一种筛选牛高原低氧适应基因aldoc和功能性分子标记的方法及其应用
技术领域：
：1.本发明属于动物分子育种
技术领域：
：，具体涉及一种筛选牛高原低氧适应基因aldoc和功能性分子标记的方法及其应用。
背景技术：
：：2.公开该
背景技术：
：部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。3.牛是反刍动物，它们生活在不同的环境中，具有将低质量的饲料有效转化为高能量的脂肪、肉和牛奶的能力(elsik等，2009)。在瘤胃微生物的作用下，牛可将粗饲料消化成如乙酸、丁酸和丙酸等发酵产物(russellandvansoest，1984)。青藏高原的高海拔会削弱瘤胃的发酵，提高基础代谢率(qiao等，2013)。氧气是维持动物机体新陈代谢和生命的关键物质，是正常生命活动所必需的。低氧环境产生一系列的生理和基因组变化，这些变化使得人类和本地动物对当地极端的高原气候产生了适应(o’brien等，2020)。牛自驯化以来，已成为高原地区不可缺少的动物资源，对提供肉、奶和服务起着重要作用。因此，牛的环境适应机制引起了人们的广泛关注。4.牦牛(bosgrunniens)和普通牛(bostaurus)大约在500万年前分化，但在基因组水平上保持着高度的同源性(qiu等，2012)。牦牛主要生活在高海拔地区，尤其是兴都库什‑喜马拉雅地区和3000‑5500米的青藏高原地区。从生理学角度来看，牦牛具有比低海拔牛更强的代谢能力(wang等，2011)、较低的心肺容量、较大的心肺容积(wiener等，2003)。牦牛和西藏牛品种已经通过扩大肺动脉、支气管动脉平滑肌、红细胞、血红蛋白和红细胞压积的数量来适应高原环境(li等，2006；ma等，2011)。这些研究为理解人类和动物适应高海拔环境的分子机制奠定了基础。历史上，阿沛甲咂牛是在80‑100年前，通过引进来自印度、不丹和尼泊尔的瘤牛(bosindicus)祖先，与中国本土的普通牛杂交繁殖而成的(guan等，2017)。西藏牛和日喀则牛也生活在海拔3500米以上的高原，这些牛通过长期的自然选择已经很好地适应了高海拔缺氧环境。它们还具有很强的觅食能力、耐粗饲能力、高能量代谢和较强的心肺功能，以确保体内血液的正常循环和运输(dolt等，2007；wang等，2011)，这为理解高原低氧适应机制提供了一个理想的模型。5.高海拔地区的特点是缺氧(空气含氧量只有平原地区的50％‑60％)、年平均气温低(从‑1℃到‑5℃)，生长季节短(从6月到9月)和饲料供应的季节性变化(shao等，2010)，导致缺乏优质牧草。因此，在高原营养供给不足的情况，牛如何提供代谢机能保障生长发育、生存、生产性能的发挥，高原牛机体本身的低氧代谢调控和适应至关重要。高原地区由于缺氧、饲料和营养的缺乏导致能量供应不足，动物机体往往通过提高糖酵解或者是提高底物的利用率来获得所需的能量。6.大多数细胞的主要能量来源是葡萄糖，通过糖酵解和/或氧化代谢从中产生三磷酸腺苷(atp)。由于葡萄糖缺乏会引起细胞内磷酸腺苷/三磷酸腺苷比值增加，腺苷酸活化蛋白激酶(ampk)被激活，通过抑制合成过程(如蛋白质或脂质合成)和促进分解过程(如糖酵解)来恢复能量平衡(xiao等，2017)。糖酵解是应对能量胁迫的一个主要分解代谢过程，大部分丙酮酸代谢从葡萄糖转化为乳酸的代谢途径。虽然正常的非增殖细胞只有在无氧条件下才能进行糖酵解，但有的细胞即使在有氧条件下也主要依靠糖酵解来产生atp和生物合成的基本单元，即所谓的“有氧糖酵解”或“沃伯格效应”(vanderheiden等，2009)。果糖1.6‑二磷酸醛缩酶(aldoc)基因，醛缩酶可以起到监视系统的作用，在细胞能量状态下降之前，感知到葡萄糖供应的下降，并以与amp/adp无关的方式激活ampk。醛缩酶(aldoc)是葡萄糖利用率的理想传感器(zhang等，2018)。在低氧条件下，aldoc上调表达促进酵解产生atp，以满足动物能量代谢的需求(leiherer等，2014)。在低氧条件下，aldoc上调表达促进酵解产生atp，以满足动物能量代谢的需求(leiherer等，2014)。技术实现要素：7.针对上述现有技术，本发明提供一种筛选牛高原低氧适应基因aldoc和功能性分子标记的方法及其应用。本发明从牛基因组选择和遗传适应等角度，选择分布于高海拔(海拔大于1800米)和低海拔(海拔低于1500米)的牛品种，通过采用牛777k高密度snp芯片，整合flk、hapflk和xpehh三种基因组选择信号分析方法，比较高低海拔牛之间和牛品种内的基因组选择信号，通过组合筛选策略和生物信息学分析鉴定出适应高原低氧极端环境的候选基因，进一步通过选择信号验证和重测序数据分析挖掘出潜在的功能性分子标记，并建立相应检测方法。本发明为高原低氧特色牛品种的培育等分子育种提供了科学依据和简单易行的检测技术；同时对于地方牛品种遗传资源的保护、评价和利用具重要意义和价值。8.本发明的目的之一在于提供一种筛选牛高原低氧适应基因和功能性分子标记的方法。9.本发明的目的之二在于提供上述方法的应用。10.为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：11.本发明的第一个方面，提供一种筛选牛高原低氧适应基因和功能性分子标记，所述方法至少包括：12.基于snp芯片检测分析不同海拔牛品种dna样品；13.基于flk、hapflk和xpehh基因组选择信号分析方法进行分析，筛选受到显著正选择的单核苷酸多态snps以及候选基因，整合基因功能注释筛选高原低氧适应候选基因和snp分子标记。14.进一步的，基于上述方法，本发明筛选鉴定出aldoc基因为牛高原低氧适应性的关键基因；更进一步的，牛高原低氧适应性分子标记还包括位于该基因的snp，包括但不限于g.20588331t>g(rs133198943a>c)；g.20590099g>a(c.288c>t，aa96f>f)；g.20590664t>c；g.20591903c>a(g.20591903g>t)；其中，单核苷酸多态位点g.20591903c>a选择信号最强，是实验验证的功能性分子标记，其中，牛高原低氧适应基因型为tt型，或者其互补序列aa型。15.本发明的第二个方面，提供上述方法在筛选适合高原低氧生存的牛个体(群体、品系或品种)中的应用。16.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：17.上述技术方案针对牛品种高原低氧适应的遗传特性，从基因组选择和遗传适应的角度，选择分布于高、低海拔的地方牛品种，整合多种基因组选择信号、生物信息学、启动子活性分析、基因表达分析等的方法和策略，高效准确筛选适应高原低氧的关键基因aldoc和功能性分子标记，并通过引入突变建立创造性酶切位点的crs‑pcr‑rflp方法检测基因型，方法设计合理，依据关键基因和功能性标记设计的检测方法，具有准确性高、应用操作简便、成本低的特点；18.采用上述技术方案提供的方法可以有效筛选出具有高原低氧适应性强的个体，对高海拔地区牛品种的育种工作以及遗传改良具有重要意义。上述技术方案是分子育种技术在生产实践上的一次很好应用，可为牛种质资源保护利用以及品种起源研究提供技术，大大节省育种的成本和特色种质培育的时间，获得很好的经济和社会效益，因此具有良好的实际应用之价值。附图说明19.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。20.图1为本发明实施例中flk、hapflk和xpehh鉴定的共有基因(韦恩图)。21.图2为本发明实施例中高低海拔牛品种之间第19号染色体hapflk和xpehh选择信号分布。22.图3为本发明实施例中中国地方牛品种(25个)差异选择区域(chr19:20.537‑20.664mb，包括aldoc基因)的snp和单倍型进化树。23.图4为本发明实施例中alodc基因结构及其潜在功能变异在不同牛群体中的等位基因频率分析。24.图5为本发明实施例中snp(g.20591903c>a)对aldoc基因启动子活性的影响；25.注：*表示p<0.05。26.图6为本发明实施例中snp(g.20591903c>a)不同基因型个体肝脏组织aldoc的表达差异。27.图7为本发明实施例中snp(g.20591903g>t)不同基因型个体测序结果。具体实施方式28.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
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：的普通技术人员通常理解的相同含义。29.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。30.目前关于地方牛高原低氧适应的分子生物学研究较少，尚未有筛选高原低氧适应性地方牛的方法。31.有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种筛选牛高原低氧适应基因和功能性分子标记的方法，所述方法至少包括：32.基于snp芯片检测分析不同海拔牛品种dna样品；33.基于flk、hapflk和xpehh基因组选择信号分析方法进行分析，筛选受到显著正选择的单核苷酸多态snps以及候选基因，整合基因功能注释筛选高原低氧适应候选基因和snp分子标记。34.本发明的又一具体实施方式中，所述筛选牛高原低氧适应基因和功能性分子标记的方法包括：35.s1.不同海拔牛品种样品的采集及dna提取；36.s2.snp芯片检测分析；37.s3.flk、hapflk基因组选择信号分析；38.s4.xpehh基因组选择信号分析；39.s5.受正选择遗传变异和差异选择区域的鉴定；40.s6.基于候选基因的筛选策略筛选候选基因；41.s7.差异选择区域的正选择信号验证；42.s8.利用重测数据鉴定正选择基因内潜在的功能变异。43.其中，步骤s3和s4没有先后顺序之分，因此步序可以是s3‑s4或s4‑s3；44.本发明的又一具体实施方式中，步骤s1具体方法包括：45.s1.1选择不同海拔普通牛、瘤牛品种，普通牛和瘤牛的混合品种；46.s1.2采集牛的血液，提取血液组织中的dna。47.本发明的又一具体实施方式中，步骤s2具体方法包括：48.s2.1使用snp芯片对样品进行分析，并进行基因分型；49.s2.2对snp数据进行过滤，对剩余符合要求的snp做进一步分析；50.s2.3为每条染色体构建单倍型。51.本发明的又一具体实施方式中，步骤s3具体方法包括：52.s3.1基于flk和hapflk全基因组选择信号分析方法，分别比较高海拔和低海拔组的snps对应的选择信号值，获取两组间的snps的差异选择信号；53.s3.2利用基因型数据分别运行flk和hapflk程序，获取品种内的snps的选择信号，并以nelore为远缘群体；在flk分析中，将nelore定义为远缘群体，并设k＝10和nfit＝20；54.s3.3使用hapflk结果以及python和r脚本为选定区域构建整个基因组和局部基因组区域的进化树；55.s3.4通过拟合r中全基因组的标准正态分布，计算了hapflk值的p值。56.本发明的又一具体实施方式中，步骤s4具体方法包括：57.s4.1估算高海拔和低海拔牛品种之间的xpehh值，在牛基因组中使用1mb≈1cm定义物理距离与遗传距离的关系；58.s4.2基于reqdel‑fast构建单倍型。59.本发明的又一具体实施方式中，步骤s5具体方法包括：60.基于flk、hapflk和xpehh选择信号分析结果，分别筛选正选择信号值位于前0.1％的snps。61.本发明的又一具体实施方式中，步骤s6具体方法包括：62.s6.1以鉴定得到的snps上下游50kbp定义为受选择区域，将重叠区域串联，获得差异选择区域；63.s6.2利用ucsc在线网站注释差异选择区域内或者与该区域重叠的参考基因；64.s6.3筛选出高低海拔组间比较的flk、hapflk和xpehh选择信号排名前10位的差异选择区域，分别鉴定出候选基因(例如aldoc基因)，并进行功能注释。65.本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s7具体方法包括：66.s7.1基于flk和hapflk分析结果，分别构建全基因组和局部选择区域进化树，分析该候选基因在各牛品种内的受选择情况；67.s7.2基于品种内flk和hapflk选择信号分析结果进一步验证组间比较的结果。68.本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s8具体方法包括：69.s8.1获取双末端illumina重测序数据，将获得的数据分别与参考基因组(umd3.1)比对；70.s8.2过滤获得高质量的映射序列，从高质量的映射序列中检出遗传变异；71.s8.3从特定基因区域内提取遗传变异，提取的区域是候选基因上游区和基因区；72.s8.5分别计算各遗传变异的基因型和等位基因频率；73.s8.6通过功能注释，确定潜在的功能变异的snp位点。74.本发明的又一具体实施方式中，提供基于上述方法鉴定获得的牛高原低氧适应性的分子标记，具体的，aldoc基因为牛高原低氧适应性的关键基因，可作为牛高原低氧适应性分子标记；同时，牛高原低氧适应性分子标记还包括位于该基因上四个单核苷酸多态位点，如：g.20588331t>g(rs133198943a>c)；g.20590099g>a(c.288c>t，aa96f>f)；g.20590664t>c；g.20591903c>a(g.20591903g>t)。其中，单核苷酸多态位点snp(g.20591903c>a)是实验验证的功能性分子标记，其中，牛高原低氧适应基因型为tt型，或者其互补序列aa型。75.本发明的又一具体实施方式中，提供用于检测上述分子标记的试剂盒，该试剂盒可用于筛选适合高原低氧生存的牛个体(群体、品系或品种)；更具体的，所述试剂盒包括用于检测单核苷酸多态位点的引物；所述单核苷酸多态位点包括g.20588331t>g(rs133198943a>c)；g.20590099g>a(c.288c>t，aa96f>f)；g.20590664t>c；g.20591903c>a(g.20591903g>t)中的任意一个或多个；76.本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测单核苷酸多态位点g.20591903g>t的试剂盒，所述试剂盒至少包括如下引物：77.f:5‘‑gtaattgtttacggtgacgc‑3’(seqidno.7)；78.r:5‘‑ggccttgttctgattcctgc‑3’(seqidno.8)。79.本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在筛选适合高原低氧生存的牛个体(群体、品系或品种)中的应用。80.本发明的又一具体实施方式中，所述应用方式具体为：81.提取不同牛个体的血液dna；82.利用检测上述分子标记的试剂盒，通过crs‑pcr‑rflp的方法鉴定标记的基因型，识别带有高原低氧适应特异分子标记的个体。83.本发明的又一具体实施方式中，所述分子标记为单核苷酸多态位点g.20591903g>t；此时所述试剂盒至少包括如下引物和bstui限制性内切酶；84.f:5‘‑gtaattgtttacggtgacgc‑3’(seqidno.7)；85.r:5‘‑ggccttgttctgattcctgc‑3’(seqidno.8)。86.本发明实际上建立了一种利用基因组直接测序技术筛选高原低氧适应性地方牛的方法。本发明通过对不同品种地方牛进行高密度snp芯片分析，结合选择信号分析方法，发现了与高原低氧有关的特异snp位点，可通过验证单一snp位点或snp位点的组合判断牛的高原低氧适应性。这对高原地区牛的分子育种发展有着重要意义。87.下面结合实施例对本
发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。88.实施例89.1、高低海拔牛品种样品的采集和dna提取90.选择25个分布于不同海拔的国内地方牛品种以及1个国外品种作为远缘参考群体，共352头，包含普通牛、瘤牛、及其普通牛和瘤牛的混合种，分别提取血液dna。其中，分布在海拔低于1500米的牛品种组成低海拔组(la)，分布在海拔1800米以上地区的牛品种组成高海拔组(ha)。牛品种及分组信息具体如表1：91.表1.牛品种信息与分组[0092][0093]2、采用illumina高密度bovinehd777ksnp芯片进行基因分型[0094]使用该芯片进行基因分型，应用python程序pedda_row从基因型检测结果文件finalreport.txt中提取ab格式的基因型结果。该芯片共有777,962个单核苷酸多态标记(snps)，使用plink1.9(http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/plink2.shtml)软件对snps数据进行过滤，首先去除x，y和线粒体染色体上的40,497个snp以及未独特定位到umd3.1的snps。其中snp检出率低于90％或者最小等位基因频率小于0.05的snp被去除，过滤后，对剩余702,622个常染色体snps进行后续的分析。[0095]3、高低海拔组和品种内基因组flk和hapflk选择信号分析[0096]应用hapflk软件(https://forge‑dga.jouy.inra.fr/projects/hapflk/)中的flk和hapflk全基因组选择信号分析方法，分别比较高海拔和低海拔组的snps对应的选择信号值，获取两组间的snps的差异选择信号。另外，利用25个品种的基因型数据分别运行flk和hapflk程序，获取品种内的snps的选择信号，并以nelore为远缘群体。在flk分析中，将nelore定义为远缘群体，并设k＝10和nfit＝20。使用hapflk结果以及改进的python和r脚本(local_reynolds.py和local_trees.r)为选定区域构建整个基因组和局部基因组区域的进化树。并通过拟合r中全基因组的标准正态分布，计算了hapflk值的p值。[0097]4、xpehh基因组选择信号分析[0098]在selscan软件中应用xpehh来估计高海拔和低海拔品种之间的xpehh值。xpehh值在每组对比中都是标准化的，从而具有均值和单位平方差。我们在牛基因组中使用了1mb≈1cm的亲缘关系。并在plink1.9和fastphase1.4中使用reqdel‑fast进行单倍型构建。[0099]5、受正选择遗传变异和差异选择区域的鉴定[0100]利用flk、hapflk和xpehh选择信号分析方法比较高海拔和低海拔牛群，分别筛选受到显著正选择的前0.1％的snps，分别鉴定出701，702，700个snps。[0101]6、差异选择区域和候选基因的鉴定[0102]以上述鉴定的snps上下游50kbp定义为受选择区域，将重叠区域串联，获得差异选择区域，flk、hapflk和xpehh分别鉴定出351、32和99个差异选择区域。最后，利用在线ucsc(https://genome.ucsc.edu/cgi‑bin/hgtables)鉴定差异选择区域内或者与该区域重叠的参考基因，结果分别鉴定出341、50和142个候选的正选择基因，可能与高海拔适应相关。其中，应用三种方法，鉴定出2个共有(重叠)基因；flk和hapflk鉴定出9个共有基因；flk和xpehh鉴定出23个共有基因；hapflk和xpehh共鉴定出5个共有基因，包括aldoc、spag5、kiaa0100、pigs、sdf2(图1)。进一步，筛选出高低海拔组间比较的flk、hapflk和xpehh选择信号排名前10位的差异选择区域，分别鉴定出候选基因，并进行功能注释。其中，发现adloc基因所在的差异选择区域(chr19:20.537‑20.664mb)的hapflk值排名第一；而且，基因注视发现该基因与无氧酵解有关。我们将该选择区域及包含的aldoc基因作为候选基因开展后续的分析。[0103]adloc基因位于第19号染色体，其hapflk和xpehh的基因组选择信号分析结果如图2所示。在hapflk分析中，该差异选择区域共有56个snps，其中有11个snps位于前0.1％(hapflk≥17.2)，特别是snp(rs133198943)位于alodc内，其具有最强的选择信号值(hapflk＝20.51,p＝3.97e‑04)。在xpehh分析中，只有1个snp(rs136098191)的xpehh信号值(xpehh＝3.51,p＝7.77e‑04)排名位于前0.1％(xpehh≥3.386)。[0104]7、差异选择区域的正选择信号验证[0105]利用25个品种内flk和hapflk分析结果，分别构建全基因组和局部选择区域进化树，分析该基因在各牛品种内的受选择情况，结果如图3所示，在品种内的flk分析中，alodc基因在高原品种西藏牛(tibetan)中受到最强的正选择(p＝1.40e‑41)；在另一个高原牛品种阿沛甲砸牛(apeijiaza)中也受到强烈的正选择(p＝4.4e‑09)。在hapflk分析中，三个高原品种西藏牛(p＝7.7e‑83)、日喀则驼峰牛(shigatsehumped；p＝4.9e‑07)、阿沛甲砸牛(p＝9.8e‑08))受到强烈的选择，其中西藏牛的信号最强。品种内选择信号分析结果进一步证实了组间比较的结果。[0106]8、利用重测数据鉴定正选择基因内潜在的功能变异[0107]从ncbisra数据库下载双末端illumina重测序数据(数据号:prjna285834,prjna422979和prjna396672)。上述数据包含29头西藏牛、低海拔牛品种(哈萨克牛和蒙古牛)共20头、牦牛10头，瘤牛14头、野牛18头和独龙牛22头。利用bwa‑mem软件，将下载的数据分别与参考基因组(umd3.1)对性比对。利用samtools，并设计参数“‑view‑f4‑q20”过滤高质量映射序列，并用“rmdup”参数去除重复读数。应用gatk软件从高质量的映射序列中检出遗传变异。应用picard对bam文件进行排序并屏蔽重复序列(http://broadinstitute.github.io/picard/)。利用vcftools软件从特定基因区域内提取遗传变异，提取的区域是aldoc基因atg上游2000kbp和基因区。结果，我们在上述群体中，共鉴定出275个遗传变异，并分别计算各基因型和等位基因的频率。通过功能注释，共鉴定出4个潜在的功能变异(g.20588331t>g，rs133198943a>c；g.20590099g>a，c.288c>t，aa96f>f；g.20590664t>c；g.20591903c>a)，它们在高低海拔组存在显著的差异(图4)，是与牛高原低氧适应有关的潜在功能变异。其中，snp(g.20591903c>a)位于启动子区域，应用animaltfdb(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/animaltfdb/#！/)对野生型(acggtgactcgccttcatc)和突变型序列(acggtgactctccttcatc)进行转录因子结合位点预测,结果发现snpg.20591903c>a(g.‑1428g>t；翻译起始atg的a为+1)突变引起了转录因子结合位点很大的变化，如表2所示，删除了5个转录因子(fos、hdac2、ybx1、ybx2、ap1)结合位点，同时增加了1个转录因子(foxo3)的结合位点。上述许多转录因子与低氧适应有关。例如，有文献报道foxo3与低氧诱导的内皮细胞凋亡有关(hu等，cellsignal,2018,51:233‑242)。有研究表明，缺氧抑制foxo3蛋白的羟基化和降解，从而导致foxo3在肾小管上皮细胞中的积累和活化。缺氧激活的hif‑1参与foxo3的激活，对肾脏起保护作用。在低氧肾脏中，应激反应性转录因子foxo3可被激活以适应低氧环境，从而减缓慢性肾脏病的发展(li等，jclininvest,2019,129(6):2374‑2389)。hifs通过促进无氧糖酵解和抑制氧化磷酸化来改变代谢途径，缺氧激活hifs赋予小卵母细胞无氧代谢程序，低氧可通过表达foxo3和hifs诱导卵母细胞休眠状态(shimamoto等，pnas，2019，116(25)：12321‑12326)。由于未成熟卵泡的过度激活，foxo3干扰的小鼠很快失去了生育能力(castrillon等，science，2003，301：215–218)。foxo3通过抑制一系列核编码的线粒体基因，在降低线粒体质量和氧消耗方面发挥作用(jensen等，emboj.2011，30：4554–4570)。上述研究提示转录因子foxo3与无氧酵解和低氧适应有关，snp(g.20591903c>a)可能通过影响转录因子与aldoc的结合，改变aldoc的表达。[0108]表2.aldoc基因snp(g.20591903c>a或者g>t)野生型和突变型序列转录因子结合位点的变化[0109][0110]9、snp(g.20591903c>a)对aldoc基因启动子活性的影响[0111](1)重组质粒的构建：以snp(g.20591903c>a)野生型和突变型个体的dna为模板，设计一对引物aldoc‑snp20591903。[0112]f:5’‑ggggtacctaccttctccatccccctct‑3’,seqidno.1,大写字母为限制酶kpni的酶切位点和保护性碱基；[0113]r:5’‑ccgctcgagcgatgaggtggagtgactga‑3’,seqidno.2,大写字母为限制性内切酶xhoi的酶切位点和保护性碱基[0114]pcr分别扩增包含snp(g.20591903c>a)的片段，扩增片段的长度为327bp，构建包含snp(g.20591903c>a)的野生型质粒(pgl3‑aldoc‑gg)和突变型质粒(pgl3‑aldoc‑tt)，利用产物测序验证序列的准确性。[0115](2)细胞培养及瞬时细胞转染：人肝癌细胞(hepg2)和胎牛成纤维细胞(bff)培养所用的培养基均为包含7％fbs以及1％双抗的dmem完全培养基，将冻存细胞在37℃复苏，置于37℃，5％的培养箱中培养48‑72小时后传代继续培养。将培养的健康细胞传代至24孔板，培养24‑48h，待细胞密度达到70％‑90％时，进行细胞转染,方法如下：[0116]转染溶液配制：[0117]溶液①50μlopti‑mem+1.8μllipofectamine2000；[0118]溶液②50μlopti‑mem+800ngpgl3‑basic重组质粒/空载质粒+20ng内参质粒prl‑tk室温静止5min；[0119]溶液③将溶液①和溶液②在1.5ml离心管中轻轻混匀，孵育20min；[0120]弃去24孔板中原来的培养基，用opti‑mem轻轻冲洗两遍，加入400μlopti‑mem，这一过程需在溶液①和溶液②孵育的20min内完成。将溶液③置于24孔板中，在37℃，5％的培养箱中培养培养5h后弃掉转染液，换成含有血清的完全培养基继续培养48h。测定荧光素酶活性。[0121]以上述方法分别转染实验组(转染不同目的序列的重组质粒)、对照组(转染pgl3‑basic空载质粒)，每种质粒分别转染bff和hepg2细胞，重复转染3次。[0122](3)荧光素酶活性检测：培养细胞48小时后，取出24孔板弃去培养基，用pbs清洗细胞两次。随后，在24孔板中加入100μl1×细胞裂解液plb，轻轻晃动培养板加快细胞裂解，并在显微镜中观察细胞裂解情况，裂解15‑30min后，取出已经裂解完毕的细胞悬液，分别置于1.5ml离心管中储存。取20μl细胞裂解液于透光性良好的1.5ml离心管中，加入100μllarⅱ试剂轻柔混合，快速置于荧光检测仪中，分析萤火虫荧光素酶的活力。在荧光检测仪中取出离心管快速加入100μlstop&glotm试剂，迅速淬灭萤火虫荧光素酶活性，激活内参质粒prl‑tk的海肾荧光素酶反应，置于荧光检测仪中分析海肾荧光素酶活力。萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值即为荧光素酶的相对活性(relativeluciferaseactivity，rla)，rla结果为三次独立重复试验的平均值。结果如图5所示，证明tt突变可增强aldoc启动子活性。[0123]10、snp(g.20591903c>a)对肝脏组织aldoc表达的影响[0124](1)各选择3头基因型gg和tt牛个体的肝脏组织，提取rna。[0125](2)设计一对引物aldoc‑mrna，产物大小249bp。[0126]f:5’‑agtacgttacagagaaggtcct‑3’seqidno.3[0127]r:5’‑cattgaggttgagagatgcct‑3’seqidno.4[0128]利用荧光定量qpcr分析aldoc基因在肝脏组织的表达情况。结果如下图6所示。[0129]11、高原低氧适应基因aldoc的snp测序鉴定方法[0130](1)选择高海拔牛10头，低海拔牛10头，提取血液dna。[0131](2)设计包含该snp(g.20591903g>t)位点处的一对pcr扩增引物。[0132]f:5’‑taccttctccatccccctct‑3’(seqidno.5)[0133]r:5’‑cgatgaggtggagtgactga‑3’(seqidno.6)[0134](3)进行pcr扩增，pcr反应体系为25μl，包括上游引物0.5μl(10μmol/l)，下游引物0.5μl(10μmol/l)，dna模板1μl(50μmol/l)，ddh2o10.5μl，2×taqpcrmastermix12.5μl，反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，此步骤进行35个循环，最后72℃延伸10min，目的片段长度327bp。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。[0135](4)对扩增产物进行直接测序，根据ncbi公布的牛aldoc基因序列进行分析比对，发生g>t突变的个体，即基因型为tt的个体属于高原低氧适应牛(见图7)。[0136]12、高原低氧适应基因aldoc的snp(g.20591903g>t)基因检测方法[0137](1)选择不同牛品种，提取血液dna。[0138](2)针对特异snp(g.20591903g>t)位点设计引物，通过在上游引物中引入1个突变产生限制性内切酶酶切位点bstui，因此，bstui限制性内切酶可将具有不同突变的pcr产物切成长度不同的片段。[0139]f:5’‑gtaattgtttacggtgacgc‑3’(seqidno.7)[0140]r:5’‑ggccttgttctgattcctgc‑3’(seqidno.8)[0141]pcr扩增：进行pcr扩增，pcr反应体系为25μl，包括上游引物0.5μl(10μmol/l)，下游引物0.5μl(10μmol/l)，dna模板1μl(50μmol/l)，ddh2o10.5μl，2×taqpcrmastermix12.5μl，反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，此步骤进行35个循环，最后72℃延伸10min，目的片段长度104bp。[0142]crs‑pcr‑rflp基因分型：利用限制性内切酶bstui对pcr产物进行酶切，酶切后经2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，野生纯合型个体可分离出两个条带84bp、20bp，其中由于20bp片段较小，所以在凝胶中只显示一条带即84bp)；杂合型个体可分离出四条带104bp、84bp、20bp，其中，由于20bp片段较小，所以在凝胶中显示两条带104bp和84bp；纯合突变型个体可分离出一条带104bp。[0143]其次，本实施例中还公开了包含上述引物以及酶的试剂盒。[0144]所述试剂盒还包括pcr扩增反应试剂、酶切反应剂。[0145]具体的，pcr扩增反应试剂包括dntp(25mmeach)、mgcl2(25mm)、pcrbμffer、ddh2o等；[0146]酶切反应包括ddh2o、bstui酶buffer、bstui酶(10u/μl)。[0147]应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。当前第1页1 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