗光氧化作用的活性成分，为后续的研究和应用提供有效地指导。

附图说明

图1为马尾松树皮提取分离纯化流程图；

图2为组分fr.1～fr.4对光老化细胞活性的影响；

图3为实施例2所得的20:80、60:40、100:0的洗脱组分中抗光老化活性的结果示意图；

图4为实施例3所得的fr.2.1～fr.2.4抗光老化活性的结果；

图5为fr.2.3对光老化细胞β-半乳糖苷酶染色结果的影响；

图6为组分fr.2.3对uvb引起的光老化细胞ros水平的影响；

图7为不同乙醇提取物光老化l929细胞活性的影响；

图8为不同萃取物光老化l929细胞活性的影响；

图9为组分fr.2.3总离子流图(esi负离子模式)

图10为化合物的质谱图。

具体实施方式

下面通过下述附加技术特征对本发明进行进一步的详细说明。

本发明所述的方法包括如下步骤：

1)将马尾松树皮粉碎后加入纤维素酶进行酶解，得预处理物料；

2)向所述预处理物料中添加甲醇或乙醇溶液，并对混合体系进行超声处理，以提取所述预处理物料中有效成分，收集提取液；

3)用乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次对所述提取液进行萃取，收集水饱和正丁醇的萃取液；

4)用弱极性的大孔吸附树脂对所述水饱和正丁醇萃取液中的有效成分进行分离纯化，纯化的过程中采用乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱，收集乙醇的体积分数大于30％的洗脱液，浓缩干燥后得所述马尾松树皮提取物。

本发明在研究的过程中发现马尾松中的一些成分具有抗光老化的作用，这在本领域尚属首次。进而，提出了上述的可提取得到具有抗光老化作用的弱极性成分的方法。其中，用醇对酶解后的物料进行提取的过程中进行超声波处理有利于有效成分充分地溶出，用正丁醇对物料进行萃取前先用乙酸乙酯先对物料进行萃取有利于去除物料中的其他非极性成分，有利于具有抗光老化作用的有效成分的富集，最后用弱大孔树脂进行分离纯化，并收集乙醇的体积分数大于30％的洗脱液，可得到具有抗光氧化活性的马尾松树皮提取物。

根据一些优选的实施例，所述步骤1)中将马尾松树皮粉碎后用酸性条件下活性较高的纤维素酶进行处理。其中，处理过程中调整体系的ph为4.5～5.5。

根据一些优选的实施例，所述步骤2)中加入乙醇溶液后，混合体系中乙醇的浓度为55～65％。将乙醇的浓度调整至上述的浓度有利于马尾松树皮中有效成分的充分溶出。

根据一些优选的实施例，所述步骤2)中超声处理的条件为功率250～350w，时间40～60min。在上述条件下进行处理，既有利于有效的成分地充分溶出还不会导致有效成分的结构的破坏。

根据一些优选的实施例，用所述乙酸乙酯对所述提取液进行萃取前，对所述提取液进行浓缩以挥干提取液中的甲醇或乙醇。

根据一些优选的实施例，浓缩后物料的体积为提取液体积的1/10～1/15。

根据一些优选的实施例，用所述乙酸乙酯对所述提取液进行萃取的过程中，所述提取液与所述乙酸乙酯的体积比为1：0.8～1.5。采用上述体积的乙酸乙酯对物料进行处理，有利于将其中的杂质成分充分地提取还不会导致乙酸乙酯的用量过多造成浪费。

根据一些优选的实施例，用所述乙酸乙酯和水饱和正丁醇对物料进行萃取的过程中，萃取的条件为用等体积乙酸乙酯萃取3-5次，直至萃取液无明显颜色；再采用等体积水饱和正丁醇对剩余水相萃取3-5次，直至萃取液无明显颜色。

根据一些优选的实施例，所述弱极性大孔树脂为ab-8、h-60、xda-1b或d101b大孔吸附树脂。

根据一些优选的实施例，针对于采用所述弱极性大孔树脂为ab-8大孔树脂的纯化，洗脱的过程中收集乙醇的体积分数40～60％的洗脱液。上述洗脱液中有效成分的含量最高，抗光氧化活性较强，因此选择上述洗脱液。

根据一些优选的实施例，针对于采用所述弱极性大孔树脂为ab-8大孔树脂的纯化，采用梯度洗脱的方式进行，乙醇：水溶剂系统按体积比10:90、30:70、50:50、70:30、90:10洗脱，其中，乙醇的体积分数大于30的洗脱液中的成分均具血抗光老化活性，且乙醇与水的体积比为50:50的效果最好。

根据一些优选的实施例，为进一步得到抗光老化活性更优的成分，将步骤4)所得马尾松树皮提取物中乙醇的体积分数40～60％的洗脱液用聚酰胺树脂进行分离纯化，纯化的过程中用乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱，收集乙醇的体积分数为50～70％的洗脱液，再次得提取物。

根据一些优选的实施例，纯化的过程中利用中压制备色谱设备对再次得到的提取物进行分离纯化，采用c18flash色谱柱，粒径为15μm，洗脱剂为不同浓度甲醇的水溶液。采用上述方法进行纯化，一方面可以有效分离活性成分，另一方面得到的活性成分具有较强的抗光老化作用。

洗脱过程中洗脱剂梯度为：2cv、甲醇体积分数20-40％；3cv、甲醇体积分数40-80％；1cv、甲醇体积分数80％；1cv、甲醇体积分数80-100％；2cv、甲醇体积分数100-100％。

根据一些优选的实施例，纯化过程中的具体操作为：

本发明的另一目的是保护本发明所述方法制备得到的马尾松树皮提取物。

分：

优选的，所述有效成分的质量百分数为8～12％；

有效成分的质量百分数为25～35％；

有效成分的质量百分数为40～50％。

优选的，上述有效成分由本发明所述的方法制备得到。

本发明还保护本发明所述的马尾松树皮提取物在制备具有抗光氧化作用的产品中的应用。

优选的，具有抗光氧化作用的产品为化妆品或食品。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中涉及的纤维素酶为cas:9012-54-8；为灰白色无定形粉末。

实施例1

本实施例涉及一种马尾松树皮提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)精选马尾松树皮，洗净，50℃烘干，粉碎过80目筛；向上述马尾松树皮粉末中加入3％纤维素酶(cas:9012-54-8；灰白色无定形粉末)，按料液比1:7加入蒸馏水，稀盐酸调ph至5.0，50℃孵育100min；

(2)向上述体系中加入无水乙醇和蒸馏水，使乙醇浓度为60％，超声处理50min，超声功率为300w，对混合物料进行抽滤，收集提取液；

(3)将残渣按照步骤2重复操作1次；并合并2次提取液；45℃减压浓缩至原体积的1/10，制得浓缩液；

(4)将浓缩液采用等体积乙酸乙酯萃取3次，直至萃取液无明显颜色；再采用等体积水饱和正丁醇对剩余水相萃取5次，直至萃取液无明显颜色，并减压浓缩、冻干，获得水饱和正丁醇萃取物；

(5)称取水饱和正丁醇萃取物，加入少量无水乙醇溶解，并加入蒸馏水制成悬浊液；将所述悬浊液采用ab-8大孔吸附树脂进行分离纯化，ab-8大孔吸附树脂层析柱的径高比为1:15，洗脱体积为2bv，乙醇：水溶剂系统按体积比10:90、30:70、50:50、70:30、90:10洗脱，按乙醇：水溶剂系统、30:70、50:50、70:30、90:10，分别得到fr.1～fr.4共4个组分和乙醇：水溶剂比10:90的洗脱组分分别45℃减压浓缩、冻干，获得固体粉末；

(6)取步骤(5)所得5种组分的固体粉末，利用uvb诱导的l929细胞光老化模型进行评价，以细胞活性、ros水平和β-半乳糖苷酶染色实验为指标，评价抗光老化能力，发现上述fr.1～fr.4组分均具有抗光老化能力，其中抗光老能力最强的组分为fr.2，即乙醇：水的体积比为50:50的体系提取得到的组分，而乙醇：水溶剂比10:90的洗脱组分没有抗光老化能力。

实施例2

本实施例与实施例1相比区别在于通过对组分fr.2的分离纯化得到一种抗光老化能力更强的提取物。

取步骤组分fr.2，加入少量无水乙醇溶解，并加入蒸馏水制成悬浊液；采用聚酰胺树脂进行纯化，聚酰胺粒径为200目；聚酰胺层析柱的径高比为1:6；洗脱体积为2.5bv；

乙醇：水溶剂系统按体积比20:80、60:40、100:0洗脱，细胞结果表明，60:40的洗脱组分的抗光老化效果较好，收集体积比60:40的洗脱组分，将其去除水分后干燥得粉末。

实施例3

本实施例与实施例2相比区别在于，通过对实施例2所述的组分进行纯化得到一种抗光老化能力更强的提取物(其提取的流程图如图1)。

将实施例2所得组分用少量甲醇溶解，配制成浓度为10mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，利用中压制备色谱设备进行分离纯化，采用c18flash色谱柱，粒径为15μm，上样量为柱体积的2％，采用不同浓度的甲醇溶液进行洗脱，其中洗脱剂梯度为：2cv、20-40％；3cv、40-80％；1cv、80％；1cv、80-100％；2cv、100-100％，仪器自动收集出峰的组分。hplc检测合并相似组分，得到fr.2.1～fr.2.4共4个组分，分别45℃减压浓缩、冻干，获得固体粉末；经验证发现，上述4中组分均具有抗光老化能力，其中fr.2.3的抗光老化能力最强。

进一步分析发现，组分fr.2.3的组成及比例如下：

对比例1

与实施例1相比，其区别在于，所述步骤(2)提取的过程中调整乙醇溶液的浓度为80％。

对比例2

与实施例1相比，其区别在于，所述步骤(4)中不采用乙酸乙酯对物料进行萃取，直接用水饱和的正丁醇对物料进行处理。

实验例

将实施例1～3和对比例1～2所得的提取物进行活性实验。

利用uvb诱导的l929细胞光老化模型进行评价，以细胞活性、ros水平和β-半乳糖苷酶染色实验为指标，评价抗光老化能力。

其具体方法为：

实验对象：l929成纤维细胞(购买于中国协和细胞库，来源于雄性c3h/an小鼠的正常皮下疏松结缔组织)

实验步骤

(1)细胞模型建立

细胞融合达到80％-90％时，弃旧培养液，胰酶消化细胞制备细胞悬液，细胞浓度为5×10⁴个/ml，细胞密度为5×10³/孔(每孔接种100μl)，接种于96孔板内。继续培养24h后，弃旧培养液，pbs冲洗细胞2次，每孔加100μlpbs覆盖，使用铝箔纸将空白对照组覆盖。将uvb照射剂量分为30mj/cm²,150mj/cm²,300mj/cm²，450mj/cm²，600mj/cm²，每组剂量设置6个复孔。

照射剂量(mj/cm²)＝照射强度(mw/cm²)×照射时间(s)

照射完后，弃去pbs，每孔再加入100ul培养液放培养箱继续培养。培养24h后，cck-8法检测细胞活力。未照射组细胞用锡纸包裹不接受uvb照射。照射过程中为防止uvb的热刺激，需要将孔板置于冰上进行照射操作。

(2)细胞相对活性测定

将生长密度达到80％-90％的细胞以细胞密度为5×10³/孔(每孔接种100μl)，接种于96孔板内。随机分为空白对照组、uv组、不同浓度样品+uv组，培养液培养细胞24h，次日，弃掉旧液，pbs冲洗细胞2次，每孔加100μlpbs覆盖，使用铝箔纸将空白对照组覆盖，用uv照射uv组、样品+uv组，根据公式计算出照射时间。照射完毕，弃去pbs加入培养液，放置于37℃5％co2的培养箱中培养24h后测定细胞增殖率。

测定前，弃掉旧液，pbs冲洗细胞2次，每孔加入100μl完全培养基，再加入10μlcck-8溶液，37℃孵育3h后，酶标仪检测450nm处的a殖，计算细胞相对活性：

(3)β-半乳糖苷酶染色

细胞密度为2.5×10⁵个/ml，接种至6孔板，每孔2ml(或细胞密度为1×10⁵个/ml，接种至24孔板，每孔1ml)，37℃培养24h后，uvb照射造模，继续培养8h。之后，采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色，严格按照试剂盒说明书操作。倒置显微镜下观察染色结果，计数被染为蓝绿色的衰老细胞比例。即染色衰老细胞数/总细胞数×100％，每组均设3个复孔。

(4)细胞ros水平检测

将生长密度达到80％-90％的l929细胞以细胞密度为5×10⁴/孔(每孔接种0.5ml)，接种于24孔板内，培养24h后，随机分为空白对照组、uvb模型组、uvb+不同浓度样品组。弃掉旧液，pbs冲洗细胞1次，每孔加1mlpbs覆盖，使用铝箔纸将空白对照组覆盖，uvb辐射剂量为300mj/cm2，然后弃去pbs，再加入培养基，放置于37℃5％co2的培养箱中培养24h。

蛋白质含量测定：培养24h后，弃去培养基，pbs冲洗细胞2次，每孔加入50μl裂解液(含1mm的pmsf)，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，再加入1mlpbs，吹打后移入2ml离心管中，12000rpm/min离心5min。取上清液备用，按照bca检测试剂盒方法检测蛋白质含量，结果以mgprotein表示。

荧光强度测定：培养24h后，弃去培养基，pbs冲洗细胞2次，每孔加入1ml稀释好的2′,7′二氯荧光黄双乙酸盐(2，7-dichlorodihydrofluoresceindiacetate，dcfh-da)(按照1:1000用无血清培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10μmol/l)，37℃避光孵育30min后，用pbs缓冲液洗涤细胞3次，用荧光酶标仪(激发波长485nm，发射波长525nm)测其荧光强度。

根据所测蛋白质含量和荧光强度表示细胞内的ros水平，单位：荧光强度/mgprotein。

结果发现，

实施例1中所得fr.1～fr.4四种组分的抗光老化活性的结果如图2所示，与uvb模型组相比，组分fr.2在20、10μg/ml时，可显著增强光老化细胞活性(p<0.01)。

实施例2所得的20:80、60:40、100:0的洗脱组分中抗光老化活性的结果为如图3所示，与uvb模型组相比，60％乙醇组分在10、5μg/ml时，可显著增强光老化细胞活性(p<0.01)。

实施例3所得的fr.2.1～fr.2.4抗光老化活性的结果如图4所示，由图4可知组分fr.2.3在5、2.5μg/ml时，可显著增强光老化细胞活性(p<0.01)；其余组分仅fr.2.2在5μg/ml时具有一定活性(p<0.05)，。

研究组分fr.2.3对光老化细胞β-半乳糖苷酶染色结果的影响，由图5可知，组分fr.2.3在5μg/ml时，可显著降低uvb引起的细胞衰老数量；研究fr.2.3对光老化细胞ros水平的影响，由图6可知，组分fr.2.3在10μg/ml时，可显著降低uvb引起的光老化细胞ros水平(p<0.05)。

图9为组分fr.2.3的总离子流图，图10为化合物1～3的质谱图。

对比例1所得的组分的相关活性如图7所示，与uvb模型组相比，60％乙醇提取物在40μg/ml时，即可显著增强光老化细胞活性(p<0.01)；而80％乙醇提取物在80μg/ml时才可显著增加活性。因此，60％乙醇提取效果优于80％乙醇提取。

对比例2所得的组分的相关活性如图8所示，a表示先用乙酸乙酯萃取后，再用水饱和正丁醇萃取，得到的萃取物；b表示直接采用水饱和正丁醇萃取，得到的萃取物。结果表明，与uvb模型组相比，萃取物a在20μg/ml时，即可显著增强光老化细胞活性(p<0.01)；而萃取物b在60μg/ml时才可显著增加活性。因此，先用乙酸乙酯萃取后，再用水饱和正丁醇萃取，得到的萃取物具有较强活性。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。