一种脆弱拟杆菌在制备治疗炎症性肠病药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种脆弱拟杆菌在治疗炎症性肠病中的应用。

背景技术：

炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)是一组不明原因的慢性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，uc)和克罗恩病(crohn'sdisease，cd)。前者又称非特异性溃疡性结肠炎，是一种原因不明的直肠和结肠的炎症，病变主要限于大肠黏膜与黏膜下层。炎症性肠病的发病机制尚未阐明，目前认为是基因上易感人群对肠道共生微生物产生过度的先天或后天免疫反应所致。

炎症性肠病尚缺乏有效的治疗手段，目前其治疗药物主要包括以下几类：(1)氨基水杨酸类制剂(2)肾上腺糖皮质激素(gcs)(3)免疫抑制剂(4)单克隆抗体(5)抗生素(6)微生态制剂。传统药物如氨基水杨酸类制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等因不良反应较多，而单克隆抗体药物又价格昂贵，故微生态制剂因其对肠道菌群具有明显的调节作用和较少的毒副作用而逐渐成为ibd治疗的新手段，成为当下的研究热点。

脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)是一种革兰氏阴性专性厌氧菌，属于拟杆菌门，根据能否分泌脆弱拟杆菌肠毒素可将其分为产肠毒素型脆弱拟杆菌(enterotoxigenicbacteroidesfragilis,etbf)和非产肠毒素型脆弱拟杆菌(nontoxigenicbacteroidesfragilis，ntbf)两种亚型。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道菌群的一部分，主要存在于结肠中，此外，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。

本发明首次研究发现，脆弱拟杆菌atcc25285能够通过调节肠道菌群稳态及增强肠道调节性免疫，有效治疗炎症性肠病，特别是溃疡性结肠炎，并且，从肠道菌群和肠道免疫角度探究脆弱拟杆菌atcc25285对肠道炎症的作用目前尚未见报道。

技术实现要素：

发明目的

本发明基于大量的实验研究和分析，提供了一种脆弱拟杆菌的新用途。

技术方案

一种脆弱拟杆菌在制备治疗炎症性肠病药物中的应用，其特征在于，该脆弱拟杆菌菌株为atcc25285。

所述的脆弱拟杆菌atcc25285，其特征在于，该脆弱拟杆菌atcc25285为脆弱拟杆菌atcc25285活菌体。

所述的应用，其特征在于，所述药学有效剂量为10⁶-10¹⁰cfu。

所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎。

有益效果：

本发明提供脆弱拟杆菌atcc25285在治疗炎症性肠病中的新用途。本发明研究发现，脆弱拟杆菌atcc25285能够有效调节结肠炎情况下肠道菌群紊乱向稳态转变，并增加肠道调节性t细胞(treg)及其分泌的具有免疫抑制作用的il10的表达，从而增强肠道调节性免疫，缓解肠道炎症。

附图说明：

图1：肠道菌群16srrna基因测序结果；图中，a是肠道菌群α多样性的物种多样性结果、b是肠道菌群物种丰富度分析结果，c是肠道菌群β多样性分析结果，d是肠道菌群主成分分析结果；e、f分别是肠道菌群在门、属水平上的物种分析结果；其中图中：nc：空白对照组；dss/control：结肠炎组；b.fragilis/dss+b.fragilis：给药组

图2：粪便样品中短链脂肪酸含量检测结果；图中，乙酸(a)，丙酸(b)，丁酸(c)，异丁酸、戊酸、异戊酸(d)；图中，*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；

图3：各组小鼠体重变化情况结果；

图4：各组小鼠结肠长度变化结果；

图5：各组小鼠结肠he染色结果，其中下方图为局部放大图；

图6：各组小鼠肠系膜淋巴结(mln)、结肠(li)treg细胞的表达情况；

图7：各组小鼠结肠il10的表达情况；

图8：各组小鼠结肠紧密连接蛋白zo-1的表达情况，其中右图为局部放大图。

具体实施方式

atcc25285购自北纳创联生物技术有限公司。

实施例1

脆弱拟杆菌atcc25285的培养

1、培养方法

tsa+10％无菌脱纤维羊血，37℃，严格厌氧，培养48h。

1ltsa培养基配方如下：胰蛋白胨……15g

大豆蛋白胨……5.0g

nacl……………5.0g

琼脂粉…………15g

。

称取本品40g，加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟。冷却至50度左右，加入10％的无菌脱纤维羊血，晃动混匀，倒平板。将菌种在平板上进行涂布，并按条件培养。

实施例2

脆弱拟杆菌atcc25285治疗结肠炎的效果

选取健康成熟的spf级c57/bl6雌性小鼠，体重18-22g，购自南京青龙山动物繁殖场，共18只，随机分成3组，每组6只，所有小鼠实验前适应性饲养1周。

1、动物分组及给药

空白对照组(nc组)：小鼠饮用无菌水。

结肠炎组(dss组)：小鼠给予3％的dss溶液作为饮用水，7天后，换为正常饮用水，并每天灌胃200μl无菌水，3天后处死。

给药组(dss+b.fragilis组)：小鼠给予3％的dss溶液作为饮用水，7天后换为正常饮用水，并每天灌胃200μl脆弱拟杆菌(含活菌10⁶-10¹⁰cfu)，3天后处死。

2、肠道菌群组成变化情况

实验方法：取粪便样品进行肠道菌群16srrna基因测序并进行肠道菌群alpha多样性、beta多样性分析、主成分分析和物种组成分析。

实验结果：如图1a和图1b所示，相比nc组，dss组肠道菌群物种多样性和丰富度均减少，而给药后明显增加；如图1c所示，beta多样性分析结果显示：结肠炎小鼠经给药后肠道微生物群落构成多样性增加；如图1d所示，第一主成分(pc1)的贡献率为28.33％，在第一主成分上给药组与nc组的聚类圈有交叠，说明给药能够有效减少结肠炎引起的小鼠肠道菌群结构的变化；如图1e、图1f所示，给药组肠道菌群在门、属水平上拟杆菌的丰度都明显增加。以上结果说明，脆弱拟杆菌atcc25285能够有效维持小鼠肠道菌群稳态。

3、肠道菌群的主要代谢产物-短链脂肪酸含量检测

实验方法：取粪便样品，气相色谱检测粪便样品中短链脂肪酸含量。

实验结果：如图2所示，相比dss组，给药组肠道菌群的主要代谢产物乙酸、丙酸、丁酸等的表达量均明显增加，给药能够维持小鼠肠道菌群稳态并增加其代谢产物含量。

4、体重变化

实验方法：每天同一时间记录小鼠体重。

实验结果：如图3所示，给药能够有效缓解结肠炎造成的体重降低情况。

5、结肠长度变化

实验结果：如图4所示，给药能够有效缓解结肠炎小鼠结肠长度减小的情况。

6、结肠he染色

实验方法：取结肠组织，用4％多聚甲醛固定，再进行石蜡包埋、切片、he染色，观察炎症情况。

实验结果：如图5所示，结肠炎导致小鼠结肠出现腺窝缺失及大量炎症细胞浸润，而给药后结肠腺体结构恢复正常、炎症症状得到明显缓解。

7、treg细胞的表达

实验方法：取肠系膜淋巴结、结肠组织，通过密度梯度离心提取淋巴细胞，然后流式检测各组样品treg细胞的表达情况。

实验结果：如图6所示，给药组肠系膜淋巴结及结肠中treg细胞的比例均增加，而炎症性肠病的发生与treg失衡密切相关，这说明脆弱拟杆菌能够增加肠道treg的表达，从而增强小鼠的肠道调节性免疫，维持肠道免疫平衡。

8、结肠il10的表达

实验方法：取结肠组织，提取组织蛋白，通过流式检测il10的表达。

实验结果：如图7所示，由于treg主要通过分泌il10从而发挥免疫抑制作用，给药组结肠il10的含量明显增加，说明给药确实能够增强肠道调节性免疫。

9、结肠紧密连接蛋白zo-1的表达

实验方法：取结肠组织，用4％多聚甲醛固定，再进行石蜡包埋、切片、免疫荧光染色，观察zo-1的表达情况。

实验结果：由于肠道黏膜屏障功能与肠道炎症密切相关，而细胞间的紧密连接作用是肠道黏膜屏障的最重要的组成部分，其中，紧密连接蛋白zo-1起着重要作用，如图8所示，相比nc组，dss组zo-1的表达减少，而给药组明显增加,肠道黏膜屏障功能增强。

以上结果说明，脆弱拟杆菌atcc25285能够有效调节小鼠肠道菌群稳态并增加其主要代谢产物-短链脂肪酸的含量，更重要的是，能够增加肠道treg及具有免疫抑制作用的il10的表达，从而维持肠道免疫平衡，另外，还能够通过增加紧密连接蛋白zo-1的表达增强肠道黏膜屏障功能。通过以上作用，脆弱拟杆菌atcc25285能够有效缓解结肠炎，在治疗炎症性肠病方面具有较大的应用潜力。