多肽AT03在治疗糖尿病肾病药物中的应用的制作方法

多肽at03在治疗糖尿病肾病药物中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及一种多肽的应用，具体涉及一种多肽at03在治疗糖尿病肾病药物中的应用，属于生物化学技术领域。


背景技术：

[0002]
糖尿病是一种慢性、系统性的代谢性疾病，已成为全球关注的慢性病之一，是世界范围内死亡的主要原因之一。糖尿病肾病是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，是患者进展为终末期肾病发生肾衰竭的主要危险因素(郑文，潘少康，刘东伟，刘章锁.糖尿病肾病治疗进展，中华肾脏病杂志，第476页，2020年6月第36卷第6期)。糖尿病肾病的主要表现是从早期肾小球高滤过开始，随后是微量白蛋白尿到大量白蛋白尿的发展，然后肾小球滤过率下降。糖尿病肾病约占糖尿病患者的40％，是全世界慢性肾脏病的主要原因，也是终末期肾病的主要原因(liuyikai，luoshuoming，deng min，zhouzhiguang.progress in diagnosis and treatment of diabetic nephropathy.chin j arterioscler，2020，1007-3949)。其发病机制主要是肾小球毛细血管病变，主要是肾小球的入球小动脉扩张，肾小囊内压力增高的同时肾小球毛细血管病变导致滤过率增加，临床上以大量持续的蛋白尿为特征。到终末期肾单位大量坏死闭锁，肾小球滤过率降低，导致尿量减少蛋白尿消失，出现尿毒症，此时病人只能依靠肾脏移植和血液透析维持生命。给病人及家属产生巨额的医疗负担，病人的生活质量也会严重降低。还有研究显示，糖尿病肾病人群较正常人群nf-b、tnf-α、il-6等炎症因子表达较高。考虑可能是炎症因子形成免疫复合物沉积于血管内皮，肾小球内血管长期受炎症因子刺激，反复的损伤修复导致肾小球不可逆性损伤(周艺昊，田乔宇，孙俊寒，顾颐，王延亮，魏一民.糖尿病肾病研究进展，医药界，第51页，2020年02月第04期)。目前，对于糖尿病肾病的治疗，主要是包括降糖和降压治疗，没有专门用于治疗糖尿病肾病的药物。
[0003]
抗糖尿病多肽是一种天然多肽，在母体蛋白质中被加密和灭活，必须在体内胃肠道消化过程中或在食品加工过程中通过酶水解来发挥作用。抗糖尿病的活性可通过抑制胰高血糖素分泌，促进胰岛素分泌，增强β细胞功能实现，从而有效抑制小鼠的高血糖效应(shibu,marthandam,asokan,et al.short tetra-peptide from soy-protein hydrolysate attenuates hyperglycemia associated damages in h9c2 cells and icr mice.journal of food biochemistry,2018.)。多肽at03是一种大豆蛋白水解物抗糖尿病多肽，具有高抗糖尿病活性。
[0004]
由于糖尿病和糖尿病肾病致病机理和治疗原理的不同，以往技术中并未发现有药物能同时治疗两种病症，并能起到很好的治疗效果。本案发明人致力于对多肽at03进行研究，开发了多肽at03的新用途，提供了一种多肽at03在治疗糖尿病肾病药物中的应用，提供了一种有效治疗糖尿病肾病的药物。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种多肽at03的新用途，提供了一种多肽at03在治疗糖尿病肾病药物中的应用，提供了一种有效治疗糖尿病肾病的药物。
[0006]
本发明提供了一种多肽at03在治疗糖尿病肾病药物中的应用，所述多肽at03的氨基酸序列为：val-his-val-val-r1；其中，r1＝-nh2。
[0007]
本发明的val-his-val-val-r1为大豆蛋白的降解产物。
[0008]
本发明还提供一种药物组合物，用于治疗糖尿病肾病，所述药物组合物以多肽at03为活性成分。
[0009]
本发明的药物组合物还包含药学上可接受的辅料。
[0010]
本发明的辅料为液体辅料、固体辅料或半固体辅料。
[0011]
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物包含至少一种有效量的本多肽at03和至少一种药学上可接受的药用载体或辅料。本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的药物组合物制成各种合适的剂型。
[0012]
适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂以及可用于注射的无菌溶液。
[0013]
本发明的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配制，液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。
[0014]
本发明通过一系列动物实验证实了多肽at03在治疗糖尿病肾病中的药理学活性，证实了多肽at03不仅可以用应于抗糖尿病，还能应用于治疗糖尿病肾病，提供了一种有效治疗糖尿病肾病的药物，同时提供了一种多肽at03在治疗糖尿病肾病药物中的应用。本发明的多肽at03能够明显降糖、改善肾脏受损，具有开发成为治疗糖尿病肾病药物的应用前景。
附图说明
[0015]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0016]
图1：为6组小鼠降糖效果对比图。
[0017]
图2：为6组小鼠ogtt试验对比图和ogtt-auc柱状分析图(****：表示与对照相比在99％置信度内(p<0.0001))。
[0018]
图3：为6组小鼠itt试验对比图和itt-auc柱状分析图(****：表示与对照相比在99％置信度内(p<0.0001))。
[0019]
图4：为6组小鼠肾重对比图和肾重/体重比对比图。
[0020]
图5：为6组小鼠肾功能评价对比图。
[0021]
图6：为6组小鼠肾脏h&e染色病理切片图。
具体实施方式
[0022]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体
条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市购获得。
[0023]
本发明的实验结果采用graphpad prism软件进行分析，数据以平均值
±
标准误差(mean
±
sem)表示，并通过t检验进行评价。模型组与对照组比较，以*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001表示，给药组与模型组比较，以#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001表示。western blot结果采用tanon图像分析软件进行分析。
[0024]
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]
以下实施例中的小鼠均为健康雄性c57bl/6j小鼠，年龄为6-8周。
[0026]
以下实施例中的化合物均使用无菌的pbs作为溶剂配制得到。
[0027]
实施例1、多肽at03的制备
[0028]
多肽at03的氨基酸序列为：val-his-val-val-r1；其中，r1＝-nh2。本实施例中，抗糖尿病多肽化合物at03采用fmoc固相多肽合成法，由羧基端向氨基端方向合成，多肽at03的氨基酸按照前述氨基酸顺序依次连接。
[0029]
(1)多肽合成
[0030]
本发明的制备条件采用mbhar(amide-mbha-resin酰胺保护的mbha树脂)或者王树脂，以活化脂的方法，脱fmoc保护基合成。
[0031]
本发明的茚检试剂包括以下组分：
[0032]
试剂1：20g苯酚/5ml乙醇；
[0033]
试剂2：0.05 0.001m kcn(水)/2.5ml吡啶；
[0034]
试剂3：0.5g茚三酮/10ml乙醇；
[0035]
茚检试剂的使用比例为试剂1:试剂2:试剂3＝l:2:l(滴)，沸水中加热3-10min。
[0036]
本发明的多肽at03的制备方法具体包括以下步骤：
[0037]
a.处理树脂：称取一定量mbha树脂(1％交联度，200-400目，取代值0.5mmol/g)于合成仪中，加入dcm搅拌30min，抽干，再用dmf洗4次，每次2min，挑取少量树脂进行茚检，若树脂颜色无改变，表明正常，可使用。
[0038]
b.脱fmoc保护：20％哌啶(溶于dmf中)洗4次，每次2min，然后用dmf洗4次，每次2min，在第3次洗之后茚检，茚检显蓝紫色表明fmoc已脱，可接下一个氨基酸。
[0039]
c.缩合反应：将氨基酸、hobt、hbtu依次加入烧杯中，加入dmf使其溶解，dmf体积尽量小，加入diea启动反应后，立即加入到合成仪中，之后用少量dmf冲洗烧杯和合成仪壁(投料量＝树脂取代值(mmol/g)
×
m(树脂质量g)
×
m(肽的分子量g/mol)
×
几倍过量，氨基酸、hbtu、hobt加入3倍过量，diea为液体碱，起到活化酯反应，加入6倍过量，保证每步接近99％成功)。整个反应体系用氩气保护。反应搅拌1h，抽干，用dmf洗3次，每次2min，茚检无改变，说明氨基酸已接到树脂上。
[0040]
d.每接一个氨基酸，都重复步骤b、c，直至接肽完成为止。
[0041]
e.多肽切割：
[0042]
a.多肽at03的氨基酸全部连接完成后，用20％哌啶脱f-moc保护，洗4次，每次2min，然后用dmf洗4次，每次2min，茚检显色后，用dcm洗2次，每次3min，甲醇洗1次，每次3min，再用dcm洗1次，每次3min，甲醇洗2次，每次3min。经过处理后，移开搅拌棒，用胶塞密封合成仪，再使用真空泵彻底抽干，至少2h以上，直至树脂完全干燥呈粉末状。
[0043]
b.在抽干的合成仪中加入切割剂(tfa:tis:水＝95:2.5:2.5(v/v/v))，反应3h，每20min搅拌1min，用圆底烧瓶收集切割剂，并用tfa洗涤2次，每次5min(5ml/次)，收集的tfa与之前收集的切割剂合并。
[0044]
c.将所得的切割剂在旋转蒸发仪上减压抽干，把预先冷却的乙醚(50-80ml)加入到圆底烧瓶中，用力摇晃进行沉淀，静置。待白色固体沉淀到底部，使用滴管吸取上清液，加入分液漏斗中，补加等体积水，摇晃(中间放气几次)，静置。这时，分液漏斗内部的液体会进行分层，把下层水相流入圆底烧瓶中，将沉淀进行溶解(如果不好溶解，可加醋酸调节溶解性)。
[0045]
d.轻轻摇晃圆底烧瓶(防止乳化)，使得溶解彻底，然后倒入分液漏斗，把水相流入烧杯收集，多次冲洗，每次冲洗后收集水相。
[0046]
e.用保鲜膜密封烧杯，插孔、标记，-80℃过夜存放，然后真空冷冻干燥处理。
[0047]
(2)粗肽脱盐
[0048]
由于粗肽中存在反应过程中生成的副产物、盐和一些其他杂质，因此要对粗肽进行脱盐处理，初步除去杂质。首先称取一定量的sephadex g-25(约50-100目)，加入5-10倍去离子水，加热溶胀3h，装柱。待自然沉降完全后，用10％醋酸平衡柱子2h左右，然后上样、10％醋酸进行洗脱，收集核酸蛋白紫外检测仪220nm处有吸收峰的溶液，同样用保鲜膜密封烧杯，插孔、标记，-80℃过夜存放，然后真空冷冻干燥处理。
[0049]
(3)脱盐产物的纯化和纯度分析
[0050]
用高效液相色谱进行纯化：制备柱为c18反相制备柱，规格为xbridgetmbeh130 prep c18(10μm，19
×
250mm)，洗脱体系为20％-80％乙腈/水/0.1％三氟乙酸，持续60min，流速：8ml/min，收集主峰。待真空冷冻干燥后，送质谱(esi-ms)进行验证。
[0051]
纯化产物的纯度分析：分析柱为c18反相制备柱，规格为xbridgetmbeh130 prep c18(10μm，4.6
×
250mm)，洗脱体系为10％-90％乙腈/水/0.1％三氟乙酸，持续30min，流速：1ml/min，根据220nm色谱图积分，计算纯度。
[0052]
合成的多肽采用高效液相色谱进行纯化(纯度>95％)，并通过高分辨质谱进行表征。
[0053]
基于以上合成步骤，合成得到本发明的多肽at03：vhvv。
[0054]
实施例2、多肽at03对糖尿病和糖尿病肾病小鼠的治疗作用研究
[0055]
2.1抗糖尿病多肽化合物at03以及阳性药物对糖尿病小鼠的糖尿病改善作用
[0056]
获得db/db小鼠糖尿病模型(从南京大学-南京生物医药研究院购买，12周左右小鼠，并测定血糖和体重保证后续实验顺利进行)，对模型小鼠随机分成5组(生理盐水组、at03低剂量组、at03高剂量组、med组(medi0382，为一种glp-1/gcg受体双重激动剂)和sar组(sar425899，为一种glp-1/gcg受体双重激动剂))，每组6只，每只小鼠的基础体重和血糖无差异，每组小鼠每天分别皮下注射化合物at03(60μg/kg)、at03(120μg/kg)、med(120μg/kg)、sar(120μg/kg)、和生理盐水(dn组：同窝出生的正常小鼠；dc组：db/db小鼠对照组)。在小鼠每天给药之后，隔天禁食6h测小鼠的血糖和体重，每周测一次进水量和进食量。在第4周测ogtt，第5周测胰岛素耐量(itt)，第6-7周使用小鼠代谢笼检测小鼠代谢情况，第8周取材，检测各种血清学指标和病理学指标。
[0057]
2.1.1多肽at03对糖尿病小鼠的降糖作用
[0058]
2型糖尿病模型，其表现特征为：肥胖、胰岛素抵抗、高糖血症、血脂异常和肝脏脂肪空泡样变性等。
[0059]
从图1中6组小鼠降糖效果对比图中可以看出，降糖效果由大到小为：sar(120ug/kg)＞at03(120ug/kg)＞at03(60ug/kg)＞med(120ug/kg)；sar(120ug/kg)和med(120ug/kg)在第4天基本降到正常水平，at03(60ug/kg)和at03(120ug/kg)在第8天基本降到正常水平。
[0060]
2.1.2多肽at03对糖尿病小鼠的胰岛素改善作用
[0061]
在多肽at03以及阳性药物治疗糖尿病小鼠第4周和第5周的时候，分别进行了口服葡萄糖耐受实验(ogtt)和胰岛素耐受测试(itt)。测试结果见图2和图3。
[0062]
从图2中6组小鼠ogtt试验结果可以看出，多肽at03在使用浓度为60ug/kg和120ug/kg均展现出一定的改善糖耐受效果，且呈现出浓度依赖性，其中at03(120ug/kg)展现出和sar(120ug/kg)一样的效果。
[0063]
从图3中6组小鼠itt试验结果可以看出，多肽at03在使用浓度为60ug/kg和120ug/kg均展现出一定的改善胰岛素抵抗效果，且呈现出浓度依赖性，其中at03(60ug/kg)展现出和med一样的效果，at03(120ug/kg)和sar(120ug/kg)效果相当。
[0064]
2.2多肽at03以及阳性药物对糖尿病小鼠的糖尿病肾病的治疗作用
[0065]
2.2.1多肽at03对db/db模型小鼠肾脏萎缩的改善
[0066]
从图4中6组小鼠的肾重对比可以看出，at03、med和sar均有改善肾脏肥大的作用，at03(120ug/kg)和med效果更显著。从6组小鼠肾重/体重比结果说明，糖尿病模型会有一定的肾脏相对萎缩，而at03具有改善肾脏相对萎缩的功能。
[0067]
2.2.2多肽at03对db/db模型小鼠肾脏功能的改善
[0068]
从图5中6组小鼠肾功能评价对比图可以看出，at03(120ug/kg)和sar(120ug/kg)均可以减少血清中cre(血肌酐)的含量，sar的作用效果更显著。此外，at03(60ug/kg)、at03(120ug/kg)、med(120ug/kg)、sar(120ug/kg)均可以明显减少血清中bun(尿素氮)的含量，说明这些多肽均有改善肾功能的作用。
[0069]
2.2.3多肽at03对db/db模型小鼠肾脏纤维化病变的改善
[0070]
从图6中可以看出，与dn组相比，dc组小鼠出现肾小球和肾小管间质纤维化，并且肾小球出现黏连现象，at03(60ug/kg)、at03(120ug/kg)、med(120ug/kg)、sar(120ug/kg)均能抑制糖尿病小鼠肾脏纤维化病变，并且改善肾脏受损。
[0071]
综上所述，本发明的多肽at03具有改善肾脏萎缩、肾脏功能以及肾脏纤维化病变的效果，本发明的多肽at03在治疗糖尿病肾病药物中具有良好的治疗效果。本发明的多肽at03能够明显降糖、改善肾脏受损，具有开发成为治疗糖尿病肾病药物的应用前景。
[0072]
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求书所界定的保护范围。