他汀类化合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及他汀类化合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用。

背景技术：

目前全世界不育症约占育龄夫妇的15％，并呈逐年上升趋势，其中男性因素导致的不育约占50％，其原因多是由配子发生障碍所导致。由于无法得到健康成熟的雄性配子，不能实施传统的辅助生殖技术进行治疗，目前临床上对此唯一的解决办法是使用精子库的供精生育，因此他们无法得到真正生物学意义的后代。

精原干细胞是一种起源于原始生殖细胞并处于未分化状态的生殖细胞，分布于雄性动物睾丸曲细精管中的基底膜上。当雄性哺乳动物进入青春期后，睾丸中的精原干细胞将持续不断地产生精子并行自我更新以维持一定的干细胞数量，在这一细胞分化过程中，精原干细胞起着极为重要的作用，它既要具备维持自我更新的功能，又要不断分化形成各阶段的生殖细胞并最终形成精子，也即，精原干细胞承载着向下一代传递遗传信息的使命，其再生功能直接影响雄性哺乳动物精子生成能力，因此，可通过提高个体精原干细胞的再生功能以促进生成有功能的精子，继而可实现雄性不育症的预防和/或治疗。

有鉴于此，有必要提出一种药物通过促进精原干细胞再生功能以用于雄性不育症的预防和/或治疗。

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明提供了他汀类化合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用，通过促进并维持哺乳动物精原干细胞的长期自我更新，进而促进精子的持续生成，从而为预防和/或治疗雄性不育症(如无精症、少精症、弱精症、畸形精子症和精子无力症)提供了新的药物选择，并且为老药新用，其应用成熟、安全，可快速转化为临床，避免了新药研发的周期。

用于解决问题的方案

第一方面，本发明提供了他汀类化合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用。

优选地，所述药物用于预防和/或治疗哺乳动物雄性不育症。

进一步优选地，所述雄性不育症选自无精症、少精症、弱精症、畸形精子症和精子无力症中的一种或多种，优选无精症和少精症中的一种或多种。

优选地，所述药物通过体外培养的方式促进哺乳动物精原干细胞再生。

优选地，所述药物首先通过体外培养的方式促进哺乳动物精原干细胞再生，然后再将所述精原干细胞移植至所述哺乳动物体内，以促进精子生成。

优选地，所述药物通过直接施用于所述哺乳动物体内促进所述精原干细胞再生。

优选地，所述药物部分替代细胞因子gdnf对所述哺乳动物精原干细胞自我更新的维持作用。

优选地，所述他汀类化合物选自洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、瑞舒伐他汀及其药学上可接受的盐中的一种或多种。

进一步优选地，所述他汀类化合物选自洛伐他汀。

优选地，所述哺乳动物为啮齿类动物和/或灵长类动物。

进一步优选地，所述啮齿类动物为大鼠或小鼠，优选小鼠。

进一步优选地，所述灵长类动物为猕猴或人，优选人。

第二方面，本发明还提供一种组合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用，所述组合物含有他汀类化合物。

优选地，所述药物用于预防和/或治疗哺乳动物雄性不育症。

进一步优选地，所述雄性不育症选自无精症、少精症、弱精症、畸形精子症和精子无力症中的一种或多种。

优选地，所述他汀类化合物选自洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、瑞舒伐他汀及其药学上可接受的盐中的一种或多种。

进一步优选地，所述他汀类化合物选自洛伐他汀。

发明的效果

本发明提供了他汀类化合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用，为预防/或治疗雄性不育症(如无精症、少精症、弱精症、畸形精子症和精子无力症)提供了新的药物选择。

本发明提供的应用，以洛伐他汀为例的他汀类化合物可通过体外培养的方式或者直接施用于体内的方式来促进哺乳动物的精原干细胞再生，也可以通过先在体外培养促进哺乳动物精原干细胞再生再将精原干细胞移植至哺乳动物体内以促进精子的持续生成，为促进精原干细胞再生提供了多种选择。

胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)对精原干细胞自我更新起关键作用，本发明通过研究发现，他汀类化合物促进精原干细胞再生可实现部分替代胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)的功能，并调节细胞代谢，降低细胞炎症反应，进而促进精原干细胞的持续自我更新功能。

本发明通过研究发现，他汀类化合物对啮齿类哺乳动物和灵长类哺乳动物精原干细胞的再生均具有很好的促进作用，并可对因睾丸损伤导致的精原干细胞数量减少情况进行修复；而且，该方案为老药新用，他汀类化合物是现有的常见上市药物，在20世纪八十年代就已作为调整血脂用药，其应用成熟、安全，可以快速转化应用于临床，避免了新药研发的漫长周期，具有应用和推广意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的不同浓度洛伐他汀通过体外培养方式对小鼠精原干细胞再生功能促进效果的比较；

图2为本发明实施例2提供的各类他汀类化合物通过体外培养方式对小鼠精原干细胞再生功能促进效果的比较；

图3为本发明实施例3提供的在体外无外源添加gdnf条件下洛伐他汀维持小鼠精原干细胞增殖情况；

图4为本发明实施例4提供的受体小鼠睾丸内移植经洛伐他汀长期培养的精原干细胞生精的执行情况；

图5为本发明实施例5提供的生理条件下体内注射不同浓度洛伐他汀对精原干细胞增殖的促进作用情况；

图6为本发明实施例5提供的白消安模拟病理条件下体内注射洛伐他汀对精原干细胞增殖的促进作用情况；

图7为本发明实施例6提供的洛伐他汀对人曲细精管中精原干细胞的维持与增殖情况。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将结合附图对本发明的实施例进行详细说明，附图中给出了本发明的较佳实施例，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施，并不限于本文所描述的实施例。

若未特别指明，实施例中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；若未特别指明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

本发明是通过以下技术方案实现：

本发明首先利用小鼠精原干细胞的体外培养体系，在培养成分中去除对精原干细胞自我更新的维持起关键作用的细胞因子gdnf，从而在体外建立一种精原干细胞无法维持长期自我更新的“困境”体系，进而运用此体系，通过规模化的药物筛选与研究，发现他汀类药物在此体系下可有效地维持有功能的精原干细胞长期自我更新。

进一步地，通过他汀类药物在小鼠体内注射实验，发现其能够促进并维持精原干细胞的再生活动，进而促进精子的生成。

更进一步地，对他汀类药物促进精子生成作用在灵长类上进行了探索。实验结果表明，在灵长类动物实验上，以洛伐他汀为例的他汀化合物也可有效维持精原干细胞的存活。

定义

术语“他汀”是一类具有如通式(i)所示的结构的小分子降血脂药物：

其中，a部分是与酶的底物hmg-coa中hmg结构类似的β,δ-二羟基戊酸结构，为他汀类化合物的降血脂药效基团；b部分的r基为与酶变构后产生的憎水性浅沟相结合的憎水性刚性平面结构；c部分为a与b两部分之间的连接部分。

术语“他汀类化合物”是本领域所熟知的，主要包括洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、瑞舒伐他汀及其药学上可接受的盐；其中，“药学可接受的盐”主要包括他汀的碱金属盐和碱土金属盐，如他汀的钠盐、钙盐等。

术语“组合物”，即混合物，包括：1)几种已知物组成的组合物，如中药的复方；2)若干未知物组成的组合物，如中药的有效部位；3)新化合物和有生理活性的已知物组成的组合物，如新药的复方制剂；4)新化合物和无生理活性的已知物组成的组合物，例如新药的片剂、针剂等。本发明的“组合物”主要是指以他汀类化合物为药效活性成分并与其它成分形成如上述1)-4)任一形式的组合物。

术语“哺乳动物”是指脊椎动物亚门下哺乳纲的一类用肺呼吸空气的温血脊椎动物，因能通过乳腺分泌乳汁来给幼体哺乳而得名；哺乳类是一种恒温、脊椎动物，身体有毛发，大部分都是胎生，并藉由乳腺哺育后代；哺乳动物是动物发展史上最高级的阶段，也是与人类关系最密切的一个类群。本发明“哺乳动物”主要是指啮齿类哺乳动物和/或灵长类哺乳动物，其中，啮齿类哺乳动物包括但不限于大鼠、小鼠，灵长类哺乳动物包括但不限于猕猴、人。

术语“雄性不育症”是指因精原干细胞无法再生所导致的不育症，如无精症、少精症、弱精症、畸形精子症和精子无力症中的一种或多种。

术语“预防”是指例如当患者或受试者易患病状或者处于疾病或病状的风险中时，完全或几乎完全阻止疾病或病状(例如，感染、缺血或再灌注损伤)发生；预防还可以包括抑制，即阻止病状的发展。

术语“治疗”是指：1)抑制该疾病；例如，抑制正在经历或显示疾病、病状或病症的病理学或症状学的个体的该疾病、病状或病症(即，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)；或2)改善该疾病；例如，改善正在经历或显示疾病、病状或病症的病理学或症状学的个体的该疾病、病状或病症(即，逆转病理学和/或症状学)。

实验材料及仪器

精原干细胞的培养皿(康宁)；小鼠精原干细胞系(依据已有报道建立的可长期体外传代的具有精原干细胞特性的小鼠源精原干细胞系)、饲养层细胞(依据已有报道中描述的利用胚胎13.5天胎鼠表皮制作的胎鼠成纤维细胞，体外经由丝裂霉素c处理抑制其增殖特性的一类细胞，常用于小鼠胚胎干细胞系、小鼠精原干细胞细胞系中提供细胞营养的一类共培养细胞)；二甲基亚砜dmso(sigma)；stempro-34sfm基础培养基及其stempro培养基添加剂、非必需氨基酸、丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、胎牛血清、n2添加剂(均市购自gibco)；乳酸、维生素、生物素、维生素c、孕酮、雌二醇、葡萄糖、牛血清白蛋白(均市购自sigma)；碱性成纤维细胞因子(gibco)；小鼠源白血病抑制因子(cellsignalingtechnology)；小鼠源表皮生长因子(gibco)；大鼠源细胞因子gdnf(r&d)；白消安(sigma)；琼脂糖(sigma)；4％多聚甲醛溶液(sigma)；anti-utf1(abcam)；anti-ddx4(abcam)；hoechst33342(sigma)。

超净工作台(赛默飞)；恒温细胞培养箱(赛默飞)；cytation5细胞成像微孔板检测系统(伯腾)；荧光显微镜(蔡司)；荧光体视镜(奥林巴斯)；激光共聚焦显微镜(蔡司)；若干玻璃针、显微镊、尖头镊等；

实验方法

实施例1不同浓度洛伐他汀通过体外培养方式对小鼠精原干细胞再生功能的促进作用

(1)配制用于体外培养精原干细胞的培养基(以50ml为例)

(2)准备用于接种精原干细胞的培养皿及饲养层细胞

在96孔培养板的各培养孔中接种由丝裂霉素c处理过的胎鼠成纤维细胞，作为培养小鼠精原干细胞的饲养层细胞。

(3)不同浓度洛伐他汀对体外培养精原干细胞的作用

将小鼠精原干细胞接种在预先准备有饲养层细胞的培养孔中，接种密度为10⁴细胞/孔，在培养液中依次加入0μm至20μm不同浓度的洛伐他汀；细胞置于5％co2、37℃恒温细胞培养箱中；隔日换液。

(4)检测精原干细胞克隆形成能力

利用高内涵cytation5检测培养板中各孔精原干细胞形成克隆数量。

结果如图1所示，洛伐他汀在体外无外源添加细胞因子gdnf的情况下，能够维持小鼠精原干细胞的自我更新，具有促进精原干细胞再生功能；其中，在培养基中添加5μm洛伐他汀对小鼠精原干细胞体外自我更新并形成克隆的促进效果最佳。

实施例2各类他汀化合物通过体外培养方式对小鼠精原干细胞再生功能的促进作用

(1)配制用于体外培养精原干细胞的培养基(以50ml为例)

(2)准备用于接种精原干细胞的培养皿及饲养层细胞

在96孔培养板的各培养孔中接种由丝裂霉素c处理过的胎鼠成纤维细胞，作为培养小鼠精原干细胞的饲养层细胞。

(3)各类他汀化合物对体外培养精原干细胞的作用

将小鼠精原干细胞接种在预先准备有饲养层细胞的培养孔中，接种密度为10⁴细胞/孔，在培养液中依次加入不同种类的他汀化合物：洛伐他汀、普伐他汀钠、氟伐他汀钠、阿托伐他汀钙、匹伐他汀钙、美伐他汀、瑞舒伐他汀钙、瑞舒伐他汀，对照组加入同等体积的他汀类化合物稀释溶剂dmso；细胞置于5％co2、37℃恒温细胞培养箱中；隔日换液。

(4)检测精原干细胞克隆形成能力

利用高内涵cytation5检测培养板中各孔精原干细胞形成克隆数量。

结果如图2所示，各类他汀化合物在体外无外源添加细胞因子gdnf的情况下，均能够维持小鼠精原干细胞的自我更新，实现促进精原干细胞再生功能。

实施例3在体外无外源添加细胞因子gdnf的条件下，他汀类化合物可维持小鼠精原干细胞的长期培养

(1)配制用于体外培养精原干细胞的培养基(以50ml为例)

(2)准备用于接种精原干细胞的培养皿及饲养层细胞

在12孔培养板的各培养孔中接种由丝裂霉素c处理过的胎鼠成纤维细胞，作为培养小鼠精原干细胞的饲养层细胞。

(3)他汀类化合物对体外培养精原干细胞培养及传代

将小鼠精原干细胞接种在预先准备有饲养层细胞的培养孔中，接种密度为2×10⁵细胞/孔，在培养液中加入5μm的洛伐他汀；同时设立两个对照组，即分别在培养液中加入等体积的洛伐他汀溶剂dmso、等体积的已知可促进精原干细胞体外增殖的细胞因子gdnf(10ng/ml)；细胞置于5％co2、37℃恒温细胞培养箱中；隔日换液，6天传代一次。

传代过程中统计各组细胞数量，结果如图3所示，这说明以洛伐他汀为例的他汀类化合物在体外无外源添加细胞因子gdnf的情况下，可部分替代细胞因子gdnf的功能以持续维持小鼠精原干细胞的自我更新，实现促进精原干细胞再生功能。

实施例4将实施例3中经他汀类化合物促进再生后的精原干细胞进行体内移植实验

(1)准备白消安受体小鼠

icr小鼠交配后，第二天检查阴道栓记为0.5天，在交配后12.5天以40mg/kg浓度给孕鼠腹腔注射白消安进行造模，在小鼠出生后第10天进行精原干细胞的睾丸移植。

(2)受体小鼠麻醉后，将玻璃针在内径约40μm处断针，装入口吸管内，吸入经实施例3中经他汀类化合物促进再生后的精原干细胞悬液5μl，针头稍吸入台盼蓝指示位置。

(3)剖开受体小鼠下腹部，于膀胱旁边寻找与睾丸相连的脂肪垫，轻轻拖出腹腔，在体式显微镜镜下，沿睾丸动脉平行方向找到输出小管，一手持显微镊夹起输出小管，另一手执口吸管，将针头戳入输出小管，并沿输出小管向睾丸网方向插进后，将由实施例3中经他汀类化合物促进再生后的精原干细胞吹入睾丸的曲细精管中。

(4)注射结束后，将睾丸及脂肪垫小心送入腹腔，勿使睾丸扭转，然后逐层缝合，最后将酒精棉敷于小鼠腹部防止感染；将小鼠置于37℃温台，待其苏醒后放回饲养室。

(5)60天后，取受体小鼠双侧睾丸检测外源移植的精原干细胞定植、分化情况。

结果如图4所示，标记有绿色荧光蛋白的外源植入精原干细胞在受体小鼠睾丸曲细精管中定植(图中与绿色荧光蛋白共标记精原干细胞标记基因plzf的细胞)，并执行精原干细胞分化成精子的功能，即可启动减数分裂过程(图中标记dna双链断裂标记γh2ax和联会复合体蛋白sycp3的细胞)，最后生成功能性精子(图中标记生殖细胞标记蛋白ddx4与精子细胞标记鱼精蛋白pna的细胞)。上述实验结果显示，将小鼠精原干细胞先经体外培养再生后再移植体内，精原干细胞可执行正常的生精功能，这说明以洛伐他汀为例的他汀类化合物在促进精原干细胞增殖的同时，也能够有效地维持精原干细胞的身份和功能，促进精子生成。

实施例5直接施用于小鼠体内验证他汀类药物可治疗雄性不育症

(1)生理状态下小鼠腹腔注射洛伐他汀实验

生理状态下，每日在实验组小鼠腹腔内分别注射1mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重的洛伐他汀，同时在对照组小鼠的相同位置注射等剂量小分子溶剂dmso；同一组别小鼠连续5日注射相同剂量药物或对照溶剂dmso；第6日取各组小鼠睾丸组织，通过免疫荧光染色检测其曲细精管中精原干细胞(ssc)增殖情况及生精恢复情况。

结果如图5所示，这说明以洛伐他汀为例的他汀类化合物能够直接施用于生理状态下的小鼠体内以促进精原干细胞再生，可实现雄性不育症的预防；其中，在生理状态下的小鼠体内注射5mg/kg体重浓度的洛伐他汀对精原干细胞增殖的促进效果最优。

(2)白消安处理模拟病理状态下小鼠腹腔注射洛伐他汀实验

制备白消安诱导的病理模型鼠，即小鼠腹腔注射白消安10mg/kg体重，注射后第10天起，每日在实验组腹腔内注射洛伐他汀，同时在对照组小鼠的相同位置注射等剂量小分子溶剂dmso；每隔5天取各组小鼠睾丸组织，通过免疫荧光染色检测并统计其曲细精管中精原干细胞(ssc)增殖情况及生精恢复情况。

结果如图6所示，连续注射5天洛伐他汀后观察小鼠睾丸曲细精管中精原干细胞的数量，与对照组相比，洛伐他汀治疗的小鼠在连续注射5天后，精原干细胞数量显著恢复；连续注射10天洛伐他汀后，观察小鼠睾丸曲细精管中精原干细胞数量，与治疗5天比，精原干细胞数量仍持续恢复，对照组在10天中也逐步恢复，但恢复速度和数量上均不及洛伐他汀治疗组。这说明，以洛伐他汀为例的他汀类化合物能够直接施用于病理状态下的小鼠体内以促进精原干细胞再生，从而实现雄性不育症的治疗。

实施例6他汀类化合物对人曲细精管中精原干细胞维持与增殖的促进作用

(1)人睾丸曲细精管组织的体外培养

将活检取材的人睾丸组织样品用pbs清洗后，用尖头镊将组织中曲细精管分离形成约2mm/段的管腔样品；管腔置于1％琼脂糖凝胶块上，加入精原干细胞培养液，实验组培养液中添加洛伐他汀5μm，对照组培养液中添加等体积洛伐他汀溶剂dmso，置于35℃培养箱中培养，隔日换液。

(2)免疫荧光染色检测

收集体外培养14天的人睾丸管腔组织，用4％多聚甲醛溶液室温固定24小时，之后进行石蜡包埋，组织切片。对组织切片进行免疫荧光染色目的抗体，具体为：添加一抗(anti-utf1和anti-ddx4)，抗体稀释比均为1:300，放置于4℃冰箱过夜；添加相应荧光反应二抗(如488/594/647anti-ms/rb/rt)，抗体稀释比1:400，室温静置1h；hoechst33342染核，稀释比l:1000，室温染10min；切片观察及拍照统计。

结果如图7所示，相较于对照组，利用以洛伐他汀为例的他汀类化合物培养的人睾丸曲细精管组织，可很好维持精原干细胞的存活，这说明他汀类化合物可促进人精原干细胞的存活和增殖，也即，他汀类化合物不仅能促进小鼠等啮齿类哺乳动物的精原干细胞再生功能，还能促进猕猴、人等灵长类哺乳动物的精原干细胞再生功能，从而实现对哺乳动物雄性不育症的预防和/或治疗。

以上实施例仅用于阐明本发明的若干实施方案，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明的范围产生任何限制。应当明确的是，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围之内。