本发明属于天然产物化学领域，具体涉及一种从祖师麻中提取高纯度香豆素的方法。
背景技术：
中药祖师麻为瑞香科植物黄瑞香、陕甘瑞香及凹叶瑞香的茎皮和根皮。黄瑞香分布于陕西、甘肃、青海、四川等地。陕甘瑞香分布于陕西、甘肃、四川、云南、西藏等地。凹叶瑞香分布于陕西、甘肃、四川、云南等地。具有祛风通络，散瘀止痛之功效，常用于风湿痹痛，四肢麻木，头痛，胃痛，腰痛，跌打损伤。
祖师麻成分复杂，主要含有香豆素类、二萜类、木质素类、黄酮类、蒽醌类及甾醇类等化学成分，其中最为主要的有效成分为瑞香素、祖师麻乙素、瑞香素-8-o-葡萄糖苷及7-oh香豆素等香豆素，在祖师麻的现有制剂中，瑞香素等成分也是作为药品质量控制的指标成分，同时，祖师麻药材属毒性药材，对其毒性二萜类成分，它的提取工艺更要对该部分的成分进行检测，从源头上减少有害杂质，主要包括芫花瑞香宁、格尼迪木素，结构式如下。
中国专利cn102008599b公开了一种祖师麻提取物的制备方法，包括用乙醇溶液回流提取，再上大孔吸附树脂精制，所得祖师麻提取物的纯度较低，未能有效清除杂质。
中国专利申请cn108721439a公开了另一种祖师麻提取物的制备方法，包括用乙醇溶液回流提取，再依次通过石油醚、醋酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，最后上大孔吸附树脂精制，有效去除了部分杂质，但如毒性二萜类成分，未能取得较好的去除效果。
总结来看，现有质控方法仅对药材、提取物和制剂中祖师麻甲素、祖师麻乙素、瑞香素-8-o-葡萄糖苷及7-oh香豆素的含量进行了测定，未能对其毒性成分进行质量控制，导致其制剂均具有一定的胃肠道刺激或皮肤刺激过敏反应，因此，迫切需要一种能够对其活性成分的全面控制的方法，能有效的保证其疗效，对其毒性成分的全面控制能有效的控制其毒性反应的发生。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种能够解决祖师麻提取产物纯度低、杂质去除难的缺陷，获得高纯度的目标产物的方法，该方法特别适合应用于高纯度药物的制备及科学研究。
本发明的技术方案是：
一种从祖师麻中提取高纯度香豆素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
s1：超临界流体萃取；将祖师麻粉碎，过50目筛，通过超临界流体co2萃取，得到祖师麻的初步提取物；
s2：离子液体溶解：将步骤s1所得祖师麻的初步提取物置于离子液体中，同时进行微波处理，离子液体的质量是所得祖师麻的初步提取物质量的3-5倍，过滤，所得滤液为祖师麻的处理产物；
s3：分离提取物：将步骤s2所得祖师麻的处理产物加入到混合溶剂中，萃取3次，分离有机相获得祖师麻香豆素；
s4：提取物的精制：将步骤s3所得祖师麻香豆素采用大孔吸附树脂层析，收集洗涤后的洗脱液，减压浓缩、干燥，最终得到高纯度的祖师麻香豆素。
进一步地，所述步骤s1所述超临界流体萃取的条件为：控制萃取釜的温度为45-50℃，萃取釜压力为25-30mpa，萃取时间为1-2h，设置二氧化碳流量为20-25kg/h。
进一步地，所述步骤s2所述离子液体为浓度为0.8-1.5mol/l的1-丁基-3-甲基咪唑氯盐水溶液。
进一步地，所述步骤s2所述微波处理的条件为，处理温度40-45℃，处理时间10-25min，微波功率200-400w。
进一步地，所述步骤s3所述混合溶剂由乙酸乙酯和乙醇按照质量比1：2-5组成。
进一步地，所述步骤s3所述混合溶剂的量为步骤s2所得祖师麻的处理产物质量的3-10倍。
进一步地，所述步骤s4所述大孔吸附树脂层析的步骤为，先用水洗涤大孔吸附树脂，然后用解析液洗涤大孔吸附树脂。
进一步地，所述解析液为体积分数为60-75％的甲醇水溶液。
所述从祖师麻中提取高纯度香豆素的方法中用到的大孔吸附树脂为d-101型，购于西安维华环保科技有限公司，乙酸乙酯、乙醇等原材料均为公知的商品化普通原材料，均可从市场上购买获得。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明通过超临界流体萃取的方式获得初步提取物，将该提取物溶于离子液体中，过滤，将滤液通过混合溶剂萃取，最后用大孔吸附树脂精制制得，方法整体顺序连贯，可操作性强，所用器材及药品均易获得。
(2)本发明创造性的将超临界流体萃取、离子液体提取、混合溶剂萃取结合运用，并最后通过大孔吸附树脂精制产物，能够获得高纯度的祖师麻香豆素提取物，经实验证实包括瑞香苷、瑞香素-8-o-β-d-葡萄糖苷、7-oh香豆素等四种香豆素含量可达88.1％，并对毒性二萜类成分的检测可知，毒性成分含量极低，经实验证实包括芫花瑞香宁和格尼迪木素的含量仅为0.06％。
(3)本发明通过离子液体的运用极大提高了提取效率，在保证含量的同时还保证了较高的纯度，与现有技术相比优势明显。
(4)本发明解决了以往祖师麻提取物的纯度低、杂质去除难的缺陷，能够获得高纯度的目标产物，特别适合应用于高纯度药物的制备及科学研究，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，将本发明的所述内容做进一步解释。但本发明上述主题的范围不仅限于以下实施例。
实施例1、一种从祖师麻中提取高纯度香豆素的方法
一种从祖师麻中提取高纯度香豆素的方法，包括如下步骤：
s1：超临界流体萃取：将祖师麻粉碎，过50目筛，通过超临界流体co2萃取，得到祖师麻的初步提取物，所述超临界流体萃取的条件为：控制萃取釜的温度为45℃，萃取釜压力为25mpa，萃取时间为1h，设置二氧化碳流量为20kg/h；
s2：离子液体溶解：将步骤s1所得祖师麻的初步提取物置于离子液体中，所述离子液体为浓度为0.8mol/l的1-丁基-3-甲基咪唑氯盐水溶液，离子液体的质量是所得祖师麻的初步提取物质量的3倍，同时进行微波处理，处理温度40℃，处理时间10min，微波功率200w，过滤，所得滤液为祖师麻的处理产物；
s3：分离提取物：将步骤s2所得祖师麻的处理产物加入到混合溶剂中，所述混合溶剂由乙酸乙酯和乙醇按照质量比1：2组成，混合溶剂的量为祖师麻的处理产物质量的3倍，萃取3次，分离有机相获得祖师麻香豆素；
s4：提取物的精制：将步骤s3所得祖师麻香豆素采用大孔吸附树脂层析，先用水洗涤大孔吸附树脂，然后用体积分数为60％的甲醇水溶液作为解析液洗涤大孔吸附树脂，收集洗涤后的洗脱液，减压浓缩、干燥，最终得到高纯度的祖师麻香豆素。
实施例2、一种从祖师麻中提取高纯度香豆素的方法
一种从祖师麻中提取高纯度香豆素的方法，包括如下步骤：
s1：超临界流体萃取：将祖师麻粉碎，过50目筛，通过超临界流体co2萃取，得到祖师麻的初步提取物，所述超临界流体萃取的条件为：控制萃取釜的温度为50℃，萃取釜压力为30mpa，萃取时间为2h，设置二氧化碳流量为25kg/h；
s2：离子液体溶解：将步骤s1所得祖师麻的初步提取物置于离子液体中，所述离子液体为浓度为1.5mol/l的1-丁基-3-甲基咪唑氯盐水溶液，离子液体的质量是所得祖师麻的初步提取物质量的3倍，同时进行微波处理，处理温度45℃，处理时间25min，微波功率400w，过滤，所得滤液为祖师麻的处理产物；
s3：分离提取物：将步骤s2所得祖师麻的处理产物加入到混合溶剂中，所述混合溶剂由乙酸乙酯和乙醇按照质量比1：5组成，混合溶剂的量为祖师麻的处理产物质量的10倍，萃取3次，分离有机相获得祖师麻香豆素；
s4：提取物的精制：将步骤s3所得祖师麻香豆素采用大孔吸附树脂层析，先用水洗涤大孔吸附树脂，然后用体积分数为75％的甲醇水溶液作为解析液洗涤大孔吸附树脂，收集洗涤后的洗脱液，减压浓缩、干燥，最终得到高纯度的祖师麻香豆素。
实施例3、一种从祖师麻中提取高纯度香豆素的方法
一种从祖师麻中提取高纯度香豆素的方法，包括如下步骤：
s1：超临界流体萃取：将祖师麻粉碎，过50目筛，通过超临界流体co2萃取，得到祖师麻的初步提取物，所述超临界流体萃取的条件为：控制萃取釜的温度为45℃，萃取釜压力为30mpa，萃取时间为2h，设置二氧化碳流量为25kg/h；
s2：离子液体溶解：将步骤s1所得祖师麻的初步提取物置于离子液体中，所述离子液体为浓度为1.2mol/l的1-丁基-3-甲基咪唑氯盐水溶液，离子液体的质量是所得祖师麻的初步提取物质量的5倍，同时进行微波处理，处理温度40℃，处理时间20min，微波功率300w，过滤，所得滤液为祖师麻的处理产物；
s3：分离提取物：将步骤s2所得祖师麻的处理产物加入到混合溶剂中，所述混合溶剂由乙酸乙酯和乙醇按照质量比1：3组成，混合溶剂的量为祖师麻的处理产物质量的6倍，萃取3次，分离有机相获得祖师麻香豆素；
s4：提取物的精制：将步骤s3所得祖师麻香豆素采用大孔吸附树脂层析，先用水洗涤大孔吸附树脂，然后用体积分数为70％的甲醇水溶液作为解析液洗涤大孔吸附树脂，收集洗涤后的洗脱液，减压浓缩、干燥，最终得到高纯度的祖师麻香豆素。
对比例1、一种从祖师麻中提取香豆素的方法
一种从祖师麻中提取香豆素的方法，包括如下步骤：
s1：超临界流体萃取：将祖师麻粉碎，过50目筛，通过超临界流体co2萃取，得到祖师麻的初步提取物，所述超临界流体萃取的条件为：控制萃取釜的温度为45℃，萃取釜压力为30mpa，萃取时间为2h，设置二氧化碳流量为25kg/h；
s2：分离提取物：将步骤s2所得祖师麻的初步提取物加入到混合溶剂中，所述混合溶剂由乙酸乙酯和乙醇按照质量比1：3组成，混合溶剂的量为祖师麻的处理产物质量的6倍，萃取3次，分离有机相获得祖师麻香豆素；
s3：提取物的精制：将步骤s3所得祖师麻香豆素采用大孔吸附树脂层析，先用水洗涤大孔吸附树脂，然后用体积分数为70％的甲醇水溶液作为解析液洗涤大孔吸附树脂，收集洗涤后的洗脱液，减压浓缩、干燥，最终得到高纯度的祖师麻香豆素。
对比例1与实施例3类似，不同的是，对比例1没有实施例3中的步骤s2对祖师麻的初步提取物进行离子液体的溶解和微波处理。
对比例2、一种从祖师麻中提取香豆素的方法
一种从祖师麻中提取香豆素的方法，包括如下步骤：
s1：超临界流体萃取：将祖师麻粉碎，过50目筛，通过超临界流体co2萃取，得到祖师麻的初步提取物，所述超临界流体萃取的条件为：控制萃取釜的温度为45℃，萃取釜压力为30mpa，萃取时间为2h，设置二氧化碳流量为25kg/h；
s2：离子液体溶解：将步骤s1所得祖师麻的初步提取物置于离子液体中，所述离子液体为浓度为1.2mol/l的1-丁基-3-甲基咪唑氯盐水溶液，离子液体的质量是所得祖师麻的初步提取物质量的5倍，过滤，所得滤液为祖师麻的处理产物；
s3：分离提取物：将步骤s2所得祖师麻的处理产物加入到混合溶剂中，所述混合溶剂由乙酸乙酯和乙醇按照质量比1：3组成，混合溶剂的量为祖师麻的处理产物质量的6倍，萃取3次，分离有机相获得祖师麻香豆素；
s4：提取物的精制：将步骤s3所得祖师麻香豆素采用大孔吸附树脂层析，先用水洗涤大孔吸附树脂，然后用体积分数为70％的甲醇水溶液作为解析液洗涤大孔吸附树脂，收集洗涤后的洗脱液，减压浓缩、干燥，最终得到高纯度的祖师麻香豆素。
对比例2与实施例3类似，不同的是，对比例2步骤s2置于离子液体后没有通过微波处理。
试验例1、祖师麻提取物的含量测定
试验对象：实施例1-3和对比例1-2制得的香豆素。
试验方法：
(1)色谱条件与系统适用性试验：仪器：acquityuplci-class(waters,usa)；
色谱柱：acquityuplcbehc18(2.1×100mm,1.7μm)；以甲醇-0.05％磷酸溶液(18：82)为流动相；检测波长为327nm。理论板数按瑞香苷峰计算应不低于9000。
(2)对照品溶液的制备：精密称取瑞香苷、瑞香素-8-o-β-d-葡萄糖苷、祖师麻甲素和祖师麻乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含40μg、35μg、25μg的混合溶液，摇匀，即得。
(3)供试品溶液的制备：取制得的高含量香豆素约0.2g，精密称定，置具塞圆底瓶中，精密加入体积分数为80％乙醇100ml，密塞，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，精密量取10ml，蒸干，残渣加50％甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
(4)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
试验结果：如表1所示。
表1：祖师麻中香豆素的含量测定
由表1可知，本发明提供的祖师麻香豆素的提取方法提取效率高，能够获得高含量的香豆素，特别是实施例3，四种香豆素的总含量能够达到88.1％，明显高于对比例1和对比例2；对比例1没有经过离子液体及经微波处理，直接进行萃取会使得有效成分的流失，降低含量，而对比例2没有经过微波处理，祖师麻的初步提取物不能与离子液体充分作用，影响了最终的提取效果。
试验例2、祖师麻提取物的杂质含量测定
试验对象：实施例1-3和对比例1制得的香豆素。
试验方法：
(1)色谱条件：
仪器：acquityuplci-class(waters,usa)；
色谱柱：acquityuplcbehc18(2.1×100mm,1.7μm)；
流动相：0.1％甲酸水溶液a-乙腈b，梯度洗脱；
梯度条件：0-10min：30-95％b，10-10.5min：95-30％b,10.5-14min：30％b；柱温箱：40℃；流速：0.4ml/min；进样量：2μl。
(2)对照品溶液的制备：精密称取芫花瑞香宁、格尼迪木素对照品适量，加甲醇制成1μg/ml的溶液，摇匀，即得。
(3)供试品溶液的制备：取制得的高含量香豆素约0.2g，精密称定，置具塞圆底瓶中，精密加入80％乙醇100ml，密塞，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，精密量取10ml，蒸干，残渣加50％甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
(4)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
试验结果：如表2所示。
表2：祖师麻中杂质含量测定结果
由表2可知，实施例1-3相较于对比例1能够明显减少杂质含量，说明了本发明在通过离子液体处理后，再通过混合溶剂萃取，能够显著降低杂质含量，提高祖师麻提取物中香豆素的纯度，适用于高纯度祖师麻药物的制备和科学研究，并启发了在主要含有香豆素类中药提取工艺的新思路。