本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种基于卵巢靶向的干细胞组合物的干细胞制剂。
背景技术：
卵巢早衰(prematureovarianfailure，pof)是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前闭经的现象。是一种以闭经、不孕、雌激素缺乏、卵泡减少和促性腺激素增高为特征的疾病，并伴有一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等，严重影响女性的身心健康。此外，pof的女性，患骨质疏松症、心血管疾病和痴呆的风险增加。pof在女性中占1-3％，近年来发病率呈上升趋势。
pof病因复杂，尚未完全阐明，但与自身免疫应答、感染、遗传因素、化疗、放疗、手术等治疗效果及内分泌功能障碍有关。目前，pof的最常用的治疗方法是激素替代疗法(hormonereplacementtherapy，hrt)。该疗法虽然对pof的临床症状具有一定的缓解作用，然而，hrt不能从根本上修复受损的卵巢，恢复卵巢功能。此外，研究表明，长期hrt治疗增加心脏病和中风的风险，可能会增加乳腺癌和自身免疫性疾病的风险。因此，需要新的治疗策略来恢复pof患者的卵巢功能。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种基于卵巢靶向的干细胞组合物的干细胞制剂，该干细胞组合物采用免疫原性低的胎盘充质干细胞与经血间充质干细胞，可有效修复受损卵巢，且无毒副作用，两者联合使用对治疗卵巢早衰具有协同增效的作用。
其具体技术方案如下：
本发明提供了一种干细胞组合物，由胎盘间充质干细胞和经血间充质干细胞组成。
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力。间充质干细胞来源广泛，体外扩增稳定，不涉及伦理问题，免疫原性低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，不须经过严格配对使用。经血间充质干细胞具有的间充质干细胞特性，且来源于子宫内膜，能够更好的适应子宫内膜的微环境，迁移归巢到内膜损伤部位，修复再生受损组织。另外，经血获取方式无痛苦并可反复获取。人胎盘间充质干细胞具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。胎盘间充质干细胞是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。
相比于单独使用胎盘间充质干细胞或经血间充质干细胞，本发明将胎盘间充质干细胞与经血间充质干细胞联合使用，能显著提高卵巢早衰对卵巢早衰的治疗效果，两组配合使用具有协同增效的作用。
本发明中，所述胎盘间充质干细胞与所述经血间充质干细胞的细胞数量比为1：3～3：1，优选为1：1、3：1或1：3。
本发明还提供了上述干细胞组合物在制备预防和/或治疗卵巢早衰药物中的应用。
本发明还提供了一种干细胞制剂，包括上述干细胞组合物、白蛋白和溶媒。
本发明中，所述干细胞制剂中的各组分的浓度为：
胎盘间充质干细胞：5×107～1.5×108个/ml；
经血间充质干细胞：5×107～1.5×108个/ml；
白蛋白：20wt％；
溶媒：补足。
优选地，所述干细胞制剂中各组分的浓度为：
胎盘间充质干细胞：1×108个/ml；
经血间充质干细胞：1×108个/ml；
白蛋白：20wt％；
溶媒：补足。
本发明中，所述溶媒为生理盐水，白蛋白为人血白蛋白。
所述干细胞制剂的给药方式为卵巢注射给药。
本发明中采用常用的卵巢注射方法将药物直接靶向注射到卵巢局部。
本发明中，所述卵巢注射给药具体为：每个卵巢每隔15天注射1次，共注射3～4次，每次注射1ml所述干细胞制剂。
优选地，所述卵巢注射给药具体为：每个卵巢每隔15天注射1次，共注射3次，每次注射1ml所述干细胞制剂。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种干细胞组合物，由胎盘间充质干细胞和经血间充质干细胞组成。该干细胞组合物中胎盘间充质干细胞与经血间充质干细胞联合使用，可有效降低雌激素水平，修复卵巢损伤，恢复卵巢功能，对卵巢早衰的治疗效果显著优于单独使用胎盘间充质干细胞或经血间充质干细胞的效治疗效果，两者结合使用具有协同增效的作用。该干细胞组合物中两种间充质干细胞来源广泛，体外扩增稳定，无伦理道德问题，免疫原性低，使用安全，无毒副作用。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1人胎盘间充质干细胞的制备及收集
1.采集健康产妇自愿捐赠的胎盘一个，把它放置在一个大的无菌不锈钢器械盆中，倒入适量的1×双抗的生理盐水，清洗胎盘，去掉脐带和羊膜，采集羊膜内层的母面层的结缔组织，放置到新的无菌玻璃皿中，用生理盐水清洗干净，去除多余的血和胎盘小叶的组织，清洗3-4次，然后把胎盘母面层的结缔组织用剪刀剪成小块，按照组织块体积：0.25％胰蛋白酶体积＝3：5，加入胰蛋白酶，37度，150-200转/min，消化30分钟。
2.消化完后，取出组织块用生理盐水清洗3次，充分把残留的胰蛋白酶清洗干净，然后将组织块加125ml储液瓶中，加入20ml0.5％i型胶原酶，再加入dmem高糖培养基定容到100ml，37度，150-200转/min，消化至组织块消失。
3.将消化液平均分装到4支50ml离心管中，然后用生理盐水定容到50ml，混匀600g离心10分钟，然后弃上清，用无血清间充质干细胞完全培养基重悬，接种到培养瓶，按照5-10ml组织块的量接种1个t175培养瓶，放入37度，5％co2培养箱中培养。
4.培养48h后开始换液，待细胞汇合度达到80-90％开始传代，待细胞传代到p3代细胞开始收集，进行无菌检测，内毒素检测，流式表型，细胞计数及活力检测。
5.将汇合度达到90％的p3代胎盘干细胞用0.25％胰蛋白酶消化下来，用胰酶终止液终止消化，500g离心5min，弃上清，用生理盐水重悬500g离心5min，清洗2次。
实施例2人经血间充质干细胞的制备及收集
1.采集健康经血丰富的年轻女孩志愿捐赠的经血，将经血与等体积的生理盐水进行混合得到经血稀释液，用密度梯度法进行分离，将经血稀释液缓慢地加到装有15mlficoll淋巴分离液的50ml离心管中，至于分离液上层，加入30-40ml的经血稀释液，800g离心20min，升降速为0。
2.离心好后，用巴士吸管吸取中间的白膜层于新的50ml离心管中，用生理盐水重悬，500g离心5min，然后用无血清间充质干细胞完全培养基重悬，接种到培养瓶中，接种按照4000-6000cm2，放置于37度，5％co2培养箱中培养。
3.培养48h后开始换液，待细胞汇合度达到80-90％开始传代，待细胞传代到p3代细胞开始收集，进行无菌检测，内毒素检测，流式表型，细胞计数及活力检测。
4.将汇合度达到90％的p3代胎盘干细胞用0.25％胰蛋白酶消化下来，用胰酶终止液终止消化，500g离心5min，弃上清，用生理盐水重悬500g离心5min，清洗2次。
实施例3干细胞制剂的制备
将实施例1和实施例2的所收集到胎盘间充质干细胞和经血间充质干细胞，无菌检测和内毒素检测为阴性，细胞活力达到90％以上，细胞流式表型必须符合干细胞流式表型标准(cd73、cd90、cd105≥95.0％；cd34、cd45、hla-dr≤2.0％)。
1.将数量为1×108胎盘间充质干细胞悬液与数量为1×108经血间充质干细胞悬液充分混匀，500g离心5min。
2.弃上清，用生理盐水重悬干细胞，300g离心5min。
3.弃上清，用1.7ml生理盐水和0.7ml20％白蛋白将细胞重悬，然后用40μm的无菌细胞过滤器过滤，制成2ml干细胞制剂。
实施例4干细胞制剂的制备
将实施例1和实施例2的所收集到胎盘间充质干细胞和经血间充质干细胞，无菌检测和内毒素检测为阴性，细胞活力达到90％以上，细胞流式表型必须符合干细胞流式表型标准(cd73、cd90、cd105≥95.0％；cd34、cd45、hla-dr≤2.0％)。
1.将数量为5×107胎盘间充质干细胞悬液与数量为1.5×108经血间充质干细胞悬液充分混匀，500g离心5min。
2.弃上清，用生理盐水重悬干细胞，300g离心5min。
3.弃上清，用1.7ml生理盐水和0.7ml20％白蛋白将细胞重悬，然后用40μm的无菌细胞过滤器过滤，制成2ml干细胞制剂。
实施例5干细胞制剂的制备
将实施例1和实施例2的所收集到胎盘间充质干细胞和经血间充质干细胞，无菌检测和内毒素检测为阴性，细胞活力达到90％以上，细胞流式表型必须符合干细胞流式表型标准(cd73、cd90、cd105≥95.0％；cd34、cd45、hla-dr≤2.0％)。
1.将数量为1.5×108胎盘间充质干细胞悬液与数量为5×107经血间充质干细胞悬液充分混匀，500g离心5min。
2.弃上清，用生理盐水重悬干细胞，300g离心5min。
3.弃上清，用1.7ml生理盐水和0.7ml20％白蛋白将细胞重悬，然后用40μm的无菌细胞过滤器过滤，制成2ml干细胞制剂。
实施例6干细胞制剂治疗卵巢早衰的效果验证
招募60名卵巢早衰的志愿者，年龄在22-45岁之间，随机分成6组，每组10名，分别为对照组1，对照组2，对照组3，实验组1，实验组2，实验组3。
实验组1：将实施例3制成的2ml干细胞制剂分成2个1ml，分别给卵巢早衰患者两个卵巢局部注射进去。每个卵巢分别注入1×108数量间充质干细胞，每隔15天局部注射一次，一般注射3次；
实验组2：取实施例4制成的干细胞制剂分成2个1ml，分别给卵巢早衰患者两个卵巢局部注射进去。每个卵巢分别注入1×108数量间充质干细胞，每隔15天局部注射一次，一般注射3次；
实验组3：取实施例5制成的干细胞制剂分成2个1ml，分别给卵巢早衰患者两个卵巢局部注射进去。每个卵巢分别注入1×108数量间充质干细胞，每隔15天局部注射一次，一般注射3次；
对照组1口服安慰剂；
对照组2单一使用2ml细胞数为2×108胎盘间充质干细胞进行给药，给药方式同实验组1；
对照组3单一使用2ml细胞数为2×108经血间充质干细胞进行给药，给药方式同实验组1。
志愿者于给药前进行血清激素检测，分别是促卵泡激素fsh，促黄体生成素lh，雌二醇e2，给药后3个月再做一次血清激素(促卵泡激素fsh，促黄体生成素lh，雌二醇e2)检测，结果如表1所示。
从表1的结果可以看出，对照组2～3和实验组间充质干细胞卵巢给药3个月后，三项激素不同程度的恢复至正常水平。相比于对照组2和3，实验组给药3个月后三项激素水平明显降低，差异显著，说明本发明提供的干细胞制剂可以有效改善雌激素分泌，对卵巢早衰治疗效果明显。
表1给药前后激素检测结果
实施例7干细胞制剂治疗卵巢早衰的临床表现
本实施例随机选取年龄在22-45岁之间的3名卵巢早衰志愿者，观测其用药后的临床表面。
给药方式：每个卵巢每次注射1ml实施例3制备的干细胞制剂。
案例1：李女士，22岁，未婚，月经不调，经期持续推迟。
临床现象：平时月经不规律，量非常少，持续时间短，经常痛经，并伴随有心悸、头痛、乏力、腰酸背痛，经期经常推迟，有时推迟一两个月，多次寻医就诊治疗治疗效果不明显。2018年3月4号第一次靶向注射后并随访，使用一周后明显感觉睡眠有所改善。2018年3月19号第二次靶向注射后并随访，靶向注射后一周随访，发现她精力提升，睡眠深，食欲增加，皮肤感觉细腻光滑，使用干细胞后第一次来月经，痛经现象改善，经血量有所改善，持续时间4天。2018年4月4号第三次靶向注射后一周随访，精神活力上升，睡眠香，食欲好，皮肤变紧致细腻。2018年4月19号第四次靶向注射一个月后随访，规律性次月来月经，每天量约75ml左右，持续5天，随后连续随访6个月，她每次月经量趋近正常量，而且有规律，心悸、头痛、乏力、腰酸背痛和经期经常推迟现象完全消失。
案例2：黄女士，32岁，卵巢早衰，不孕不育。
临床现象：平时月经不规律，量少，持续时间短，结婚6年一直未怀孕，检查雌激素指标偏低，子宫和卵巢偏小。2018年6月5号第一次进行靶向注射后并随访，使用一周后明显感觉食欲和睡眠有所改善。2018年6月20号第二次靶向注射后并随访，靶向注射后一周随访，发现她精力提升，睡眠深，食欲增加，皮肤感觉细腻光滑，使用干细胞后第一次来月经，月经量有所增加，持续时间5天。2018年7月5号第三次靶向注射后一周随访，精力充沛，睡眠香，食欲好，皮肤变紧致细腻，性欲强烈。2018年7月20号第四次靶向注射一个月后随访，第二次来月经，每天量约80ml左右，持续5天，随后连续随访三个月，她每次月经量均正常，而且有规律。卵巢早衰靶向治疗四个月后月经未按时来，她开始出现出现恶心、食欲不振，全身乏力，去医院做检查，发现已经是怀孕了，于2019年9月16日顺利产下7.5斤重男宝宝。
案例3：郑女士，45岁，突然停经7个月，雌激素指标降低。
临床现象：出现停经、易出汗、潮热、心慌、失眠、食欲下降、掉头发、性欲的下降、阴部干涩和易怒等症状。
用药情况：己烯雌酚片0.5mg/1次/日，21天后停药一周，周期性服。服药一个月后有来月经，但是量很少，持续天数少，时间不规律。2018年7月2日第一次靶向注射后一周随访，无明显不适感觉，皮肤变光滑、润泽、肤色变白，潮热、心慌、失眠和食欲下降明显改善。2018年7月17日第二次靶向注射后随访，发现她皱纹开始减少，面部色斑变淡，精力提升，开始来月经量和天数有所增加。2018年8月1日第三次靶向注射后随访，皮肤开始变得紧致以及肌肉变得紧实，乳房、臀部变得紧致富有弹性，食欲正常，无不适症状，阴部变湿润，月经量趋近正常值，持续4天左右，性欲增强。复查血清超氧化物歧化酶(sod)活力测定，雌激素水平测定均明显升高。建议己烯雌酚片减半0.25mg/1次/日，14天后停药一周，周期性服用。靶向注射6个月后随访，月经基本正常，而且规律，复查雌激素水平雌二醇(e2)和孕酮(p)值均在正常范围。建议停止使用己烯雌酚片。停用己烯雌酚片后连续随访6个月，发现精力充沛，睡眠香，食欲好，月经正常并且规律，性欲旺盛。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。