PX-12在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶PLPro抑制剂药物中的应用

px-12在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶plpro抑制剂药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及的是px-12或其药学上可接受的盐在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶plpro抑制剂药物中的应用，更详细地说px-12或可作为冠状病毒木瓜样蛋白酶plpro的有效抑制剂。


背景技术：

2.px-12(1-methylpropyl 2-imidazolyl disulfide)是trx-1的小分子抑制剂，作用于trx-1上cys73的不可逆硫代烷基化,可刺激细胞凋亡，下调hif-1α和血管内皮生长因子(vegf)并抑制肿瘤的生长。由于高水平的trx-1与结直肠癌，胃癌和肺癌有关，因此px-12与化疗联合用于晚期转移性癌症是一种潜在的癌症治疗方法。
3.冠状病毒属于冠状病毒属(coronavirus)冠状病毒科(coronaviridae)尼多病毒目(nidovirales)，是一类具有多形性、有包膜的正链rna病毒，主要引起人和动物的呼吸道和肠道疾病。过去将冠状病毒分为3个组，i组和ii组主要为哺乳动物和人冠状病毒，iii组主要为禽类冠状病毒；现在可以根据宿主、血清型基因序列以及结构的不同可将冠状病毒分为四类：α类、β类、γ类和δ类。在这四类α类、β类只会感染哺乳动物，γ类和δ类主要感染鸟类。
4.冠状病毒主要侵害呼吸道，胃肠道和神经系统等，往往会造成呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎。2003年，严重的上呼吸道疾病(sars)暴发，全世界约8000人感染，死亡率高达10％。2014年，中东呼吸综合征(mers)在全世界多个国家暴发，死亡率比sars更高，约达40％。新型冠状病毒(sars-cov-2)是一种以前从未在人类中发现的冠状病毒新毒株，这种新毒株引起了新型冠状病毒肺炎(covid-19)，有比2003年sars病毒有更强的感染能力，致死力约为5％。自从疫情爆发以来至今，全球累计感染人数已经超过三千万，死亡人数多达上百万，并且疫情还在继续发酵。这些疾病的感染严重影响了人们的健康。冠状病毒的反复发作，提示人类对于其研究知之甚少，开发治疗冠状病毒的药物迫在眉睫。
5.木瓜样蛋白酶(plpro)是表达在冠状病毒5’末端基因组nsp3上的水解酶，主要功能为酶切多聚蛋白pp1a上nsp1-2，nsp2-3，nsp3-4之间特异性四肽结构lxgg，该多聚蛋白需要被水解后成为成熟的功能蛋白；另外，木瓜样蛋白酶具有从宿主细胞里脱离泛素的附加功能，该功能保护冠状病毒进而规避宿主固有的免疫反应。因此，木瓜样蛋白酶对于病毒的生命周期至关重要，可以作为抗冠状病毒药物设计筛选的理想靶点。
6.在这里我们发现，px-12会抑制sars-cov-2木瓜样蛋白酶的活性。不同冠状病毒的序列分析表明，冠状病毒的木瓜样蛋白酶具有高度相似性，这种抑制能力普适于冠状病毒木瓜样蛋白酶。经查阅相关资料，未发现px-12化合物作为冠状病毒木瓜样蛋白酶plpro抑制剂的相关报道。


技术实现要素：

7.本发明针对冠状病毒引起的肺部，呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎等相关炎症疾病缺乏有效防治药物的问题，指出px-12及其药学上可以接受的盐在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂药物的应用。
8.本发明技术是以新型冠状病毒(sars-cov-2)为模型，基于新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(sars-cov-2plpro)的三维结构进行药物设计，对包括天然产物库，临床化合物库，抗病毒药物库的数千个化合物进行理论筛选，得到可能对新型冠状病毒plpro有抑制的化合物。然后，我们利用前期构建的sars-cov-2木瓜样蛋白酶抑制剂筛选试剂盒，通过酶活性测试对这些化合物进行实验筛选。
9.本发明提供的第一种技术方案是：px-12在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶plpro抑制剂药物中的应用。
10.所述的冠状病毒为hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku、sars-cov、mers-cov、或者sars-cov-2中的任一种。
11.本发明提供的第二种技术方案是：一种冠状病毒木瓜样蛋白酶plpro抑制剂具有式i所示结构：
[0012][0013]
优选地，具有抑制效果的px-12还包括各种旋光异构体、其水合物及其与酸形成的可药用的盐。
[0014]
进一步优选地，所述水合物的结晶水数目为1-16中的任意实数。
[0015]
进一步优选地，所述的酸选自盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸或苹果酸中的任一种。
[0016]
本发明还进一步提供了一种冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂药物。
[0017]
进一步优选地，所述药物可以制备成各种剂型，例如：胶囊、片剂、丸剂、颗粒冲剂、注射药剂或喷剂，可以采用多种给药途径，例如口服、经皮、静脉或肌肉注射等。
[0018]
本发明所述的px-12对冠状病毒的靶点木瓜样蛋白酶plpro的酶活性具有抑制作用，尤其是新冠病毒的靶点木瓜样蛋白酶的酶活性有较强抑制作用，可作为冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制剂及其药物。
附图说明
[0019]
图1为实施例1在不同浓度的px-12下底物肽在木瓜样蛋白酶代谢下荧光强度随时间变化的示意图。
[0020]
图2为实施例2化合物px-12对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制曲线。
具体实施方式
[0021]
下述实施例中所用的抑制剂分子，均购自mce(medchemexpress)或其他普通商业
途径。
[0022]
本发明所用的抑制剂筛选试剂盒为为本发明申请人具有自主知识产权的产品(申请专利号为202010674650.x)，包括以下组分：
[0023]
sars-cov-2木瓜样蛋白酶、
[0024]
底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)、
[0025]
硼酸硼砂缓冲液。
[0026]
所述sars-cov-2木瓜样蛋白酶浓度为0.01-1mg/ml；
[0027]
优选地，所述底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)的浓度为0.1mm-5mm；其中dabcyl是猝灭剂4-二甲胺偶氮苯4
’-
羧酸，edans是荧光团5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸；
[0028]
优选地，所述硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔/升；所述硼酸硼砂缓冲液的ph为7-9。
[0029]
其中采用的sars-cov2木瓜样蛋白酶购自crystalo biopharma，底物dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)委托gl biochem定制合成，硼酸硼砂缓冲液购自雷根生物。
[0030]
进一步优选地，sars-cov-2木瓜样蛋白酶(浓度为0.1mg/ml)、底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)(浓度为0.1mm-5mm)、硼酸硼砂缓冲液(ph＝7-9)。本发明所述的试剂盒需要用配合荧光酶标仪进行荧光检测。实施例1：在抑制剂px-12不同浓度作用下底物肽在木瓜样蛋白酶代谢下荧光强度随时间变化
[0031]
具体实施过程为：
[0032]
1)sars-cov-2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
[0033]
2)将sars-cov-2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1ul稀释于98ul硼酸硼砂缓冲液(ph＝7.4)中，加入检测板中；
[0034]
3)将不同浓度的抑制剂(px-12浓度为0，0.05mm，0.1mm，0.25mm，0.5mm，1mm，2.5mm)分别取1ul加入上述步骤(2)获得的溶液中；
[0035]
4)将相同浓度的底物肽(0.5mm)1ul加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，每1分钟采一点；
[0036]
5)抑制剂存在的条件下，底物肽在酶代谢下荧光强度随时间缓慢增强效果如下图1，其结果显示，该底物肽被酶催化产生的荧光增强可以被抑制剂px-12抑制，并且这种抑制现象是浓度相关的。
[0037]
实施例2：化合物px-12对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制能力具体实施过程如下：
[0038]
1)sars-cov-2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
[0039]
2)将sars-cov-2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1ul稀释于98ul硼酸硼砂缓冲液(ph＝7.4)中，加入检测板中；
[0040]
3)将不同浓度的抑制剂(px-12浓度为0，0.05mm，0.1mm，0.25mm，0.5mm，1mm，2.5mm)分别取1ul加入上述步骤(2)获得的溶液中；
[0041]
4)将相同浓度的底物肽(0.5mm)1ul加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，孵育1h；
[0042]
5)统计各组孵育前后342nm激发，496nm处的荧光发射值。以control组(抑制剂浓度为0组)孵育前后的荧光变化值作为100，不同抑制组的荧光变化值与之相比得到剩余活性值(residual activity)。使用graphpad prism6软件，以抑制剂浓度的对数值(logc(inhibitor))为横坐标，对应的剩余活性值(residual activity)为纵坐标。结果如图2所示，得到抑制剂的ic
50
值。表1列举了px-12对sars-cov-2plpro抑制的活性数据。ic
50
计算的公式为y＝100/(1+10^((x-logic
50
)))，其中y代表剩余活性分数,x代表抑制剂化合物浓度的常用对数,∧指的是幂算法。图2所示为所示为不同抑制剂浓度对抑制酶活性比例作图，可以得到该化合物的抑制能力，用抑制酶活性一半时的抑制剂浓度来表示。
[0043]
表一：化合物px-12结构和抑制新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(plpro)ic
50
值
[0044][0045]
对所公开的实施例的上述说明，所有的操作方法和操作步骤以及底物的反应条件等，都是根据该技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
[0046]
因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。