基于高分子前药的自组装组合药物载体及其应用的制作方法

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种基于多糖高分子前药构建的自组装组合药物载体及其在耐药性肿瘤联合药物治疗中的应用。

背景技术：

化学药物治疗(化疗)是临床恶性肿瘤主要治疗方式之一。但是，化疗药物的体内半衰期短、肿瘤靶向性差，使得给药后很多药物无法到达肿瘤组织，导致治疗效果有限，而药物大量分布于正常组织，造成毒副作用大。随着高分子化学不断发展和成熟，高分子前药作为一种新型的药物递送系统，是将化疗药物衍生化形成或共价偶联于聚合物高分子，具有增加药物的肿瘤靶向性和选择性，提高肿瘤组织中药物浓度，减少药物在正常脏器的分布，降低毒副作用等优势，在国内外开展了广泛研究。然而，肿瘤耐药仍然是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一。肿瘤耐药性的分子机制较复杂，主要包括肿瘤细胞表面高表达药物外排蛋白和肿瘤细胞内高表达抗凋亡蛋白等。例如：药物外排蛋白(p-糖蛋白(p-gp)和atp结合转运蛋白2(abcg2)等)借助于atp提供的能量将肿瘤细胞内的化疗药物主动转运至胞外，造成胞内药物浓度始终低于有效治疗浓度；抗凋亡蛋白(survivin蛋白和b细胞淋巴瘤(bcl)-2蛋白)通过阻断caspase和nf-κb等凋亡信号通路，抑制化疗药物诱导的细胞凋亡。近年来，研究发现肿瘤组织中存在一群具有干细胞特征的细胞，被称为干细胞样肿瘤细胞(简称肿瘤干样细胞)，这类细胞具有自我更新、多向分化能力和强致瘤性。肿瘤干样细胞高表达药物外排蛋白，并且具有极强的dna修复和活性氧清除能力，使其对放疗和化疗都具有高度的耐受性。

为了克服肿瘤耐药性，采用组合药物联合治疗策略，通过化疗增敏剂和化疗药物联用，利用化疗增敏剂降低耐药肿瘤的化疗抗性，克服肿瘤耐药性，增强化疗药物对耐药肿瘤的治疗效果，发挥协同抗肿瘤作用。然而，化疗药物与化疗增敏剂由于化学结构不同，两者体内的药动学行为和组织分布规律存在很大差异，通过传统物理混合的“鸡尾酒”式的给药方式难以维持两药在给药后分布至肿瘤组织再进入到肿瘤细胞内的整个过程中的最佳协同药物比，使得药物联用往往达不到预期效果。基于微纳载体的组合药物共递送系统可解决这一问题。将组合药物共载于同一个载体中，不仅能够维持药物在给药后的协同比例，还延长了药物的作用时间，同时提高药物的靶向性。但是，化疗增敏剂和化疗药物的作用机制决定两药在对耐药肿瘤治疗过程中存在作用先后次序。若化疗药物同时或先于化疗增敏剂从载体中释放，释放的化疗药物不但无法杀死未敏化的耐药肿瘤细胞，甚至会增强其耐药性或干性。因此，基于耐药肿瘤细胞和肿瘤干样细胞的生物学特征，不仅需要化疗增敏剂与化疗药物联用治疗耐药肿瘤，并且需要维持两药的协同比例，同时基于化疗增敏剂与化疗药物作用机制，需要两药在细胞内适时发挥作用，增强协同抗肿瘤效力。

技术实现要素：

本发明的目的是解决化疗增敏剂与化疗药物联用对耐药肿瘤治疗效果不佳的技术问题，提供一种偶联化疗药物和低氧响应性疏水基团的多糖高分子前药，能够自组装并物理包埋化疗增敏剂得到组合药物载体，最终用于化疗增敏剂与化疗药物的共递送，提高两药协同抗耐药肿瘤作用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种多糖高分子前药，包括高分子多糖聚合物，在高分子多糖聚合物上修饰有化疗药物和低氧响应性疏水基团，所述化疗药物和低氧响应性疏水基团分别通过酰胺键或酯键与高分子多糖聚合物连接；

所述高分子多糖聚合物选自透明质酸、肝素或羧基葡聚糖；

所述化疗药物选自喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春地辛、阿糖胞苷、吉西他滨、安西他滨、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、阿霉素、表阿霉素、阿柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、紫杉醇、多西紫杉醇、尼莫司汀、替尼泊苷、依托泊苷、氨鲁米特或美法仑；

所述低氧响应性疏水基团为2-硝基咪唑基团或偶氮苯基团。

进一步地，在高分子多糖聚合物和化疗药物之间还有连接臂，所述连接臂为活性氧响应性连接臂，活性氧响应性连接臂一端通过酰胺键或酯键与高分子多糖聚合物连接，另一端与化疗药物连接。

进一步地，所述活性氧响应性连接臂为草酸酯或酮缩硫醇。

一种用于治疗耐药肿瘤的聚合物胶束，由上述多糖高分子前药在水中自组装形成；

所述聚合物胶束包载有化疗增敏剂，所述化疗增敏剂选自戈洛帕米、奎尼丁、维拉帕米、氯丙嗪、环孢菌素a、利血平、地高辛、胺碘酮、黄体酮、木黄酮、他莫昔芬、非洛地平、硝苯地平、红霉素、氟芬那酸、地尔硫卓、伐司朴达、比立考达、依克立达、唑喹达、洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、姜黄素、人参皂苷、艾曲波帕、烟曲霉毒素c、拉帕替尼、新生霉素、柳氮磺胺吡啶、非布索坦、ym-155、llp-3、venetoclax、navitoclax、obatoclaxmesylate、abt-737、bm-1074或marinopyrrolea。

一种用于治疗耐药肿瘤的聚合物水凝胶，由上述多糖高分子前药和上述聚合物胶束在水中自组装形成。

一种用于治疗普通肿瘤或肿瘤干样细胞相关耐药肿瘤的聚合物胶束，由上述多糖高分子前药在水中自组装形成；

所述聚合物胶束包载有分化诱导剂，所述分化诱导剂选自全反式维甲酸、1,3-顺式维甲酸、9-顺式维甲酸、视黄醇、视黄醛、三氧化二砷、硫化砷、骨形态发生蛋白7、骨形态发生蛋白2或vismodegib。

一种用于治疗普通肿瘤或肿瘤干样细胞相关耐药肿瘤的聚合物水凝胶，由上述多糖高分子前药和上述聚合物胶束在水中自组装形成。

本发明提供了一种双重修饰的多糖高分子前药，同时将化疗药物和低氧响应的疏水基团修饰在高分子多糖聚合物上，该多糖高分子前药可以制成包载有化疗增敏剂或分化诱导剂的组合药物释放系统。由于化疗增敏剂或分化诱导剂是通过物理作用荷载在多糖高分子前药形成的胶束载体内，当进入耐药肿瘤细胞或肿瘤干细胞时，即会释放出来，发挥降低耐药性的作用，而通过化学键共价连接在多糖分子上的化疗药物会晚于降低耐药性诱导剂的释放，从而进一步发挥疗效。

附图说明

图1为本发明中基于高分子前药的自组装组合药物载体在在耐药肿瘤细胞、肿瘤干样细胞和普通肿瘤细胞的细胞内释药过程。

图2为实施例1中聚合物胶束中药物在低氧环境的释放结果。

图3为实施例1中聚合物胶束对耐药肿瘤细胞中耐药蛋白的下调作用。

图4为实施例1中聚合物胶束对耐药肿瘤细胞存活率的抑制。

图5为实施例1中聚合物胶束负载的药物在体内的血药浓度比变化。

图6为实施例1中聚合物胶束的体内抗肿瘤活性结果。

图7为实施例2中聚合物水凝胶的照片。

图8为实施例2中聚合物水凝胶中药物在低氧环境的释放结果。

图9为实施例2中聚合物水凝胶的体内抗肿瘤活性结果。

图10为实施例3中聚合物胶束中药物在低氧和活性氧环境的释放结果。

图11为实施例3中聚合物胶束上调肿瘤干样细胞活性氧水平以及化疗药物的胞内释放结果。

图12为实施例3中聚合物胶束对肿瘤干样细胞中干性相关蛋白的抑制作用。

图13为实施例3中聚合物胶束对肿瘤干样细胞存活率的抑制结果。

图14为实施例3中聚合物胶束的体内药动学考察及血药浓度比变化。

图15为实施例3中聚合物胶束对富含肿瘤干样细胞肿瘤生长的抑制结果。

图16为实施例4中聚合物水凝胶中药物在低氧和活性氧环境的释放结果。

图17为实施例4聚合物水凝胶对富含肿瘤干样细胞肿瘤生长的抑制结果。

具体实施方式

本发明设计并合成了一类多糖高分子前药，并利用该多糖高分子前药构建得到了共载降低耐药性诱导剂(化疗增敏剂或分化诱导剂)和化疗药物的组合药物递送系统，该递送系统可以在耐药肿瘤细胞或/和肿瘤干样细胞中逐级、依次释放两种药物，以解决两种药物联合作用效果不佳的技术问题。

在本发明中，肿瘤干样细胞相关耐药肿瘤是指肿瘤组织中富含未分化/低分化的肿瘤干样细胞，从而导致肿瘤组织具有高耐药性。

本发明中的多糖高分子前药，包括高分子多糖聚合物，在高分子多糖聚合物上修饰有化疗药物和低氧响应性疏水基团，所述化疗药物和低氧响应性疏水基团分别通过酰胺键或酯键与高分子多糖聚合物连接；所述高分子多糖聚合物选自透明质酸、肝素或羧基葡聚糖；所述化疗药物选自喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春地辛、阿糖胞苷、吉西他滨、安西他滨、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、阿霉素、表阿霉素、阿柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、紫杉醇、多西紫杉醇、尼莫司汀、替尼泊苷、依托泊苷、氨鲁米特或美法仑；所述低氧响应性疏水基团为2-硝基咪唑基团或偶氮苯基团。

如图1中a所示，由于多糖高分子前药具有两亲性，可在水中自组装形成聚合物胶束，并包埋化疗增敏剂，形成用于治疗耐药肿瘤的组合药物递送载体。该组合药物递送载体可维持化疗增敏剂与化疗药物在肿瘤组织中的协同药物比。在肿瘤组织低氧微环境中，多糖高分子前药中的低氧响应性疏水基团可发生结构变化，由原来的疏水结构转变为亲水结构，使胶束中的疏水作用力降低，导致胶束解离，其中包埋的化学增敏剂快速释放。由于化疗药物是通过酯键或酰胺键共价连接在高分子多糖聚合物上，其释放依赖于耐药细胞中的酯酶或酰胺酶对共价键的水解。因此，物理包埋于胶束中的化疗增敏剂在低氧下的释放速率远高于共价偶联的化疗药物的释放速率。在耐药肿瘤细胞中，先释放的化学增敏剂可降低细胞的耐药性，后释放的化疗药物在耐药性显著下调后杀死肿瘤细胞，实现大幅提高两药的协同效率。

在本发明中，上述聚合物胶束的制备方法为：将化疗增敏剂溶于有机溶剂得到有机相、多糖高分子前药溶于水得到水相，然后将两相共混后超声乳化，结束后采用真空减压除去有机溶剂，再过水系滤膜得到聚合物胶束，即为用于治疗耐药肿瘤的组合药物递送载体。

进一步地，所述化疗增敏剂选自戈洛帕米、奎尼丁、维拉帕米、氯丙嗪、环孢菌素a、利血平、地高辛、胺碘酮、黄体酮、木黄酮、他莫昔芬、非洛地平、硝苯地平、红霉素、氟芬那酸、地尔硫卓、伐司朴达、比立考达、依克立达、唑喹达、洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、姜黄素、人参皂苷、艾曲波帕、烟曲霉毒素c、拉帕替尼、新生霉素、柳氮磺胺吡啶、非布索坦、ym-155、llp-3、venetoclax、navitoclax、obatoclaxmesylate、abt-737、bm-1074、marinopyrrolea。

另外，为了进一步提高药物在高耐药性肿瘤组织中的分布，实现肿瘤原位给药，还可将上述组合药物递送载体与高浓度的多糖高分子前药在水中进一步组装形成组合药物水凝胶载体。具体制备方法为：将组合药物递送载体加入到高浓度的多糖高分子前药水溶液中，涡旋后静置即得。

另一方面，针对强耐药性的肿瘤细胞-肿瘤干样细胞，本发明进一步对前述多糖高分子前药进行了结构衍生，具体是将化疗药物通过活性氧响应性连接臂与高分子多糖聚合物共价连接得到多糖高分子前药。所述活性氧响应性连接臂选自草酸酯或酮缩硫醇。

如图1中b所示，该多糖高分子前药也可自组装形成胶束，并荷载分化诱导剂，得到组合药物递送载体。特别地，在低氧的肿瘤干样细胞中，该组合药物递送载体可响应性的快速释放物理包埋的分化诱导剂，而由于肿瘤干样细胞具有强活性氧清除能力，其中活性氧水平较低，化疗药物稳定修饰于多糖高分子聚合物上，在肿瘤干样细胞中不释放。先释放的分化诱导剂诱导肿瘤干样细胞分化，降低肿瘤干样细胞的耐药性，增强其对化疗药物的敏感性，同时在分化过程中，由于生物合成增加，胞内的活性氧水平大幅升高，多糖高分子前药中活性氧响应性连接臂发生降解，化疗药物从多糖高分子聚合物上脱离，在分化后的肿瘤细胞中释放。这种基于肿瘤干样细胞未分化和分化过程中生理信号变化，调控分化诱导剂和化疗药物的适时先后释放，大大提高了化疗药物对肿瘤干样细胞的杀伤力。同时，在非干样的普通肿瘤细胞中，由于胞内活性氧水平较高，因此多糖高分子前药会迅速降解，释放化疗药物，杀死肿瘤细胞。该组合药物递送载体可趋同化的同时清除肿瘤干样细胞和普通肿瘤细胞，克服肿瘤异质性以及干性相关的肿瘤耐药。

在本发明中，上述聚合物胶束的制备方法为：将分化诱导剂溶于有机溶剂得到有机相、多糖高分子前药溶于水得到水相，然后将两相共混后超声乳化，结束后采用真空减压除去有机溶剂，再过水系滤膜得到聚合物胶束，即为组合药物递送载体。

进一步地，所述分化诱导剂选自全反式维甲酸、1,3-顺式维甲酸、9-顺式维甲酸、视黄醇、视黄醛、三氧化二砷、硫化砷、骨形态发生蛋白7、骨形态发生蛋白2、vismodegib。

另外，为了进一步提高药物在富含肿瘤干样细胞的肿瘤组织中的分布，实现肿瘤原位给药，还可将上述组合药物递送载体与高浓度的多糖高分子前药在水中进一步组装形成组合药物水凝胶载体。具体制备方法为：将组合药物递送载体加入到高浓度的多糖高分子前药水溶液中，涡旋后静置即得。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

用于耐药肿瘤治疗的聚合物胶束

一、多糖高分子前药的合成

将胆固醇氯甲酸酯(502mg)和三乙胺(120mg)加入到20ml的二氯甲烷中搅拌，继续加入对氨基偶氮苯(368mg)反应12h，反应完成后收集反应液，真空旋干，产物用硅胶柱层析纯化分离，得到胆固醇甲酰对氨基偶氮苯。取2-硝基咪唑(302mg)和碳酸钾(557mg)加入到10ml的n,n-二甲基甲酰胺中搅拌，再加入6-(boc-氨基)溴己烷(782mg)，反应加热到80℃并回流反应4h，反应完成后，70℃旋干，得到棕色固体。萃取干燥后，得到产物1-(6-bo-氨己基)-2-硝基咪唑。取1-(6-boc-氨己基)-2-硝基咪唑(493mg)溶解于10ml的1.25m盐酸-甲醇溶液，室温下搅拌反应过夜以脱去boc保护基。反应完成后，将反应液在40℃旋干，得到6-(2-硝基咪唑基)己胺。

将透明质酸(ha,90kda,196mg)、肝素钠(hp,15kda,150mg)、羧基葡聚糖(cdt,15kda,137mg)分别溶解于10ml的水，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci)(190mg)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(143mg)，室温下搅拌0.5h后，加入事先溶于5ml二甲亚砜(dmso)的胆固醇甲酰对氨基偶氮苯(197mg)，在室温下继续搅拌反应24h。接着将反应液装入透析袋(3.5kda)在水中透析24h，收集透析袋中液体并冻干，得到胆固醇偶氮苯基团修饰的多糖衍生物c-ha、c-hp、c-cdt。

将ha(90kda,205mg)、hp(15kda,144mg)、cdt(15kda,125mg)分别溶解于25ml的水，再加入edci(571mg)和nhs(571mg)，室温下搅拌0.5h后，加入6-(2-硝基咪唑基)己胺(155mg)，在室温下继续搅拌反应24h。接着将反应液装入透析袋(14kda)在水中透析24h，收集透析袋中液体并冻干，得到2-硝基咪唑基团修饰的多糖衍生物n-ha、n-hp、n-cdt。

将适量的c-ha、c-hp、c-cdt、n-ha、n-hp、n-cdt分别溶解于25ml的水中，再加入edci和nhs，室温下搅拌0.5h后，再分别加入喜树碱(cpt)、10-羟基喜树碱(hcpt)、7-乙基-10-羟基喜树碱(sn-38)、长春碱(vlb)、阿霉素(dox)、表阿霉素(epi)、米托蒽醌(mit)、紫杉醇(ptx)、多西紫杉醇(dtx)，在室温下继续搅拌反应24h。接着将反应液装入透析袋在水中透析24h，收集透析袋中液体并冻干，得到多糖高分子前药c-ha-cpt、c-ha-hcpt、c-ha-sn-38、n-ha-vlb、c-hp-dox、n-hp-epi、c-cdt-mit、n-cdt-ptx、n-cdt-dtx。

二、荷载组合药物的聚合物胶束的制备

采用单乳化法制备荷载组合药物的聚合物胶束。将环孢菌素a(csa)、奎尼丁(qd)、利血平(rsp)、木黄酮(gst)、他莫昔芬(tam)、硝苯地平(ndp)、地尔硫卓(dtz)、姜黄素(cur)、烟曲霉毒素c(ftc)、ym-155(ym)、abt-737(abt)溶于1ml的氯仿得到有机相。将多糖高分子前药c-ha-cpt、c-ha-hcpt、c-ha-sn-38、n-ha-vlb、c-hp-dox、n-hp-epi、c-cdt-mit、n-cdt-ptx、n-cdt-dtx溶解于5ml的水得到水相。将水相置于冰水浴中，并在探头超声下逐滴滴加有机相至水相，滴加完成后继续超声20min。将得到的乳液在40℃下抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，再过220nm滤膜得到荷载组合药物的聚合物胶束。采用粒径仪测定各组胶束的粒径和多分散系数，结果如表1所示。

表1荷载组合药物的聚合物胶束的粒径与多分散系数

三、药物释放

将化疗药物(cpt或mit)与化疗增敏剂(csa或ftc)通过单乳化法共载入低氧响应基团修饰的多糖高分子胶束，得到物理共载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt/ha和ftc/mit/cdt)。将2ml的荷载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt-ha、ftc/mit-cdt、ym/ptx-cdt和abt/dtx-cdt)以及物理共载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt/ha和ftc/mit/cdt)装入透析袋中，将透析袋置于60ml的透析介质中(含2％tween80的pbs)。加入终浓度为100μm的nadph和10mg/ml的肝微粒体，并通氮气置换空气模拟低氧微环境。在搅拌下，不同时间点取200μl的透析介质，采用高效液相色谱法测定药物浓度，并计算药物释放量，绘制药物释放曲线。结果如图2所示，在低氧环境下，荷载组合药物的聚合物胶束中物理包埋的化疗增敏剂释放速率显著高于化学偶联的化疗药物的释放速率。证明了聚合物胶束能够响应低氧微环境快速释放化疗增敏剂，实现了荷载的组合药物化疗增敏剂与化疗药物的差速(先后)释放。

四、荷载组合药物的聚合物胶束下调耐药相关蛋白的评价

将人源乳腺癌耐药细胞(mcf-7/mdr)细胞以1×10⁵个/孔的密度接种于6孔培养板中，分别加入荷载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt-ha、ftc/mit-cdt、ym/ptx-cdt和abt/dtx-cdt)和物理共载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt/ha、ftc/mit/cdt、ym/ptx/cdt和abt/dtx/cdt)培养48h。采用荧光抗体免疫染色法对处理后的耐药细胞的相关耐药蛋白进行荧光标记，采用流式细胞分析仪检测荧光标记的蛋白水平。结果如图3所示，相比未处理的对照组，经荷载化疗增敏剂的聚合物胶束处理后的耐药细胞中耐药相关蛋白(p-gp、abcg2、survivin、bcl-2蛋白)都显著下调。证明了荷载组合药物的聚合物胶束能够显著降低耐药肿瘤细胞的耐药性。

五、荷载组合药物的聚合物胶束对耐药肿瘤细胞的体外细胞毒评价

将戈洛帕米(gal)、地高辛(dig)、胺碘酮(btl)、非洛地平(fdp)、红霉素(em)、llp-3(llp)、bm-1074(bm)作为化疗增敏剂按第二部分所述方法与多糖高分子前药c-ha-cpt制备得到荷载组合药物的聚合物胶束(gal/cpt-ha、dig/cpt-ha、btl/cpt-ha、fdp/cpt-ha、em/cpt-ha、llp/cpt-ha和bm/cpt-ha)。将mcf-7/mdr细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔培养板中，加入荷载组合药物的聚合物胶束和游离组合药物(化疗增敏剂+化疗药物)，或不同浓度的荷载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt-ha和ftc/mit-cdt)和物理共载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt/ha和ftc/mit/cdt)。在低氧培养箱中培养96h之后，采用cck8检测法测定细胞活力，计算细胞存活率。结果如图4所示，相比游离组合药物以及物理共载组合药物的聚合物胶束，荷载组合药物的聚合物胶束对耐药肿瘤细胞具有更强的细胞毒性。证明了荷载组合药物的聚合物胶束能够维持两药的协同比例，同时在耐药肿瘤细胞内逐级释放两药，增强了两药对耐药肿瘤细胞的协同杀伤效率。

六、荷载组合药物的聚合物胶束的药动学考察

将荷载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt-ha和ftc/mit-cdt)和游离组合药物(csa+cpt和ftc+mit)尾静脉注射入实验大鼠体内，分别在不同时间点取血，离心取血浆，通过有机溶剂萃取后测定血药浓度。结果如图5所示，相比游离药物混合物，聚合物胶束能长时间维持组合药物的剂量比。

七、荷载组合药物的聚合物胶束的体内抗肿瘤活性评价

将mcf-7/mdr细胞重悬于pbs和matrigel基质胶(1:1)混合溶液中，以1×10⁷个/只的数量接种于小鼠(nu/nu,雌性,6周龄,20g)乳腺脂肪垫，构建耐药肿瘤小鼠模型。将荷瘤小鼠分组，分别尾静脉注射生理盐水(saline)、游离组合药物(csa+cpt和ftc+mit)、物理共载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt/ha和ftc/mit/cdt)和荷载组合药物的聚合物胶束(csa/cpt-ha和ftc/mit-cdt)，每隔两天给药一次，给药四次。测量肿瘤的长径与短径，计算肿瘤体积(体积＝长径×短径×短径/2)，监测肿瘤体积变化。结果如图6所示，相较于游离组合药物，组合药物胶束具有更强的抑制耐药肿瘤生长的作用，证明了共载组合药物化疗增敏剂和化疗药物的胶束维持了两药的药物比，提高了药物协同抗耐药肿瘤的作用。而具有适时逐级释药功能的组合药物胶束的抗肿瘤作用强于没有逐级释药特性的物理共载组合药物胶束，证明了在维持药物协同比例下，具有逐级释药特性的胶束先释放化疗增敏剂，降低耐药肿瘤细胞对化疗药物的抗性，再释放化疗药物，显著增强两药的协同抑制耐药肿瘤生长的作用。

实施例2

用于耐药肿瘤治疗的聚合物水凝胶

一、多糖高分子前药的合成

将c-ha、c-cdt、n-ha、n-hp、n-cdt分别溶解于25ml的水中，再加入edci和nhs，室温下搅拌0.5h后，再分别加入阿糖胞苷(cc)、拓扑替康(tpt)、甲氨蝶呤(mtx)、尼莫司汀(anu)、依托泊苷(vp)，在室温下继续搅拌反应24h。接着将反应液装入透析袋置于水中透析24h，收集透析袋中液体并冻干，得到多糖高分子前药c-ha-cc、c-cdt-tpt、n-ha-mtx、n-hp-anu、n-cdt-vp。

二、荷载组合药物的聚合物水凝胶的制备

将维拉帕米(ver)、氯丙嗪(cpz)、人参皂苷rg1(gsg)、人参皂苷rb1(gsb)按实施例1中方法，与多糖高分子前药c-ha-cc、c-cdt-tpt、n-ha-mtx、n-hp-anu、n-cdt-vp制备成荷载组合药物的聚合物胶束。取1ml胶束与对应的多糖高分子前药溶液共混，涡旋混匀后，在常温下静置即可形成荷载组合药物的聚合物水凝胶vep/cc-ha、vep/tpt-cdt、cpz/mtx-ha、gsg/anu-hp或gsb/vp-cdt。成胶效果如图7所示，从左到右依次分别是水、vep/cc-ha、vep/tpt-cdt、cpz/mtx-ha、gsg/anu-hp和gsb/vp-cdt，发现组装体系可形成水凝胶。

三、药物释放

将1ml的荷载组合药物的聚合物水凝胶(vep/cc-ha和cpz/mtx-ha)和物理共载组合药物的聚合物水凝胶(vep/cc/ha和cpz/mtx/ha)置于烧瓶中，加入20ml的透析介质(含2％tween80的pbs)中，并加入终浓度为100μm的nadph和10mg/ml的肝微粒体，通氮气置换空气，模拟低氧的微环境。在搅拌下，不同时间点取200μl的透析介质，采用高效液相色谱法测定药物浓度，并计算药物释放量，绘制药物释放曲线。结果如图8所示，在低氧环境下，荷载组合药物的聚合物水凝胶中物理包埋的化疗增敏剂释放速率显著高于化学偶联的化疗药物的释放速率。证明了聚合物水凝胶能够响应低氧微环境快速释放化疗增敏剂，实现了荷载的组合药物化疗增敏剂与化疗药物的差速(先后)释放。

四、荷载组合药物的聚合物水凝胶的体内抗肿瘤活性评价

将荷耐药乳腺癌(mcf-7/mdr)肿瘤小鼠分组，分别在肿瘤原位注射生理盐水(saline)、游离组合药物(vep+cc和cpz+mtx)、物理共载组合药物的聚合物水凝胶(vep/cc/ha和cpz/mtx/ha)和荷载组合药物的聚合物水凝胶(vep/cc-ha和cpz/mtx-ha)，给药一次，监测肿瘤体积变化。结果如图9所示，具有适时逐级释药功能的组合药物水凝胶的抗肿瘤作用强于没有逐级释药特性的物理共载组合药物水凝胶和游离组合药物，证明了在维持药物协同比例下，具有逐级释药特性的水凝胶先释放化疗增敏剂，降低耐药肿瘤细胞对化疗药物的抗性，再释放化疗药物，可以显著增强两药协同抑制耐药肿瘤生长的作用。

实施例3

用于肿瘤干样细胞相关耐药肿瘤治疗的聚合物胶束

一、多糖高分子前药的合成

将草酰氯(632mg)溶于5ml的无水二氯甲烷中，并置于冰水浴上搅拌，再将2-叠氮基乙醇(87.2mg)溶于5ml的无水二氯甲烷并缓慢滴加至反应液中，继续在冰水浴上搅拌反应4h。反应完成后，旋干得到浅棕色的油状物。再将得到的油状物重新溶解于20ml的无水二氯甲烷，并置于冰水浴上搅拌，接着将喜树碱(cpt)与三乙胺(110mg)和4-二甲氨基吡啶(25.6mg)溶于10ml的无水二氯甲烷，缓慢滴加至反应液中，继续在冰水浴上反应2h。反应液经过萃取后，旋干得到粗产物。最后经硅胶柱层析纯化得到活性氧响应草酸酯偶联cpt前药分子。将适量的n-ha分别溶于25ml的水中，再加入edci和nhs，室温下搅拌0.5h后，加入氨基-二苯并环辛炔(125mg)，在室温下继续搅拌反应24h。接着将反应液装入透析袋(14kda)在水中透析48h，收集透析袋中液体并冻干，得到产物。再将产物和草酸酯偶联cpt前药分子溶于50ml的dmso和水的混合溶液(dmso:h2o＝4:1,v:v)中，室温下搅拌反应24h。之后将反应液装入透析袋在水中透析48h，收集透析袋中液体并冻干，得到多糖高分子前药n-ha-oxa-cpt。

取无水丙酮和无水3-巯基丙酸在通入干燥的氯化氢室温搅拌4h，然后在冰盐混合物中停止反应，实现结晶。将产物洗涤，用正己烷和冷水过滤，真空干燥获得产物酮缩硫醇二丙酸。将酮缩硫醇二丙酸溶解于无水dmf中，在氮气中加入nhs和edci到上述混合物中。搅拌2h后，滴加cpt和阿霉素(dox)，进一步反应24小时后得旋干到粗产物。经硅胶柱层析纯化得到活性氧响应酮缩硫醇前药分子。将活性氧响应酮缩硫醇前药分子溶解于25ml的水中，加入edci和nhs，室温下搅拌0.5h后，将适量的n-ha、n-cdt分别溶解于25ml的水中，在室温下继续搅拌反应24h。之后将反应液装入透析袋(14kda)在水中透析48h，收集透析袋中液体并冻干，得到多糖高分子前药n-ha-tkt-dox和n-cdt-tkt-cpt。

二、荷载组合药物的聚合物胶束的制备

采用单乳化法制备荷载组合药物的聚合物胶束。将全反式维甲酸(atra)、1,3-顺式维甲酸(cra)、9-顺式维甲酸(tra)、视黄醇(rto)、视黄醛(rte)、vismodegib(vmg)与多糖高分子前药中。将3mg的atra、cra、tra、rto、rte、vmg分别溶于1ml的氯仿得到有机相，将多糖前药分子n-ha-oxa-cpt、n-ha-tkt-dox和n-cdt-tkt-cpt溶解于5ml的水得到水相。将水相置于冰水浴中，并在探头超声下超声逐滴滴加有机相至水相，滴加完成后继续超声20min。将得到的乳液在40℃下抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，再过220nm滤膜，得到荷载组合药物的聚合物胶束。采用粒径仪测定各组胶束的粒径和多分散系数，结果如表2所示。

表2荷载组合药物的聚合物胶束的粒径与多分散系数

三、药物释放

将2ml的荷载组合药物的聚合物胶束(atra/cpt-ha、cra/cpt-ha、rto/dox-ha和rte/cpt-cdt)装入透析袋置于60ml的透析介质中(含2％tween80的pbs)。加入终浓度为100μm的nadph和10mg/ml的肝微粒体，并通入氮气置换空气，模拟低氧的微环境。48h后，再在该体系中，加入终浓度为100μm的过氧化氢模拟高活性氧水平的环境，持续48h。在搅拌下，不同时间点取200μl的透析介质，采用高效液相色谱法测定药物浓度，并计算药物释放量，绘制药物释放曲线。结果如图10所示，在低氧环境下，荷载组合药物的聚合物胶束中物理包埋的分化诱导剂释放速率显著高于化学偶联的化疗药物的释放速率。而在后续双氧水环境下，胶束会发生响应性的快速释放化疗药物。两种药物的释放分别与两种不同的刺激相关联，呈现明显的逐级释放行为。证明了聚合物胶束能够响应低氧微环境快速释放分化诱导剂，而在活性氧微环境中响应性释放化疗药物，实现了荷载的组合药物分化诱导剂与化疗药物的差速(逐级)释放。

四、荷载组合药物的聚合物胶束上调肿瘤干样细胞中活性氧水平及化疗药物胞内释放评价

采用侧群细胞流式分选技术得到mcf-7肿瘤干样细胞，将其以1×10⁵个/孔的密度接种于6孔低粘附培养板中，分别加入荷载组合药物的聚合物胶束(atra/cpt-ha)和单载化疗药物的聚合物胶束(cpt-ha)。在低氧条件下孵育48h后，采用dcfh-da染色法，对细胞的胞内活性氧进行荧光标记，采用流式细胞仪测定活性氧浓度。采用高效液相色谱定量检测的胞内cpt，考察cpt胞内释放。结果如图11所示，经荷载组合药物的聚合物胶束处理后，肿瘤干样细胞中活性氧水平显著升高。证明了荷载组合药物的聚合物胶束在低氧下能够在肿瘤干样细胞内释放分化诱导剂atra，释放后的atra诱导肿瘤干样细胞分化，分化细胞的胞内活性氧浓度大幅升高。胞内活性氧的升高触发化疗药物cpt的响应性释放。

五、荷载组合药物的聚合物胶束下调肿瘤干样细胞中干性相关蛋白

采用无血清悬浮培养富集肿瘤干样细胞法获得人源三阴性乳腺癌hcc70、hcc1937和sum-159pt肿瘤干样细胞。将mcf-7、hcc70、hcc1937和sum-159pt肿瘤干样细胞以1×10⁵个/孔的密度接种于6孔低粘附培养板中，分别加入不同的荷载组合药物的聚合物胶束(atra/cpt-ha和rto/dox-ha)、对应的单载分化诱导剂和化疗药物的聚合物胶束(atra/ha和cpt-ha)和物理共载组合药物的聚合物胶束(atra/cpt/ha)。在低氧条件下孵育48h后，采用免疫荧光技术对细胞内的干性相关蛋白进行免疫荧光标记，采用流式细胞仪测定干性相关蛋白表达量。结果如图12所示，相比对照组，荷载组合药物的聚合物胶束能够显著降低肿瘤干样细胞中干性相关蛋白oct-4、sox-2、nanog和abcg2的表达，证明了聚合物胶束在低氧下响应性释放分化诱导剂，诱导肿瘤干样细胞分化，显著下调胞内干性相关蛋白表达，降低干性。

六、荷载组合药物的聚合物胶束对肿瘤干样细胞的体外细胞毒评价

将人源乳腺癌mcf-7、hcc70、hcc1937和sum-159pt肿瘤干样细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔低粘附培养板中，分别加入荷载组合药物的聚合物胶束(atra/cpt-ha)、对应的单载分化诱导剂和化疗药物的聚合物胶束(atra/ha和cpt-ha)和物理共载组合药物的聚合物胶束(atra/cpt/ha)。在低氧条件下孵育96h后，采用cck8检测法测定细胞活力，计算细胞存活率。结果如图13所示，相比游离组合药物和其他对照组胶束，具有适时逐级释药特性的荷载组合药物的聚合物胶束对肿瘤干样细胞具有最强的细胞毒性。证明了荷载组合药物的聚合物胶束能够维持两药的协同比例，并在肿瘤干样细胞内逐级释放两药，增强了两药对肿瘤干样细胞的协同杀伤效率。

七、荷载组合药物的聚合物胶束的药动学考察

将荷载组合药物的聚合物胶束(atra/cpt-ha)和游离组合药物(atra+cpt)尾静脉注射入实验大鼠体内，分别在不同时间点取血，离心取血浆，通过有机溶剂萃取后测定血药浓度。结果如图14所示，相比游离药物混合物，聚合物胶束能显著延长atra和cpt的血浆半衰期，并能长时间维持两药剂量比。

九、荷载组合药物的聚合物胶束的体内抗肿瘤活性评价

将mcf-7、hcc70和sum-159pt肿瘤干样细胞重悬于pbs和matrigel基质胶(1:1)混合溶液中，以1×10⁶个/只的数量接种于小鼠(nod/scid,雌性,6周龄,20g)乳腺脂肪垫，构建富含肿瘤干样细胞的小鼠模型。将荷瘤小鼠分组，分别尾静脉注射生理盐水(saline)、单载分化诱导剂和化疗药物的聚合物胶束(atra/ha和cpt-ha)、物理共载组合药物的聚合物胶束(atra/cpt/ha)和荷载组合药物的聚合物胶束(atra/cpt-ha)，每隔两天给药一次，给药四次。测量肿瘤的长径与短径，计算肿瘤体积，监测肿瘤体积变化。结果如图15所示，相较于对照聚合物胶束，具有适时逐级释药功能的组合药物胶束的抗肿瘤作用显著增强，证明了在维持药物协同比例下，具有逐级释药特性的胶束先释放分化诱导剂，降低肿瘤干样细胞对化疗药物的抗性，再释放化疗药物，显著增强两药协同抑制富含干样细胞肿瘤生长的作用。

实施例4

用于肿瘤干样细胞相关耐药肿瘤治疗的聚合物水凝胶

一、荷载组合药物的聚合物水凝胶的制备

以组装法制备荷载组合药物的聚合物水凝。将三氧化二砷(aso)、硫化砷(ass)、骨形态发生蛋白7(bmp7)、骨形态发生蛋白2(bmp2)按实施例3中相关方法，与多糖高分子前药n-ha-oxa-cpt和n-cdt-tkt-dox制备成荷载组合药物的聚合物胶束。取1ml胶束与对应多糖高分子前药溶液共混，涡旋混匀后，在常温下静置即可形成荷载分化诱导剂的荷载组合药物的聚合物水凝胶aso/cpt-ha、ass/dox-cdt、bmp7/cpt-ha和bmp2/dox-cdt，每组水凝胶均性状良好且稳定。

二、药物释放

将1ml的荷载组合药物的聚合物水凝胶(aso/cpt-ha、ass/dox-cdt、bmp7/cpt-ha和bmp2/dox-cdt)置于烧瓶中，并加入60ml的透析介质中(含2％tween80的pbs)。加入终浓度为100μm的nadph和10mg/ml的肝微粒体，通入氮气置换空气，模拟低氧的微环境，48h后，再在该体系中，加入终浓度为100μm的过氧化氢模拟高活性氧水平的环境，持续48h。在搅拌下，不同时间点取200μl的透析介质，采用高效液相色谱法测定药物浓度，并计算药物释放量，绘制药物释放曲线。结果如图16所示，在低氧环境下，荷载组合药物的聚合物水凝胶中物理包埋的分化诱导剂释放速率显著高于化学偶联的化疗药物的释放速率。而在后续双氧水环境下，水凝胶则会发生响应较快地释放化疗药物。两种药物的释放分别与两种不同的刺激相关联，呈现明显的逐级释放现象。证明了聚合物水凝胶能够响应低氧微环境快速释放分化诱导剂，而在活性氧微环境中快速释放化疗药物，实现了荷载的组合药物分化诱导剂与化疗药物的差速(逐级)释放。

三、荷载组合药物的聚合物水凝胶的体内抗肿瘤活性评价

将荷mcf-7肿瘤干样细胞细胞小鼠进行分组，分别在肿瘤原位注射生理盐水(saline)、游离组合药物(aso+cpt和ass+dox)、物理共载组合药物的聚合物水凝胶(aso/cpt/ha和ass/dox/cdt)和荷载组合药物的聚合物水凝胶(aso/cpt-ha和ass/dox-cdt)，给药一次，监测肿瘤体积变化。结果如图17所示，具有适时逐级释药功能的组合药物水凝胶的抗肿瘤作用强于没有逐级释药特性的物理共载组合药物水凝胶，证明了在维持药物协同比例下，具有逐级释药特性的水凝胶先释放分化诱导剂，降低肿瘤干样细胞对化疗药物的抗性，再释放化疗药物，可以显著增强两药协同抑制富含干样细胞肿瘤生长的作用。