CD44介导的智能响应型聚合物胶束及其制备和应用

cd44介导的智能响应型聚合物胶束及其制备和应用
技术领域
1.本发明涉及胶束领域，尤其涉及一种cd44介导的智能响应型聚合物胶束及其制备和应用。


背景技术：

2.据统计，癌症已经成为人类死亡的主要原因之一。目前，药物治疗已经成为当今临床治疗肿瘤的重要手段。如今普遍的肿瘤治疗方法仍然以化疗手段为主，对患者的身体状况有不同程度的不良影响，容易出现呕吐、掉发等不良反应，易产生耐药性；且由于化疗药物缺乏对肿瘤的靶向性，使用过程中对正常细胞也有毒性。现已上市的白蛋白纳米粒等造价昂贵，肿瘤靶向性不理想，不能快速而有效的释放所负载的药物或基因。
3.胶束递送系统是一种最有潜力的纳米给药递送系统，在过去的二十年里作为抗肿瘤药物的递送载体得到了深度发展。与传统的抗肿瘤药物相比，载药聚合物胶束显示出多方面的优势，例如提高难溶性药物的溶解度，在到达靶向部位前增加药物在血液中的稳定性，通过增强渗透滞留(epr)效应显著提高药物在肿瘤组织的蓄积。因此，胶束递送系统由于能够持续增强治疗效果和减少系统毒性，而成为了一种有效的抗肿瘤药物递送系统。
4.迄今为止，胶束给药系统依然面临两个亟待解决的问题：
5.(1)肿瘤靶向效率和细胞内吞效率低下。一方面，epr效应仅实现纳米胶束在肿瘤部位的蓄积，而后续的入胞过程受胶束亲水外壳的影响，往往不尽如人意，这导致肿瘤细胞内药物浓度较低。
6.(2)药物的释放不受控制。入胞后，药物无法迅速从纳米胶束中释放并扩散至其靶部位，如细胞核。这些问题导致细胞内药物浓度过低而不能达到预期的抗肿瘤效果。


技术实现要素：

7.为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种cd44介导的智能响应型聚合物胶束及其制备和应用，本发明提供了基于聚合物组氨酸
‑
透明质酸
‑
烷基胺的cd44靶向胶束，用来递送抗肿瘤药物，由于胶束的ph敏感性，抗肿瘤药物可从聚合物胶束中释放。
8.本发明的第一个目的是提供一种ph响应性聚合物胶束，包括聚合物形成的胶束，聚合物包括透明质酸(ha)，透明质酸通过化学键连接含10
‑
18个碳原子的烷基胺和组氨酸(his)。
9.进一步地，烷基胺选自十二胺(da)、癸胺、十四烷胺、十六烷胺和十八烷胺中的一种或几种。优选地，烷基胺为十二胺。烷基胺作为疏水端，其碳原子数目越多，疏水性越强，毒性越低，但其在透明质酸的接枝率越低，因此应选择合适碳原子数目的烷基胺。
10.进一步地，透明质酸上，烷基胺的接枝率为25％
‑
35％，组氨酸的接枝率为20％
‑
30％。
11.进一步地，透明质酸的分子量为8000
‑
12000。
12.优选地，聚合物为his
‑
ha
‑
da，包括ha，ha通过化学键连接da和his。
13.本发明的第二个目的是提供一种上述ph响应性聚合物胶束的制备方法，包括以下步骤：
14.(1)利用活化剂活化透明质酸，然后将活化的透明质酸与烷基胺在溶剂中于40
‑
55℃下反应，反应完全后得到接枝烷基胺的透明质酸；
15.(2)利用活化剂活化接枝烷基胺的透明质酸，然后与组氨酸在40
‑
55℃下反应，反应完全后得到聚合物；再将聚合物分散在水中，得到ph响应性聚合物胶束。
16.进一步地，在步骤(1)中，透明质酸和烷基胺的摩尔比为1:1。
17.进一步地，步骤(1)中的透明质酸和步骤(2)中的组氨酸的摩尔比为1:2。
18.进一步地，在步骤(1)和(2)中，活化剂为1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl)、n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)和二环己基碳二亚胺中的一种或几种。
19.本发明以ha为骨架，在活化剂的催化下，连接烷基胺形成接枝烷基胺的透明质酸，其为两亲性聚合物；为得到具有ph敏感性的材料，通过具有咪唑基团的his对接枝烷基胺的透明质酸进行修饰，得到ph敏感型聚合物。
20.本发明的第三个目的是公开上述ph响应性聚合物胶束在制备抗肿瘤药物载体中的应用。
21.进一步地，抗肿瘤药物为疏水性抗肿瘤药物。
22.进一步地，抗肿瘤药物为阿霉素(dox)、蛇床子素、紫杉醇、去氢骆驼蓬、喜树碱、奥拉帕利、达沙替尼和依托泊苷中的一种或几种。
23.本发明的第四个目的是提供一种ph响应性聚合物载药胶束，其包括聚合物形成的胶束以及包载于胶束内的抗肿瘤药物，聚合物包括透明质酸(ha)，透明质酸通过化学键连接含10
‑
18个碳原子的烷基胺和组氨酸(his)。
24.进一步地，ph响应性聚合物载药胶束的粒径为100
‑
150nm。
25.进一步地，ph响应性聚合物载药胶束的制备方法包括以下步骤：
26.将本发明的上述ph响应性聚合物胶束与抗肿瘤药物混合，得到ph响应性聚合物载药胶束。
27.本发明利用肿瘤细胞表面受体的目标配体进行修饰，使聚合物胶束具有主动靶向性，并通过配体
‑
受体介导的内吞作用显著增加细胞摄取量。在发明中，制备基于聚合物组氨酸
‑
透明质酸
‑
烷基胺的新型cd44靶向胶束，用来递送含显著毒副作用的化疗药物。ha为基本骨架，同时作为亲水段和活性靶向配体。为了制备亲水性聚合物，亲水段ha与疏水段烷基胺相连接形成透明质酸
‑
烷基胺，然后利用含有ph响应性基团的组氨酸修饰透明质酸
‑
烷基胺得到最后的聚合物组氨酸
‑
透明质酸
‑
烷基胺。在生理条件下，聚合物能够自组装形成胶束并包裹进疏水抗肿瘤药物。该聚合物胶束在血液循环中保持相对稳定，通过epr效应在肿瘤部位蓄积，从而通过cd44介导的内吞作用进入细胞。在细胞内含体/溶酶体中，由于胶束的ph敏感性，抗肿瘤药物从聚合物胶束中释放并逃出溶酶体。最后，游离的抗肿瘤药物扩散进入细胞核或其他靶部位达到抗肿瘤效果。
28.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
29.本发明基于生物制药技术和肿瘤微环境特征，提供了一种基于聚合物组氨酸
‑
透明质酸
‑
烷基胺且cd44介导的智能响应型聚合物胶束，该聚合物胶束可作为抗肿瘤药物载体，由于胶束的ph敏感性，抗肿瘤药物可从聚合物胶束中释放。其合成过程简便，有利于实
现肿瘤治疗的新突破。本发明以配体
‑
受体介导和抗增殖治疗为理论基础，针对受体过表达的肿瘤，发展主动靶向作用新型高效递药系统。
30.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
31.图1是ha、ha
‑
da和his
‑
ha
‑
da的1h
‑
nmr测试结果；
32.图2是his
‑
ha
‑
da在ph7.4和ph5.3下的临界胶束浓度(cmc)值；
33.图3是dox/hhd在ph5.3和7.4下的粒径分布图；
34.图4是dox/hhd在ph5.3和7.4下的zeta电位；
35.图5是dox/hhd在ph5.3和7.4下的包封率(ee％)；
36.图6是dox
·
hcl、dox/hd和dox/hhd在ph5.3和7.4下的体外释放图；
37.图7是dox在不同剂型中的细胞摄取情况；
38.图8是不同胶束中dox的亚细胞分布情况测试结果；
39.图9是不同剂型dox下4t1细胞的存活率(a.24h,b.48h,n＝5)；
40.图10是胶束在小鼠体内的近红外荧光成像图；
41.图11是肿瘤组织的dir荧光强度；
42.图12是不同剂型dox在体内的分布情况；
43.图13是dox聚合物胶束体内抗肿瘤效果。
具体实施方式
44.下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
45.实施例1
46.1、ha
‑
da的合成
47.称取388mg(0.5mmol)的ha溶于30ml去离子水中，45℃下加入edc
·
hcl(192mg,1mmol)和nhs(115mg,1mmol)活化ha的羧基基团1h。称取92mg(0.5mmol)da溶于20ml无水乙醇中，缓慢滴加到ha溶液中，在45℃下反应24h。产物在蒸馏水中透析3
‑
4h除去副产物，冻干即得ha
‑
da。
48.2、his
‑
ha
‑
da的合成
49.称取194mg(0.5mmol)的ha
‑
da溶于10ml去离子水中，45℃下加入edc
·
hcl(96mg,0.5mmol)和nhs(57.5mg,0.5mmol)活化羧基30min，然后加入his(155mg,1mmol)，在室温下反应12h。产物在蒸馏水中透析5
‑
6次，冻干即得his
‑
ha
‑
hd。
50.his
‑
ha
‑
hd的合成路线如下：
[0051][0052]
3、载药胶束的制备
[0053]
以ha
‑
hd和his
‑
ha
‑
hd为载体材料，分别利用透析法制备载药胶束dox/hd和dox/hhd。具体步骤如下：
[0054]
将5mg聚合物材料(ha
‑
hd或his
‑
ha
‑
hd)溶于5ml去离子水中得到1mg/ml的胶束溶液，依次向溶液中加入100μl三乙胺和0.5mldox
·
hcl溶液(5mg/ml)，之后用透析袋在蒸馏水中透析4
‑
5次，透析后的液体用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤，即得载药胶束。
[0055]
下面对该实施例中的化合物进行表征以及产物的性能测定：
[0056]
1、载体材料的结构表征
[0057]
取1
‑
2mg的聚合物(ha，ha
‑
da或his
‑
ha
‑
da)溶于适量d2o中通过1hnmr对其化学结构进行表征。如图1所示，δ3.0
–
4.0ppm代表ha骨架上h的化学位移，δ1.3ppm前后代表da上
‑
ch2上h原子的化学位移；δ7.2ppm代表his咪唑基团上h的化学位移。1hnmr结果表明两种聚合物已经成功合成，由特征峰的峰面积计算出his
‑
ha
‑
da中da和his的接枝率分别为32.5％和23.1％。
[0058]
2、his
‑
ha
‑
da在不同ph下的cmc值
[0059]
通过芘探针法测定his
‑
ha
‑
da空白胶束在不同ph下的cmc值。将芘溶液(10
‑6mol/l)加入离心管旋转蒸发除去有机溶剂，his
‑
ha
‑
da溶于pbs(ph 7.4或5.3)中得到浓度从0.39到100μg/ml的溶液，将该溶液加入上述离心管超声10min。密封、常温放置24h后，通过多功能酶标仪测量其荧光强度(λex＝336nm,λem＝373、384nm)。如图2所示，在生理条件下(ph 7.4)，his
‑
ha
‑
da呈现出一个较低的cmc值6.37
×
10
‑4mg/ml，说明his
‑
ha
‑
hd在血液循环中能够抵制稀释自组装成聚合物胶束hhd，具有包载难溶性药物的潜能。然而，当ph下降到5.3时，hhd的cmc值增加到4.57
×
10
‑3mg/ml，表明his
‑
ha
‑
hd在酸性环境下难以形成聚合物胶束，其包载的药物可被迅速释放。
[0060]
3、载药胶束的质量评价
[0061]
载药胶束的粒径和zeta电位用动态激光粒径仪在不同ph下测得。包封率(ee％)在ph7.4下通过超滤法测得，取1ml的载药胶束置于超滤管中，3000r/min离心15min，通过多功能酶标仪测定下层溶液中的dox含量(λex＝480nm，λem＝590nm)；载药量(dl％)测定是在载药胶束中加入过量乙醇，所包载的dox的量通过多功能酶标仪测得。式(1
‑
1)和式(1
‑
2)为计算ee％和dl％的公式。
[0062]
ee％＝被包载药物浓度/总药物浓度
×
100％
ꢀꢀꢀ
(1
‑
1)
[0063]
dl％＝被包载药物质量/(被包载药物质量+载体质量)
×
100％
ꢀꢀꢀ
(1
‑
2)
[0064]
如表1所示，dox/hd和dox/hhd有适宜的粒径、pdi和zeta电位。两种载药胶束均具有较高的ee％和dl％。dox/hd的粒径、zeta电位、ee％和dl％均与dox/hhd接近。相对来说，dox/hhd的粒径更小，粒径分布更加集中，这有助于实现epr效应。
[0065]
表1载dox胶束的表征
[0066][0067]
为了研究dox/hhd的ph响应性，测定其在不同ph下的粒径、zeta电位和dox的体外释放。如图3所示，与ph7.4下相比，dox/hhd在ph5.3下粒径明显增大。如图4所示，随着ph值从7.4降到5.3，dox/hhd表面的zeta电位约从
‑
25mv升到
‑
18mv。以上结果说明，在酸性环境下聚合物胶束的his段发生了质子化，导致胶束结构膨胀以及表面电荷增加。接着，测定在不同ph值下dox的荧光强度研究dox/hhd胶束的包封率。如图5所示，ph5.3下dox/hhd的包封率比ph 7.4下显著下降，说明在酸性环境下胶束结构不稳定，dox从胶束中泄露出来。
[0068]
4、载药胶束的体外释放
[0069]
通过透析法研究dox
·
hcl、dox/hd和dox/hhd的体外释放。取dox盐酸溶液(250μg/ml)、dox/hd和dox/hhd各2ml置于透析袋中(mwco＝3500d)，加入装有100ml pbs(ph5.3或7.4)的棕色瓶中，将棕色瓶置于37℃的恒温振荡箱中120r/min振荡，在预设时间点(0.5、1、2、4、6、8、12、24h)时取样1ml，样品通过多功能酶标仪(λex＝480nm，λem＝590nm)测定dox的浓度。如图6所示，ph7.4生理条件下，两种载药胶束均缓慢释药，而在ph5.3(溶酶体的弱酸性环境)下迅速释药；ph5.3下，dox/hhd的累计释放量达到了约70％，而dox/hd的累积释放量仅有约40％。结合前述实验结果分析，dox/hhd在生理条件下能够缓慢释药，减少dox的系统毒性，当到达肿瘤组织的弱酸性环境时，his上的咪唑基发生质子化，导致胶束结构不稳定而造成dox的释放。dox/hhd这种灵活的释药行为有利于减少药物到达靶向位点前的释放，增加肿瘤细胞的迅速释药。
[0070]
另外，对以上实施例制备的胶束进行以下细胞或活体实验：
[0071]
1.细胞摄取与亚细胞分布
[0072]
1.1细胞摄取
[0073]
dox胶束的细胞摄取量通过流式细胞仪测定。4t1细胞以105/孔的密度铺在六孔板中，孵育24h后，孔板中可另外加入游离的ha，或不加入游离的ha，加入不同剂型的dox(dox
为10μg/ml)孵育2h，之后吸出溶液用pbs(ph 7.4)清洗2
‑
3遍，通过流式细胞仪测定细胞内的dox浓度。如图7所示，其中图7(a)为使用共聚焦显微镜测定带有或不带有游离ha的dox负载胶束的细胞摄取情况。图7(b)为流式细胞术检测不同剂型dox的细胞摄取情况。
[0074]
1.2.亚细胞分布
[0075]
通过激光共聚焦显微镜考察dox在细胞内分布。将4t1细胞以105个/孔的密度铺到六孔板中，孵育24h后，盖玻片上细胞覆盖率约为80％。然后吸出培养基，用ph7.4的pbs清洗2
‑
3遍，加入1ml的pbs，将六孔板分为三组，分别加入dox、dox/hd、dox/hhd(dox为10μg/ml)孵育2h或者6h，吸出溶液，用pbs清洗2
‑
3遍，加入固定液(4％多聚甲醛)固定，10min后吸出、清洗，再加入染核试剂hoechst33258(1ml，10μg/ml)，15min后吸出、清洗，取出盖玻片置于加有抗荧光猝灭剂的载玻片上，通过激光共聚焦显微镜观察。如图8所示，图8(a)为不同时间时dox/hhd或dox/hd在细胞内的分布情况；图8(b)为不同时间时空白hhd或hd胶束处理的细胞ao染色情况。
[0076]
2.mtt细胞毒性实验
[0077]
通过mtt法测定不同剂型dox的细胞毒性。将4t1细胞以3000个/孔的密度铺到96孔板中(200μl/孔)，孵育24h后，吸出培养基，若需用ha预处理，每孔加入100μlha(1mg/ml，ph7.4)孵育2h，吸出溶液，按照预设的dox浓度梯度(20μg/ml到0.0390625μg/ml，最后一组为空白培养基)加入100μl的已过滤除菌的dox
·
hcl、dox/hd或dox/hhd，孵育48h后，每孔加入20μl的mtt溶液(5mg/ml，ph7.4)孵育4h，吸出孔内培养基，加入150μl的dmso，置于摇床上振荡10min，使结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪在od490nm处测量各孔的吸光值。细胞存活率的计算公式如下：
[0078][0079]
其中，a490(treated)为加药孔的吸光度值，a490(non
‑
treated)为空白培养基孔的吸光度值，a0为无细胞孔的吸光度值。
[0080]
在ph7.4下,不同剂型dox对4t1细胞的毒性影响如图9所示，半数抑制浓度(ic50)如表2所示，三种剂型dox的细胞毒性具有浓度依赖性，与非敏感型胶束dox/hd相比，dox/hhd细胞毒性更高，ic50值更低，这可能是因为溶酶体中的低ph诱导了胶束结构变化，dox迅速释放，并且通过质子海绵效应逃出溶酶体。在用ha进行预处理后，载药胶束的细胞毒性受到抑制，表明dox/hhd是通过cd44受体介导的内吞作用进入细胞的，而预先加入的ha使细胞表面的cd44受体达到饱和，胞吞受抑。尽管dox
·
hcl的细胞摄取量较低，但细胞毒性却是最大的，这可能是dox
·
hcl与细胞核快速协同定位的原因。
[0081]
表2不同剂型dox对4t1细胞的半抑制浓度(ic50)
[0082][0083]
3.体内肿瘤靶向性实验
[0084]
3.1近红外荧光成像研究肿瘤靶向性
[0085]
肿瘤靶向性实验利用dir作为荧光探针通过近红外荧光成像系统进行研究。通过溶剂挥发法制得载dir胶束(dir/hd和dir/hhd)，当肿瘤体积长到100mm3时，小鼠分别尾静脉注射0.1ml的dir/hd和dir/hhd(60μg/ml)，在预设时间点(0、6、12、24、48h)通过近红外荧光成像系统考察dir在荷瘤小鼠体内的分布。48h后断颈处死小鼠，取出主要脏器(心肝脾肺肾)和肿瘤组织离体成像。如图10、11所示，dir/hd和dir/hhd在肿瘤部位均有明显的蓄积，表明粒径适宜，表面含ha的两种聚合物胶束通过epr效应以及ha
‑
cd44受体介导的主动靶向作用达到理想的体内肿瘤靶向性。然而，在预先注射0.1ml的ha(10mg/ml)后，dir胶束的肿瘤靶向性明显减弱，表明ha与肿瘤部位cd44受体的特异性结合是这些胶束产生靶向性的主要原因。两种聚合物胶束在肿瘤部位的荧光强度均随着时间的增加而增强，但dir/hhd组的荧光强度更高，表明hhd胶束有更好的肿瘤靶向性，可能是其ph敏感性导致的更好的肿瘤组织穿透性。另外，由于网状内皮系统(res)的捕获，在肝脏和脾脏中也有较强的dir荧光。
[0086]
3.2.dox的体内分布
[0087]
荷瘤小鼠尾静脉注射不同剂型的dox(dox为5mg/kg)，24h后处死小鼠，取出肿瘤组织和主要脏器，加入1ml生理盐水匀浆，然后加入2ml有机溶剂(三氯甲烷：甲醇＝3:1，v/v)进行萃取，离心(3000r/min，10min)取出有机层通过多功能酶标仪测量dox浓度。如图12所示，24h后dox在肿瘤部位有着明显的蓄积，其中，dox/hhd递送的dox量最多，与近红外荧光成像结果一致。dox
·
hcl组作为对照组，由于缺乏肿瘤靶向性，在肿瘤部位蓄积最少而在脏器中蓄积较多。
[0088]
4.体内药效学评价
[0089]
当荷瘤小鼠的肿瘤体积约为100mm3时，将小鼠分为四组，每组5只，在第1、5、9、13天时分别尾静脉注射0.1ml生理盐水、dox
·
hcl、dox/hd、dox/hhd(dox给药量为5mg/ml)，给药期间，每2天测量小鼠的重量和肿瘤体积。第21天时，处死小鼠，取出肿瘤并称重。如图13所示，图13a为给药周期内肿瘤相对体积变化；图13b为21天时肿瘤取出图像；图13c为不同实验组的肿瘤重量；图13d为给药周期内小鼠体重变化。与生理盐水组相比，三种剂型的dox对肿瘤生长均有一定的抑制效果，其中，两种dox胶束的抗肿瘤效果比dox
·
hcl好。而在两种dox胶束中，由于肿瘤靶向性和细胞内ph敏感性释药的原因，ph敏感性dox/hhd胶束具有更高的肿瘤抑制率。此外，dox胶束产生的系统毒性比游离dox的小，注射载药胶束的两组小鼠几乎没有体重减轻。
[0090]
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领
域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。