烟酰胺单核酸在制备β-半乳糖苷酶抑制剂中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药及化学技术领域，特别涉及一种烟酰胺单核酸在制备β-半乳糖苷酶抑制剂中的应用。

背景技术：

d-半乳糖是一种生理性营养成分，是由乳糖水解得到的一种右旋六碳醛糖。d-半乳糖的一水合物熔点118～120℃；无水物结晶，熔点为167℃。d-半乳糖的旋光度+80°。

β-半乳糖苷酶(ec3.2.1.23)，又称乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中，其来源十分丰富。其中细菌中的乳酸菌、环状芽孢杆菌、大肠杆菌、产气肠细菌等；霉菌中的米曲霉、黑曲霉、炭色曲霉等；酵母中的脆壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母等；放线菌中的天蓝色链霉菌等均产β-半乳糖苷酶。由于微生物的快速生长和高效代谢的生物学特性，使其成为工业化酶制剂的主要来源。β-半乳糖苷酶在乳品工业中具有重要用途：第一，它能水解牛乳和其他乳制品中的乳糖，消除人们在饮用乳制品时出现的乳糖消化吸收差，以致产生腹胀、腹泻等乳糖不耐症现象；第二，有效解决液态牛奶在超高温瞬时杀菌时，牛乳中乳糖的存在会导致胶状物的产生以致堵塞管道的问题；第三，β-半乳糖苷酶的转糖苷活力还可以将乳糖水解生成的半乳糖转移给果糖受体生成乳果糖，即功能性低聚糖，促进双歧杆菌增殖，调整肠道菌群平衡，增强机体免疫作用；同时，乳糖经乳糖酶水解生成共组分单糖-葡萄糖和半乳糖，不仅大大改善了其加工性能，而且提高了甜度，发酵性能好，更容易被小肠消化吸收，提高人体免疫力。

在正常的机体代谢中，d-半乳糖可转变为葡萄糖，参与葡萄糖的代谢，但过量供给会导致代谢紊乱，导致免疫力下降、基因表达和调控异常、细胞生长繁殖能力下降、细胞退行性改变和认知障碍等表现。相关技术中，体内d-半乳糖主要由β-半乳糖苷酶催化乳糖得来，因此，抑制β-半乳糖苷酶的活性，能大大减小d-半乳糖的生成，从而减小d-半乳糖对机体的损伤。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提出一种烟酰胺单核酸在制备β-半乳糖苷酶抑制剂中的应用，旨在解决上述技术问题。

为实现上述目的，本发明提出一种烟酰胺单核酸在制备β-半乳糖苷酶抑制剂中的应用。

可选地，所述烟酰胺单核酸在制剂中的浓度为10～200ug/ml。

本发明还提供一种β-半乳糖苷酶抑制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：

s1、取烟酰胺单核酸和超纯水，备用；

s2、将步骤s1中的烟酰胺单核酸用超纯水稀释，并超声实现均匀分散，至浓度为20mg/ml，得母液；

s3、将上述母液于-20℃冻存8～16h，即得β-半乳糖苷酶抑制剂。

可选地，所述步骤s1中的烟酰胺单核酸为粉末状。

可选地，所述步骤s1中的烟酰胺单核酸的目数为170～800目。

相较于现有技术，本发明取得了以下有益效果：

本发明技术方案中，通过烟酰胺单核苷酸以制备能够抑制机体中的β-半乳糖苷酶的活性的抑制剂，从而通过该抑制剂减少d-半乳糖的生成，进而减小d-半乳糖对机体的损伤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明一实施例中烟酰胺单核酸处理后的β-半乳糖苷酶染色强度图；

图2为本发明一实施例中烟酰胺单核酸对β-半乳糖苷酶活性的抑制数据图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参见图1和图2，本发明提出一种烟酰胺单核酸在制备β-半乳糖苷酶抑制剂中的应用。

可选地，所述烟酰胺单核酸在制剂中的浓度为10～200ug/ml。

本发明还提供一种β-半乳糖苷酶抑制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：

s1、取烟酰胺单核酸和超纯水，备用；

s2、将步骤s1中的烟酰胺单核酸用超纯水稀释，并超声实现均匀分散，至浓度为20mg/ml，得母液；

s3、将上述母液于-20℃冻存8～16h，即得β-半乳糖苷酶抑制剂。

可选地，所述步骤s1中的烟酰胺单核酸为粉末状。

可选地，所述步骤s1中的烟酰胺单核酸的目数为170～800目。

为进一步阐述说明本发明提供的烟酰胺单核酸在制备β-半乳糖苷酶抑制剂中的应用的效果，选用以下实施例组进行详细阐述。应当理解，下列实施例组仅用于说明本发明中β-半乳糖苷酶抑制剂的效果，并不限制本发明。

需要说明的是，下述实施例中所使用的的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、器材等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中用到的仪器分别为：

解剖显微镜(szx7，olympus，japan)；

ccd相机(verta1，上海土森视觉科技有限公司，china)；

精密电子天平(cp214，ohaus，usa)；

6孔板(nestbiotech，china)；

细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(货号c0602，碧云天生物，china)。

下述实施例中用到的试剂分别为：

甲基纤维素(货号m0512，sigma，usa)；

过氧化氢(批号为f1730012，阿拉丁试剂(上海)有限公司)，无色透明液体、4℃保存；用养鱼水配制成204μg/ml(6mm)浓度，现配现用。

实施例组1烟酰胺单核酸的毒性测试

1、实验操作：

1.1实验中用到的动物：

①野生型ab品系斑马鱼(自然成对交配繁殖方式)，年龄：受精后6h(6hpf)，共450尾，每组实验30尾；

②斑马鱼(饲养于28℃的养鱼水中)，其中养鱼水的水质为：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐配制而成，电导率450～550us/cm，ph6.5～8.5，硬度100～300mg/lcaco3。其饲养管理符合国际aaalac认证的要求。

1.2实验中用到的试剂：

烟酰胺单核苷酸(白色粉末，4℃避光干燥保存)：超纯水配制成20mg/ml母液，并于-20℃下冻存，备用。

1.3实验步骤：

于450尾鱼苗中随机选取270尾6hpf野生型ab品系斑马鱼，置于6孔板中，每孔30尾斑马鱼(实施例组)，然后分别加入如表1浓度所示的烟酰胺单核苷酸(由其母液稀释配制而成)；同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔容量为3ml。其中，除正常对照组外，对其余实施例组和模型对照组均水溶给予过氧化氢，以建立衰老模型。6天后结束实验，并得到如表1所示的结果数据。

表1不同浓度的烟酰胺单核苷酸下衰老斑马鱼的mtc

2、结果分析：

由上可知，在一定浓度范围内的烟酰胺单核苷酸对斑马鱼的生长具有一定的促进作用(存活率高)，超过一定浓度的烟酰胺单核苷酸对斑马鱼的生命具有严重的威胁。具体地，当烟酰胺单核苷酸的浓度在31.25ug/ml时，其对斑马鱼的生长的作用不明显；当烟酰胺单核苷酸的浓度在62.5ug/ml、以及125ug/ml时，其对斑马鱼的生长具有明显的促进作用(生长状态佳)；当烟酰胺单核苷酸的浓度超过500ug/ml时，其对斑马鱼的生存造成严重威胁，并且随着烟酰胺单核苷酸的浓度的增加，斑马鱼的死亡率不断提高。

实施例组2烟酰胺单核酸对β-半乳糖苷酶活性的抑制

1、实验操作：

1.1实验中用到的试剂：

白藜芦醇(白色粉末，阴凉避光干燥保存)：用100％dmso配制成10mg/ml的母液，并于-20℃下冻存，备用。

1.2实验步骤：

选取实施例组1中剩余的180尾6hpf野生型ab品系斑马鱼，置于6孔板中，每孔30尾斑马鱼(实施例组)，然后分别加入如表2浓度所示的烟酰胺单核苷酸(由其母液稀释配制而成)；同时设置阴性对照组(白藜芦醇6.9ug/ml)、正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)及模型对照组，每孔容量为3ml。其中，除正常对照组外，对其余实施例组、阴性对照组及模型对照组均水溶给予过氧化氢，以建立衰老模型。6天后，将斑马鱼用4％多聚甲醛固定过夜培养，并用β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色。染色结束后，每个实施例组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照并保存图片，然后利用nis-elementsd3.10高级图像处理软件进行图像分析并采集数据实验，如表2所示。分析统计斑马鱼整体β-半乳糖苷酶染色强度(s1)得到如图1所示的结果数据；然后，以β-半乳糖苷酶染色强度的统计学分析结果评价烟酰胺单核苷酸对衰老斑马鱼β-半乳糖苷酶活性的抑制作用，结果如图2所示。

1.3计算方式：

β-半乳糖苷酶活性抑制作用(％)＝{s1(模型对照组)-s1(实施例组)}/{s1(模型对照组)-s1(正常对照组)}*100％

用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，p＜0.05，表明具有显著性差异。

表2不同浓度的烟酰胺单核苷酸下斑马鱼的β-半乳糖苷酶染色强度(n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，***p＜0.001。

2、结果分析：

由上可知，加入烟酰胺单核苷酸的实施例组对斑马鱼的β-半乳糖苷酶的染色强度有影响。在一定烟酰胺单核苷酸浓度下，随着加入的烟酰胺单核苷酸的浓度的增加，其对斑马鱼的β-半乳糖苷酶的染色强度减弱，对β-半乳糖苷酶活性的抑制作用增强；到一定烟酰胺单核苷酸浓度后，β-半乳糖苷酶的染色强度随烟酰胺单核苷酸浓度的增加而增加，对斑马鱼的β-半乳糖苷酶的抑制作用减弱。具体地，当烟酰胺单核苷酸的浓度达到41.6ug/ml时，其对β-半乳糖苷酶的染色强度达到85351±568***，对β-半乳糖苷酶的抑制作用达到77％；当烟酰胺单核苷酸的浓度达到125ug/ml时，其对β-半乳糖苷酶的染色强度达到85986±771***，对β-半乳糖苷酶的抑制作用达到72％。

综上可知，烟酰胺单核苷酸对β-半乳糖苷酶的活性有一定的抑制作用；利用烟酰胺单核苷酸制备β-半乳糖苷酶抑制剂对活体动物的择优生长具备一定指导意义。

以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。