肠道上皮细胞核受体抑制子NCoR作为靶标在筛选药物中的应用

肠道上皮细胞核受体抑制子ncor作为靶标在筛选药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种防治胰岛素抵抗和肥胖相关疾病的新靶标肠道上皮细胞核受体抑制子ncor的应用。


背景技术：

2.糖尿病及肥胖成为威胁我国城乡居民健康的主要慢性病之一，在中国及全球的发病率逐年攀升，已成为主要的公共卫生问题。糖尿病主要分为1型和2型糖尿病，1型糖尿病属于自身免疫性疾病，主要原因是胰岛beta细胞坏死，胰岛素分泌绝对不足。2型糖尿病的发病机制和病理生理过程复杂，涉及多基因多器官异常，在发病过程中胰岛素抵抗是其最重要的病生理缺陷，而肥胖及其相关的慢性炎症则是导致胰岛素抵抗的主要原因，近些年研究表明肠道菌群也是重要影响因素之一。
3.目前临床上应用的糖尿病治疗药物中明确可改善胰岛素抵抗的只有胰岛素增敏剂噻唑烷二酮(tzd)类化合物，但是tzd类药物因增重和心血管风险等副作用而被撤市或限制应用
3.，因此，实际上目前并没有较好的胰岛素增敏剂。因此，研究开发新的糖尿病治疗靶点和药物势在必行，有着重要的社会价值。
4.核受体抑制子ncor属于核受体共抑制蛋白之一，核受体超家族包括过氧化物酶增殖体受体pparα，pparβ/δ，pparγ，法尼醇x受体fxr和肝脏x受体lxr等，都参与了脂质代谢和炎症通路的调节，tzd的作用靶点即为pparγ。在没有配体结合的情况下，ncor等共抑制蛋白结合在核受体上游启动子区，抑制其活性；而当配体与配体结合结构域lbd结合后，核受体与ncor等解离，招募共激活蛋白来发挥其转录调控作用。
5.ncor在多组织广泛表达，其全身性敲除可致死。针对不同组织ncor条件性敲除的研究发现，虽然ncor可与多种核受体相互作用，但在不同细胞，ncor敲除后会特异性的活化某种核受体来调节基因转录，其在不同细胞中功能并不相同。在脂肪组织
5.，ncor被敲除后通过活化pparγ，可显著减轻高脂喂养小鼠脂肪组织巨噬细胞浸润和炎症状态，改善胰岛素靶组织的胰岛素抵抗；ncor在巨噬细胞
7.的条件性敲除则可解除对lxr的抑制，激活脂肪酸合成通路基因表达，增加抗炎脂肪酸的合成，抑制nf-κb依赖的炎症反应，从而改善整体炎症状态，增加胰岛素敏感性；而在肌肉组织
11.，ncor敲除后的主要作用则是pparδ等的活化。因此我们认为，ncor在肠道上皮细胞被敲除后也会表现为某种特定核受体受到活化，并进一步调节脂质等营养物质的吸收代谢、胆汁酸的代谢、肠促胰岛素glp-1的分泌以及肠道菌群组成等，从而调节整体胰岛素敏感性。
6.到目前为止，关于对肠道上皮细胞ncor在肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病等发生发展中的作用未见报道，关于以肠道上皮细胞ncor为靶点治疗肥胖和糖尿病的药物和生物制剂也未见报道。


技术实现要素：

7.本发明解决的技术问题是提供了肠道上皮细胞核受体抑制子ncor作为靶标在筛选或制备预防、缓解或治疗胰岛素抵抗、肥胖及相关疾病的药物或生物制剂中的应用，从而为糖尿病和肥胖等的治疗提供一种有效的解决办法。
8.本发明解决的另一技术问题是提供一种肠道上皮细胞核受体抑制子ncor在制备胰岛素增敏或降脂小鼠模型中的应用，具体在动物水平验证通过敲除小鼠肠道上皮细胞ncor的表达，能够增加葡萄糖耐受和清除能力，减少脂质吸收能力，促进脂质代谢和清除能力。
9.为此，本发明提供了如下技术方案：
10.本发明技术方案的第一方面是提供了一种以肠道上皮细胞核受体抑制子ncor作为靶标在筛选或制备预防、缓解或治疗胰岛素抵抗、肥胖及相关疾病的药物或生物制剂中的应用。
11.优选的是，所述胰岛素抵抗、肥胖及相关疾病为糖尿病、高胰岛血症、高血脂症、高胆固醇血症、肥胖及葡萄糖不耐性。
12.优选的是，所述生物制剂或所述药物用于抑制肠道上皮细胞核受体ncor与核受体的相互作用，改变胆汁酸的含量和组成，减少肠道甘油三酯、胆固醇等脂质的吸收，增加其排泄；促进氧化代谢产热和能量消耗；促进肠促胰岛素glp-1的分泌，调节胰岛素分泌及糖脂代谢通路。所述生物制剂或所述药物上述作用并不依赖于肠道菌群变化。。
13.本发明技术方案的第二方面是提供一种肠道上皮细胞核受体抑制子ncor在制备胰岛素增敏或降脂小鼠模型中的应用。
14.优选的是，所述抑制ncor是，包括但不限于，通过cre-loxp系统以基因重组方式敲除该基因，以获得ncor组织特异性敲除的胰岛素增敏或降脂小鼠模型。
15.优选的是，所述ncor组织特异性敲除的胰岛素增敏或降脂小鼠模型能够增加葡萄糖耐受和清除能力，减少脂质吸收能力，促进脂质代谢和清除能力。
16.优选的是，所述的组织选自肠道上皮细胞。
17.有益技术效果：
18.本发明通过系统的研究发现：条件性敲除小鼠肠道上皮细胞ncor基因，得到ncor组织特异性敲除的小鼠，再进行高脂饮食喂养后，可显著逆转小鼠肥胖及胰岛素抵抗表型，降低体重，降低肝脏及腹腔脂肪重量，改善口服葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性，采用金标准高胰岛素正常血糖钳夹实验评价后，进一步精确证明了整体和肝脏、脂肪组织等靶器官的胰岛素敏感性均得到了显著改善。同时，条件性敲除小鼠肠道上皮细胞ncor也可显著改善肥胖小鼠的高胰岛素血症和肝脏脂质堆积，改变胆汁酸的含量和组成，减少肠道脂质吸收，并刺激活性胰高血糖素样肽(glp-1)的分泌。采用代谢笼对小鼠的能量代谢的监控表明条件性敲除小鼠肠道上皮细胞ncor还可增加代谢率，如产热及氧化代谢等，但并不增加小鼠的活动频率。进一步的，通过野生型小鼠与条件性肠道上皮细胞ncor敲除小鼠共饲养的方法，证明条件性肠道上皮细胞ncor敲除对表型的改善作用并不依赖肠道菌群介导。综上所述，发明人首次发现，通过条件性敲除肠道上皮细胞ncor，可以改善整体的胰岛素敏感性并降低体重，说明其可以作为靶标。通过抑制肠道上皮细胞ncor来增加肠促胰岛素激素glp-1的分泌，改变胆汁酸的含量和组成，抑制肠道脂质吸收，增加能量代谢率等，从而改善脂质
代谢，胰岛素抵抗及肥胖，有助于改变临床胰岛素增敏剂缺乏的现状，对2型糖尿病及肥胖的预防和治疗都有着积极的意义。
19.本发明的其他优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
20.图1为本发明条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对体重及组织重量的影响；a为高脂饮食喂养期间野生型小鼠(wt小鼠)和肠道上皮细胞ncor敲除小鼠(iko小鼠)的体重变化情况；b为高脂饮食喂养期间wt和iko小鼠的每周平均摄食情况；c为高脂饮食喂养后wt和iko小鼠的主要脏器肝脏(liver)，腹腔脂肪(wat)和胰腺(pancreas)湿重；d为高脂饮食喂养后wt和iko小鼠的主要脏器肝脏(liver)，腹腔脂肪(wat)和胰腺(pancreas)占体重比例。
21.图2为本发明条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对正常饮食和高脂饮食喂养小鼠胰岛素敏感性表型的影响；a正常饮食喂养下wt和iko小鼠口服葡萄糖耐量；b高脂饮食喂养后wt和iko小鼠口服葡萄糖耐量；c高脂饮食喂养后wt和iko小鼠胰岛素耐量。
22.图3为本发明条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对高脂饮食喂养小鼠分泌激素的影响：a高脂饮食喂养后wt和iko小鼠空腹胰岛素和糖刺激后15分钟血胰岛素水平；b高脂饮食喂养后wt和iko小鼠空腹糖促胰岛素激素-1(glp-1)水平；c高脂饮食喂养后wt和iko小鼠糖刺激后10分钟glp-1水平。
23.图4为本发明条件性肠道上皮细胞ncor敲除后高脂饮食喂养小鼠进行高胰岛素正常血糖钳夹实验对胰岛素敏感性精确评价的结果；a葡萄糖输注速率；b葡萄糖处置速率；c胰岛素刺激的葡萄糖处置速率；d稳态时相比基础状态胰岛素对肝糖输出抑制率；e稳态时相比基础状态胰岛素对血游离脂肪酸水平抑制率；f基础和稳态时血胰岛素水平。
24.图5为本发明条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对高脂饮食喂养小鼠脂质水平的影响；a血甘油三酯水平；b血总胆固醇水平；c血游离脂肪酸水平；d肝脏甘油三酯水平；e肝脏总胆固醇水平；f肝脏游离脂肪酸水平；g粪便中甘油三酯水平；h粪便中总胆固醇水平；i粪便中游离脂肪酸水平。
25.图6为本发明条件性肠道上皮细胞ncor敲除小鼠和野生型小鼠的共饲养(co-house)实验；a高脂饮食喂养后共饲养组(co-wt和co-iko)小鼠和分开饲养组(wt和iko)小鼠的口服葡萄糖耐量；b高脂饮食喂养后共饲养组(co-wt和co-iko)小鼠和分开饲养组(wt和iko)小鼠的胰岛素耐量；c高脂饮食喂养期间共饲养组(co-wt和co-iko)小鼠和分开饲养组(wt和iko)小鼠的体重变化情况；d高脂饮食喂养后共饲养组(co-wt和co-iko)小鼠和分开饲养组(wt和iko)小鼠的空腹胰岛素水平和糖刺激后10分钟的血胰岛素水平。
26.图7为本发明条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对高脂饮食喂养小鼠能量代谢的影响。a高脂饮食喂养后wt和iko小鼠能量代谢率；b高脂饮食喂养后wt和iko小鼠耗氧量；c高脂饮食喂养后wt和iko小鼠二氧化碳产生量；d高脂饮食喂养后wt和iko小鼠在有光照和黑暗中的活动量。
27.图8为本发明条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对高脂饮食喂养小鼠胆汁酸组成的影响。a高脂饮食喂养后wt和iko小鼠血液胆汁酸的组成；b高脂饮食喂养后wt和iko小鼠回肠胆汁酸的组成；c高脂饮食喂养后wt和iko小鼠粪便胆汁酸的组成；d高脂饮食喂养后wt和
iko小鼠回肠、粪便和血液中12α羟基甾醇型胆汁酸和非12α羟基甾醇型胆汁酸的比值。
具体实施方式
28.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
29.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
30.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
31.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
32.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
33.为使本发明的目的、技术方案、优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
34.实施例1条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对体重的影响
35.将ncor flox/flox小鼠与villin cre工具鼠进行回交数代后得到肠道上皮细胞ncor条件性敲除的雄性纯合子小鼠(iko)，同时选取出生日期和性别均相对应的ncor flox/flox小鼠作为野生型对照小鼠(wt)。wt和iko组小鼠每组各10-15只，给予高脂饮食(60％的热量来自于脂肪，购自research diets公司)喂养，每周监测体重和摄食变化。高脂饮食喂养15周后处死小鼠，摘取肝脏，腹腔脂肪和胰腺称重记录。
36.结果表明：条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对正常饮食喂养小鼠的体重无影响，但可显著抑制高脂饮食诱导的肥胖，并显著降低腹腔脂肪和肝脏的重量以及各自占体重的比例，同时也可显著增加胰腺占体重的比例；但对小鼠的摄食量无明显影响。
37.实施例2条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对胰岛素抵抗的改善作用
38.实施例1中的wt和iko组小鼠在高脂饮食喂养之前，仍进行正常饲料喂养时，进行口服葡萄糖耐量试验。小鼠禁食6小时后，尾尖取血测定空腹(0时)血糖，随后灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，于糖刺激后15分钟，30分钟，60分钟和120分钟时尾尖取血测定血糖值。于高脂饮食喂养第9周，进行口服葡萄糖耐量试验，方法同上。于高脂饮食喂养第10周，进行胰岛素耐量实验。小鼠禁食6小时后，尾尖取血测定空腹(0时)血糖，随后皮下注射给予胰岛素(0.3u/kg)，于胰岛素注射后15分钟，30分钟，60分钟和120分钟时尾尖取血测定血糖值。
39.结果表明：肠道上皮细胞ncor条件性敲除，对在正常饮食喂养下小鼠的葡萄糖耐
受性无影响，但可显著改善高脂饮食喂养导致的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性异常。
40.实施例3条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对胰岛素及糖促胰岛素激素的影响
41.实施例1中的wt和iko小鼠在高脂喂养第11周，禁食6小时后，尾尖取血，置于冰上，灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，于糖刺激后15分钟尾尖取血，置于冰上。12000rpm离心1min，吸取上清，采用alpco公司小鼠胰岛素elisa试剂盒测定血胰岛素水平。
42.实施例1中的wt和iko小鼠在高脂喂养第15周，禁食6小时，于禁食5.25小时灌胃给予西他列汀(25mg/kg，dpp4酶抑制剂)，于禁食6小时灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，于糖刺激后15分钟尾尖取血于提前加入edta抗凝剂和蛋白酶抑制剂的离心管中，置于冰上，1000g，4度离心10分钟，吸取上清，采用alpco公司小鼠活性glp-1elisa试剂盒测定血活性glp-1水平。
43.实施例1中的wt和iko小鼠在高脂喂养15周后，禁食4小时，采用二氧化碳麻醉，剖开胸腔心脏取血，至预先加有dpp4抑制剂和蛋白酶抑制剂的bd抗凝取血管中，1000g，4度离心20分钟，吸取上清，采用alpco公司小鼠活性glp-1elisa试剂盒测定血活性glp-1水平。
44.结果表明：条件性肠道上皮细胞ncor敲除可显著改善高脂饮食和肥胖导致的高胰岛素血症，并显著增加空腹和糖刺激15分钟后的活性肠道胰岛素激素glp-1水平，说明ncor敲除后可通过增加glp-1的水平从而促进胰岛素分泌以及改善胰岛素敏感性等。
45.实施例4条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对胰岛素敏感性影响的精确评价
46.采用实施例1中的方法得到的另一批次的wt和iko小鼠，高脂饮食喂养9周后，给予三溴乙醇(250mg/kg)麻醉，颈部开口，剥离出右侧颈静脉，结扎远心端，以软管(silastic 508-001，dow corning corp.)进行颈静脉插管，并从皮下穿行至背部留置，缝合伤口，恢复3天。实验当天禁食6小时后，首先以25μci每小时速度输注4min的初始量，然后改为以5μci每小时的速率输注d-[3-3h]葡萄糖(购自perkin elmer)，90分钟(记为t＝0min)时结束并取血。随后，以5μci/hour和20mu/kg/min恒定速率输注含d-[3-3h]葡萄糖的胰岛素溶液同时，开始输注50％的葡萄糖溶液。每隔10min尾尖取血测定血糖，根据血糖值调整葡萄糖的输注速率，当葡萄糖的输注速率在30min内保持基本恒定，相应血糖值也稳定在120mg/dl
±
5mg/dl范围内时，可认为达到稳态，此时的葡萄糖输注速率即为gir，取稳态时血样。测定基础状态和稳态时血液中3h的闪烁值，根据闪烁值测定结果，采用steele公式，计算得到基础状态及稳态时肝糖输出hgp并计算抑制率，葡萄糖处置速率gdr，以及主要反应肌肉葡萄糖摄取速率的胰岛素刺激的葡萄糖处置速率is-gdr。测定基础状态和稳态时血游离脂肪酸ffa和血胰岛素水平，计算得到主要反映脂肪组织胰岛素敏感性的胰岛素对游离脂肪酸水平的抑制率。
[0047]
结果表明：高脂饮食喂养后，相比wt小鼠，条件性肠道上皮细胞ncor敲除可显著性增加iko组小鼠的葡萄糖输注速率gir，葡萄糖处置速率gdr及外源性胰岛素对肝糖输出的抑制率和对游离脂肪酸的抑制率，而反映肌肉胰岛素敏感性的胰岛素刺激的葡萄糖处置速率is-gdr有增加的趋势，但无显著性差异，说明条件性肠道上皮细胞ncor敲除可显著改善小鼠整体和肝脏及脂肪组织的胰岛素敏感性。
[0048]
实施例5条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对脂质水平等影响
[0049]
实施例1中的wt和iko小鼠在高脂饮食喂养15周后，处死，心脏取血，采用中生北控公司的总甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)试剂盒测定血中tg和tc的含量，采用wako公司的
nefa试剂盒测定血中游离脂肪酸(ffa)的水平。
[0050]
实施例1中的wt和iko小鼠高脂饮食喂养15周后，处死，摘取肝脏冻存。取小块组织研磨匀浆后，采用前述tg，tc和ffa试剂盒测定相应脂质水平。
[0051]
实施例1中的wt和iko小鼠高脂饮食喂养的第12周，每只小鼠单笼饲养，收集24h的粪便，60度烘干后，加入甲醇：氯仿(1：2,v/v)，37度萃取12小时，取上清，再度蒸干，沉淀加入含10％tritonx-100异丙醇溶液复溶。采用前述tg，tc和ffa试剂盒测定相应脂质水平。
[0052]
结果表明：高脂饮食喂养后，相比wt组小鼠，条件性肠道上皮细胞ncor敲除可显著降低iko组小鼠的血甘油三酯和总胆固醇水平，但对血游离脂肪酸水平无显著影响。iko组的肝脏甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸含量也显著降低，说明条件性肠道上皮细胞ncor敲除也可显著改善高脂饮食和肥胖导致的肝脏脂质堆积。在粪便中，相比wt组小鼠，iko组的粪便中甘油三酯和总胆固醇的含量明显升高，说明条件性肠道上皮细胞ncor敲除可能会抑制肠道的脂质吸收，从而降低体重，改善肥胖等。
[0053]
实施例6条件性肠道上皮细胞ncor敲除小鼠和野生型小鼠的共饲养(co-house)实验
[0054]
采用实施例1中的方法得到的另一批次的wt和iko小鼠，从离乳开始，分为4组，wt和iko组为从3周龄后离乳开始就按基因型分开饲养，co-wt和co-iko组为从3周龄后离乳开始混合饲养，从而通过比较不同组别之间表型的差异以确定肠道菌群在条件性肠道上皮细胞ncor敲除小鼠表型中的作用。小鼠进行高脂饮食喂养第10周，进行口服葡萄糖耐量试验，方法同实施例2。高脂饮食喂养第12周，进行胰岛素耐量试验，方法同实施例2。高脂饮食喂养第13周，小鼠禁食6小时后，尾尖取血，置于冰上，灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，于糖刺激后10分钟尾尖取血，置于冰上。12000rpm离心1min，吸取上清，采用alpco公司小鼠胰岛素elisa试剂盒测定血胰岛素水平。
[0055]
结果表明：共饲养后与单独饲养相比，co-wt组与wt组的体重，葡萄糖耐受性与胰岛素敏感性均无明显差异，而co-iko组和iko组的体重，葡萄糖耐受性与胰岛素敏感性也无明显差异；共饲养组与单独饲养组条件性肠道上皮细胞ncor敲除后对高胰岛素血症的改善作用也无明显差异；说明肠道菌群在条件性肠道上皮细胞ncor敲除对高脂喂养的肥胖小鼠胰岛素敏感性表型的改善作用中并没有起主要作用。
[0056]
实施例7条件性肠道上皮细胞ncor敲除对高脂饮食喂养小鼠能量代谢的影响。
[0057]
采用实施例1中的方法得到的另一批次的wt和iko小鼠，高脂饮食喂养10周后，移入columbus代谢笼中，单笼饲养，适应性饲养一天后，监测小鼠的耗氧量vo2，二氧化碳产生量vco2及活动acti量vity，并计算能量代谢率(ee，energy expenditure)。
[0058]
结果表明：高脂饮食喂养后，相比wt组，iko组小鼠的耗氧量，二氧化碳产生量和能量代谢率均显著增加，但活动频率显著减少，说明条件性肠道上皮细胞ncor敲除可显著增加肥胖小鼠的氧化代谢和产热等过程，从而降低体重，改善肥胖。
[0059]
实施例8条件性肠道上皮细胞ncor敲除对高脂饮食喂养小鼠胆汁酸组成的影响。
[0060]
实施例1中的小鼠高脂高脂饮食喂养15周后，处死小鼠，收集粪便、回肠粘膜组织和血液样本，提取胆汁酸后，采用uplc/synapt g2-si qtof ms系统测定其含量浓度。
[0061]
结果表明：高脂饮食喂养后，相比wt组，iko组小鼠回肠和粪便的胆汁酸的含量组成发生了较大变化，胆汁酸总量显著降低，12α羟基甾醇型胆汁酸与非12α羟基甾醇型胆汁
酸的也比例显著降低，影响了肠腔内脂质的乳化过程及后续的脂质水解过程，减少了肠道的脂质吸收。
[0062]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。