一种高性能再生性角膜材料与其制备方法及用途与流程

[0001]
本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种高性能再生性角膜材料与其制备方法及用途。


背景技术：

[0002]
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]
角膜是位于眼球前壁的一层透明膜，约占纤维膜的前1/6，略呈横椭圆形，角膜前表面曲率半径为7.8mm，后部表面的曲率半径为6.8mm，主要由无血管的结缔组织构成。角膜厚度各部分不同，中央部最薄。
[0004]
角膜感染、角膜外伤等疾病可能导致角膜盲，在这些患者当中，绝大多数人可以通过角膜移植重见光明。但是由于多方面因素，目前眼库的角膜来源奇缺，不少患者只能被动地等待捐献。
[0005]
角膜移植是目前治疗角膜盲最有效的方法，但是临床仍面临着供体角膜严重匮乏、术后免疫排斥等问题，因此近年来研究人员试图制备各种角膜材料的替代品来解决这一问题。然而目前脱细胞动物角膜经板层移植后仍存在透明度不高、植片溶解及愈合时间过长等问题。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是为了克服现有技术的缺点与不足，提供一种透明度高、力学性能好、具有良好的抗降解性和生物相容性且能促进角膜伤口愈合的高性能再生性角膜材料与其制备方法及用途。
[0007]
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
[0008]
本发明的第一个方面，提供了一种高性能再生性角膜材料的制备方法，包括：
[0009]
将新鲜动物或人眼球的角膜片依次进行初步轻度脱细胞、洗除脱细胞剂、补充糖胺聚糖、多次彻底脱细胞、再次洗除净脱细胞剂、保存液封存、灭菌处理，得到高性能再生性角膜材料。
[0010]
在原材料上本申请选用人或动物角膜，其内部天然胶原特殊的结构及纤维排列是维持角膜透明度及力学强度等性能的关键，这是人工合成胶原材料无法比拟的。
[0011]
本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法制备的高性能再生性角膜材料，角膜片厚度为100-400μm，直径为3-10mm。
[0012]
本发明制备的高性能再生性角膜材料具有透明度高、力学性能好、良好的抗降解性和生物相容性且能促进角膜伤口愈合等优点。
[0013]
本发明的第三个方面，提供了上述的高性能再生性角膜材料在制备治疗因角膜病变或角膜损伤引起的盲性眼疾的医疗材料中的应用。
[0014]
由于本发明的再生性角膜材料透明度高、力学性能好、具有良好的抗降解性和生物相容性且能促进角膜伤口愈合，因此，有望在制备治疗因角膜病变或角膜损伤引起的盲性眼疾的医疗材料中得到广泛的应用。
[0015]
本发明的有益效果在于：
[0016]
(1)在再生性角膜材料上补充糖胺聚糖交联，可明显提高材料的交联度，既减少后续多次彻底脱细胞过程中脱细胞剂对角膜胶原纤维的破坏，又增加了材料的抗溶解性能，同时赋予其促进伤口愈合功能。
[0017]
(2)本发明的多次脱细胞技术与高效促愈合材料协同改性关键技术，制备出的高性能再生性角膜材料透明度高、力学性能好、具有良好的抗降解性和生物相容性且能促进角膜伤口愈合，是角膜材料制备技术的重大突破。同时，本发明工艺简单灵活，产品重现性好，易实现产业化推广。本发明的再生性角膜材料可广泛用于治疗因角膜病变或角膜损伤引起的盲性眼疾。
[0018]
(3)本发明还提供了所述高性能再生性角膜材料在作为角膜基质替代物中的应用，主要用于感染性、先天和遗传性、外伤性及免疫相关性等角膜病患者的角膜前板层、后板层或全层移植手术。
[0019]
(4)制备工艺较简单，成本较低，易于工业化推广和应用。
附图说明
[0020]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0021]
图1为本发明实施例1制备的高性能再生性角膜材料与未经处理的天然角膜苏木素-伊红染色照片对比图，其中，1a为天然角膜的苏木素-伊红染色照片图，1b为处理后的高性能再生性角膜材料的苏木素-伊红染色照片图，可看出其胶原结构保存完好。
[0022]
图2为本发明实施例1制备的高性能再生性角膜材料与未经处理的天然角膜的dapi染色照片图，其中，2a为未经处理的天然角膜的dapi染色照片图，它具有完整的全层角膜结构，可明显判断出上皮层和内皮层完整，角膜基质内存在大量基质细胞。2b为处理后的高性能再生性角膜材料的dapi染色照片图，可看出没有任何细胞残留。
[0023]
图3为本发明实施例1制备的高性能再生性角膜材料植片兔子角膜深板层移植30天后的苏木素-伊红染色照片图，可看出材料植片与兔角膜愈合完好，完全整合且没有降解，兔基质细胞与上皮层细胞已经长入所述高性能再生性角膜材料。由此，可进一步确认采用本发明提供的角膜脱细胞方法未破坏角膜基质胶原结构。
[0024]
图4是本发明实施例1制备的再生性角膜材料植片兔子角膜深板层移植30天后的裂隙灯显微镜图和植片荧光染色图；其中，4a是再生性角膜材料植片兔子角膜深板层移植30天后的裂隙灯显微镜图(弥散照明法)，从中可看出植片透明度高、无溶解现象且已基本愈合；4b是移植30天后的裂隙灯显微镜图(直接焦点照明法)，从中可看出角膜植片弯曲度及厚度正常，植片与兔角膜结合紧密；4c是移植30天后的植片荧光染色图，可以看到角膜上皮细胞已覆盖植片。
具体实施方式
[0025]
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0026]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0027]
术语解释
[0028]
edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
[0029]
nhs为n-羟基琥珀酰亚胺；
[0030]
mes为2-吗啉乙磺酸；
[0031]
tritonx-100为曲拉通x-100；
[0032]
edta为乙二胺四乙酸。
[0033]
第一方面，本发明提供了一种高性能再生性角膜材料的制备方法，所述方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜人或动物眼球的角膜片依次进行初步轻度脱细胞、洗除脱细胞剂、补充糖胺聚糖交联、后续多次彻底脱细胞、再次洗除净脱细胞剂、保存液封存、灭菌。
[0034]
其中，所述在无菌条件下切取新鲜动物或人眼球的角膜基质片的方法包括先将人或新鲜动物眼球用酒精或含妥布霉素的溶液浸泡，再在无菌条件下切取角膜基质片；所述酒精的体积百分浓度优选为70％-80％，所述妥布霉素的浓度优选为30000-50000u/l；所述动物优选为哺乳动物，包括但不限于猪、牛、羊、狗。
[0035]
在一些实施例中，所述初步轻度脱细胞剂溶液为0.1％-2％w/v的十二烷基硫酸钠、tritonx-100，edta、脱氧胆酸钠、原钒酸钠、胰酶、核酸酶、磷脂酶中的一种或多种，脱细胞处理时间15-180min，期间每隔15-60min换液一次。
[0036]
在一些实施例中，所述洗除脱细胞剂的溶液为超纯水或ph值为6.5-7.5的无菌pbs溶液。
[0037]
在一些实施例中，所述补充的糖胺聚糖可选用透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素中的一种或多种，其浓度为0.1％-2％w/v。
[0038]
在一些实施例中，所述糖胺聚糖的补充方法为化学交联法，交联剂可选用0.1％-4％w/v的甲醛、戊二醛、京尼平、edc/nhs中的一种或多种，交联时间为0.5-5h。在制备交联剂溶液时，以mes为缓冲剂调ph值至4.5-7。
[0039]
在一些实施例中，所述后续多次彻底脱细胞时，所述脱细胞剂溶液为0.5％-5％w/v的十二烷基硫酸钠、tritonx-100，edta、脱氧胆酸钠、原钒酸钠、胰酶、核酸酶、磷脂酶中的一种或多种，脱细胞处理时间为4-72h，期间每隔0.5-6h换液一次。
[0040]
在一些实施例中，所述脱细胞及换液、洗除脱细胞剂过程中进行振荡处理，且振荡频率不小于50r/min。
[0041]
在一些实施例中，所述保存液为甘油溶液，灭菌条件包括采用钴-60或电子束辐照灭菌，辐照剂量为25-30kgy。
[0042]
在一些实施例中，所有处理动物角膜的溶液与角膜体积比为2:1-40:1，所有操作
步骤均需在无菌条件下完成。
[0043]
在一些实施例中，所述高性能再生性角膜材料的角膜片厚度为100-400μm，直径为3-10mm。
[0044]
第二方面，本发明提供了所述方法制备得到的高性能再生性角膜材料。
[0045]
第三方面，本发明还提供了所述高性能再生性角膜材料在作为角膜基质替代物中的应用，上述高性能再生性角膜材料的用途为治疗因角膜病变或角膜损伤引起的盲性眼疾。
[0046]
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
[0047]
实施例1
[0048]
于屠宰场内摘取刚被处死猪的眼球，用75％的酒精冲洗直至眼球表面无血污后将其浸泡于40000u/l的妥布霉素溶液中带回；
[0049]
于无菌室内将猪眼球取出，用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用无菌pbs冲洗整个眼球，最后用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球；
[0050]
用5mm直径环钻从眼球上直接钻取角膜，在显微镜下对材料进行切削，得到厚度为200μm的只含有前弹力层及部分基质层的角膜材料；将角膜置于脱细胞剂溶液内，于室温下振荡处理一定时间，使角膜上皮细胞层、内皮细胞层脱落及部分基质细胞裂解死亡；其中，所述脱细胞剂溶液为1％w/v的脱氧胆酸钠和0.1％w/v的原钒酸钠混合液，脱细胞处理时间60min，每隔20min换液一次；
[0051]
将肝素溶于交联剂溶液中，室温下活化反应3h，取出第一次脱细胞处理后的角膜，多次洗除角膜表面的脱细胞剂溶液后，将材料浸入肝素-交联剂溶液中对脱细胞角膜进行接枝反应；其中交联剂选用0.5％w/v的edc/nhs，在制备交联剂溶液时，以mes为缓冲剂调ph值至5.6；肝素浓度为0.25％w/v；交联时间为2h。
[0052]
将改性后的材料置于脱细胞剂溶液中在300r/min下振荡进行二次脱细胞处理，然后将成品置于无菌pbs中在300r/min下振荡，洗除净材料内部残留的脱细胞剂；其中，所述脱细胞剂溶液为2％w/v的脱氧胆酸钠和0.2％w/v的原钒酸钠混合液，脱细胞处理时间12h，每隔3h换液一次；
[0053]
采用甘油溶液进行封存，30kgy的钴-60辐照灭菌，得到透明的高性能再生性角膜材料。
[0054]
上述步骤中，所有处理角膜的溶液与角膜体积比为10:1，所有操作步骤均需在无菌条件下完成。
[0055]
本实施例制备得到的角膜片厚度为200μm，直径为5mm。
[0056]
图1为本发明实施例1制备的高性能再生性角膜材料与未经处理的天然角膜苏木素-伊红染色照片对比图，其中，1a为天然角膜的苏木素-伊红染色照片图，1b为处理后的高性能再生性角膜材料的苏木素-伊红染色照片图，可看出其胶原结构保存完好。
[0057]
图2为本发明实施例1制备的高性能再生性角膜材料与未经处理的天然角膜的dapi染色照片对比图，其中，2a为未经处理的天然角膜的dapi染色照片图，它具有完整的全层角膜结构，可明显判断出上皮层和内皮层完整，角膜基质内存在大量基质细胞。2b为处理
后的高性能再生性角膜材料的dapi染色照片图，可看出没有任何细胞残留。
[0058]
图3为本发明实施例1制备的高性能再生性角膜材料植片兔子角膜深板层移植30天后的苏木素-伊红染色照片图，可看出材料植片与兔角膜愈合完好，完全整合且没有降解，兔基质细胞与上皮层细胞已经长入所述高性能再生性角膜材料。由此，可进一步确认采用本发明提供的角膜脱细胞方法未破坏角膜基质胶原结构。
[0059]
图4是本发明实施例1制备的再生性角膜材料植片兔子角膜深板层移植30天后的裂隙灯显微镜图和植片荧光染色图；其中，4a是再生性角膜材料植片兔子角膜深板层移植30天后的裂隙灯显微镜图(弥散照明法)，从中可看出植片透明度高、无溶解现象且已基本愈合；4b是移植30天后的裂隙灯显微镜图(直接焦点照明法)，从中可看出角膜植片弯曲度及厚度正常，植片与兔角膜结合紧密；4c是移植30天后的植片荧光染色图，可以看到角膜上皮细胞已覆盖植片。
[0060]
实施例2
[0061]
于屠宰场内摘取刚被处死牛的眼球，用75％的酒精冲洗直至眼球表面无血污后将其浸泡于40000u/l的妥布霉素溶液中带回；
[0062]
于无菌室内将牛眼球取出，用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用无菌pbs冲洗整个眼球，最后用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球；
[0063]
用8mm直径环钻从眼球上直接钻取角膜，在显微镜下对材料进行切削，得到厚度为400μm的只含有前弹力层及部分基质层的材料；将角膜置于脱细胞剂溶液内，于室温下振荡处理一定时间，使角膜上皮细胞层、内皮细胞层脱落及部分基质细胞裂解死亡；其中，所述脱细胞剂溶液为1.5％w/v的十二烷基硫酸钠溶液，脱细胞处理时间90min，每隔30min换液一次；
[0064]
将硫酸软骨素溶于交联剂溶液中，室温下活化反应3h，取出第一次脱细胞处理后的角膜，多次洗除角膜表面的脱细胞剂溶液后，将材料浸入硫酸软骨素-交联剂溶液中对脱细胞角膜进行接枝反应；交联剂选用2％w/v的戊二醛溶液，在制备交联剂溶液时，以mes为缓冲剂调ph值至6.5；硫酸软骨素浓度为1％w/v；交联时间为3h。
[0065]
将改性后的材料置于脱细胞剂溶液中在300r/min下振荡进行二次脱细胞处理，然后将成品置于无菌pbs中在300r/min下振荡，洗除净材料内部残留的脱细胞剂；其中，所述脱细胞剂溶液为4％w/v的十二烷基硫酸钠溶液，脱细胞处理时间24h，每隔4h换液一次；
[0066]
采用甘油溶液进行封存，30kgy的钴-60辐照灭菌，得到透明的高性能再生性角膜材料。
[0067]
上述步骤中，所有处理角膜的溶液与角膜体积比为20:1，所有操作步骤均需在无菌条件下完成。
[0068]
本实施例制备得到的角膜片厚度为400μm，直径为8mm。
[0069]
实施例3
[0070]
于屠宰场内摘取刚被处死羊的眼球，用75％的酒精冲洗直至眼球表面无血污后将其浸泡于40000u/l的妥布霉素溶液中带回；
[0071]
于无菌室内将羊眼球取出，用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用无菌pbs冲洗整个眼球，最后用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整
个眼球；
[0072]
用10mm直径环钻从眼球上直接钻取角膜，在显微镜下对材料进行切削，得到厚度为400μm的只含有前弹力层及部分基质层的材料；将角膜置于脱细胞剂溶液内，于室温下振荡处理一定时间，使角膜上皮细胞层、内皮细胞层脱落及部分基质细胞裂解死亡；其中，所述脱细胞剂溶液为2％w/v的edta和0.2％w/v的胰酶混合液，脱细胞处理时间120min，每隔30min换液一次；
[0073]
将透明质酸溶于交联剂溶液中，室温下活化反应3h，取出第一次脱细胞处理后的角膜，多次洗除角膜表面的脱细胞剂溶液后，将材料浸入透明质酸-交联剂溶液中对脱细胞角膜进行接枝反应；交联剂选用4％w/v的京尼平溶液，在制备交联剂溶液时，以mes为缓冲剂调ph值至6.5；透明质酸浓度为2％w/v；交联时间为4h。
[0074]
将改性后的材料置于脱细胞剂溶液中在300r/min下振荡进行二次脱细胞处理，然后将成品置于无菌pbs中在300r/min下振荡，洗除净材料内部残留的脱细胞剂；其中，所述脱细胞剂溶液为5％w/v的edta和0.5％w/v的胰酶混合液，脱细胞处理时间36h，每隔6h换液一次；
[0075]
采用甘油溶液进行封存，30kgy的钴-60辐照灭菌，得到透明的高性能再生性角膜材料。
[0076]
上述步骤中，所有处理角膜的溶液与角膜体积比为40:1，所有操作步骤均需在无菌条件下完成。
[0077]
本实施例制备得到的角膜片厚度为400μm，直径为10mm。
[0078]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。