本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂及其制备方法。
背景技术：
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，流行病学和分子生物学资料表明，人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)感染与宫颈癌有着十分密切的关系。几乎所有流行病学资料结合实验室的数据都强有力地支持高危型hpv持续感染是子宫宫颈癌发生的必须条件：
(1)99.7％的子宫颈癌中都能发现高危型hpv感染，高度病变(hsil)中约97％为阳性，低度病变(lsil)中的阳性率达61.4％；
(2)实验动物和组织标本研究表明hpv-dna的滴度与子宫颈癌前病变程度成正相关；
(3)hpv感染与子宫颈癌的发生有时序关系，从感染开始至发展为子宫颈癌的时间间隔10-15年，符合生物学致病机理。
宫颈癌的筛查可以降低宫颈癌发生的危险，却不能阻止hpv的感染。目前对hpv感染尚无确切治疗方法，如何快速将hpv阳性患者转阴是阻断hpv感染，预防宫颈癌的重要手段。
技术实现要素：
发明目的：针对上述现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂及其制备方法，对hpv病毒具有高效的抑制作用。尤其是通过体外进行自然杀伤细胞(nk细胞)大量培养扩增过程中，获得含有高浓度细胞因子的营养液制备而成的凝胶状制剂，对预防和治疗hpv病毒感染或阴道及宫颈炎症患者具有明显的临床效果。
技术方案：一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂，以重量份计，包括：
透明质酸钠0.5～1.0份、羟丙基甲基纤维素10～20份、苦参碱1～5份、甘油5～15份、芦荟素1～5份、玫瑰精油0.1～0.5份、百部提取物1～5份、藏红花1～5份、黄连1～10份、nk细胞衍生液20～30份及超纯水50～70份。
进一步地，包括透明质酸钠0.8份、羟丙基甲基纤维素15份、苦参碱2份、甘油10份、芦荟素3份、玫瑰精油0.3份、百部提取物2、藏红花3份、黄连4份、nk细胞衍生液25份及超纯水50份。
nk细胞衍生液为本发明的主要作用成分，其来源于人nk细胞体外培养大量扩增获得。
一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)、配置第一组份：
(11)、将70％～90％配方量的超纯水通过水浴加热的方式升温到90℃以上；
(12)、向超纯水中分别加入配方量的羟丙基甲基纤维素、甘油、透明质酸钠，搅拌充分溶解后，自然冷却至50～60℃，然后保持温度不变在水浴环境下搅拌2～4小时，充分混合均匀，高温高压灭菌，自然冷却过夜后得到第一组分；
(2)、制备nk细胞衍生液：
(21)、采集适量的健康新生儿脐带中脐带血，然后将脐带血转移离心管中离心分离，得到上层血浆和下层血细胞，其中：
上层血浆吸取出来做灭活处理；
下层血细胞用生理盐水稀释后转移到含淋巴细胞分离液的离心管中离心，离心后分四层:
上层为生理盐水与血浆混合液；
第二层为淋巴细胞；
第三层为分离液；
第四层为红细胞；
(22)、收集第二层淋巴细胞，离心后加入含诱导因子的淋巴细胞培养基重悬并接种至培养瓶中，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中，每隔1～2天补一次淋巴细胞培养基直到第14天；
(23)、第17～20天，将细胞悬液转移至离心管中离心，收集上清液，然后将上清液转移至一次性无菌平皿中，采用低温冷冻干燥法，对其进行冷冻干燥处理24小时，获得的浓缩液，即得到nk细胞衍生液。
(3)、配置第二组份：
将配方量的苦参碱、芦荟素、玫瑰精油、百部提取物、藏红花、黄连溶解于剩余配方量的超纯水得到混合液，然后通过水浴加热的方式将混合液升温至40～50℃，充分溶解，过滤除菌后即得到第二组份；
(4)、在整体b级局部a级的实验室环境下，将第一组份、配方量的nk细胞衍生液和第二组份进行充分搅拌混匀，即得到预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂。
进一步地，步骤(22)中的诱导因子包括il-2、il-15、cd3单抗及cd52单抗。
进一步地，淋巴细胞培养基购自美国lonza公司，无血清培养基x-vivo15。
进一步地，步骤(3)中的苦参碱、芦荟素、玫瑰精油、百部提取物、藏红花、黄连均采用纳米级粉末料。
各组份的作用：
羟丙基甲基纤维素是一种半合成的、不活跃的、黏弹性的聚合物，常于眼科用作润滑剂，又或在口服药物中充当辅料或赋型剂；在本发明中主要起到增稠、润滑及粘结剂的作用。
透明质酸钠是人体内一种固有的成分,是一种葡聚糖醛酸，没有种属特异性，它广泛存在于胎盘，羊水，晶状体，关节软骨，皮肤真皮层等组织；器官中它分布在细胞质,细胞间质中，对其中所含的细胞和细胞器官本身起润滑与滋养作用。
甘油是一种无色、无臭、有甜味、澄明的浓稠液体，是一种常用的润滑剂。有隔绝空气和防止水分蒸发的作用，搽于手和面部等暴露在空气中的皮肤表面，能够使皮肤保持柔软，富有弹性，不受尘埃、气候等损害等保湿作用。
苦参碱是由豆科植物苦参的干燥根、植株、果实经乙醇等有机溶剂提取制成的。具有清热、利尿、杀虫、祛湿等功效，同时还具有抗病毒、抗肿瘤抗过敏等多种作用。
芦荟素具有抗病毒感染，促进伤口愈合复原的作用，有消炎杀菌、吸热消肿、软化皮肤、保持细胞活力的功能，凝胶多糖与愈伤酸联合还具有愈合创伤活性。
玫瑰精油能消炎杀菌、可防传染病、防发炎，防痉挛、促进细胞新陈代谢及细胞再生功能。调整女性内分泌，滋养子宫，缓解痛经，改善性冷感和更年期不适。
百部提取物是百部科植物的干燥根茎中提取的有效成分。对大部分致病菌及皮肤真菌有抑制作用。
黄连提取物含小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱、掌叶防己碱等生物碱。可治疗皮肤炎症、湿疹、愈合伤口等，有强烈的抗菌性；对胶原蛋白的生成有促进作用，有活肤作用，结合它们的抗氧化性，可用于抗衰化妆品；还有一定的抑制过敏作用，美白皮肤的作用以及良好的保湿作用。
nk细胞衍生液是由nk细胞培养中通过分离、筛选、提纯获得的含有多种细胞因子的浓缩液，利用其中的各种细胞因子旁分泌效应和免疫效应调节免疫反应，一方面促使局部炎症反应下调，减轻组织炎症损伤。一方面能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞，修复损伤部位，促进黏膜创伤愈合、提升毛细血管活性，抑制色素沉淀。
使用方法：常规消毒外阴、阴道，将本发明的生物制剂进行宫颈涂抹及灌注，静躺3～5分钟。
与现有技术相比，本发明公开的一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂及其制备方法具有的有益效果在于：
1、该生物制剂中包含多种植物提取物，对阴道无刺激，安全无副作用；
2、将羟丙基甲基纤维素携带、透明质酸钠和甘油复配成生物粘附载体携带nk细胞分泌的多效因子及多种植物提取物制成的凝胶状生物制剂，涂抹给药方便、滞留性好、作用时间长，使其抗病毒抗菌成分可迅速渗透皮肤，保护粘膜细胞不受病毒侵害；
3、充分的发挥其因子通过旁分泌效应和免疫效应调节反应，促使局部炎症反应下调，减轻组织炎症损伤，提高创口组织的再生能力。
4、在使用过程中取得了明显的抗病毒效果和妇科炎症创伤的修复效果。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
具体实施例1
一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂，以重量份计，包括：
透明质酸钠0.8份、羟丙基甲基纤维素15份、苦参碱2份、甘油10份、芦荟素3份、玫瑰精油0.3份、百部提取物2、藏红花3份、黄连4份、nk细胞衍生液25份及超纯水50份。
nk细胞衍生液为本发明的主要作用成分，其来源于人nk细胞体外培养大量扩增获得。
一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)、配置第一组份：
(11)、将80％配方量的超纯水通过水浴加热的方式升温到95℃；
(12)、向超纯水中分别加入配方量的羟丙基甲基纤维素、甘油、透明质酸钠，搅拌充分溶解后，自然冷却至55℃，然后保持温度不变在水浴环境下搅拌3小时，充分混合均匀，高温高压灭菌，自然冷却过夜后得到第一组分；
(2)、制备nk细胞衍生液：
(21)、采集适量的健康新生儿脐带中脐带血，然后将脐带血转移离心管中离心分离，得到上层血浆和下层血细胞，其中：
上层血浆吸取出来做灭活处理；
下层血细胞用生理盐水稀释后转移到含淋巴细胞分离液的离心管中离心，离心后分四层:
上层为生理盐水与血浆混合液；
第二层为淋巴细胞；
第三层为分离液；
第四层为红细胞；
(22)、收集第二层淋巴细胞，离心后加入含诱导因子的淋巴细胞培养基重悬并接种至培养瓶中，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中，每隔1.5天补一次淋巴细胞培养基直到第14天；
(23)第17～20天，将细胞悬液转移至离心管中离心，收集上清液，然后将上清液转移至一次性无菌平皿中，采用低温冷冻干燥法，对其进行冷冻干燥处理24小时，获得的浓缩液，即得到nk细胞衍生液。
(3)、配置第二组份：
将配方量的苦参碱、芦荟素、玫瑰精油、百部提取物、藏红花、黄连溶解于剩余配方量的超纯水得到混合液，然后通过水浴加热的方式将混合液升温至45℃，充分溶解，过滤除菌后即得到第二组份；
(4)、在整体b级局部a级的实验室环境下，将第一组份、配方量的nk细胞衍生液和第二组份进行充分搅拌混匀，即得到预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂。
进一步地，步骤(22)中的诱导因子包括il-2、il-15、cd3单抗及cd52单抗。
进一步地，淋巴细胞培养基购自美国lonza公司，无血清培养基x-vivo15。
进一步地，步骤(3)中的苦参碱、芦荟素、玫瑰精油、百部提取物、藏红花、黄连均采用纳米级粉末料。可提高其生物利用率，同时也能保证容液易于过滤除菌。
本实施例1制备的生物制剂在hpv感染患者中的应用
本实施例1制备的生物制剂临床上应用于10例hpv病毒感染患者，治疗过程于妇科治疗室中进行。患者截石位仰卧于治疗床上，常规消毒外阴、阴道，铺巾；干棉球搽拭消毒液，营养液冲洗宫颈、阴道及外阴；宫颈涂抹及灌注本发明生物制剂。连续按此上药流程操作7天。
一个月后疗效观察：10例hpv高危低位多型别感染中，4例低位转阴性，3例高危转阴，10例均为治疗一个月后复查；10例患者均不同程度的合并宫颈炎，宫颈糜烂、肥大，经连续7天治疗后症状明显改善，中度糜烂变轻度，轻度变光滑；合并急慢性阴道炎患者治疗1天症状改善，3天治愈；无任何症状患者治疗1次感觉阴道舒适、滋润。
综上，本实施例获得的生物制剂，无刺激性作用，呈粘稠状，生物粘附作用好，且流动性不强，涂抹及灌注阴道后，不会流失的同时又不会产生不适感，可在涂抹表面形成一层物理屏障的保护膜，维持宫颈表面或溃疡创面不被二次交叉感染，同时有效的保证了药效作用时间。由于本发明所含的独特成分nk细胞衍生液中含有大量的细胞因子，具有抑制炎症，免疫调控及促进病变部位的快速组织修复。本发明中的nk细胞衍生液是通过冷冻干燥技术进行浓缩，更是保护了nk细胞培养液中的各种活性蛋白分子的功能不至于在浓缩过程中因蛋白变性流失。
具体实施例2
一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂，以重量份计，包括：
透明质酸钠0.5份、羟丙基甲基纤维素10份、苦参碱1份、甘油5份、芦荟素1份、玫瑰精油0.1份、百部提取物1份、藏红花1份、黄连1份、nk细胞衍生液20份及超纯水55份。
nk细胞衍生液为本发明的主要作用成分，其来源于人nk细胞体外培养大量扩增获得。
一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)配置第一组份：
(11)将70％配方量的超纯水通过水浴加热的方式升温到90℃；
(12)向超纯水中分别加入配方量的羟丙基甲基纤维素、甘油、透明质酸钠，搅拌充分溶解后，自然冷却至50℃，然后保持温度不变在水浴环境下搅拌4小时，充分混合均匀，高温高压灭菌，自然冷却过夜后得到第一组分；
(2)、制备nk细胞衍生液：
(21)采集适量的健康新生儿脐带中脐带血，然后将脐带血转移离心管中离心分离，得到上层血浆和下层血细胞，其中：
上层血浆吸取出来做灭活处理；
下层血细胞用生理盐水稀释后转移到含淋巴细胞分离液的离心管中离心，离心后分四层:
上层为生理盐水与血浆混合液；
第二层为淋巴细胞；
第三层为分离液；
第四层为红细胞；
(22)、收集第二层淋巴细胞，离心后加入含诱导因子的淋巴细胞培养基重悬并接种至培养瓶中，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中，每隔1天补一次淋巴细胞培养基直到第14天；
(23)第17～20天，将细胞悬液转移至离心管中离心，收集上清液，然后将上清液转移至一次性无菌平皿中，采用低温冷冻干燥法，对其进行冷冻干燥处理24小时，获得的浓缩液，即得到nk细胞衍生液。
(3)、配置第二组份：
将配方量的苦参碱、芦荟素、玫瑰精油、百部提取物、藏红花、黄连溶解于剩余配方量的超纯水得到混合液，然后通过水浴加热的方式将混合液升温至40℃，充分溶解，过滤除菌后即得到第二组份；
(4)、在整体b级局部a级的实验室环境下，将第一组份、配方量的nk细胞衍生液和第二组份进行充分搅拌混匀，即得到预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂。
进一步地，步骤(22)中的诱导因子包括il-2、il-15、cd3单抗及cd52单抗。
进一步地，淋巴细胞培养基购自美国lonza公司，无血清培养基x-vivo15。
进一步地，步骤(3)中的苦参碱、芦荟素、玫瑰精油、百部提取物、藏红花、黄连均采用纳米级粉末料。可提高其生物利用率，同时也能保证容液易于过滤除菌。
本实施例制备的生物制剂的临床案例：
刘某，女，30岁，2020年8月5日体检发现宫颈hpv59、hpv6阳性，宫颈液基细胞学tbs检查报告：无上皮内病变或恶性病变，于2020年9月11日-2020年9月14日通过本实施例制备的生物制剂进行宫颈局部相关治疗，局部治疗四天宫颈由中度肥大变为光滑；一个月后hpv复查结果为hpv6(低危)阳,高危型hpv59转阴。
具体实施例3
一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂，以重量份计，包括：
透明质酸钠1.0份、羟丙基甲基纤维素20份、苦参碱5份、甘油15份、芦荟素5份、玫瑰精油0.5份、百部提取物5份、藏红花5份、黄连10份、nk细胞衍生液30份及超纯水70份。
nk细胞衍生液为本发明的主要作用成分，其来源于人nk细胞体外培养大量扩增获得。
一种预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)配置第一组份：
(11)将90％配方量的超纯水通过水浴加热的方式升温到90℃以上；
(12)向超纯水中分别加入配方量的羟丙基甲基纤维素、甘油、透明质酸钠，搅拌充分溶解后，自然冷却至60℃，然后保持温度不变在水浴环境下搅拌2小时，充分混合均匀，高温高压灭菌，自然冷却过夜后得到第一组分；
(2)、制备nk细胞衍生液：
(21)采集适量的健康新生儿脐带中脐带血，然后将脐带血转移离心管中离心分离，得到上层血浆和下层血细胞，其中：
上层血浆吸取出来做灭活处理；
下层血细胞用生理盐水稀释后转移到含淋巴细胞分离液的离心管中离心，离心后分四层:
上层为生理盐水与血浆混合液；
第二层为淋巴细胞；
第三层为分离液；
第四层为红细胞；
(22)、收集第二层淋巴细胞，离心后加入含诱导因子的淋巴细胞培养基重悬并接种至培养瓶中，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中，每隔2天补一次淋巴细胞培养基直到第14天；
(23)第17～20天，将细胞悬液转移至离心管中离心，收集上清液，然后将上清液转移至一次性无菌平皿中，采用低温冷冻干燥法，对其进行冷冻干燥处理24小时，获得的浓缩液，即得到nk细胞衍生液。
(3)、配置第二组份：
将配方量的苦参碱、芦荟素、玫瑰精油、百部提取物、藏红花、黄连溶解于剩余配方量的超纯水得到混合液，然后通过水浴加热的方式将混合液升温至50℃，充分溶解，过滤除菌后即得到第二组份；
(4)、在整体b级局部a级的实验室环境下，将第一组份、配方量的nk细胞衍生液和第二组份进行充分搅拌混匀，即得到预防及治疗hpv病毒感染的生物制剂。
进一步地，步骤(22)中的诱导因子包括il-2、il-15、cd3单抗及cd52单抗。
进一步地，淋巴细胞培养基购自美国lonza公司，无血清培养基x-vivo15。
进一步地，步骤(3)中的苦参碱、芦荟素、玫瑰精油、百部提取物、藏红花、黄连均采用纳米级粉末料。可提高其生物利用率，同时也能保证容液易于过滤除菌。
本实施例制备的生物制剂的临床案例：
张某，女，34岁，2019.3.28日第二次检查hpv52(高危)阳性，予重组人干扰素α2b阴道泡腾胶囊阴道上药治疗二个月，于2019.10.30日再次复查仍显示hpv52阳性，干扰素治疗无效，因而停止用药。2020年9月30日再次检查显示hpv52、hpv35高危阳性，于2020年10月10日-2020年10月16日例如本实施例制备的生物制剂进行宫颈局部相关治疗，局部治疗七天后宫颈由肥大变为光滑；一个月后hpv复查结果为hpv52高危阳型，高危型hpv35转阴。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。