一种用于肺部疾病治疗的药物制剂及其制备方法与流程

1.本发明属于药物制剂，药物递送等领域，特别涉及一种用于肺部疾病治疗的药物制剂及其制备方法。


背景技术：

2.根据世界卫生组织(who)的研究，慢性阻塞性肺疾病(copd)，下呼吸道感染和肺癌分别是全球第三，第四和第六种死亡原因，体现出现有治疗办法的局限性。此外，许多其他呼吸系统疾病也亟待有效的治疗方法。半衰期短、靶向性差，简单的传统剂型已经不能满足许多疾病治疗的需要。通过设计药物递药系统可以提升药物有效性同时减少副作用，使药物在病灶部位蓄积，增加体系的靶向性以及赋予体系长效释药能力成为了研究热点。特别是，肺部靶向近年来备受关注，其既可以实现局部治疗也可以进一步作用于全身，但是目前还未出现针对肺部的有效靶向递送制剂上市。
3.细胞递药具备递送范围广、生物相容性高、易实现靶向递送等优点。目前常用的细胞递药策略包括细胞内部包裹；细胞外受体连接、共价连接及选择素连接。然而尽管已经有近四十年的研究，细胞递药制剂还未能上市。制备过程复杂、所需材料昂贵以及细胞活性在制备过程中的损伤都是阻碍其发展的重要因素。因此开发一种制备过程简单方便，且对细胞活性影响小的细胞递药策略十分必要。
4.近年来，金属-多酚网络结构在仿生学、材料学、医学等众多领域应用广泛。多酚分子和金属离子可以在水溶液中通过配位螯合作用快速自组装成网状结构，并可以黏附在已经存在的界面上形成纳米涂层。由于制备过程简单、所用材料环保安全，金属-多酚网络可应用于载药、催化与生物成像等方面。研究表明金属-多酚网络结构能包裹于酵母细胞及大肠杆菌表面，且不影响生物活性。但现有研究中没有将多酚网络用于细胞递药的案例。鉴于金属-多酚网络良好的生物相容性和多酚配体的多酚羟基的特性，本发明基于多酚的特殊结构，将金属-多酚网络结构或者不含金属的多酚配体包覆于细胞生物膜表面，并将药物采用“搭便车”的方式夹带在生物膜与多酚结构之间，从而设计出全新的细胞载药策略，此外，利用其在体内迅速分布靶向到肺部的特点，该发明为肺部靶向及递药提供了新思路。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对肺部疾病设计新的递药体系。本发明的另一目的是提供该种细胞递送制剂的制备方法，该方法工艺简单、制备过程可控、制备所需的材料易得、制备出的细胞递药制剂活性稳定。
6.技术方案
7.一种用于肺部疾病治疗的药物制剂，其特征包括细胞、金属-多酚网络、包裹于细胞与金属-多酚网络间的药物；或者包括细胞、多酚、包裹于细胞与多酚间的药物。
8.所述的肺部疾病治疗的药物制剂，其特征在于，所述的细胞包括但不限于红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、nk细胞、dc细胞、t细胞、b细胞等。
9.所述的金属-多酚网络，其特征在于，所述的金属元素包括但不限于铝、钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、锝、钌、铑、镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镥等，其中最优金属元素为铁和镧。
10.所述的多酚，其特征在于，所述的多酚包括但不限于鞣酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸、邻苯三酚、邻苯二酚、木质素、邻苯二酚官能化聚乙二醇、邻苯二酚官能化透明质酸、多巴胺、聚多巴胺等。
11.所述的用于肺部疾病治疗的药物制剂，其特征在于，递送的药物包括但不限于生物大分子药物如基因、多肽、蛋白、单抗、酶、聚糖与核酸，如：派姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗、托珠单抗、诺西肽、超氧化歧化酶(superoxide dismutase,sod)，caspase-3、p53、anti-mir138、尿激酶、链激酶、阿替普酶、肝素等
12.所述的用于肺部疾病治疗的药物制剂，其特征在于，递送的药物可以是小分子药物与蛋白质的复合物，其所述的小分子药物包括但不限于肺部抗炎、抗菌、抗病毒药物，如：辛伐他汀、匹伐他汀、贝他定、氯膦酸盐、头孢菌素、阿莫西林、环丙沙星、羟氯喹、钙通道抑制剂(硝苯地平、地尔硫卓、氨氯地平)、内皮素受体拮抗剂(安倍生坦、波生坦、马西替坦)、磷酸二酯酶-5抑制剂(西地那非、他达拉非、伐地那非)、鸟苷酸环化酶刺激剂(利奥西瓜)、前列环素类似物和前列环素受体激动剂(贝拉前列素、依前列醇、伊洛前列素、曲前列环素、selexipag)等。
13.所述的用于肺部疾病治疗的药物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
14.1)制备细胞悬液；
15.2)将鞣酸溶液加入细胞悬液中，上下颠倒摇匀，得到鞣酸与细胞的混合悬液；
16.3)将药物溶液加入鞣酸与细胞混合悬液，上下颠倒摇匀；
17.4)将金属盐溶液加入步骤3)获得混合悬液，上下颠倒摇匀，得到细胞-金属-多酚网络载药复合物；
18.5)将步骤4)获得载药复合物与药物共孵育，孵育后离心，除去上清液，清洗，即获得产物。
19.进一步为：
20.所述的用于肺部疾病治疗的药物制剂的制备方法，其特征在于，制备过程简单，重现性高，以含金属-多酚网络的肺部给药制剂为例包括以下步骤：
21.1)将细胞用pbs稀释至所需浓度，得到细胞悬液；
22.2)将5μl鞣酸溶液加入500μl细胞悬液中，上下颠倒摇匀，得到鞣酸与细胞的混合悬液；
23.3)将10μl药物溶液加入鞣酸与细胞混合悬液，上下颠倒摇匀；
24.4)将5μl三氯化镧或三氯化铁溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，得到细胞-金属-多酚网络载药复合物；
25.5)将上述载药复合物孵育5min，孵育后离心5min，除去上清液，加入500μlpbs并上下颠倒摇匀；
26.6)重复上述过程2)～5)两次完成载药过程；
27.7)将载药细胞离心5min，除去上清液，加入500μlpbs并上下颠倒摇匀；
28.8)重复上述过程7)两次完成清洗过程，即得权力要求书1～6所述的肺部长效递药
体系。
29.不含金属离子的肺部给药制剂制备时不加入金属离子，制备方法与上述步骤基本一致。
30.所述的用于肺部疾病治疗的药物制剂，其特征在于，给药后该制剂迅速分布至患者肺部，缓慢释放，增加药效。
31.所述的用于肺部疾病治疗的药物制剂，其特征在于，该制剂给药途径包括但不限于静脉注射给药、皮下注射给药。
32.所述的用于肺部疾病治疗的药物制剂，其特征在于，所述体系可进行靶向修饰，可与其他药物蛋白复合物自组装实现药物联合递送。
33.所述的用于肺部疾病治疗的药物制剂，其特征在于，所述体系可用于治疗包括但不限于下呼吸道感染、肺动脉高压、慢性阻塞性肺疾病、肺癌等肺部疾病。
34.所述的药物制剂在药物递送领域和肺部疾病临床的应用。
35.在前期处方筛选过程中，采用磁力搅拌或者涡旋等方式将细胞、金属和多酚进行混和，均产生可见的絮状物。增加细胞的数量，絮状物变少；细胞数量过高结合效率变低，故最终确定细胞的浓度为106—109，并且采用轻柔的颠倒混匀的方式使复合物中的细胞、蛋白药物复合物以及金属多酚网络进行自组装。
36.作为细胞制剂有如下要求：
37.1.保证细胞的活性。由于细胞具备活性，在体循环实现靶向，若活性破坏，其在体内的运行和累积都将失效，且会降低其生物相容性，产生不良反应。例如血小板具有良好的靶向性和释放能力是由于其能够天然地特异性靶向损伤部位，或增殖细胞密度较高的部位，实现局部释放。若其失活则无法实现靶向。
38.2.保证细胞形态不变。例如正常成熟红细胞为无核、双凹盘形血细胞，无细胞器。它们的直径为7～8微米，中间最薄的部分只有1微米。这种形态使其比表面积很大，有利于物质交换。
39.3.保证细胞表面结构不变。
40.本发明作用原理：据报道，采用免疫细胞，单核吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞、dc细胞)，淋巴细胞，中性粒细胞等作为药物递送载体具备多种优势，例如：靶向到疾病部位、延长药物半衰期、药物可控释放、削弱药物的免疫原性和毒性等。用细胞作为药物递送载体，细胞可发挥一种“特洛伊木马”的作用，进而将药物递送到疾病部位。此外，活细胞本身携带大量受体，存在一定的靶向作用。此发明中所使用的细胞-药物复合体系，可以携带药物-蛋白复合物参与血液循环，到达肺部时，由于肺部的血流灌注速度快，在血流的作用下，本发明设计的递药体系在肺部被剪切掉落并进一步实现药物释放，从而对肺部疾病进行治疗。
41.具体而言是通过递送蛋白-药物复合物将目标大分子蛋白药物或者小分子的药物递送到靶器官，并且实现药物的缓慢释放。采用制剂手段，将所递送的药物先和蛋白质制备形成复合物，再进一步使蛋白-药物复合物吸附在细胞表面或者细胞和金属-多酚复合物之间，实现药物递送。
42.实验结果表明，采用多酚-药物复合物，可以使复合物与细胞的结合更加紧密，从而使体系稳定。但是，金属多酚网络复合物存在时，药物的释放相对缓慢。因此，对不需要缓
慢长效释放的体系，可采用无金属-多酚网络复合物的体系，从而使药物更快的发挥作用。
43.本发明的关键点是制备蛋白-药物复合物并进一步与细胞结合形成稳定的细胞/蛋白-药物复合物。与其他细胞递送体系相比，本发明采用活细胞为载体，并且在制备和储存过程中保留该细胞的生物活性，并利用其特殊的生物活性实现药物的靶向递送、缓慢释放的目的。采用本发明，可以通过活细胞进行药物递送并且靶向到肺部，发挥药效。
44.本发明所述的细胞/金属-多酚网络/蛋白复合物，其鞣质和金属的最佳摩尔比为1:1。(理论上来说其他金属也可以，并且已经在权利要求书中列明，实施例中采用金属镧作为模式金属，是因为镧系金属在临床前研究中本身即可作为一种药物，实现抗肿瘤、抗炎的作用，有研究表明，采用镧修饰后的介孔硅，可以增加对药物布洛芬的吸附以提高载药量，并且可以控制其释放)
45.该体系制备过程简单，所使用的复合物材料对细胞毒性无影响。难点在于选择适于靶向到靶器官的细胞，并且在制备和储存过程中避免细胞活性丧失。
46.本发明基于细胞递药体系进行广泛研究，考虑将金属-多酚网络包裹于细胞外。首先利用提取大鼠红细胞进行初步实验，通过比较细胞浓度、细胞与金属-多酚网络的比例、金属-多酚网络存在与否、载药量等进行初步筛选。并进一步筛选了不同种类的细胞，对其体内的靶向性进行研究。根据确定的处方及操作方法，延伸至其他细胞及其他金属材料，最终实现本发明。
47.有益效果
48.本发明制备的制剂符合细胞制剂要求，即保持细胞活性，形态不变，表面结构不变，同时本发明还实现靶向和定点释放的功能，同时本发明肺部长效递药体系具有制备工艺简单、制备过程可控，可快速递送至肺部等优点。
附图说明
49.附图1为实施例1所制得的红细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物的倒置荧光显微镜照片；
50.附图2为实施例2所制得的红细胞/铁-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物的倒置荧光显微镜照片；
51.附图3为实施例3所制得的raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物的激光共聚焦显微镜照片；
52.附图4为实施例4所制得的raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物的细胞存活情况实验结果；
53.附图5为实施例5所制得的raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物在小鼠各脏器的分布情况；
54.附图6为实施例6所制得的raw264.7细胞/镧-鞣酸网络复合物的紫外光谱图；
具体实施方式：
55.本发明除特殊说明，所用的百分比都是体积百分比。
56.本发明所用的原料或者试剂，均市售可得或者自行提取可得。
57.本发明采用倒置荧光显微镜，激光共聚焦显微镜，透射电子显微镜，紫外光谱，小
动物活体成像等对体系的结构进行表征。
58.实施例1
[0059][0060][0061]
制备工艺：
[0062]
称取牛血清白蛋白10mg，溶于5ml去离子水；称取1.5mg fitc，溶于4ml乙醇。将二者加入圆底烧瓶混合，4℃冰水浴反应8h。将反应液分装于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水环境中透析除去游离fitc。收集透析袋内液体获得fitc标记的牛血清白蛋白，备用。将分离提纯的红细胞用pbs缓冲液稀释至20％。称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。精密称定七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。取100μl红细胞加入至pbs缓冲液400μl，上下颠倒混匀。将5μl鞣酸溶液加入500μl红细胞悬液中，上下颠倒摇匀。将10μl fitc标记的牛血清白蛋白加入鞣酸与红细胞混合悬液，上下颠倒摇匀。将5μl三氯化镧溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，得到细胞-金属-多酚网络载药复合物。将上述细胞-金属-多酚网络载药复合物孵育5min，孵育后离心5min，除去上清液，加入pbs缓冲液500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。
[0063]
采用倒置荧光显微镜观察实施例1所制备得到的红细胞-镧-鞣酸网络复合物包红细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。结果见图1：实施例1制备得到的红细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物大小为5～10μm，具有明显的荧光，且红细胞形态无明显变化。表明金属-多酚网络结构能有效的将大分子药物包裹于细胞表面。
[0064]
实施例2
[0065]
[0066][0067]
制备工艺：
[0068]
称取牛血清白蛋白10mg，溶于5ml去离子水；称取1.5mg fitc，溶于4ml乙醇。将二者加入圆底烧瓶混合，于4℃冰水浴条件下反应8h。将反应液分装于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水环境中透析除去游离fitc。收集透析袋内液体获得fitc标记的牛血清白蛋白，备用。将分离提纯的红细胞用pbs稀释至20％。称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取六水合三氯化铁3.9mg，溶于1ml去离子水制得六水合三氯化铁母液。取100μl红细胞加入至pbs 400μl，上下颠倒混匀。将5μl鞣酸溶液加入500μl红细胞悬液中，上下颠倒摇匀。将10μl fitc标记的人血清白蛋白复合物溶液加入鞣酸与红细胞混合悬液，上下颠倒摇匀。将5μl六水合三氯化铁溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，得到红细胞/铁-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。将上述红细胞/铁-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物孵育5min，孵育后离心5min，除去上清液，加入pbs缓冲液500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/铁-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。
[0069]
采用倒置荧光显微镜观察实施例2所制备得到的红细胞/铁-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。实施例2制备得到的红细胞/铁-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物大小为5～10μm，具有明显的荧光，且红细胞形态无明显变化。实验结果表明，改变金属离子种类，依然能有效的将大分子药物包裹于细胞表面。附图2为其倒置荧光显微镜照片。
[0070]
实施例3
[0071][0072][0073]
制备工艺：
[0074]
称取牛血清白蛋白10mg，溶于5ml去离子水；称取1.5mg fitc，溶于4ml乙醇。将二者加入圆底烧瓶混合，于4℃冰水浴条件下反应8h。将反应液分装于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水环境中透析除去游离fitc。收集透析袋内液体获得fitc-牛血清白蛋白，备用。将raw264.7细胞用pbs稀释为2
×
106～4
×
106个/ml。称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。精密称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。
取raw264.7细胞100μl加入至pbs 400μl，上下颠倒混匀。将5μl鞣酸溶液加入500μl raw264.7细胞悬液中，上下颠倒摇匀。将10μl fitc标记的牛血清白蛋白加入鞣酸与raw264.7细胞混合悬液，上下颠倒摇匀。将5μl三氯化镧溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，得到raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。将上述raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物于4℃冰水浴条件孵育5min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。
[0075]
采用激光共聚焦显微镜观察实施例3所制备得到的raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。实施例3所制备得到的raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物大小为5～10μm，相比于无金属-多酚网络对照组，raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物中的细胞膜周围具备明显的荧光，且raw264.7的细胞形态无明显变化。表明该raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物能将大分子药物包裹于细胞表面。附图3为其激光共聚焦实验结果。
[0076]
实施例4
[0077][0078][0079]
制备工艺：
[0080]
称取牛血清白蛋白10mg，溶于10ml去离子水，备用。将raw264.7细胞用磷酸缓存液稀释为2
×
106～4
×
106个/ml。称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。取raw264.7细胞100μl加入至pbs 400μl，上下颠倒混匀。将5μl鞣酸溶液加入500μl raw264.7细胞悬液中，上下颠倒摇匀。将10μl牛血清白蛋白溶液加入鞣酸与raw264.7细胞混合悬液，上下颠倒摇匀。将5μl三氯化镧溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，得到raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。将上述raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物孵育5min，孵育后离心5min，除去上清液，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物。
[0081]
以1:10的比例向raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物中加入台盼蓝染液，于4℃条件下孵育3min，死细胞被台盼蓝染为蓝色，活细胞颜色无变化。于0h、2h、4h、6h、8h、10h、60h于显微镜下进行活细胞血球计数板计数，计算复合物中细胞的存活率。结果表明raw264.7细胞在60h后存活率仍能保持60％以上，说明该肺部给药制剂中的细胞活性良好。附图4为复合物中细胞的存活率随时间的变化情况。
[0082]
实施例5
[0083][0084][0085]
制备工艺：
[0086]
称取牛血清白蛋白5.0mg，溶于4.5ml pbs；称取sulfo-cy70.5mg溶于0.5ml去离子水。将上述两种溶液于圆底烧瓶混和，冰水浴过夜反应。将反应液分装于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水环境中透析除去游离sulfo-cy7。收集透析袋内液体获得的sulfo-cy7标记的牛血清白蛋白，备用。将raw264.7细胞用pbs稀释为3.5
×
107个/ml。称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。取raw264.7细胞100μl加入至pbs 400μl，上下颠倒混匀。将5μl鞣酸溶液加入500ml raw264.7细胞悬液中，上下颠倒摇匀。将10μl sulfo-cy7标记的人血清白蛋白溶液加入鞣酸与raw264.7细胞混合悬液，上下颠倒摇匀。将5μl三氯化镧溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，得到raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-人血清白蛋白复合物。将上述raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物于4℃冰水浴条件孵育5min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物的制备。
[0087]
采用balb/c小鼠作为模型动物，随机分为两组。在小鼠尾静脉分别注射上述制得的raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物以及游离sulfo-cy7标记的牛血清白蛋白溶液。于1h、2h、4h对小鼠进行脊椎脱臼处死，分离心、肝、脾、肺、肾、脑组织并进行荧光成像。测定荧光强度的条件是发射波长745nm，吸收波长774nm。
[0088]
实验结果表明，sulfo-cy7标记的raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物迅速蓄积到小鼠的肺部，且随着注射时间的延长，小鼠肺部及其他血流丰富组织的复合物蓄积减弱，但与对照组相比，sulfo-cy7标记的制剂组的小鼠肺部荧光更亮。说明sulfo-cy7标记的制剂能有效蓄积于肺部，实现体系的肺部蓄积和递药，附图5为sulfo-cy7标记的raw264.7细胞/镧-鞣酸网络-牛血清白蛋白复合物在模型小鼠各脏器的蓄积情况。
[0089]
实施例6
[0090]
raw264.7细胞
[0091]
鞣酸
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
40mg
[0092]
七水合三氯化镧
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
8.9mg
[0093]
ph 7.4 pbs
[0094]
制备工艺：
[0095]
将raw264.7细胞用pbs稀释为2
×
106～4
×
106个/ml。称取鞣酸40mg，溶于1ml去离
子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。取raw264.7细胞100μl加入至pbs 400μl，上下颠倒混匀。将5μl鞣酸溶液加入500μl raw264.7细胞悬液中，上下颠倒摇匀。将5μl三氯化镧溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育5min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，完成镧-鞣酸包裹raw264.7的制备。
[0096]
采用紫外分光光度计对实施例6所制备得到的镧-鞣酸包裹细胞制剂进行全波长扫描。实施例6所制备得到的镧-鞣酸包裹细胞制剂于221nm波长处有明显的紫外吸收，游离三氯化镧溶液的对照组，镧-鞣酸包裹细胞制剂具备明显的紫外吸收特征。表明镧离子共轭结构改变，证明镧-鞣酸网格结构附着于细胞表面，且空间结构发生变化。附图6为raw264.7细胞/镧-鞣酸网络及游离镧金属的紫外吸收情况。
[0097]
实施例7
[0098]
红细胞
[0099]
il-6单抗
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1-5mg
[0100]
ph 7.4 pbs
[0101]
制备工艺：
[0102]
取红细胞(母液4
×
109/ml)5μl用500μl pbs稀释，上下颠倒混匀。将50μl il-6单抗(母液1mg/ml)加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，完成红细胞/il-6单抗复合物的制备。
[0103]
实施例8
[0104]
红细胞
[0105]
鞣酸
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
40mg
[0106]
七水合三氯化镧
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
8.9mg
[0107]
伊匹单抗
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1-5mg
[0108]
ph 7.4 pbs
[0109]
制备工艺：
[0110]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入pbs至500μl，上下颠倒混匀。将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀。将50μl伊匹单抗(母液1mg/ml)加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl三氯化镧溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，加入500μlpbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，完成红细胞/镧-鞣酸/伊匹单抗复合物的制备。
[0111]
实施例9
[0112]
红细胞
[0113]
鞣酸
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
40mg
[0114]
七水合三氯化镧
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
8.9mg
[0115]
质粒dnap53
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1-5mg
[0116]
ph 7.4 pbs
[0117]
制备工艺：
[0118]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)10μl加入pbs至500μl，上下颠倒混匀。将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀。将100μl质粒dna p53(母液1mg/ml)加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl三氯化镧溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，加入500μlpbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，完成红细胞/镧-鞣酸-质粒dna p53复合物的制备。
[0119]
实施例10
[0120]
红细胞
[0121]
caspase-3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1-5mg
[0122]
ph 7.4 pbs
[0123]
制备工艺：
[0124]
取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs500μl，上下颠倒混匀。将100μl caspase-3(母液1mg/ml)加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，完成红细胞/caspase-3复合物的制备。
[0125]
实施例11
[0126]
红细胞
[0127]
鞣酸
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
40mg
[0128]
七水合三氯化镧
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
8.9mg
[0129]
歧化酶
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1-5mg
[0130]
ph 7.4 pbs
[0131]
制备工艺：
[0132]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)10μl加入至pbs500μl，上下颠倒混匀。将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀。将100μl质粒歧化酶(superoxide dismutase,sod)(母液1mg/ml)加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl三氯化镧溶液加入上述混合悬液，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，完成红细胞/镧-鞣酸-sod复合物的制备。
[0133]
实施例12
[0134]
红细胞
[0135]
人血清白蛋白
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10mg
[0136]
曲前列环素
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5-2mg
[0137]
去离子水
[0138]
ph 7.4 pbs
[0139]
制备工艺：
[0140]
精密称定人血清白蛋白2mg溶解于2ml去离子水，精密称定曲前列环素0.5mg溶于200μl去离子水，将曲前列环素溶液于搅拌条件下缓慢滴加至人血清白蛋白中，搅拌10min，制得人血清白蛋白-曲前列环素复合物，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入pbs至500μl，上下颠倒混匀。将100μl人血清白蛋白-曲前列环素复合物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/人血清白蛋白-曲前列环素-含药复合物。
[0141]
实施例13
[0142]
红细胞
[0143]
人血清白蛋白
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10mg
[0144]
辛伐他丁
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1-5mg
[0145]
乙醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
200μl
[0146]
去离子水
[0147]
ph 7.4pbs
[0148]
制备工艺：
[0149]
精密称定人血清白蛋白2mg溶解于2ml去离子水，精密称定辛伐他丁1mg溶于200μl乙醇，将辛伐他丁溶液于搅拌条件下缓慢滴加至人血清白蛋白中，搅拌10min，制得人血清白蛋白-辛伐他丁复合物，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs 500μl，上下颠倒混匀。将100μl人血清白蛋白-辛伐他丁复合物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/人血清白蛋白-辛伐他丁-含药复合物。
[0150]
实施例14
[0151][0152]
制备工艺：
[0153]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。精密称定人血清白蛋白2mg溶解于2ml去离子水，精密称定硫酸羟氯喹1mg溶于200μl去离子水，将羟氯喹溶液于搅拌条件下缓慢滴加至人血清白蛋白
中，搅拌10min，制得人血清白蛋白-羟氯喹复合物，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs 500μl，上下颠倒混匀，将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，将100μl人血清白蛋白-羟氯喹复合物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl七水合三氯化镧加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/鞣质-镧/人血清白蛋白-硫酸羟氯喹-含药复合物。
[0154]
实施例15
[0155][0156]
制备工艺：
[0157]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。精密称定人血清白蛋白2mg溶解于2ml去离子水，精密称定他达拉非1mg溶于200μl dmso，将他达拉非溶液于搅拌条件下缓慢滴加至人血清白蛋白中，探头超声10min，制得人血清白蛋白-他达拉非复合物，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs 500μl，上下颠倒混匀，将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，将100μl人血清白蛋白-他达那非复合物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl七水合三氯化镧加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/鞣质-镧/人血清白蛋白-他达拉非-含药复合物。
[0158]
实施例16
[0159][0160]
制备工艺：
[0161]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。精密称定人血清白蛋白2mg溶解于2ml去离子水，精密称定西地那非1mg溶于200μl dmso，将他达那非溶液于搅拌条件下缓慢滴加至人血清白蛋白中，探头超声10min，制得人血清白蛋白-西地那非复合物，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs 500μl，上下颠倒混匀，将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，将100μl人血清白蛋白-西地那非复合物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl七水合三氯化镧加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/鞣质-镧/人血清白蛋白-西地那非-含药复合物。
[0162]
实施例17
[0163][0164]
制备工艺：
[0165]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。精密称定人血清白蛋白2mg溶解于2ml去离子水，精密称定伊马替尼1mg溶于200μl dmso，将伊马替尼溶液于搅拌条件下缓慢滴加至人血清白蛋白中，探头超声10min，制得人血清白蛋白-伊马替尼复合物，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs 500μl，上下颠倒混匀，将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇
匀，将100μl人血清白蛋白-伊马替尼复合物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl七水合三氯化镧加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/鞣质-镧/人血清白蛋白-伊马替尼-含药复合物。
[0166]
实施例18
[0167][0168][0169]
制备工艺：
[0170]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。精密称定人血清白蛋白2mg溶解于2ml去离子水，精密称定安倍生坦1mg溶于200μl乙醇，将安倍生坦溶液于搅拌条件下缓慢滴加至人血清白蛋白中，搅拌10min，制得人血清白蛋白-安倍生坦复合物，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs 500μl，上下颠倒混匀，将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，将100μl人血清白蛋白-安倍生坦复合物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl七水合三氯化镧加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/鞣质-镧/人血清白蛋白-安倍生坦-含药复合物。
[0171]
实施例19
[0172][0173]
制备工艺：
[0174]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。精密称定人血清白蛋白2mg溶解于2ml去离子水，精密称定盐酸法舒地尔1mg溶于200μl去离子水，将盐酸法舒地尔溶液于搅拌条件下缓慢滴加至人血清白蛋白中，搅拌10min，制得人血清白蛋白-法舒地尔复合物，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs 500μl，上下颠倒混匀，将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，将100μl人血清白蛋白-法舒地尔复合物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl七水合三氯化镧加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/鞣质-镧/人血清白蛋白-法舒地尔-含药复合物。
[0175]
实施例20
[0176][0177]
制备工艺：
[0178]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。精密称定人血清白蛋白2mg溶解于2ml去离子水，精密称定胆固醇-二氯乙酸前体药物1mg溶于200μl乙醇，将胆固醇-二氯乙酸前体药物溶液于搅拌条件下缓慢滴加至人血清白蛋白中，搅拌10min，制得人血清白蛋白-胆固醇-二氯乙酸前药复合物，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs 500μl，上下颠倒混匀，将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，将100μl人血清白蛋白-胆固醇-二氯乙酸前药复合物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl七水合三氯化镧加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/鞣质-镧/人血清白蛋白-胆固醇-二氯乙酸前药-复合物。
[0179]
实施例21
[0180]
红细胞
[0181]
鞣酸
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
40mg
[0182]
七水合三氯化镧
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
8.9mg
[0183]
透明质酸-冬凌草甲素前体药物 1-10mg
[0184]
去离子水
[0185]
ph 7.4 pbs
[0186]
制备工艺：
[0187]
称取鞣酸40mg，溶于1ml去离子水制得鞣酸母液。称取七水合三氯化镧8.9mg，溶于1ml去离子水制得三氯化镧母液。精密称定透明质酸-冬凌草甲素前体药物1mg溶于500μl去离子水，待用；取红细胞(母液浓度4
×
109/ml)5μl加入至pbs 500μl，上下颠倒混匀，将5μl鞣酸溶液加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，将100μl透明质酸-冬凌草甲素前体药物加入到上述复合物溶液中，上下颠倒摇匀，将5μl七水合三氯化镧加入红细胞悬液中，上下颠倒摇匀，加入500μl pbs并上下颠倒摇匀。将上述制剂于4℃冰水浴条件孵育15min，孵育后在4℃、150g条件下离心5min，除去上清液，加入pbs 500μl并上下颠倒摇匀。重复上述包裹过程两次，制得红细胞/鞣质-镧/透明质酸-冬凌草甲素前体药物-复合物。