SPINK7蛋白在制备促进过度炎症创面愈合的药物中的应用的制作方法

spink7蛋白在制备促进过度炎症创面愈合的药物中的应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及spink7蛋白在制备促进过度炎症创面愈合的药物中的应用。


背景技术：

[0002]
炎症是机体对于损伤的一种防御反应，通常是有益的，但过度的炎症反应会导致皮肤创面愈合障碍。皮肤创面愈合是一个复杂而有序的动态修复过程，主要由特征鲜明而又互有重叠的三个阶段构成，即炎症反应期、增殖期和重塑期。炎症反应是皮肤创面顺利愈合的启动因素，但是过度的、持续的炎症反应则会导致创面难以愈合，形成慢性难愈创面。慢性炎症创面特别是糖尿病创面愈合困难是棘手的世界性医学难题，目前尚无很好的治疗方法；过度炎症反应导致皮肤角质形成细胞增殖受限，无法完成再上皮化；成纤维细胞增殖与迁移能力下降，肉芽组织形成障碍，进而抑制伤口的正常愈合。由于过度炎症反应导致的慢性难愈创面主要包括糖尿病创面、静脉性溃疡和压力性溃疡等，尤以糖尿病足为代表的糖尿病难愈创面为典型。在糖尿病病人中，15％的糖尿病病人具有创面难愈的症状，其中高达84％的病人会因伤口不能愈合而面临截肢的危险。因此，抑制以糖尿病创面为代表的慢性难愈创面的炎症反应对糖尿病难愈创面的治疗具有重要意义。
[0003]
kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子7(serine protease inhibitor kazal type7,spink7)又名食管癌相关基因2(esophageal cancer-related gene 2,ecrg2)，是最初由我国学者从食管组织克隆并鉴定出来的一个食管癌候选抑癌基因。spink7由258个碱基编码，翻译成含85个氨基酸的9.23kd大小的蛋白产物，可分泌到胞外，其氨基酸序列在任、小鼠、大鼠等哺乳动物高度保守。spink7蛋白在食管上皮、口腔黏膜等呈组成性表达，也表达于银屑病、湿疹等免疫性疾病的皮损区域。研究发现，spink7在调节细胞增殖与凋亡，迁移与侵袭等事件中有重要作用，但其发挥作用的机制尚不完全清楚。
[0004]
然而，目前尚未见报道spink7蛋白在皮肤创面愈合和以糖尿病创面为代表的慢性难愈创面这类疾病中的作用和机制，spink7是否可以作为促进过度炎症创面愈合的干预靶点尚不清楚。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提出spink7蛋白在制备促进过度炎症创面愈合的药物中的应用，所述应用能有效抑制皮肤创面过度炎症反应，促进创面特别是糖尿病创面愈合，为促进慢性炎症创面特别是糖尿病创面愈合，提供一种途径，有着良好的应用前景。
[0006]
本发明的技术方案是：
[0007]
spink7蛋白在制备促进过度炎症创面愈合的药物中的应用。
[0008]
spink7蛋白在制备促进糖尿病创面愈合的药物中的应用
[0009]
spink7蛋白也可以作为创面愈合促进剂或伤口炎症抑制剂应用于化妆品、护肤用品中。
[0010]
所述药物是利用所述spink7蛋白抑制皮肤创面过度炎症反应，促进创面愈合。
[0011]
所述创面为慢性炎症创面、压力性溃疡、静脉性溃疡、褥疮伤口、烧伤伤口、手术伤口任一种，所述慢性炎症创面包括糖尿病伤口、糖尿病足部溃疡。
[0012]
所述spink7蛋白抑制炎症因子tnf-α及il-6的表达。
[0013]
本发明所述过度炎症是指机体在炎症反应中，致炎症因子持续存在不能消退，常表现为炎症因子如il-6、tnf-a等持续高表达，不断损伤组织，造成炎症过程迁延不愈。
[0014]
一种组合物或试剂盒，其含有spink7蛋白。
[0015]
上述spink7蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示：mkitggllllctvvyfcssseaaslspkkvdcsiykkypvvaipcpitylpvcgsdyitygnechlct eslksngrvqflhdgsc。
[0016]
编码spink7蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示：atgaagatcactgggggtctccttctgctctgtacagtggtctatttctgtagcagctcagaagctgctagtctgtctccaaaaaaagtggactgcagcatttacaagaagtatccagtggtggccatcccctgccccatcacatacctaccagtttgtggttctgactacatcacctatgggaatgaatgtcacttgtgtaccgagagcttgaaaagtaatggaagagttcagtttcttcacgatggaagttgctaa。
[0017]
含有编码所述spink7蛋白的核酸分子的重组载体、重组微生物和/或转基因细胞系同样可以用于上述应用。
[0018]
上述的组合物或试剂盒，其用于促进过度炎症创面愈合；用于降低糖尿病创面炎症反应、促进创面愈合；用于作为创面愈合促进剂或创面炎症抑制剂；用于抑制伤口周围炎症因子tnf-α及il-6的表达。
[0019]
本发明中，所述spink7蛋白可以是来源于天然的、合成的、基因重组的，还可以由合成的或是基因重组获得。
[0020]
本发明所述组合物包括有效剂量的spink7蛋白、以及一种或多种药学上可接受的任何载体、赋形剂及辅剂等，包括但不限于稀释剂、粘合剂、湿润剂等。其可制成适用于人或动物的任何剂型，包括但不限于注射剂、涂抹剂、缓蚀剂等。其可根据公知方法制备得到。所述组合物或试剂盒中的spink7蛋白的含量为0.1％-99％重量比。
[0021]
有益效果：
[0022]
本发明首次提出了spink7蛋白在抑制皮肤创面炎症的用途。本发明首次提出了spink7蛋白能降低糖尿病创面的炎症反应，有效抑制皮肤创面过度炎症反应，从而促进糖尿病创面的愈合。研究发现，以慢病毒感染人角质细胞株hacat细胞过表达spink7蛋白，能够显著抑制il-6和tnf-a等促炎细胞因子在炎症反应中的表达水平；采用spink7敲除小鼠及相应的对照野生型小鼠制备皮肤创面发现敲除小鼠愈合延缓，并伴有显著上调表达的il-6和tnf-a水平；进一步以spink7的真核表达质粒在糖尿病小鼠创面注射上调spink7的水平能够显著促进创面愈合并抑制il-6和tnf-a等促炎因子的表达水平。本发明所述的spink7能够抑制创面炎症，促进糖尿病创面愈合，具有很好的应用前景。
附图说明
[0023]
图1是spink7慢病毒感染hacat人角质细胞的稳定克隆经western blot检测显示该细胞能够高表达spink7蛋白。
[0024]
图2a是spink7在hacat人角质细胞高表达能够显著抑制tnf-a和ifn-γ联合刺激
no.5),tnf-a r:ggatccggtggtttgctacgacgt(seq id no.6)；tbp f：aagggagaatcatggaccag(seq id no.7)，tbp r：ccgtaaggcatcattggact(seq id no.8)。以tbp基因为内参，结果以炎症分子是对照组0h表达的多少倍来表示。
[0048]
3.2实验结果：
[0049]
spink7慢病毒稳定感染的hacat克隆经western blot检测显示能够在蛋白水平高表达spink7，参见图1。
[0050]
以tnf-a和ifn-γ联合刺激spink7高表达的hacat细胞和其对照细胞后，检测炎症相关的细胞因子的表达，显示spink7高表达能够显著抑制il-6和tnf-a等分子的转录表达，参见图2a、2b，其中，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
[0051]
实施例2：spink7敲除导致过度炎症反应，抑制小鼠创面愈合
[0052]
2.1实验方法：
[0053]
动物：spink7敲除小鼠及相应的对照野生型小鼠，每组8-10只。spink7敲除小鼠引种自赛业生物科技公司，在中国人民解放军陆军军医大学实验动物中心繁育。
[0054]
小鼠全层皮肤缺损创面模型的建立：
[0055]
小鼠以1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，后背部剃毛后以75％酒精和碘伏备皮，以皮肤活检器在后背部皮肤制备两个直径6mm的圆形皮肤全层缺损的创面。
[0056]
创面愈合的量化分析：
[0057]
建立创面模型后，在0、1、3、5、7、10天等时相点拍照记录伤口，计算伤口愈合速度，绘制小鼠伤口愈合的时间曲线。
[0058]
定量pcr：收集0天的全层正常小鼠皮肤和7天的创面组织，提取总rna，检测il-6和tnf-a的表达。
[0059]
2.2实验结果：
[0060]
如图3a、3b所示：spink7敲除小鼠较对照野生型小鼠创面愈合明显延迟；如图3c、3d所示：spink7敲除小鼠7天的创面组织il-6和tnf-a的表达水平较对照野生小鼠显著升高(*p<0.05；**p<0.01)。表明spink7在体内是有效抑制创面炎症的关键分子，其缺失会导致创面过度炎症反应进而延迟创面愈合。
[0061]
实施例3：创面局部注射spink7真核表达质粒抑制糖尿病小鼠创面炎症反应，促进糖尿病创面愈合
[0062]
3.1实验方法：
[0063]
质粒：spink7的真核表达质粒和对照cmv空质粒购自origene公司，按常规方法扩增、纯化(分子克隆实验指南，2013年10月四版)。
[0064]
糖尿病小鼠：c57bl/6小鼠按体重连续注射50mg/kg链脲霉素(stz,roche)5天。稳定10天以后，检测小鼠血糖，若血糖值＞20mmol/l，即糖尿病小鼠造模成功。
[0065]
创面局部质粒注射：糖尿病小鼠制备后背部直径6mm圆形全层皮肤缺损创面后，即刻在创缘分3点注射10ug/100ul纯化质粒。
[0066]
创面愈合曲线的制作和创面取材后的定量pcr方法同前。
[0067]
3.2实验结果
[0068]
如图4a、4b所示：spink7真核表达质粒创缘注射后能够显著促进糖尿病小鼠创面愈合；如图4c、4d所示：spink7质粒注射后7天的糖尿病创面组织il-6和tnf-a的表达水平较
对照质粒注射创面显著降低(*p<0.05；**p<0.01)。表明糖尿病创面通过创缘注射spink7真核表达质粒提高spink7蛋白水平能够一直创面炎症，促进糖尿病创面愈合。
[0069]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。