安宫牛黄丸在小儿严重脓毒症ECMO治疗中预防脑部并发症的应用的制作方法

安宫牛黄丸在小儿严重脓毒症ecmo治疗中预防脑部并发症的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及到药物的新用途领域，具体是涉及安宫牛黄丸在小儿严重脓毒症ecmo治疗中预防脑部并发症的应用。


背景技术：

[0002]
重症肺炎是小儿严重脓毒症最常见的重要原因之一。在世界范围内，每年有1.56亿肺炎患儿，5岁以内儿童中重症肺炎发病率为10％～15％。重症肺炎占5岁以下儿童危重症首位，病死率高达21％，而并发严重脓毒症的发病率为22/10万，病死率9％～22％，其中需要ecmo支持的占1/25-1/100。
[0003]
肺炎并严重脓毒症不但与病原体如细菌、病毒、支(衣)原体等不断攀升的耐药性有关，也与机体炎症-抗炎系统的平衡失调、机体免疫功能的紊乱密切相关。脓毒症发生时，免疫细胞大量凋亡，吞噬细胞功能障碍，以及过度的炎症反应，机体处于免疫麻痹状态；脓毒症好转后，患者较正常人更易受到致病菌感染，增加了死亡的风险性。因此，近年来脓毒症免疫疗法成为了研究的热点，然而需要生命支持的小儿肺炎严重脓毒症者，临床发现ecmo支持可引起中枢神经系统相关获得性免疫反应，进而加重ecmo相关脑损伤，其中的固有及适应性免疫机制目前仍不清楚。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的，是通过安宫牛黄丸干预小儿肺炎并严重脓毒症ecmo支持的生化指标、危重程度及合并脑部并发症情况的分析，及对其外周血中性粒细胞、巨噬细胞、t细胞表型的变化，损伤相关分子及其受体、趋化因子、细胞因子及适应性免疫应答和内皮相关分子的变化研究，分析安宫牛黄丸对小儿肺炎并严重脓毒症ecmo支持并脑部并发症的干预作用，以期为临床提供诊疗线索。
[0005]
本发明采用的技术方案是：
[0006]
安宫牛黄丸在小儿严重脓毒症ecmo治疗中预防脑部并发症的应用。
[0007]
优选的，所述的应用为，安宫牛黄丸于ecmo治疗初始即给予。
[0008]
优选的，所述的应用为，安宫牛黄丸每日1丸鼻饲，共10天。
[0009]
优选的，所述的应用的对象为小儿严重脓毒症是炎症反应的症状和体征再加上感染，并且伴有发热或低体温(直肠温度＞38.5℃或＜35℃)、心动过速(在低体温时可以缺乏)、意识改变、需要依赖血管活性药物，并且合并氧分压/氧浓度＜200mmhg、乳酸(lac)＞2mmol/l、尿量给予充分液体复苏后仍＜0.5ml
·
kg-1
·
h-1、血肌酐＞2.0mg/dl(176.8μmol/l)、胆红素＞2.0mg/dl(34.2μmol/l)、plt＜100
×
109/l、inr＞1.5其中之一者为严重脓毒症[9]，ecmo支持的指征：严重呼吸衰竭，持续pao2/fio2<60～80或氧合指数(oi)>40；常规机械通气和其他呼吸支持治疗无反应(高频、一氧化氮吸入、俯卧位通气)；高机械通气压力(如常规通气平均气道压>20～25、高频通气>30)或已出现气压伤；持续高碳酸血症呼
吸衰竭(如：ph<7.1)。
[0010]
本发明的有益效果在于：小儿肺炎严重脓毒症ecmo并脑部并发症与cd11b+细胞杀菌活性和lps特异的cd8+ctl细胞毒性杀伤功能麻痹有关，这与cd11b+细胞上游hmgb1/rage和ythdf1分子过表达，使得cd11b+细胞分泌趋化th1细胞为主的cxcl9趋化因子下调，而促进炎症进入脑部的下游il-17因子上调，使得th17/th1比例失调，而加重内皮损伤，破坏血脑屏障完整性，ccr2highcx3cr1low/ccr2lowcx3cr1high比例上调使更多炎症细胞进入脑内，进一步加重脑部炎症有关。安宫牛黄丸从上述免疫靶点干预小儿肺炎严重脓毒症ecmo并脑部并发症，有一定的保护作用。
附图说明
[0011]
图1为三组外周血白细胞损伤相关分子及受体、趋化因子和炎症因子mrna改变(相对ct值)对比图。
[0012]
图2为三组血浆hmgb1、il-17、cxcl9、血管内皮分子和s100b蛋白改变(单位：pg/ml)对比图。
具体实施方式
[0013]
本发明提供了安宫牛黄丸在小儿严重脓毒症ecmo治疗中预防脑部并发症的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0014]
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。
[0015]
一、纳入和排除标准：1.2017年2月1日至2019年6月30日在河南省人民医院picu入住24h以上并符合肺炎不并或并严重脓毒症应用ecmo支持的患儿。均签署了知情同意书，并且通过了医院伦理委员会评审。2.入院28天内判定应用ecmo后是否出现脑部并发症包括各种弥漫脑功能障碍(注意力改变、记忆力改变、定向力改变、书写不能、肌张力增高、谵妄、昏迷、缺血性卒中、脑缺血、脑脓肿和癫痫等)。3.排除入院时血管环、明确严重的心肌炎和心律失常、胃肠炎、食管闭锁、阑尾炎等急腹症、惊厥持续状态和glasgow昏迷评分值﹤8分的患儿、中枢神经系统感染、dic、大疱表皮松解症、先天代谢病、血液病、肾炎肾病、风湿结缔组织病、肺部肿瘤、肺结核、艾滋病、肿瘤放化疗、精神疾病、外伤、药物中毒、毒物中毒及入院后24小时内死亡的患儿。
[0016]
二、分组：以在入院24h到28天收集的临床资料及实验室检查为依据分为单纯肺炎组(i组，5例)、肺炎并严重脓毒症应用ecmo支持并脑部并发症组(ii组,7例)、肺炎并严重脓毒症应用ecmo支持并脑部并发症予安宫牛黄丸干预组(iii组,6例)。安宫牛黄丸于ecmo治疗初始即给与，每日1丸鼻饲，共10天。对符合纳入条件的患儿在第10天截取性别、年龄、wbc计数、hb、plt计数、crp、pct、血气分析、lac、be、氧合指数、尿量、肝肾功心肌酶、凝血功能指标，各组均按临床诊疗常规均质化治疗。治疗10天行危重症评分，分值>80,非危重；80～71,危重；≤70,极危重。抽血化验crp、pct、lac、be、氧合指数，并留取外周血行流式细胞检测，血浆elisa检测，外周血白细胞行rt-pcr检测和elispot检测。
[0017]
三、免疫学及分子生物学方法：研究外周血的中性粒细胞cd63+亚群、巨噬细胞cd63+亚群、中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,net)相关分子弹性蛋白酶(elastase)、巨噬细胞和中性粒细胞ccr2highcx3cr1low亚群及ccr2lowcx3cr1high亚群、cd4+、cd8+t细胞和lps刺激后的cd8+ctl适应性免疫应答及炎症和抗炎因子及血管内皮生长因子(vegf)的蛋白变化，及研究外周血白细胞的损伤相关分子高迁移率族蛋白b1(high mobility group box-1protein，hmgb1)及受体(rage、tlr9)、细胞因子(tnf-α、il-27、ythdf1、il-17)和趋化因子(cxcl9、cxcl10)的基因表达和血浆hmgb1、cxcl9、il-17、内皮相关分子(ang2/ang1、stie2)及脑损伤分子s100b的蛋白表达，并分析各组上述指标与严重程度和lac、be、氧合指数、平均住院日及脑部并发症等临床指标的关系。
[0018]
1.流式细胞及elisa分析外周血巨噬细胞、中性粒细胞各亚群、elastase、t细胞数目和细胞因子情况。留取入院后10天外周抗凝血2ml行流式分析。应用流式细胞仪检测外周血的cd3-/cd11b+/ly6g+/cd63+(中性粒细胞cd63+亚群)、cd3-/cd11b+/ly6g-/cd63+(巨噬细胞cd63+亚群)、cd11b+/ly6g+/-/ccr2highcx3cr1low亚群及ccr2lowcx3cr1high亚群及elastase的表达，以判断巨噬细胞和中性粒细胞各种亚群情况。取外周抗凝血200μl，加溶血素1ml，5分钟，加1
×
pbs5ml终止溶血，1
×
pbs2ml吹打震荡，离心1200rpm，5分钟，弃上清，震荡混匀，取20μl细胞悬液，加2μlapc-小鼠抗人cd3，2μlpcy7-小鼠抗人cd11b，和2μlfitc-兔抗人ly6g及2μlpe-兔抗人cd63抗体，或加2μlpcy7-小鼠抗人cd11b，和2μlfitc-兔抗人ly6g(1：10，abcam公司)，2μlapc-小鼠抗人ccr2(1：10，cell signaling公司)及2μlpe-兔抗人cx3cr1抗体(1：10，cell signaling公司)，室温30分钟，1
×
pbs2ml震荡，离心1200rpm，5分钟，弃上清，重复1次，1
×
pbs2ml震荡上机。
[0019]
取外周抗凝血200μl，加溶血素1ml，5分钟，加1
×
pbs5ml终止溶血，离心1200rpm，5分钟，弃上清，1
×
pbs2ml吹打震荡，离心1200rpm，5分钟，弃上清，震荡混匀，取20μl细胞悬液，加1％多聚甲醛100μl固定8分钟，1
×
pbs2ml震荡，离心1200rpm，5分钟，弃上清，加0.1％皂素透膜8分钟，1
×
pbs2ml震荡，离心1200rpm，5分钟，弃上清，加8μlfitc-兔抗人elastase抗体，室温30分钟，1
×
pbs2ml震荡，离心1200rpm，5分钟，弃上清，重复1次，1
×
pbs2ml震荡上机。不加一抗，用同型apc、pcy7、fitc及pe标记的小鼠抗人和兔抗人阴性对照抗体重复上述步骤，作为阴性对照。各组平均计数1万个细胞，kaluza1.3软件分析统计各种细胞比例，进行比较。人cd4+、cd8+t细胞通过t细胞亚群检测试剂盒进行流式检测。人tnf-α、il-10、vegf细胞因子及hmgb1、cxcl9、ang1、ang2、stie2、s100b检测通过elisa检测试剂盒检测。
[0020]
2.rt-pcr收集外周血白细胞放入trizol溶液中，-80度保存。总rna应用trizol结合人血液rna提取(qiagen rneasy)试剂盒(qiagen biochemical company)提取获得。通过pubmed gene bank和primer bank设计引物。总cdna应用cdna第一链合成试剂盒(revertaid rt reverse transcription kit,thermo company)获得。应用sybr fast qpcr mastermix试剂盒(sigma)进行pcr反应，并用bio-rad荧光定量pcr仪检测ct值，2-δδct方法计算与管家基因甘油醛3磷酸脱氢酶(gapdh,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)比较后的相对ct值。
[0021]
3.elispot(1)第一天：从试剂盒中取96孔板，在洁净台上用12道加样器按100μl/孔加入70％酒精，静置10秒钟后甩去酒精。迅速按180μl/孔加入无菌pbs，稍置后甩去。重复上述步骤2次。用无菌pbs按1:100稀释捕获抗体，按100μl/孔加入稀释液置96孔板中，用保
鲜膜和锡箔纸依次包好，置于4度冰箱过夜。(2)第二天：从液氮中复苏pbmc细胞，转细胞到装有10ml含20％fbs的rpmi-1640培养液的离心管中，1500rpmx8分钟。弃上清，加入10％fbs的rpmi-1640培养液10ml将细胞悬起，37度5％c02培养箱1-2小时。1500rpmx8分钟，弃上清，加2m110％fbs的rpmi-1640培养液将细胞悬起混匀，取5μl至15μl0.4％台盼蓝中，混匀取样加入血球计数板，静置5分钟。显微镜下计数备用。取出包被好捕获抗体的96孔板，按180μl/孔加入无菌pbs，稍置后甩去，重复上述步骤3次。按100μl/孔加入10％fbs的rpmi-1640培养液，置37度5％c02培养箱中o.5-1小时。取出96孔板，甩培养液，按l00μl/孔依次加入细胞。加入100μl/孔lps(10ng/μl)，阴性对照孔加入细胞和10％fbs的rpmi-1640培养液。均设置复孔。用保鲜膜将96孔板包好，37度5％c02培养箱中孵育24小时。(3)第三天：取出96孔板，甩去细胞和刺激原。按180μl/孔加入含0.05％tween-20的pbs，吹打孔底3-5遍，甩去，重复3遍。按180μl/孔加入pbs，吹打孔底3-5遍，甩去，重复3次。用pbs按1:100比例稀释检测抗体，按100μl/孔加入稀释液，保鲜膜包好，置37度5％c02培养箱中4小时。取出96孔板，按180μl/孔加入含0.i％tween-20的pbs，吹打孔底3-5遍，甩去，重复3次。按180μl/孔加入pbs，吹打孔底3-5遍，甩去，重复3次。用pbs按1：1000比例稀释链霉卵白素-碱性磷酸酶结合物，按100μl/孔加入稀释液，保鲜膜包好，置37度5％c02培养箱中1-2小时。取出96孔板，按180μl/孔加入含0.1tween-20的pbs，吹打孔底，甩去，重复3次。按180μl/孔加入pbs，吹打孔底3-5遍，甩去，重复1次。按100μl/孔加入底物bcip/nbt，室温下避光放置10-30分钟。自来水洗板10-20遍，洁净台风口处吹干，4度冰箱过夜保存，次日读板。各组孔取平均值减去阴性对照后所得的数值为终值，再进行各组间比较。
[0022]
四、统计学方法采用graphpad prism5.0软件进行统计学分析。临床指标与危重症评分的相关性采用线性回归分析。计量资料以x
±
s表示，并对各组行正态性检验和方差齐性检验，数据符合正态分布且具方差齐性，则两组间比较采用t检验。计数资料采用频数进行统计描述，两组比较采用χ2检验。认为p＜0.05为差异有统计学意义。
[0023]
五、对比结果分析
[0024]
1.临床资料分组情况，如表1所示，单纯肺炎组5例，男3例，女2例，年龄2.5月-11.5月；肺炎并严重脓毒症应用ecmo支持并脑部并发症组7例，男3例，女4例，年龄2.3月-15月；安宫牛黄丸组6例，男4例，女2例，年龄2.0月-13月，各组性别和年龄比较无显著差异。
[0025]
表1临床资料分组情况表
[0026][0027]
2.三组第10天临床指标与危重症评分相关性的回归分析
[0028]
多数患者入院第一天显示其pct浓度>0.25ng/ml，纳入研究所有患者均对抗生素治疗反应良好，接收抗生素治疗后的第5天，患儿平均crp和/或pct浓度均显著下降。因此，可以看出纳入研究的肺炎患儿系细菌感染所致。
[0029]
与单纯肺炎组比较，后两组在crp、pct、be绝对值、lac、胆红素、血肌酐、aptt、pt、inr、d二聚体、平均住院天数方面均明显升高(p＜0.001-0.0001)(表2)；而在plt、氧分压/氧浓度、尿量、血压、纤维蛋白原(fib)方面均明显降低(p＜0.01-0.0001)(表2)。各组危重
评分分析发现，与单纯肺炎组比较，后两组危重评分明显加重(p＜0.001)，各项指标与危重评分进行回归分析发现，危重评分高低与be绝对值、lac和平均住院天数相关(p＜0.05)(表2)。
[0030]
而与肺炎严重脓毒症ecmo并脑部并发症组比较，安宫牛黄丸组危重评分略有好转(表2)，主要表现为在be绝对值、lac、平均住院天数方面均明显降低(p＜0.05-0.0001)(表2)，在plt、氧分压/氧浓度、尿量方面均明显升高(p＜0.05-0.001)(表2)。
[0031]
表2三组临床资料分析比较表
[0032]
[0033]
3.流式细胞及常见细胞因子和内皮因子elisa分析结果
[0034]
鉴于各组临床和危重转归的差异改变，我们决定关注白细胞尤其是巨噬细胞、中性粒细胞和t细胞在外周血招募的数目和功能活化及net变性情况。ii组较i组cd63
+
巨噬细胞和中性粒细胞亚群比例(p<0.001-0.0001；表3)降低，cd4
+
、cd8
+
t细胞数目和tnf-α亦降低(p＜0.05-0.0001)，而elastase、ccr2
high
cx3cr1
low
/ccr2
low
cx3cr1
high
比例(p<0.0001)、il-10和vegf却是上升的(p＜0.05-0.01)(表4)。提示可能外周血细胞免疫耗竭、麻痹和无能处于一种不应期状态而net相关分子elastase过度活化致血管损伤，及ccr2
high
cx3cr1
low
m1型巨噬细胞和中性粒细胞增加进一步进入脑组织引发脑损伤，可能是导致上述ii组危重程度和生化指标加重并发脑部并发症的重要因素。而iii组较ii组上述cd63
+
巨噬细胞和中性粒细胞亚群比例(p<0.05；表3)上升，elastase(p＜0.05)、ccr2
high
cx3cr1
low
/ccr2
low
cx3cr1
high
比例(p＜0.001-0.0001)降低，而cd4
+
、cd8
+
t细胞数目和tnf-α、il-10及vegf无明显改变(表4)。提示安宫牛黄丸组减轻脑部并发症与提高具有正常脱颗粒功能的cd63
+
巨噬细胞和中性粒细胞亚群比例，改善外周血细胞免疫麻痹状态，减少net相关分子elastase的脏器损伤及降低ccr2
high
cx3cr1
low
m1型巨噬细胞和中性粒细胞脑损伤作用有关。
[0035]
表3各组外周血巨噬细胞和中性粒细胞(neu)亚群及弹性蛋白酶的流式表达谱分析[单位：各组细胞亚群占总细胞的比例(％)]
[0036][0037]
[0038]
表4各组外周血cd4
+
cd8
+
t细胞数目流式检测(单位：个/μl)和细胞因子的elisa分析(单位：pg/ml)
[0039][0040]
4.各组外周血白细胞免疫因子的rt-pcr结果
[0041]
如图1所示，各组损伤相关分子及其受体mrna表达研究发现，ii组较i组外周血白细胞hmgb1和rage表达均明显上升(p＜0.001-0.01)，而tlr9明显减少(p＜0.0001)。上述ii组hmgb1和rage上调及tlr9的免疫麻痹状态与前述该组危重性和生化指标的严重程度相一致。iii组较ii组hmgb1和rage表达有一定程度的下降(p＜0.05)，而tlr9无改变。各组外周血白细胞趋化因子和炎症因子mrna表达研究发现，ii组较i组cxcl9、cxcl10、tnf-α、il-27表达均明显减少(p＜0.0001-0.01)，而ythdf1和il-17表达明显增加(p＜0.01)，明显的正常免疫麻痹和异常免疫过度的状态与前述ii组最严重的危重性相一致。iii组较ii组cxcl9表达有一定程度的上升(p＜0.05)，而cxcl10、tnf-α和il-27无改变，而ythdf1和il-17表达明显减少(p＜0.05)。
[0042]
5.各组血浆hmgb1、il-17、cxcl9、内皮相关因子和s100b的elisa结果
[0043]
如图2所示，鉴于免疫因子mrna表达研究的结果，我们进一步研究了各组血浆hmgb1、il-17、cxcl9蛋白水平的变化，发现ii组较i组外周血hmgb1和il-17蛋白明显上升(p＜0.001)，而cxcl9蛋白明显减少(p＜0.001)；iii组较ii组外周血hmgb1和il-17蛋白有一定程度的下降(p＜0.05)，cxcl9蛋白有一定程度的上升(p＜0.05)。各组血浆血管内皮损伤和保护性分子蛋白表达研究发现，ii组较i组ang2/ang1上升，stie2下降(p＜0.001-0.01)，这种内皮损伤状态与前述ii组最严重的临床转归相一致。iii组较ii组stie2表达有一定程度的上升(p＜0.05)，而ang2/ang1无改变。各组血浆脑组织损伤指标s100b研究发现，ii组较i组外周血s100b蛋白明显上升(p＜0.001)；iii组较ii组外周血s100b蛋白有一定程度的下降(p＜0.05)。
[0044]
6.各组lps刺激后的cd8+ctl适应性免疫应答的elispot结果
[0045]
如表5所示，各组lps刺激后的外周血白细胞适应性免疫应答研究发现，ii组较i组ifn-γ斑点形成细胞明显降低(p＜0.05)，这种cd8
+
ctl免疫麻痹的状态与前述ii组危重程度和严重的生化指标相一致。iii组较ii组ifn-γ斑点形成细胞有一定程度的上升(p＜0.05)。
[0046]
表5各组lps刺激后cd8
+
ctl功能的比较(spot forming cells，sfc/2x105celis)
[0047] lps刺激后cd8
+
ctl的功能i组157.10
±
25.34ii组27.53
±
19.72
***
t值8.12iii组44.27
±
13.40
***,#
t值7.87 2.65
[0048]
本发明的检测分析了cd11b
+
细胞及相关上下游分子应答在小儿严重脓毒症ecmo支持从肺部到脑部并发症间的免疫作用机制，为小儿肺炎并严重脓毒症ecmo支持脑部并发症的早期识别和早期干预，提供治疗靶点及预后评估的科研依据和技术平台，以期降低其脑部并发症引发的病死率，提高生存率，改善其生活质量。
[0049]
首先，各项生化指标与危重评分进行回归分析发现，危重评分高低与ecmo7天的be绝对值、lac和平均住院天数相关(p＜0.05)，脑部并发症组ecmo7天较单纯肺炎组的be绝对值、乳酸(lac)、平均住院日明显升高，而plt、尿量、氧合指数明显下降(p＜0.001-0.05)；无脑部并发症组较脑部并发症组ecmo7天的be绝对值、乳酸(lac)及平均住院日下降，而plt、尿量、氧合指数上升(p＜0.05)。对小儿肺炎严重脓毒症ecmo支持合并脑部并发症的临床判定有一定的意义。但临床如果出现上述指标改变时往往已是中晚期，因此，这些临床指标对判定小儿肺炎严重脓毒症ecmo支持并发脑部并发症的意义有限，有必要进一步研究早期提示和干预的免疫分子靶向及其机制，实现其早期个体化诊断评估、积极救治及加强防范。
[0050]
在此基础上，我们首先流式分析了脓毒症发生时一线早期发挥作用的比较重要的免疫细胞，中性粒、巨噬和t细胞的数目和活化情况。cd11b
+
是单核细胞系统的表面分子标志，包括巨噬和中性粒细胞，而鉴于cd63分子既是m1型巨噬细胞和中性粒细胞脱颗粒活化的重要标志物，与脓毒症炎症发生发展过程可能密切相关，而肺组织异常过度免疫如中性粒细胞活化之后脱颗粒、net形成与发生严重的免疫麻痹状态和多脏器较严重的功能衰竭有关。因此我们应用流式细胞仪选择cd63
+
标记有正常脱颗粒活化功能的巨噬细胞和中性粒细胞，用弹性蛋白酶标记变性中性粒细胞形成的net相关分子。既然ccr2
high
cx3cr1
low
单核细胞与炎症进入脑组织造成脓毒症脑病有关，ccr2
high
cx3cr1
low
被选为诱发脑损伤的变性单核细胞的标志。
[0051]
研究发现，与单纯肺炎组比较，肺炎并严重脓毒症ecmo支持合并脑部并发症组外周血的cd63
+
m1型巨噬细胞和中性粒细胞脱颗粒功能亚群下调呈严重免疫麻痹状态，cd4
+
、cd8
+
t细胞数目和tnf-α亦降低，且lps特异的cd8
+
ctl细胞毒性杀伤功能减弱，而elastase、ccr2
high
cx3cr1
low
/ccr2
low
cx3cr1
high
比例、il-10和vegf上升，提示肺组织异常的过度炎症，可能进一步耗竭骨髓释放的正常免疫细胞，而骨髓正常的免疫完全失去代偿能力，处于免疫严重耗竭麻痹无能的不应期，导致骨髓释放至外周血的有正常脱颗粒免疫功能的cd63
+
m1型巨噬细胞和中性粒细胞的免疫麻痹无能，而肺组织异常过度免疫如中性粒细胞活化之后脱颗粒、net形成、m1型巨噬细胞活化后th1/th2比例失调及treg比例失调致使il-10上升等可能占上风，及ccr2
high
cx3cr1
low
m1型巨噬细胞和中性粒细胞增加进一步使炎症细胞进入脑组织引发脑损伤，可能是导致上述ii组危重程度和生化指标加重并发脑部并发症的重要因素。
[0052]
进一步ii组较i组外周血白细胞mrna表达发现hmgb1、rage、ythdf1和il-17表达均
明显上升(p＜0.001-0.01)，而tlr9、cxcl9、cxcl10、tnf-α和il-27表达均明显减少(p＜0.0001-0.01)；血浆蛋白hmgb1、il-17、s100b、ang2/ang1上升，cxcl9、stie2下降(p＜0.0001-0.01)。以上提示可能外周血白细胞hmgb1及其受体rage持续过度表达上调，ythdf1基因上调，有文献报道ythdf1通过促进jak2/stat3基因甲基化信号和蛋白翻译，而jak2/stat3又可以促进il-17表达，导致过度免疫和后期的免疫麻痹，使得中性粒和巨噬细胞进一步消耗，呈现了一种持续性tlr9、cxcl9、cxcl10、tnf-α、il-27明显下降的免疫麻痹的状态，从而可能使得外周血呈现cd4
+
和cd8
+
t细胞减少和lps特异的cd8
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ctl细胞毒性杀伤功能减弱的免疫麻痹状态，而il-17上升可能与炎性细胞同时迁移入脑内导致脑内炎症反应有关。这与肺炎并严重脓毒症ecmo并发脑部并发症、be绝对值和lac更严重和平均住院天数更长相一致，可能是其预后差的早期预警指标。
[0053]
其中最上游的损伤相关分子hmgb1及其受体rage在ii组外周血白细胞基因表达比i组明显升高(p＜0.05)，是严重脓毒症危重程度加重的主要早期标志物。有文献报道，hmgb1/rage可能通过诱导中性粒细胞招募及产生弹性蛋白酶对组织损伤的放大效应导致肺组织坏死性改变。另外hmgb1可通过内毒素刺激的巨噬细胞内的nf-kb上调，刺激tnf-α分泌，使得肺炎并严重脓毒症中性粒和巨噬细胞进一步活化消耗，导致脓毒症肺损伤加重
[26]
。在脓毒症休克患者和动物模型研究发现，hmgb1在脓毒症后期持续上升，可以导致中性粒细胞nadph氧化酶失能从而降低其抗菌能力，与严重脓毒症休克致死性免疫麻痹机制相关
[27]
。这与本研究发现的肺炎并严重脓毒症ecmo并发脑部并发症时hmgb1及其受体rage上调，外周血活化的中性粒细胞和m1型巨噬细胞减少(p＜0.0001-0.01)而至严重的临床转归相一致。
[0054]
il-27有研究表明既可以抵抗细菌生长，又能介导小鼠骨髓抑制细胞抵抗巨噬细胞过度炎症，提示可以协助脓毒症的早期抗菌和抵抗过度炎症引发的后期免疫麻痹有关
[28]
。本研究tlr9、il-27在严重脓毒症ecmo脑部并发症时基因表达明显下降(p＜0.001-0.01)，可能与上述hmgb1/rage增加导致中性粒和巨噬细胞致死性免疫麻痹，进一步导致外周血活化的中性粒细胞和m1型巨噬细胞耗竭的状态相关。上述固有免疫麻痹，使得中性粒细胞和m1型巨噬细胞分泌趋化t细胞的趋化因子cxcl9、cxcl10(p＜0.001-0.05)及炎症因子tnf-α、il-27基因表达进一步减少(p＜0.001-0.01)，从而使得外周血呈现cd4
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cd8
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t细胞减少(p＜0.001-0.05)和lps特异的cd8
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ctl细胞毒性杀伤功能减弱(p＜0.001)的适应性免疫麻痹状态，这与合并脑部并发症的临床转归相一致。
[0055]
对下游内皮效应细胞作用的研究发现，上述固有和适应性免疫麻痹状态，并发血ang2/ang1上升、stie2下降的内皮损伤机制(p＜0.05)，与脑部严重的临床转归相一致。有文献报道，严重肺部感染时tie2/ang2比例失调与肺部血管渗漏机制相关
[29]
，lps增加ang-2而抑制ang-1和tie-2表达，与内皮损伤相关
[30]
，引起紧密连接蛋白occludin减少，低剂量lps上调ve-cad而高剂量lps抑制ve-cad表达
[31]
，这与我们的血ang2/ang1上升、stie2下降的内皮损伤研究结果一致，可能参与了下一步紧密连接蛋白的损伤致毛细血管渗漏机制的发生，与脑部并发症临床的危重转归相一致。
[0056]
本研究进一步研究发现，安宫牛黄丸组较脑部并发症组临床危重转归稍好转，be绝对值、lac、平均住院天数方面均明显降低，在plt、氧分压/氧浓度、尿量方面均明显升高，与其抑制外周血白细胞hmgb1和il-17蛋白及rage和ythdf1基因表达的异常过度免疫，改善
外周血cd63
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巨噬和中性粒细胞亚群的免疫麻痹状态，下调net相关分子elastase，上调趋化th1细胞为主的cxcl9趋化因子蛋白表达及lps特异的cd8
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ctl细胞毒性杀伤功能，从而上调stie2内皮蛋白表达进而改善正常免疫、保护内皮细胞完整和下调巨噬细胞和中性粒细胞ccr2
high
cx3cr1
low
/ccr2
low
cx3cr1
high
比例从而抑制炎症细胞进入脑内的调节作用有关。