lncRNATC8260作为肺癌治疗靶点的应用的制作方法

tc8260，但目前尚无其作为肺癌治疗靶标的相关文献报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供lncrna tc8260作为肺癌治疗靶点的应用。
7.本发明的另一目的是提供lncrna tc8260作为肺癌诊断靶点的应用。
8.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
9.lncrna tc8260作为治疗靶点在制备或筛选治疗肺癌和/或肺癌转移的药物中的应用,lncrna tc8260对应的cdna序列如seq id no:1所示。
10.lncrna tc8260或促进lncrna tc8260表达的物质在制备或筛选治疗肺癌和/或肺癌转移的药物中的应用。
11.lncrna tc8260作为检测靶点在制备肺癌辅助诊断试剂中的应用。
12.检测lncrna tc8260表达量的试剂在制备肺癌辅助诊断试剂中的应用。
13.作为本发明的一种优选，所述的检测lncrna tc8260表达量的试剂为检测lncrna tc8260的特异性引物。
14.作为本发明的进一步优选，所述的检测lncrna tc8260的特异性引物如seq id no:4和seq id no:5所示。
15.有益效果：
16.本发明前期试验发现采用nj001封闭sp70能够显著抑制肺癌细胞的增殖、侵袭、转移，并能诱导其发生凋亡。因此，本发明利用nj001封闭sp70后的spc-a1细胞作为实验组，未使用nj001封闭sp70的spc-a1细胞作为对照组，筛选出差异表达的lncrna tc8260。lncrna tc8260在正常人支气管上皮细胞株hbe表达水平显著高于肺癌细胞株(spc-a1、a549、h1299、h358、h460、h520)(p《0.05)。健康对照者中lncrna tc8260的表达水平也显著高于肺癌患者血清(p《0.05)。通过细胞划痕实验对转染了lncrna tc8260 sirna及相应control的细胞迁移能力进行观察比较，如图6所示下调lncrna tc8260可促进spc-a1细胞迁移。可见lncrna tc8260作为治疗靶点可以在制备或筛选治疗肺癌和/或肺癌转移的药物中应用。lncrna tc8260也可以作为检测靶点在制备肺癌辅助诊断试剂中应用。
17.与现有的分子治疗靶标，如egfr、ros1、pd1等相比，lncrna tc8260可为不符合治疗入选标准的晚期肺癌患者提供新的治疗策略选择，亦可为个体化靶向治疗无效的肺癌患者提供新的治疗思路，有利于具有潜在治疗价值的新型小分子药物的研发。
附图说明
18.图1.spc-a1与spc-a1+nj001差异表达lncrna聚类图。
19.注：spc-a1+nj001为nj001处理24h的spc-a1细胞。
20.图2.lncrna en5775、lncrna tc8260、lncrna tc9593在spc-a1+nj001及spc-a1中相对表达量。
21.图3.lncrna tc8260在肺癌细胞株及hbe中的相对表达量
22.其中1代表hbe，2代表spc-a1，3代表a549，4代表h1299，5代表h358，6代表h460，7代表h520.
23.图4.lncrna tc8260在肺癌患者血清中表达下调。
24.图5.lncrna tc8260干扰片段的干扰效率
25.图6.划痕实验检测lncrna tc8260 sirna对spc-a1细胞迁移能力的影响
具体实施方式
26.实施例1
27.为了筛选差异表达lncrna，我们采用晶芯lncrna微阵列芯片获得lncrna表达谱。
28.(1)细胞处理：选取处于对数生长期的spc-a1细胞，消化收集制成单细胞悬液，6孔细胞培养板每孔铺板细胞量2
×
105个，培养过夜，吸弃培养上清，并用温浴的hank’s液500μl每孔清洗细胞一遍。sp70封闭组每孔加入单抗nj001溶液，终浓度为300ng/μl；对照组每孔加入500μl培养液，每组设3个平行孔。干预后培养36h后，弃尽6孔板中的细胞培养液，直接在培养板中加入1ml mz裂解液裂解细胞，用mz裂解液吹打细胞数次，对细胞进行消化、裂解。待细胞完全裂解后收集细胞悬液于无rna酶的eppendorf管中，漩涡振荡器振荡混匀后，直接用于下一步的rna提取或置于-80℃冰箱冷冻保存。
29.(2)rna提取：使用mircute mirna提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，按操作手册提取上述已加mz裂解液的细胞悬液rna。
30.(3)rna浓度及纯度测定：采用nanodrop 2000超微量分光光度计(美国赛默飞)测定rna样本a260/a280比值，在1.8～2.0之间，表示rna纯度高，可用于后续实验。
31.(4)基因芯片检测：基因表达谱芯片检测以待检测样品的总rna为起始，通过质检后，反转录合成一链获得单链cdna，再通过合成双链获得双链cdna，而后在体外转录得到生物素标记的反义rna(antisense rna，arna)。使用磁珠纯化arna，除去盐、酶等杂质，片段处理，与芯片上的探针杂交。经水洗染色后，在芯片上扫描图像获得原始数据，最后进行数据分析。
32.通过lncrna表达谱芯片检测，发现在spc-a1+nj001组与spc-a1组间存在83个表达差异的lncrna(图1)。
33.实施例2
34.通过实时荧光定量pcr的方法检测了封闭sp70的spc-a1细胞中lncrnaen5775、lncrna tc8260、lncrnatc9593的表达水平，并将未封闭sp70的spc-a1作为对照组。
35.(1)逆转录反应：
36.20μl体系：rna(调整至100μg-500μg)与4μl 5
×
primescript rt master mix混匀，并用rnase-free水补齐至总体积20μl；逆转录条件为37℃15min，85℃5s和4℃∞；-20℃保存备用。
37.(2)实时荧光定量pcr(real-time pcr)：
38.pcr引物：以cdna第一链为模板，以β-actin为内参照，扩增lncrna en5775、lncrna tc8260、lncrna tc9593。
39.用ddh2o将引物溶解至终浓度为100μmol/l，-20℃保存备用，工作浓度为10μmol/ml。引物序列见表1。
40.表1 pcr引物序列
[0041][0042]
反应体系(20μl)：2
×
sybr premix dimer eraser 10μl、上游引物(10μmol/ml)和下游引物(10μmol/ml)各0.8μl、0.4μl rox、ddh2o 6μl和cdna模板2μl。
[0043]
扩增程序(两步法)：95℃预变性30s，95℃变性5s，57℃退火30s，72℃延伸34s，40个循环。
[0044]
(3)实验结果分析：β-actin作内参，采用相对定量法。各样本目的基因的ct值减去相应β-actin的ct值得到两者差值，即
△
ct＝ct目的基因-ctβ-actin，各样本相对定量为2
-△
ct
＝2-(ct目的基因-ctβ-actin)，两组样本比较采用非配对t检验或秩和检验。在细胞系中，对应于阴性对照组，目的基因的表达倍数改变采用2
-△△
c t法(
△△
ct＝
△
ct目的基因
-△
ct nc)，两组样本比较采用配对t检验。设三复孔，每次试验重复测定3次。
[0045]
结果显示:lncrna en5775、lncrna tc8260、lncrna tc9593在spc-a1+nj001组较spc-a1组显著升高(p《0.05)，与芯片结果一致(图2)。
[0046]
实施例3
[0047]
(1)细胞培养：spc-a1、a549、h1299、h358、h460、h520的基础培养基分别为rpmi-1640、dmem、rpmi-1640、dmem、dmem、dmem，使用前配制成用含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的完全培养液；人支气管上皮细胞株hbe培养于含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％胎牛血清的rpmi-1640培养液中，37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养。
[0048]
(2)rna提取：采用mircute mirna提取分离试剂盒(北京天根)，按操作说明提取上述细胞rna。
[0049]
(3)rna浓度及纯度测定：采用nanodrop 2000超微量分光光度计(美国赛默飞)测定rna样本a260/a280比值，在1.8～2.0之间，表示rna纯度高，可用于后续实验。
[0050]
(4)rt-pcr：详见实施例2。
[0051]
结果显示:lncrna tc8260在正常人支气管上皮细胞株hbe表达水平显著高于肺癌细胞株(spc-a1、a549、h1299、h358、h460、h520)(p《0.05)(图3)。
[0052]
实施例4
[0053]
(1)血清样本收集：收集未经治疗的肺癌初诊患者及健康体检者抗凝全血2ml，3000rmp离心10min，吸取上层血清至无rna酶的1.5ml eppendorf管中，4℃、12000rmp离心10min，吸取血清(注意不要吸道沉淀)至新的无rna酶的1.5ml eppendorf管中，-80℃冻存或直接提取rna。
[0054]
(2)rna提取：使用bioteke提取试剂盒按操作说明提取1ml血清样本中rna；
[0055]
(3)rna浓度及纯度测定：采用nanodrop 2000超微量分光光度计(美国赛默飞)测定rna样本a260/a280比值，在1.8～2.0之间，表示rna 纯度高，可用于后续实验。
[0056]
(4)逆转录反应：
[0057]
20μl体系：4μl rna与4μl 5
×
primescript rt master mix混匀，并用rnase-free水补齐至总体积20μl；逆转录条件为37℃15min，85℃5s和4℃∞；-20℃保存备用。
[0058]
(5)实时荧光pcr：详见实施例2。
[0059]
结果显示:健康对照者血清中lncrna tc8260的表达水平显著高于肺癌患者(p《0.05)(图4)。
[0060]
实施例5
[0061]
(1)溶解sirna：-20℃取出干粉，12000rpm
×
2min；轻轻打开管盖，按说明书加入相应体积depc水，配制成终浓度为2m的sirna溶液，分装后-20℃冻存待用。
[0062]
(2)细胞培养：用含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的rpmi-1640培养液培养人肺腺癌spc-a1细胞。
[0063]
(3)细胞铺板：收集生长状态较好的、1000rmp离心5min，弃上清；以含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的rpmi-1640培养液重悬细胞，使细胞密度维持在(4.0-10.0)
×
105/ml，接种至六孔培养板中，每孔2ml，37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养贴壁后待用；
[0064]
(4)转染：取1.5ml无菌ep管若干，每管加入125μlrpmi-1640基础培养基和7.5μl lipofectamine3000；另取相同数量1.5ml无菌ep，每管加入125μlrpmi-1640基础培养基和3.75μl sirna；室温静置5min后，混匀稀释后的lipofectamine3000和sirna；室温静置15min；吸弃6孔板内rpmi-1640完全培养液，1ml pbs洗涤1次，吸弃；每孔加lipofectamine3000和sirna混合液(250μl)，37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养；6h后换为2ml rpmi-1640完全培养液继续培养48h；收集细胞，实时荧光pcr检测转染效率。
[0065]
(5)实时荧光pcr：同前。
[0066]
结果显示:收集转染效率达到要求的spc-a1细胞，提取rna，qrt-pcr检测干扰效率。结果显示sh-tc8260-2片段在spc-a1细胞中的干扰效率达到了50％，具有较好的干扰效率(图5)。因此，选择这个干扰片段进行后续的细胞实验。
[0067]
实施例6
[0068]
(1)细胞培养：用含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的rpmi-1640培养液培养人肺腺癌spc-a1细胞。
[0069]
(2)细胞铺板：收集生长状态较好的、1000rmp离心5min，弃上清；以含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的rpmi-1640培养液重悬细胞，使细胞密度维持在(4.0-10.0)
×
105/ml，接种至六孔培养板中，每孔2ml，37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养贴壁后待用；
[0070]
(3)转染：取1.5ml无菌ep管若干，每管加入125μlrpmi-1640基础培养基和7.5μl lipofectamine3000；另取相同数量1.5ml无菌ep，每管加入125μlrpmi-1640基础培养基和3.75μl sirna；室温静置5min后，混匀稀释后的lipofectamine3000和sirna；室温静置15min；吸弃6孔板内rpmi-1640完全培养液，1ml pbs洗涤1次，吸弃；每孔加lipofectamine3000和sirna混合液(250μl)，37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养；6h后换为2ml rpmi-1640完全培养液继续培养48h；
[0071]
(4)划痕：使用无菌的100-200μl黄色枪头，在6孔板各孔画“井”字，并用奥林巴斯光学显微镜(日本olympus)拍照记录spc-a1细胞迁移情况。
[0072]
通过细胞划痕实验对转染了lncrna tc8260 sirna及相应control的细胞迁移能力进行观察比较，如图6所示下调lncrna tc8260可促进spc-a1细胞迁移。