一种紫杉醇药物递送载体及其制备方法

1.本发明属于制药技术领域，涉及药物载体的制备方面，具体涉及一种紫杉醇药物递送载体及其制备方法。


背景技术：

2.紫杉醇是一种天然萜类化合物，分子式为c
47
h
51
no
14
，是从紫衫的树皮中提取而得，具有抗瘤谱广、治疗指数高的优点，其被广泛的应用在各种癌症的治疗当中。不过，紫杉醇的水溶性差，其在水中的溶解度约为0.7mg/l
1.；同时，其口服生物利用度低
2.，低于2％，导致其在临床上仅能够通过静脉注射使用。
3.目前，紫杉醇的制剂包括脂质体、微球、微乳、纳米粒和胶束等等，这些制剂针对紫杉醇水溶性低的缺陷，从不同的角度提升了紫杉醇的临床应用效果。为了提升紫杉醇的水溶性，本领域通常选择一些物质作为增溶剂使用，这些物质包括聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮
[3
‑
5]
，以及烟酰胺、脂族羧酸的n,n
‑
二烷基酰胺、醇、聚乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇
‑
15
‑
羟基硬脂酸酯、peg
‑
脂质、泊洛沙姆、多库酯钠、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸、聚山梨酯、中链甘油三酯、甲基纤维素和糖等等
[6]
。除了上述常用的物质，利用肽来增强水溶性差药物的水溶性，是近些年来的研究热点
[7
‑
8]
。
[0004]
然而，现有技术对于紫杉醇水溶性的增强的效果有限，极少开发出类似水溶性药物的制剂，限制了紫杉醇的应用。因此，本领域亟待开发一种能大幅度提升紫杉醇水溶性并制备相应合适制剂的方法。
[0005]
本部分引述的现有技术文献为：
[0006]
[1].rowinsky e k,donehower r c.paclitaxel(taxol)[j].new england journal ofmedicine,1995,332(15):1004.
[0007]
[2].sparreboom a,van asperen j,mayer u,et al.limited oral bioavailability and active epithelial excretion ofpaclitaxel(taxol)caused by p
‑
glycoprotein in theintestine[j].proceedings of the national academy of ences of the united states of america,1997,94(5):p.2031
‑
2035.
[0008]
[3].lu f,shenyy,sheny q,et al.treatments ofpaclitaxel with poly(vinyl pyrrolidone)to improve drug release from poly(
‑
caprolactone)matrix for film
‑
based stent[j].international journal of pharmaceutics,2012,434(1
‑
2).
[0009]
[4].torchilin v p.torchilin,v.p.micellar nanocarriers:pharmaceutical perspectives.pharm.res.24,1
‑
16[j].pharmaceutical research,2007,24(1):1
‑
16.
[0010]
[5].kakinoki,atsufumi,kaneo,et al.synthesis and evaluation ofwater
‑
soluble poly(vinyl alcohol)
‑
paclitaxel conjugate as a macromolecular prodrug(biopharmacy)[j].biological&pharmaceuticalbulletin,2008,31(5):963
‑
969.
[0011]
[6].p
·
j
·
盖拉德,c
·
c
·
m
·
阿佩尔多恩,j
·
里普.不良水溶性物质的高主动脂质体装载,2016,cn 103501766 b.
[0012]
[7].inadaa,oshima t,takahashi h,et al.enhancement ofwater solubility of indomethacin by complexation with protein hydrolysate[j].international journal ofpharmaceutics,2013,453(2):587
‑
593.
[0013]
[8].sakurai y,inada a,hitotsumatsu m,et al.development of amphiphilic metal
‑
binding short peptides that change the dispersibility of paclitaxel upon complexation with intermediate metal(ii)ions[j].journal ofdrug delivery ence and technology,2020,59:101882.


技术实现要素：

[0014]
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于显著提高紫杉醇在水中的溶解度，并制备一种包封率优良的紫杉醇药物递送载体，同时将其应用在肿瘤的治疗中。
[0015]
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
[0016]
一种紫杉醇药物递送载体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0017]
(1)按重量比2:5:1，将单硬脂酸甘油酯、kolliphor el、卵磷脂溶解于有机溶剂中，加入玻璃微球，将有机溶剂蒸干后，冻干得到成膜的玻璃微球；
[0018]
(2)将紫杉醇溶于有机溶剂中，然后加入多肽dgrgggaaaa和聚酰胺
‑
胺树形分子的混合水溶液，混合震荡均匀并将有机溶剂蒸干，然后冻干并用磷酸盐缓冲液复悬；其中，聚酰胺
‑
胺树形分子的代数为2代或3代，所述多肽dgrgggaaaa和所述聚酰胺
‑
胺树形分子的重量比为2:1；
[0019]
(3)将步骤(2)所得物加入到步骤(1)所得物中，于10～50khz频率下，在水浴中超声处理，之后分离出玻璃微球，得到携载紫杉醇的脂质体混悬液递送载体。
[0020]
作为本发明可选的实施方案，所述有机溶剂包括乙醇、丙醇、丙酮中的至少一种。
[0021]
作为本发优选的实施方案，所述多肽dgrgggaaaa的制备方法如下：
[0022]
1)以二氯甲烷作为溶剂，将树脂与芴甲氧羰基
‑
天冬氨酸
‑4‑
叔丁脂、n,n
‑
二异丙基乙胺进行接触反应，然后用二甲基甲酰胺洗涤，再用二氯甲烷、甲醇和n,n
‑
二异丙基乙胺进行封头处理，接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；
[0023]
2)以二甲基甲酰胺作为溶剂，将甘氨酸、1
‑
羟基苯并三氮唑、n,n
‑
二异丙基碳二亚胺加入反应体系中进行接触反应，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；
[0024]
3)将精氨酸、甘氨酸、丙氨酸依次加入反应体系中进行接触反应，接着加入哌啶进行进行脱保护，最后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；
[0025]
4)将反应产物进行洗涤、干燥，然后加入切割液切割、沉降、纯化以制得多肽dgrgggaaaa。
[0026]
作为本发明优选的实施方案，步骤(1)中，所述玻璃微球的粒径为100～200μm；所述玻璃微球与有机溶剂的体积比为(1～4):1。
[0027]
作为本发明可选的实施方案，将有机溶剂蒸干时，采用真空旋转蒸发。
[0028]
作为本发明优选的实施方案，步骤(2)中，所述混合溶液中，所述多肽dgrgggaaaa的浓度为0.8～1.2mg/ml，所述聚酰胺
‑
胺树形分子的浓度为0.6～1.2mg/ml。
[0029]
作为本发明优选的实施方案，所述聚酰胺
‑
胺树形分子的代数为2代。
[0030]
作为本发明优选的实施方案，所述磷酸盐缓冲液的ph＝3.5～8.5，优选ph＝7.2，
浓度为5～50mm。
[0031]
作为本发明优选的实施方案，步骤(3)中，步骤(1)所得物与步骤(2)所得物的的体积比为(1～4):1；所述超声处理的时间为5～10分钟。
[0032]
本发明还提供了依据上述制备方案制备得到的紫杉醇药物递送载体及其在制备用于治疗癌症药物方面的应用。
[0033]
如本发明一个实施例所示，本发明发现部分现有技术报道的增溶物，如聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇，对于紫杉醇的水溶性的提升并不显著，这与在asuka inada的报道
1.的结论一致。我们发现，所考察的多肽对于紫杉醇的水溶性有较为明显的提升，这一结果与yuki sakurai
2.、asuka inada
[3]
、tatsuya oshima
[4]
、张继稳
[5]
的研究发现一致。不过，在我们尝试将肽与高分子材料混合后，意外的发现dgrgggaaaa与第2代聚酰胺
‑
胺树形分子混合作为增溶物质，可以及其显著的提升紫杉醇的的表观溶解度，几乎达到紫杉醇溶解度的55倍。在此结果的鼓舞下，我们将紫杉醇溶解在水相中制备携载紫杉醇的脂质体。在本发明之前，荷兰的发明人p
·
j
·
盖拉德提出可以通过对不良水溶性物质增溶后制备脂质体，但根据现有报道的记载，可知其对于药物水溶性的提升是有限的，难以获得可观的载药量，且其方法复杂难控。发明人经过大量的实验摸索后，发现配合玻璃微球制备脂质体的方法是可行的，在经过反复摸索优化后，获得了可以将包封率提升至接近90％的方案。
[0034]
因此，本发明对现有技术的贡献及其有益效果是：
[0035]
本发明显著的提升了紫杉醇的水溶性，并制备得到了包封率良好的脂质体，解决了现有技术中因紫杉醇水溶性差而应用受限的难题，利于相关肿瘤的治疗，具有广阔的应用前景。
[0036]
本部分中引述的现有技术文献为：
[0037]
[1].inada a,oshima t,baba y.enhancing the water dispersibility ofpaclitaxel by complexation with hydrophobic peptides[j].colloids and surfaces b:biointerfaces,2015,135:408
‑
415.
[0038]
[2].sakurai y,inada a,hitotsumatsu m,et al.development of amphiphilic metal
‑
binding short peptides that change the dispersibility of paclitaxel upon complexation with intermediate metal(ii)ions[j].journal ofdrug delivery ence and technology,2020,59:101882.
[0039]
[3].inada a,wang m,oshima t,et al.water solubility of complexes between a peptide mixture and poorly water
‑
soluble ionic and nonionic drugs[j].journal of chemical engineering ofjapan,2016,49(6):544
‑
551.
[0040]
[4].inadaa,oshima t,takahashi h,et al.enhancement ofwater solubility of indomethacin by complexation with protein hydrolysate[j].international journal ofpharmaceutics,2013,453(2):587
‑
593.
[0041]
[5].张继稳,郭涛,李海燕.用于增加紫杉醇或以紫杉醇结构为基础的类似药物的溶解度的寡肽,cn 103421085 b
具体实施方式
[0042]
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用
于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0043]
实施例1
[0044]
一、原料及试剂
[0045]
1、单硬脂酸甘油酯、kolliphor el(聚氧乙烯(35)蓖麻油)、卵磷脂、丙醇、二氯甲烷、第2代聚酰胺
‑
胺树形分子、第3代聚酰胺
‑
胺树形分子、芴甲氧羰基
‑
天冬氨酸
‑4‑
叔丁脂、n,n
‑
二异丙基乙胺、甲醇、哌啶、茚三酮、甘氨酸、1
‑
羟基苯并三氮唑、n,n
‑
二异丙基碳二亚胺、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸及其它有机试剂和材料均为市售产品；
[0046]
2、玻璃微球为发明人实验室自有，粒径分布在100～200μm；
[0047]
3、dgrgggaaaa为参照中国专利cn 107365354 a实施例1的方法制备而得，方便公众阅读起见，本发明将其引述如下：
[0048]
制备两亲性多肽dgrgggaaaa：
[0049]
a、称量2
‑
cl树脂1g(树脂载药量的取代度为0.5)于20ml的20℃的dcm中浸泡2min，然后用dmf、dcm各洗一次；以20mldcm作溶剂，称量0.2g的fmoc
‑
asp(otbu)
‑
oh，与1ml的diea、2
‑
cl树脂1g在20℃下反应1.5h，然后用dmf洗涤2次；用20mldcm+1ml甲醇+1mldiea在20℃下封头30min，用dmf洗涤3次；用15ml哌啶在20℃下脱保护，反应15min，然后用dmf洗涤4次，直至茚三酮检测为蓝色；
[0050]
b、向体系中投0.4gg和0.5g hobt，加1ml dic作为催化剂，20mldmf作溶剂在20℃下反应1h，然后洗涤3次，直至茚三酮检测为蓝色；依次加入0.9g r、0.4g g、0.5ga于20℃下，各个氨基酸均反应45min；
[0051]
c、待氨基酸序列全部接上之后，接着加入15ml哌啶于20℃下脱保护处理15min，反应结束后洗涤，茚三酮检测为蓝色即可；然后分别用20ml的dmf、dcm、甲醇依次洗涤，甲醇洗涤吹干；按质量体积比1g：10ml加切割液(含有tfa和水，并且体积比依次为为95：5)切割，沉降，纯化检测得到两亲性多肽dgrgggaaaa；
[0052]
本发明所得多肽纯度95.16重量％，质量0.77g。
[0053]
4、khhaaaaaaa参照如下文献的记载制备而得：
[0054]
sakurai y,inada a,hitotsumatsu m,et al.development of amphiphilic metal
‑
binding short peptides that change the dispersibility of paclitaxel upon complexation with intermediate metal(ii)ions[j].journal ofdrug delivery ence and technology,2020,59:101882.
[0055]
5、多肽混合物参照如下文献中关于多肽混合物制备的方法制备而得：
[0056]
inadaa,wang m,oshima t,et al.water solubility ofcomplexes between a peptide mixture and poorly water
‑
soluble ionic and nonionic drugs[j].journal of chemical engineering of japan,2016,49(6):544
‑
551.
[0057]
6、u6为中国专利cn 103421085 a中记载的寡肽u6，其序列为：
[0058]
trp phe phe glyarg glu lys asp
[0059]
二、水溶性实验
[0060]
1、预实验
[0061]
设置对照组：将紫杉醇溶于乙醇中制备得到浓度为30mg/l的药物乙醇溶液，将500
μl的药物乙醇溶液和500μl的蒸馏水混合后进行真空旋转蒸发并冻干。
[0062]
设置实验组：将添加物溶于水中，制成浓度为1.0g/l的添加物水溶液；将紫杉醇溶于乙醇中制备得到浓度为30mg/l的药物乙醇溶液；然后将500μl的药物乙醇溶液和500μl的添加物水溶液混合后进行真空旋转蒸发并冻干。添加物按表1选择，表中的“+”代表将其前后的物质混合，“()”中的比例为物质的重量添加比。
[0063]
表1
[0064][0065][0066]
溶解度测试：
[0067]
将1ml浓度为10mm的磷酸盐缓冲液(ph＝7.2)加入到对照组和各个实验组中复悬，并将所得水溶液在30℃、转速为1500rpm的摇床上震荡30分钟，随后用0.45μm滤膜过滤，滤
液用高效液相色谱测定紫杉醇浓度。
[0068]
讨论及结果：
[0069]
如表2所示，单独添加肽，能一定程度上提高紫杉醇的表观溶解度，而单独添加高分子材料对于紫杉醇表观溶解度的提升没有明显贡献，这一结果与前人的研究结论一致。尝试将肽与高分子材料混合后，我们发现，仅有将dgrgggaaaa与第2代聚酰胺
‑
胺树形分子混合能显著的提升紫杉醇的表观溶解度(29.20
±
0.12mg/l)。
[0070]
表2
[0071][0072]
2、优化实验
[0073]
(1)dgrgggaaaa与第2代聚酰胺
‑
胺树形分子的重量比
[0074]
在确定dgrgggaaaa与第2代聚酰胺
‑
胺树形分子混合可以显著的提升紫杉醇的表观溶解度的基础上，我们考察两者之间不同重量比对表观溶解度的影响，结果如表3所示。
[0075]
表3
[0076][0077]
(2)不同ph的选择
[0078]
在确定dgrgggaaaa与第2代聚酰胺
‑
胺树形分子的最优重量比为2:1的基础上，发明人考察了利用不同ph值的磷酸盐缓冲液复悬各实验组对紫杉醇表观溶解度的影响，结果如表4所示。
[0079]
表4
[0080][0081][0082]
(3)聚酰胺
‑
胺树形分子代数的选择
[0083]
在确定dgrgggaaaa与第2代聚酰胺
‑
胺树形分子的最优重量比为2:1的基础上，发明人考察了将第2代聚酰胺
‑
胺树形分子替换为第3代聚酰胺
‑
胺树形分子对紫杉醇表观溶解度的影响。结果发现，采用第3代聚酰胺
‑
胺树形分子后，紫杉醇的表观溶解度仍可高达37.66
±
0.10mg/l。
[0084]
三、脂质体的制备
[0085]
(1)紫杉醇溶液的制备：取3mg紫杉醇溶于2ml丙酮中，得紫杉醇丙酮溶液；按重量
比2:1将dgrgggaaaa和第2代聚酰胺
‑
胺树加入蒸馏水中，配置成两者浓度分别为1mg/ml和0.5mg/ml的混合水溶液98ml，然后与前述所得紫杉醇丙酮溶液混合，磁力搅拌充分混匀，取5ml进行真空旋转蒸发并冻干，然后用5ml浓度为10mm的磷酸盐缓冲液(ph＝7.2)复悬，得到紫杉醇溶液。
[0086]
(2)按重量比2:5:1，取单硬脂酸甘油酯、kolliphor el、卵磷脂溶解溶解于5ml的丙酮中，之后加入15ml玻璃微球，完全吸附后，进行真空旋转蒸发去除丙酮，再对所得物进行冻干；将所得5ml紫杉醇溶液加入到前述冻干所得物中，完全吸附后，于水浴中，在28khz频率下进行超声10分钟，之后再加入5ml浓度为10mm的磷酸盐缓冲液(ph＝7.2)，磁力搅拌75分钟，真空抽滤后收集滤液，再用5ml浓度为10mm的磷酸盐缓冲液(ph＝7.2)冲洗玻璃微球，真空抽滤后收集滤液，然后合并两次所得滤液，得到装载紫杉醇的脂质体。
[0087]
采用高速冷冻离心辅助超滤离心法分离脂质体和游离药物，测得包封率为89.23％。
[0088]
在获得上述脂质体制备方案前，发明人进行了如下摸索实验：1)考察了油相的制备对于包封率的影响，油相的选择方案和测得包封率的结果如表5所示；2)考察用实验组16的方案(u6+聚乙烯吡咯烷酮(1:1))制备紫杉醇溶液。
[0089]
表5
[0090][0091]
利用实验组16的方案制备紫杉醇溶液制备脂质体时，包封率为68.33％。