一种内源性细胞调节系统及其应用的制作方法

1.本发明涉及细胞生物学，再生医学以及药物领域，尤其涉及一种内源性细胞调节系统及其应用。


背景技术：

2.细胞衰老可以由dna损伤、表观遗传变化，端粒缩短、代谢失调、线粒体功能障碍以及炎症等多种因素诱发。通过单一途径抗细胞衰老或者活化细胞功能在理论上难以实现。
3.人体皮肤组织主要由真皮和表皮两层构成，真皮为表皮提供固体支撑，并向表皮提供营养；另外，皮肤组织的营养支持，同时来源于皮下组织的营养物质提供以及微循环的营养物质交换。表皮细胞在皮肤组织外层，形成皮肤屏障，抵御外界有害、刺激物、日光进入，同时具有保湿及调节抗炎作用。真皮主要由成纤维细胞和细胞外基质构成，成纤维细胞正常的增殖和分化，维系着皮肤正常的结构和生理功能。胶原蛋白和弹性蛋白是由成纤维细胞合成和分泌的，是组成真皮层三维结构的主要成分，形成主要的细胞外基质。胶原能够给细胞外基质以强度和韧性；弹性纤维提供组织弹性，让肌肤有伸展和褶合的能力；同时，细胞外基质形成细胞的微环境，调节细胞的物质交换，支撑皮肤结构，保持皮肤水分。皮下组织中提供营养支持的细胞，主要来源于皮下组织中的脂肪细胞。婴儿的脸部皮肤细腻有光泽，最主要的原因是皮下脂肪细胞富有活力。形成血管的血管内皮细胞，可以调节局部毛细血管的微循环。
4.此外，组织中过多衰老细胞的存在，不利于正常细胞的存活和生长。衰老细胞能分泌一系列促炎细胞因子、趋化因子、蛋白酶和其他因子，破坏周围组织以及抑制正常细胞活性：例如，衰老细胞分泌促炎细胞因子，造成正常细胞周围的慢性炎症环境，加速细胞老化；而炎症因子，如tnf-α，对胶原蛋白i为负调控作用。
5.皮肤细胞外基质由细胞合成和分泌，主要由胶原蛋白、弹性蛋白和糖蛋白以及蛋白多糖构成。细胞外基质形成细胞的微环境，调节细胞的物质交换，支撑皮肤结构，保持皮肤水分。随着年龄的增长，基质金属蛋白酶降解胶原的速度增加，胶原含量减少，表现为肌肤皱纹的形成。
6.皮肤组织中不同类型的细胞健康有序地发挥自身的细胞功能，可以保持皮肤组织的年轻并且抵抗皮肤组织的衰老。然而现有技术中并没有能过调控细胞的代谢通路，多靶点、多层次、多途径、全方位地活化细胞，优化皮肤细胞微生态，恢复细胞年轻态，维持细胞健康态，重建细胞内源性功能，从而改善皮肤组织的解剖结构与功能的产品。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明提供一种内源性细胞调节系统，用于促进皮肤细胞自我调节恢复细胞年轻态和健康态，系统改善皮肤组织生理状态。
8.为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种内源性细胞调节系统，所述系统包括核苷类化合物，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸和蛋白类物质中的至少2种；
9.所述核苷类化合物选自腺苷类化合物、胞苷类化合物和鸟苷类化合物中的至少一种；
10.所述饱和脂肪酸选自硬脂酸，软脂酸，棕榈酸，棕榈酸乙酯、硬脂酸衍生物、软脂酸衍生物以及棕榈酸衍生物中的至少一种；
11.所述不饱和脂肪酸主要选自油酸、亚油酸、石榴酸、亚麻酸、十八碳烯酸和二十碳烯酸中的至少一种。
12.作为对上述技术方案的进一步描述：所述的蛋白类物质选自动物胎盘蛋白，动物脐带提取物、寡肽(寡肽-1，寡肽-2，寡肽-3，寡肽-4，寡肽-5或寡肽-6)、多肽、蚕丝、蚕丝氨基酸、蚕丝粉、蚕丝胶蛋白、蚕丝提取物、蛋氨酸、蛋粉、蛋黄提取物、蛋壳膜提取物、蛋清、蛋清提取物、二肽-1、二肽-2、二肽-4、谷氨酰胺、谷胱甘肽、瓜氨酸、寡聚核苷酸、胱氨酸、胶原氨基酸类、胶原提取物、角蛋白、角蛋白氨基酸、角蛋白氨基酸类、酵母、酵母多糖、酵母多糖类、酵母发酵产物提取物、酵母菌/大豆蛋白发酵产物、酵母菌/大麦籽发酵产物滤液、酵母菌/大麦籽发酵产物滤液、酵母菌/葡萄发酵产物提取物、酵母菌胞溶产物提取物、酵母菌/米糠发酵产物、酵母菌多肽类、酵母菌发酵产物、酵母菌发酵产物滤液、酵酵母菌发酵溶胞产物滤液、酵母菌溶胞物、酵母菌溶胞物提取物、精氨酸、壳糖胺、牛奶、牛奶氨基酸、牛奶氨基酸类、牛奶蛋白提取物、脯氨酸、葡糖胺、乳酸、乳蛋白、水解蚕丝、水解大豆蛋白、水解大米蛋白、酪氨酸、酪蛋白、酪氨酸甲酯hcl、酪蛋白酸钾、酪蛋白酸钠、酪蛋白提取物、酪乳粉、鸟氨酸、乳链菌肽、乳清、乳清蛋白、乳清酸、乳球蛋白、乳铁蛋白、水解弹性蛋白、水解蛋壳膜、水解胶原、水解角蛋白、水解角蛋白pg-丙基甲基硅烷二醇、水解角蛋白乙酯、水解酵母、水解酵母蛋白、水解酵母提取物、羊水解胎盘提取物、猪水解胎盘蛋白、猪水解胎盘提取物、丝胶蛋白、丝心蛋白、四肽-1、四肽-4、天冬氨酸、天冬酰胺、血清白蛋白、血清蛋白和组氨酸中的一种或多种。
13.作为优选，所述蛋白类物质选自乳蛋白、水解酵母提取物、水解蚕丝蛋白、寡肽、蚕丝胶蛋白、酪氨酸、水解胶原、丝胶蛋白、水解蚕丝、蚕丝蛋白、酵母菌多肽类、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、精氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、寡肽、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、棕榈酰四肽-10、黄原胶、肌肽、丝聚素和虾青素酵母提取物中的一种或多种。作为进一步优选，所述蛋白类物质选自乳蛋白，蚕丝胶蛋白，以及乳蛋白和或蚕丝胶蛋白，以及组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、蛋氨酸、胱氨酸以及精氨酸的混合物。
14.作为对上述技术方案的进一步描述：所述核苷类化合物、不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸和黄酮类物质主要由天然产物中提取得到，也可以是人工合成物质。作为进一步优选，所述核苷类化合物来源于葡萄籽提取物、石榴籽提取物、地黄根提取物、番木瓜果提取物和中国灵芝提取物的至少一种；更优选地，所述核苷类化合物来源于葡萄籽提取物和石榴籽提取物中的一种或两种。
15.作为进一步优选，所述不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸来源于葡萄籽提取物、石榴籽提取物、双孢蘑菇提取物、椰子果提取物、绿茶提取物、可可提取物和燕麦粗粉提取物中的至少一种；更优选地，所述不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸来源于葡萄籽提取物和石榴籽提取物中的一种或两种。
16.作为进一步优选，所述黄酮类物质来源于卷柏提取物、大豆提取物、沙棘提取物、仙人掌提取物、明党参、玄参根提取物和当归根提取物中的至少一种。更优选地，所述黄酮
类物质来源于卷柏提取物。
17.作为对上述技术方案进一步描述：所述核苷类化合物分子量范围为80～8000；所述不饱和脂肪酸分子量范围为100～3000；所述饱和脂肪酸分子量范围为100～3000；所述黄酮类物质分子量范围为100～2100。作为进一步优选，所述核苷类化合物分子量范围为80～1200；所述不饱和脂肪酸分子量范围为100～1000；所述饱和脂肪酸分子量范围为100～1000；所述黄酮类物质分子量范围为100～1200，发现该范围内的各成分对细胞年轻态和健康态的调节效果较好。
18.所述系统中核苷类化合物含量为10ng/ml～500ug/ml，不饱和脂肪酸含量为10ng/ml～500ug/ml，饱和脂肪酸含量为10ng/ml～500ug/ml；蛋白类物质含量为100mg/ml～10g/ml。
19.作为对上述技术方案的进一步描述：所述系统中还包括1ng-800ng/ml的黄酮类物质。
20.作为优选，所述黄酮类物质为穗花杉双黄酮，槲皮素，汉黄芩素，异柳杉双黄酮，糖苷黄酮类物质，柚皮素，大豆异黄酮，五羟黄酮，生物黄酮类物质，漆树黄酮和4
′
，6，7-三羟基异黄酮中的一种或多种。
21.作为对上述技术方案的进一步描述：所述调节系统还包括皮肤护理成分a和/或皮肤护理成分b；
22.所述皮肤护理成分a选自抗微生物成分、润湿剂、保湿剂、uv吸收剂、表皮屏障功能调节剂、皮肤恢复和再生成分、皮肤紧密和抗皱剂、缓解和抗炎剂、抗瘙痒成分、抗氧化剂、自由基清除剂、uv-猝灭剂、皮脂调节和抗粉刺剂、牵拉痕调节剂、皮肤免疫系统调节剂、皮肤光亮剂、皮肤微循环调节剂、微血丝和毛细管扩张调节剂和组织金属蛋白酶抑制剂中的一种或多种；
23.所述皮肤护理成分b选自蛋白质、鞣花酸、生长因子、辅酶、酶抑制剂、肽(如二-、三-、四-、五-和六肽)、碳水化合物(如单-、二-、三-和寡糖)、多糖、糖胺聚糖、糖胺聚糖亚单元、脂质、鞘氨醇、鞘脂、鞘糖脂、硫脂、磷脂、甾醇、植物甾醇、皂苷、酚、多酚、萜、生物碱、维生素原、维生素a族、b族维生素、抗坏血酸类物质(抗坏血酸、抗坏血酸镁、抗坏血酸钙、抗坏血酸多肽、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸硬脂酸脂、抗坏血酸棕榈酸脂、乙基抗坏血酸、异抗坏血酸、抗坏血酸/pca镁、抗坏血酸硫酸脂二钠等其他抗坏血酸衍生物)、维生素d、维生素e、维生素k、叶酸、核黄素、肌醇，硫胺素hcl、松香油、视黄醛、维a酸、异维a酸、阿利维a酸、阿维a酯、阿维a类、螯合剂、肌酸酐、二甲基乙醇胺、氨基酸如丝氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、n-乙酰半胱氨酸、瓜氨酸、胶原、明胶、白蛋白、丝胶、蚕丝蛋白、抗角蛋白微丝聚集蛋白、转化生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、神经生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、衍生自血小板的生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、血管内皮细胞生长因子、微量元素(钙，铁，镁)、氢化卯磷脂、水解胶原、黄原胶，聚谷氨酸钠，肌肽、辅酶q10、烟酰胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖、白藜芦醇、果糖、甘露糖、二羟丙酮、赤藓酮糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、β-葡聚糖、角叉菜胶、糖原、脱乙酰壳多糖、香菇多糖、地衣多糖、菊糖、岩藻糖、藻酸盐、木糖葡聚糖、葡聚糖、直链淀粉、果聚糖、支链淀粉、透明质酸、软骨素硫酸盐、肝素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸、燕麦β-葡聚糖、n-乙酰葡糖胺、尿囊素、神
经酰胺、n-脂酰基鞘氨醇葡糖苷、脑苷脂、神经节苷脂、硫苷酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、乳酸、柠檬酸、羟乙酸、壬二酸、水杨酸、硫辛酸、吡咯烷酮羧酸、尿利酸、咖啡酸、共轭亚油酸、角鲨烷、角鲨烯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、凡士林、羊毛脂、植物鞘氨醇、谷甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、羽扇醇、甘草甜素、芦丁、染料木素、黄豆苷元、非瑟酮、杨梅黄酮、木犀草素、橙皮素、水飞蓟宾、水飞蓟素、芹黄素、表棓儿茶素、表棓儿茶素没食子酸酯、去甲二氢愈创木酸、鞣花酸间苯二酚、甘草次酸、法呢醇、α-没药醇、β-没药醇、茶碱、可可碱、松萝酸、锌-、硒-、锰-盐、甘油、丙二醇、丁二醇、山梨醇、赤藓醇、己二醇、植三醇、卡波姆，聚山梨醇酯-20、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、双甘油、辛酰羟肟酸、1，2-己二醇、1，3-丙二醇、鲸蜡醇棕酰酸酯、辛酸癸酸甘油三酯、棕榈酰四肽-10、聚山梨醇酯-60、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇-8、甜菜碱、小核菌胶、透明质酸钠、防卫素、组织蛋白酶抑制素、富组蛋白、水杨酸盐、肉桂酸盐、咖啡因、丝聚素、褪黑素、尿素、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、过氧化物歧化酶、乳过氧化物酶、磷脂酶、鞘磷脂酶、转谷氨酰胺酶、氨甲环酸、α1-抗胰蛋白酶、亮肽素、激动素、邻氨基苯甲酸盐、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、芦台因、玉米黄质、棕榈油、常规的化妆品天然提取物(如地黄根提取物、番木瓜果、中国灵芝、明党参、仙人掌提取物、当归根提取物、玄参根提取物、小豆蔻籽提取物、双孢蘑菇提取物、茶提取物、燕麦粗粉提取物、椰子果提取物、可可提取物、葡萄籽提取物、石榴籽提取物、卷柏提取物、芥提取物、虾青素酵母提取物、西门肺草提取物、银杏提取物、积雪草、甘菊提取物、真芦荟、金盏花提取物、甘草提取物、金缕梅提取物、沙棘提取物，月见草油、绿茶提取物、非洲臀果木提取物、红火百里香提取物、积雪草提取物、山金车提取物、珍珠提取物、白茅根提取物、甘草提取物、瓜拉那提取物、红花提取物、大豆提取物等)、茶树油、低聚原花青素和多元醇中的一种或多种。
24.作为对上述技术方案的进一步描述：所述调节系统的产品形式为溶液，乳剂(水包油和油包水)，乳状物，洗剂，分散体，粉状物，软膏，凝胶形式和粘性表面活性剂，乳化聚合物，润发油，生发素，香波，肥皂，凝胶，冻干剂，粉末，条棒，笔，喷雾剂，身体用油，面膜或贴剂形式。
25.本发明还提供所述细胞调节系统的应用，所述调节系统用于组织细胞的内源性修复和细胞功能活化；以及减少衰老细胞，并且恢复细胞的年轻态。
26.作为对上述技术方案的进一步描述：所述调节系统用于促进组织细胞分泌益于修复和再生的细胞因子。
27.作为对上述技术方案的进一步描述：所述调节系统用于调控组织细胞的细胞节律/生物钟；以及用于对组织细胞进行表观遗传调控，降低dna表观遗传时钟年龄。
28.作为对上述技术方案的进一步描述：所述调节系统用于增强组织细胞线粒体氧化代谢功能。
29.作为对上述技术方案的进一步描述：所述组织细胞为表皮细胞、表皮干细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪间充质干细胞和血管内皮细胞中的一种或几种；来源于人，猴，鼠，猪，牛，狗，羊，兔，鸡或马。
30.进一步地，本发明还提供所述调节系统在制备化妆品中的应用。
31.进一步地，本发明还提供所述调节系统在制备皮肤组织细胞的细胞培养基或无血清细胞培养基中的应用。
32.本发明的特点如下：越恶劣的自然环境孕育出的生命越顽强。云南高原炎炎烈日强紫外线干旱环境造就的葡萄，石榴，卷柏等植物中富含天然抗衰老抗紫外线抗缺水物质，是许多护肤品有效成份的原料来源，却一直没有被深度科学地挖掘，因而效果受限。本发明通过开发一种内源性细胞调节系统，使用高纯度的来源于天然动植物中的核苷类化合物，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸，黄酮类物质，蛋白水解物，乳蛋白、氨基酸等物质经过特定的组合配比，系统地调控皮肤组织中不同类型细胞的代谢活性、细胞节律、精细表观遗传调控擦除衰老印迹、增强线粒体功能等，减少衰老细胞，从而增强皮肤组织的修复和抵抗能力，抵抗肌肤衰老。
33.尽管大部分皮肤护理产品含有该专利中的成分，如核苷类化合物，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸，类黄酮类物质等，但这些成分在护肤品中多作为天然提取物中的混合成分使用，纯度低，杂质含量多；成分比例不明确或者含量低；并且常被作为辅助成分而非主要活性成分使用；本发明公开的组合成分对皮肤组织不同细胞的不同作用在现有公开材料中也没有具体明确。本发明首次开发了上述物质的有效组合和配比作为护肤品的主要活性成分，形成一种促进皮肤细胞自我调节恢复细胞年轻态和健康态的调节系统；进一步地，该调节系统可有效地调节皮肤组织不同细胞的新陈代谢和生理状态，活化不同类型的细胞功能，且在不使用外源营养因子的刺激下，发挥内源性细胞的自我调节作用，利于不同分化类型的细胞恢复到年轻和健康状态，根据组织微环境的代谢需求，自我主动调整细胞功能，从而改善皮肤组织的生理状态。根据该调节系统，进一步发明了一种内源性智慧细胞活化系统(intelligent cell endogenous activation system，缩写为iceas)。
34.与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明提供的细胞调节系统能够多靶点、多层次、多途径、全方位地活化细胞，优化皮肤细胞微生态，恢复细胞年轻态，维持细胞健康态，重建细胞内源性功能，从而改善皮肤组织的解剖结构与功能。以多种不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸，黄酮类物质，核苷类化合物和蛋白类物质的特殊组合为主调控细胞代谢通路，提高细胞活性，靶向减少衰老细胞，抗氧化，以恢复皮肤细胞年轻态，修复皮肤三维立体结构，维持细胞健康状态。
附图说明
35.图1为皮肤成纤维细胞生长曲线(实施例1调节系统)图；
36.图2为表皮细胞生长曲线(实施例1调节系统)图；
37.图3为平滑肌细胞生长曲线(实施例1调节系统)图；
38.图4为血管内皮细胞生长曲线(实施例1调节系统)图；
39.图5为脂肪间充质干细胞生长曲线(实施例1调节系统)图；
40.图6为皮肤成纤维细胞天狼猩红的染色检测结果图，检测波长540nm；
41.图7为皮肤成纤维细胞生长曲线(实施例2调节系统)图；
42.图8为表皮细胞生长曲线(实施例2调节系统)图；
43.图9为平滑肌细胞生长曲线(实施例2调节系统)图；
44.图10为血管内皮细胞生长曲线(实施例2调节系统)图；
45.图11为脂肪间充质干细胞生长曲线(实施例2调节系统)；
46.图12为皮肤成纤维细胞天狼猩红的染色检测(检测波长540nm)结果；
47.图13为皮肤成纤维细胞天狼猩红的染色检测(检测波长540nm)结果；
48.图14为皮肤成纤维细胞天狼猩红的染色检测(检测波长540nm)结果；
49.图15为不同年龄个体来源的皮肤成纤维细胞分泌的procollagen typel检测；a，procollagen typel的定量检测；其中y代表年龄
″
岁
″
，average代表处理前的细胞分泌量，dm代表对照组；b，精华水处理后胶原在不同年龄皮肤成纤维中分泌含量的变化示意图；
50.图16为脂肪间充质干细胞中使用精华水处理5天后细胞因子基因表达量的检测结果；
51.图17为不同类型的细胞中，衰老相关基因cdknia、cdkn2a、il6的表达量检测结果；
52.图18为不同年龄来源的皮肤成纤维细胞中cbx1处理前后基因表达量的变化；
53.图19为调节系统处理后皮肤成纤维细胞中表观遗传时钟的变化；
54.图20为皮肤成纤维细胞中sirt3基因的表达；
55.图21为皮肤成纤维细胞中调节细胞节律相关的基因(clock，bmal1，rora)表达量检测结果；
56.图22为血管内皮细胞中调节细胞节律相关的基因(clock，bmal1，rora)表达量检测结果；
57.图23为表皮细胞中调节细胞节律相关的基因(clock，bmal1，rora)表达量检测结果；
58.图24为人源皮肤成纤维细胞中不同细胞因子和弹性蛋白，丝聚蛋白表达量的检测结果；
59.图25为人源表皮细胞中金属蛋白酶组织抑制因子1(timp1)表达量的检测结果；
60.图26为皮肤成纤维细胞的β-半乳糖苷酶染色鉴定结果；
61.图27为使用精粹液的人群皮肤水分测试结果；
62.图28为熬夜人群使用精粹液后的皮肤含水量检测结果；
63.图29为受试人群皮肤的ph检测结果；
64.图30为连续使用后停用对受试者皮肤水分的测试结果图。
具体实施方式
65.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
66.以下实施例中用到的蛋白类物质均由市场上购买得到。以下实施例中采用的核苷类化合物，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸和黄酮类物质主要为植物来源，由现有提取分离方法得到；本发明各种有效成分的来源并不局限于植物提取物，也可以由人工合成得到。当核苷类化合物、脂肪酸和黄酮类物质来源于植物提取时，经分离纯化得到核苷类化合物、不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸和黄酮类物质，截留的分子量范围如下：
67.核苷类化合物分子量范围：80～1200；
68.不饱和脂肪酸分子量范围：100～1000；
69.饱和脂肪酸分子量范围：100～1000；
70.黄酮类物质分子量范围：100～1200。
71.核苷类化合物中粗产物中包含鸟苷类、腺苷类和胞苷类化合物，再经过纯化可以
分别获得鸟苷类、腺苷类和胞苷类化合物，提取工艺中，石榴籽中鸟苷类化合物含量较低，而葡萄籽中鸟苷类化合物含量相对较高。
72.实施例1
73.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+2μg/ml胞苷类化合物+2.5μg/ml鸟苷类化合物+60μg/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白和化妆品中用到的各类氨基酸比如组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、瓜氨酸、蛋氨酸以及精氨酸，浓度可以任意设定)+350ng/ml黄酮类物质+微量元素(铁，镁，钙)+83μg/ml维生素；
74.其中核苷类化合物(腺苷类化合物，胞苷类化合物，鸟苷类化合物)，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸均来源于葡萄籽提取物和石榴籽提取物。
75.所述黄酮类物质来源于卷柏提取物，将干燥卷柏粉碎、过筛，采用有机溶液提取，提取液浓缩后纯化，分离得到黄酮类物质，主要含有穗花杉双黄酮，槲皮素，汉黄芩素，异柳杉双黄酮，糖苷黄酮类物质，柚皮素，大豆异黄酮，五羟黄酮，生物黄酮类物质，漆树黄酮和4
′
，6，7-三羟基异黄酮。本实施例所述的维生素主要含有维生素e，抗坏血酸类物质。
76.效果鉴定实验
77.分别准备人源皮肤成纤维细胞，人源表皮细胞，人源平滑肌细胞，人源血管内皮细胞和人源脂肪间充质干细胞；使用上述调节系统处理前一天，按照5000～9500个细胞/cm2进行细胞铺板。
78.检测方法：铺板后第一天(时间记为day1或者d1)开始，每种细胞使用第一步骤中制备的调节系统处理细胞，细胞培养液为dmem中合有20％(v/v)的调节系统，每隔2天，进行细胞换液。细胞培养于二氧化碳培养箱，co2浓度为5％，37℃培养。
79.对于细胞增殖活性的检测，使用mtt的方法(mtt的操作按照碧云天的试剂盒操作说明进行)，连续9天检测细胞的增殖情况；结果表明，对于皮肤成纤维细胞，表皮细胞，平滑肌细胞，血管内皮细胞，脂肪间充质干细胞，使用该实施例中的调节系统处理，细胞增殖活性良好(图1～图5)。
80.对于皮肤成纤维细胞胶原的分泌，使用天狼猩红染色(商业化试剂盒)进行检测。皮肤成纤维细胞分别于该实施例中的调节系统处理前和处理后(处理培养细胞3天)取样，对照组为dmem中含有10％fbs的培养体系(细胞常规培养体系)，细胞培养3天后使用540nm的波长定量检测天狼猩红染色后的吸光度值；结果表明，该实施例中的调节系统可有效增强皮肤成纤维细胞活性，表现为皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力增强(图6)，处理3天后胶原表达量提高2.06倍，对照组提高为1.88倍。
81.实施例2
82.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状；后续实验中也命名为精华水)：20μg/ml腺苷类化合物+2.5μg/ml胞苷类化合物+3μg/ml鸟苷类化合物+60μg/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白)+83μg/ml维生素；原料来源同实施例1。
83.效果鉴定实验
84.分别准备人源皮肤成纤维细胞，人源表皮细胞，人源平滑肌细胞，人源血管内皮细胞，人源脂肪间充质干细胞；使用上述调节系统处理前一天，按照5000～9500个细胞/cm2进
行细胞铺板。
85.检测方法：铺板后第一天(时间记为day1或者d1)开始，每种细胞使用第一步骤中制备的调节系统处理细胞，细胞培养液为dmem中含有20％的调节系统，每隔2天，进行细胞换液。细胞培养于二氧化碳培养箱，co2浓度为5％，37℃培养。
86.对于细胞增殖活性的检测，使用mtt的方法(mtt的操作按照碧云天的试剂盒操作说明进行)，连续9天检测细胞的增殖情况；结果表明，对于皮肤成纤维细胞，表皮细胞，平滑肌细胞，血管内皮细胞，脂肪间充质干细胞，使用该实施例中的调节系统处理，细胞增殖活性良好(图7～图11)。
87.对于皮肤成纤维细胞胶原的分泌，使用天狼猩红染色(商业化试剂盒)进行检测。皮肤成纤维细胞分别于该实施例中的调节系统处理前和处理后(处理培养细胞3天)取样，对照组为dmem中含有10％fbs的培养体系(细胞常规培养体系)，细胞培养3天后使用540nm的波长定量检测天狼猩红染色后的吸光度值；结果表明，该实施例中的调节系统可有效增强皮肤成纤维细胞活性，表现为皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力增强(图12)，处理3天后胶原表达量提高1.96倍，对照组提高为1.88倍。
88.实施例3
89.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：4.5μg/ml腺苷类化合物+1μg/ml胞苷类化合物+1μg/ml不饱和脂肪酸+100ng/ml饱和脂肪酸+10μg/ml鸟苷类物质+150mg/ml蛋白类物质(乳蛋白)；其中核苷类化合物(腺苷类化合物，胞苷类化合物，鸟苷类化合物)，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸来源于葡萄籽提取物和石榴籽提取物。
90.准备人源皮肤成纤维细胞，用上述调节系统处理前一天，按照5000～9500个细胞/cm2进行细胞铺板。
91.对于皮肤成纤维细胞胶原的分泌，使用天狼猩红染色(商业化试剂盒)进行检测。对于皮肤成纤维细胞胶原的分泌，使用天狼猩红染色(商业化试剂盒)进行检测。皮肤成纤维细胞分别于该实施例中的调节系统处理前和处理后(处理培养细胞3天)取样，对照组为dmem中合有10％fbs的培养体系(细胞常规培养体系)，细胞培养3天后使用540nm的波长定量检测天狼猩红染色后的吸光度值；结果表明，该实施例中的调节系统可有效增强皮肤成纤维细胞活性，表现为皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力增强(图13)，处理3天后胶原表达量提高1.82倍，对照组提高为1.88倍。虽然实验组低于对照组结果，但dmem中含有10％fbs的培养体系是一套对皮肤成纤维细胞培养的常规、稳定且良好的培养体系，采用天然产物的溶液培养细胞，保证细胞能够正常增殖，活性良好而且能达到与对照组胶原表达量相当的实验效果，表明本实施例提供的细胞调节系统在维持细胞正常生长，增强细胞活性功能和培养方面及恢复细胞年轻态上均具有良好的应用前景。
92.实施例4
93.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：100ng/ml腺苷类化合物+100ng/ml胞苷类化合物+10ng/ml鸟苷类物质+100μg/ml不饱和脂肪酸+100ng/ml饱和脂肪酸+1g/ml蛋白类物质(水解酵母提取物)+10ng/ml黄酮类物质；其中核苷类化合物(腺苷类化合物，胞苷类化合物，鸟苷类化合物)，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸来源于葡萄籽提取物和石榴籽提取物，黄酮类物质来源于卷柏提取物。
94.准备人源皮肤成纤维细胞，用上述调节系统处理前一天，按照5000～9500个细胞/
cm2进行细胞铺板。
95.对于皮肤成纤维细胞胶原的分泌，使用天狼猩红染色(商业化试剂盒)进行检测。对于皮肤成纤维细胞胶原的分泌，使用天狼猩红染色(商业化试剂盒)进行检测。皮肤成纤维细胞分别于该实施例中的调节系统处理前和处理后(处理培养细胞3天)取样，对照组为dmem中含有10％fbs的培养体系(细胞常规培养体系)，细胞培养3天后使用540nm的波长定量检测天狼猩红染色后的吸光度值；结果表明，该实施例中的调节系统可有效增强皮肤成纤维细胞活性，表现为皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力增强(图14)，处理3天后胶原表达量提高1.70倍，对照组提高为1.88倍。
96.实施例5
97.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：35μg/ml腺苷类化合物+3μg/ml胞苷类化合物+20μg/ml鸟苷类化合物+400μg/ml不饱和脂肪酸+100μg/ml饱和脂肪酸+5g/ml蛋白类物质(水解蚕丝蛋白，乳蛋白，氨基酸)；其中核苷类化合物(腺苷类化合物，胞苷类化合物，鸟苷类化合物)，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸来源于葡萄籽提取物和石榴籽提取物。
98.实施例6
99.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+4μg/ml胞苷类化合物+5μg/ml鸟苷类化合物+60ng/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白，各类氨基酸，同实施例1)+微量元素(铁，镁，钙)+83μg/ml维生素；其中核苷类化合物(腺苷类化合物，胞苷类化合物，鸟苷类化合物)，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸来源于葡萄籽提取物和石榴籽提取物，黄酮类物质来源于卷柏提取物。使用该调节系统作用的细胞为猕猴皮肤成纤维细胞。
100.实施例7
101.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：500ng/ml不饱和脂肪酸+500mg/ml蛋白类物质(寡肽，蚕丝胶蛋白，酪氨酸，水解胶原，丝胶蛋白，组氨酸)；其中不饱和脂肪酸来源于葡萄籽提取物和石榴籽提取物。
102.实施例8
103.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：300μg/ml腺苷类化合物+50μg/ml胞苷类化合物+4g/ml蛋白类物质(乳蛋白)；其中腺苷类化合物和胞苷类化合物由石榴籽提取物中分离得到。
104.实施例9
105.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：50μg/ml腺苷类化合物+20μg/ml胞苷类化合物+2μg/ml鸟苷类化合物+50μg/ml不饱和脂肪酸(亚油酸)+10ng/ml饱和脂肪酸(棕榈酸)+1g/ml蛋白类物质(乳蛋白)+600ng/ml黄酮类物质(大豆异黄酮，五羟黄酮)；其中核苷类化合物由葡萄籽提取物和石榴籽提取物中分离得到，大豆异黄酮由大豆提取物中分离得到。五羟黄酮、不饱和脂肪酸(亚油酸)和饱和脂肪酸(棕榈酸)由市场购买得到。
106.实施例10
107.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+4μg/ml胞苷类化合物+6μg/ml鸟苷+100μg/ml不饱和脂肪酸(油酸，亚油酸)+420μg/ml饱和脂肪酸(硬脂酸酯，棕榈酸乙酯，视黄醇棕榈酸酯，双甘油(癸二酸/异棕榈酸)酯)+3g/ml蛋白类物质(水解蚕丝，酵母菌多肽类，脯氨酸，酪氨酸，鸟氨酸，组氨酸，天冬氨酸，精氨酸)+22μg/ml
维生素原；其中核苷类化合物(腺苷类化合物，胞苷类化合物，鸟苷类化合物)由葡萄籽提取物和石榴籽提取物中分离得到。
108.实施例11
109.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+4μg/ml胞苷类化合物+200μg/ml不饱和脂肪酸(油酸，亚油酸)+300mg/ml蛋白类物质(乳蛋白)+微量元素(铁，镁，钙)；其中核苷类化合物(腺苷类化合物，胞苷类化合物)由石榴籽提取物中分离得到，其他原料由市场购买得到。
110.实施例12
111.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(乳状)：20μg/ml腺苷类化合物+4μg/ml胞苷类化合物+5μg/ml鸟苷类物质+60μg/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白，各类氨基酸，棕榈酰三肽-1，棕榈酰四肽-7，棕榈酰四肽-10，黄原胶，肌肽)+300ng/ml黄酮类物质类物质+透明质酸钠+83μg/ml维生素+没食子酸+儿茶素+微量元素(铁，镁，钙)+珍珠提取物；其中核苷类化合物(腺苷类化合物，胞苷类化合物，鸟苷类化合物)，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸由葡萄籽提取物中分离得到，黄酮类物质由卷柏提取物中分离得到，没食子酸和儿茶素由北美金缕梅提取物分离得到。
112.实施例13
113.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(凝胶状)：50μg/ml腺苷类化合物+6μg/ml胞苷类化合物+60μg/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+2g/ml蛋白类物质(丝聚素，虾青素酵母提取物，蚕丝蛋白)+50ng/ml黄酮类物质(穗花杉双黄酮和异柳杉双黄酮)+角鲨烷+透明质酸+棕榈酸乙酯+视黄醛+红花提取物+低聚原花青素；其中核苷类化合物，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸由葡萄籽提取物和石榴籽提取物分离得到，黄酮类物质由卷柏提取物中分离得到。
114.实施例14
115.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+4μg/ml胞苷类化合物+5μg/ml鸟苷类化合物+60ng/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白，各类氨基酸，同实施例1)+微量元素(铁，镁，钙)+83μg/ml维生素；其中核苷类化合物(腺苷类化合物，胞苷类化合物，鸟苷类化合物)，不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸均由葡萄籽提取物和石榴籽提取物中分离得到，黄酮类物质由卷柏提取物中分离得到。使用该调节系统作用的细胞为小鼠皮肤成纤维细胞。
116.实施例15
117.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+2.5μg/ml胞苷类化合物+3μg/ml鸟苷+60μg/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白)+83μg/ml维生素；其中核苷类化合物来源于中国灵芝提取物，分离得到腺苷类化合物、胞苷类化合物，不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸均由燕麦粗粉提取物中分离得到，黄酮类物质由明党参提取物中分离得到。
118.实施例16
119.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+2.5μg/ml胞苷类化合物+3μg/ml鸟苷类化合物+60μg/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白)+83μg/ml维生素；其中核苷类化合物来源于番木瓜果，分离
得到腺苷类化合物、胞苷类化合物和鸟苷类化合物；不饱和脂肪酸来源于绿茶提取物，饱和脂肪酸均由可可提取物中分离得到，黄酮类物质由仙人掌提取物中分离得到。
120.实施例17
121.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+2.5μg/ml胞苷类化合物+3μg/ml鸟苷类化合物+60μg/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白)+83μg/ml维生素；其中核苷类化合物来源于地黄根提取物，不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸均由椰子果提取物并分离得到，黄酮类物质由玄参根提取物分离得到。
122.实施例18
123.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+2.5μg/ml胞苷类化合物+3μg/ml鸟苷类化合物+60μg/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白)+83μg/ml维生素；其中核苷类化合物和饱和脂肪酸均由葡萄籽提取物中分离得到，不饱和脂肪酸由双孢蘑菇提取物中分离得到，黄酮类物质由小豆蔻籽提取物中分离得到。
124.本实施例所述的维生素主要含有维生素e，维生素k，抗坏血酸类物质，叶酸，核黄素，肌醇，硫胺素hcl。
125.实施例19
126.按照下述组合和配比制备细胞调节系统(液体状)：20μg/ml腺苷类化合物+2.5μg/ml胞苷类化合物+3μg/ml鸟苷+60μg/ml不饱和脂肪酸+30μg/ml饱和脂肪酸+600mg/ml蛋白类物质(乳蛋白)+83μg/ml维生素；其中腺苷类和胞苷类化合物由石榴籽提取物中分离得到，鸟苷由市场购买得到，不饱和脂肪酸由茶提取物分离得到，饱和脂肪酸由棕榈油分离得到，黄酮类物质由当归根提取物分离得到。
127.实施例5～实施例19中细胞调节系统体系不同，细胞的培养和皮肤成纤维细胞胶原分泌的检测方法同实施例4的步骤2和步骤3；除特别说明外，细胞为人源。实施例5～实施例19中，天狼猩红染色检测胶原表达量如表1所示。
128.表1
129.[0130][0131]
实施例20
[0132]
根据上述实验结果可知，实施例2中的调节系统对细胞的胶原表达量最高，故使用实施例2中的调节系统(本实施例中标注为精华水)，分别培养处理人源不同年龄来源的皮肤成纤维细胞：细胞培养液为dmem中含有20％的调节系统(精华水)；对照组为dmem中含有10％fbs(dm)。处理3天后，使用takara的procollagen type1试剂盒检测细胞培养液中的1型前胶原的分泌量(图15a)；结果显示，使用精华水处理后细胞胶原含量提高，中老年组(30岁～90岁)胶原含量增高显著；根据1型前胶原的含量检测，经过精华水处理后，老年个体(80～90岁)的细胞胶原合成分泌能力趋向于50～60岁个体水平，50～60岁个体的趋向于30～40岁个体水平，30～40岁个体的趋向于20～30岁个体水平(图15b)。
[0133]
使用实施例2中的调节系统(本实施例中标注为精华水)，处理人源脂肪间充质干细胞，处理的细胞培养液为dmem中含有20％的调节系统(精华水)。培养处理5天后，检测细胞中相关细胞因子igf1，vegf和fgf2的mrna表达水平，结果显示：有利于细胞活性维持的相
关细胞因子表达量增高(图16)。
[0134]
实施例21
[0135]
使用实施例2中的调节系统，分别处理人源皮肤成纤维细胞，表皮细胞，血管内皮细胞，平滑肌细胞和脂肪间充质干细胞，处理的细胞培养液为dmem中含有20％的调节系统。培养处理6天后，通过定量pcr的方法检测细胞中衰老相关基因cdkn1a，cdkn2a和il6的表达水平，结果显示：经过实施例2中的调节系统处理后，衰老相关基因cdkn1a，cdkn2a和il6的表达量降低(图17)。
[0136]
实施例22
[0137]
使用实施例2中的调节系统，处理人源不同年龄来源的皮肤成纤维细胞，按照年龄分组为大于60岁(60+years)，30岁到60岁(30+years)，20岁到30岁(20+years)，10岁到20岁(10+years)，用于处理的细胞培养液为dmem中含有20％的调节系统。处理12天后，进行cbx1基因表达量的检测。结果显示，表观遗传修饰剂cbx1在年轻细胞中表达量高，使用本实施例中的调节系统处理后，60岁(60+years)，30岁到60岁(30+years)和20岁到30岁(20+years)个体中cbx1的表达量明显增高(图18)。
[0138]
使用实施例2中的调节系统，处理人源20岁～40岁个体来源的皮肤成纤维细胞。皮肤成纤维细胞从原代分离后体外培养到第三代，分别使用对照组(dmem中含有10％fbs)的培养液和实验组(dmem中含有20％的调节系统)的培养液培养细胞，细胞培养于二氧化碳培养箱，co2浓度为5％，37℃培养；两组细胞同步进行连续传代，传代至第10代时，分别收集细胞，提取细胞dna，进行甲基化测序，通过分析全基因组甲基化水平(dna methylation，缩写为dnam)以计算表观遗传时钟(mieko matsuyama et al.，2019；标记为dnam age)。结果显示，未使用本实施例的调节系统处理，随着细胞增殖dnam age(dnam年龄)显著增加，而通过调节系统处理的细胞dnam age增加幅度较小，与起始代次相比无显著性差异(图19)。
[0139]
实施例23
[0140]
使用实施例2中的调节系统，处理人源皮肤成纤维细胞，处理的细胞培养液为dmem中含有20％(v/v)的调节系统，对照组为dmem中含有10％fbs的培养体系。培养处理6天后，通过定量pcr的方法检测细胞中sirt3的基因表达量。结果显示，和对照组相比，使用实施例2中的调节系统处理细胞后，与调控细胞线粒体的代谢活性相关的基因sirt3高表达(图20)。
[0141]
实施例24
[0142]
使用实施例1中的调节系统，分别处理人源皮肤成纤维细胞，表皮细胞和血管内皮细胞，处理的细胞培养液为dmem中含有20％的调节系统。培养处理7天后，检测细胞中和细胞节律/生物钟调节相关基因(clock，bmal1，rora)的表达量变化，结果显示：经过实施例1中的调节系统处理后细胞节律调节相关的基因(clock，bmal1，rora)表达量增高(图21～图23)：clock，bmal1和rora的表达有利于维持细胞正常的生物钟调节，和细胞的年轻化状态有关。
[0143]
实施例25
[0144]
使用实施例1中的调节系统，分别处理人源皮肤成纤维细胞和表皮细胞，处理的细胞培养液为dmem中含有20％的调节系统。培养处理6天后，检测细胞中相关细胞分泌因子或蛋白的mrna表达水平，结果显示：皮肤成纤维细胞中，处理后，促进组织修复和再生，增强细
胞活性，调节胶原合成相关的细胞因子如表皮细胞生长因子(egf)，成纤维细胞生长因子2(fgf2)，肝细胞生长因子(hgf)，角质细胞生长因子(kgf)的表达量增高；另外，弹性蛋白和丝聚蛋白的表达量也增高(图24)，有利于促进网状纤维和弹性纤维产生；表皮细胞中，处理后，抑制细胞基质金属蛋白酶分泌的金属蛋白酶组织抑制因子1(timp1)表达量升高(图25)，有利于防止胶原分解从而保护胶原。
[0145]
使用实施例1中的调节系统，处理老化的人源皮肤成纤维细胞，该样本中含有大量的衰老细胞(衰老细胞被β-半乳糖苷酶染色后显蓝色)。处理的细胞培养液为dmem中含有20％的调节系统，处理3天后，进行β-半乳糖苷酶染色鉴定，可见样本中衰老细胞(蓝色)明显减少(图26)。
[0146]
实施例26
[0147]
皮肤水分含量的检测：将实施例1中的调节系统(本实施例中标记为精粹液)给80个志愿者测试。测试时环境湿度为20％～30％，受试者洁面后在脸部皮肤使用精粹液，使用精粹液后4小时，进行皮肤水分的测试；对照组为50人，个人使用自己的日常护肤品。结果显示，志愿者使用精粹液4小时后，皮肤水分保持良好，含水量增高(图27)。
[0148]
熬夜人群皮肤含水量的检测：各组25人(25～40岁)，一组使用个人自己的日常护肤品(对照组)，一组使用精粹液(实施例1中的调节系统)后再使用个人自己的日常面霜，纳入的受试者日常习惯凌晨12点以后睡眠。测试时环境湿度为20％～30％，连续使用7天后检测皮肤的含水量，精粹液组人群皮肤含水量增高(图28)。
[0149]
皮肤ph值的检测：恢复组纳入38人，该人群脸部皮肤的ph值大于等于5.6，连续使用精粹液14天后，再次检测受试者脸部皮肤ph值，结果表明，使用精粹液后ph值降低，大部分恢复至正常ph范围内。正常组纳入64人(脸部皮肤ph值在正常范围内)，连续使用精粹液14天后，再次检测受试者脸部皮肤ph值，结果表明，使用后ph值仍在正常范围内无异常(图29)。
[0150]
实施例27
[0151]
志愿者使用实施例1中的细胞调节系统，同时搭配使用自己的面霜，连续使用24个月，之后停止使用该调节系统3个月，仅使用受试者自己的面霜。分别在未使用前，使用24个月，停止使用后1个月，停止使用后2个月，停止使用后3个月，检测受试者脸部皮肤的水分含量；测试时，环境湿度为20％～30％。检测结果显示，受试者长期使用该调节系统，皮肤状态良好特别表现为皮肤含水量提升且保持良好；停止使用后，皮肤状态良好，具体表现为皮肤保持较高的水分含量(图30)。提示该调节系统可恢复和维持细胞健康态，不产生
″
使用依赖性
″
等副作用。
[0152]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。