一种卟啉-抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶及其制备方法和应用与流程

一种卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于有机合成和生物医学材料领域，具体涉及一种卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细菌感染是目前世界上第二大死亡原因。其造成的人员死伤以及社会资源的占用给人类社会带来了极大的困扰。近几十年来，头孢霉素、甲氧西林等抗生素的持续开发和使用在很大程度上帮助人们对抗细菌感染。但随着抗生素的过度使用买药军的种类和数量逐年激增，部分耐药性菌株逐渐演变为“超级细菌”，成为人类和动物健康的主要威胁，比如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，耐万古霉素的粪肠球菌和耐多种药物的分枝杆菌。细菌的耐药性在持续增强，而得到批准用于临床的新药数量却一直在减少。因此，开发新型的抗菌疗法正是预防以及治疗耐抗生素菌的有效途径。
3.光动力抗菌治疗是一种极具潜力的新型抗菌疗法。它基于光敏染料的使用，当该光敏染料再被适当波长的光激活后会产生可以杀死细菌的活性氧簇。该方法具有无创伤，无抗生素，低读，对细菌没有筛选性等优点而引起了科学界的广泛关注。光动力抗菌治疗的关键在于开发新型高效的光敏剂。
4.卟啉化合物及其衍生物具有特殊的刚性和分子对称性，多样化的化学修饰位点，良好的光、热和化学稳定性，可在可见光区域具有较宽的光吸收范围，较高的单线态样量子产率等优点。
5.多肽本身具有良好的生物相容性，可控的降解性能和种类多样性。利用其多肽自组装技术构建的各种功能性材料有着巨大的应用前景。其中，抗菌肽不仅具备多肽的基本性能，还兼具良好的抗菌活性。以抗菌肽作为载体，将光敏性卟啉及其衍生物链接到抗菌肽的n
‑
末端，形成的卟啉
‑
抗菌肽超分子自组装体系具有更高的细菌杀伤力和更强的光动力疗法效率等优势。


技术实现要素：

6.本申请的目的在于提供一种卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶的制备方法及应用。本申请创新性的以卟啉为治疗药物，抗菌肽作为载体，利用卟啉外围含有羧基的结构特点，与抗菌肽的n
‑
末端紧密结合，形成具有三维网状结构的卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶。抗菌肽与卟啉的协同作用可显著提升水凝胶的抗菌效力和光动力疗法效率，从而实现对表层细菌感染快速治疗的作用。
7.本发明的技术方案是：
8.一种卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
9.s1：称取一定质量的卟啉单体于酸性溶液中，制成5
‑
30mmol/l的卟啉原液；
10.s2：称取一定质量的十六烷基三甲基溴化铵ctab溶于一定量的去离子水中，加入
一定量的氢氧化钠，其中ctab与氢氧化钠的摩尔比为2.5
‑
5：1，制得ctab溶液；
11.s3：将卟啉原液加入到ctab溶液中，控制ctab与卟啉的摩尔比为10
‑
25：1，使用盐酸或氢氧化钠溶液调节ph＝7
‑
8，反应36
‑
48小时，离心干燥；
12.s4：称取一定质量的n端暴露、c端接有树脂的抗菌肽于色谱纯nn
‑
二甲基甲酰胺dmf中；
13.s5：加入一定比例的苯并三氮唑
‑
n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐hbtu，其中hbtu与抗菌肽的摩尔比为1
‑
1.5：1；
14.s6：加入一定比例的nn
‑
二异丙基乙胺diea，其中diea与抗菌肽的摩尔比为2
‑
5：1，室温下避光搅拌1
‑
2小时；
15.s7：将步骤s3产物加入到步骤s6产物中，控制卟啉与抗菌肽的摩尔比为1.5
‑
2：1，氮气保护下常温反应12
‑
24小时，得到卟啉
‑
抗菌肽树脂；
16.s8：使用色谱纯dmf反复清洗步骤s7的产物，直至上清液无色，使用甲醇冲洗产物，收集滤液，得到卟啉
‑
抗菌肽溶液；
17.s9：将卟啉
‑
抗菌肽溶液放置于
‑
20℃冰箱冷冻后，于冻干机内冻干，得到卟啉
‑
抗菌肽冻干料；
18.s10：取适量的卟啉
‑
抗菌肽冻干料于4
‑
10℃溶解于水溶液中，控制卟啉
‑
抗菌肽冻干料浓度(w/v)为8
‑
15％，升温放置成胶后，即得卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶。
19.进一步地，所述步骤s1中的卟啉单体为一种含有一个外围羧基取代基的卟啉及其衍生物单体，优选卟啉锌单体。
20.进一步地，所述步骤s1中所述酸性溶液为ph为3的盐酸或硫酸溶液。
21.进一步地，所述步骤s4中所述抗菌肽为蜜蜂抗菌肽、马加宁或buforin ii。
22.进一步地，所述步骤s10中所述的水溶液为去离子水、生理盐水或na2co3溶液，优选去离子水。
23.进一步地，所述步骤s10中水凝胶成胶温度为20
‑
37℃，优选27℃。
24.一种所述卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶的制备方法制备得到的卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶。
25.本申请还公开了一种卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶的应用，作为治疗表层细菌感染的抗菌剂。
26.有益效果
27.1、试验证明本申请提供的纳米抗菌水凝胶具有良好的材料学特性，呈现紫色半透明水凝胶状，未见明显聚集和沉淀。
28.2、实验证明本申请提供的卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶能够有效抑制细菌的繁殖和增长，对正常组织细胞没有明显抑制作用，同时还有助于增强光动力疗法的效率。
29.3、本申请的制备方法中采用具有较强光敏性的卟啉及其衍生物为原料，以抗菌能力强的抗菌肽为载体，该制备方法简单，易于操作，易于产业化实施。
30.4、本申请的卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米体系是通过卟啉及其衍生物通过外围的羧基与多肽的n
‑
末端形成共价键形成的；本申请水凝胶的形成是通过多肽间的交联作用实现的；本申请通过利用卟啉及其衍生物的光敏性和抗菌肽的抗菌活性的协同作用，显著增强水凝胶的抗菌性能，提升光动力疗法的效率。
具体实施方式
31.为了更好理解本发明的实质，以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员可根据本发明的基本思想，做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
32.实施例1
33.一种卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
34.s1：称取一定质量的卟啉单体于ph＝3的盐酸溶液中，制成15mmol/l的卟啉原液；
35.s2：称取一定质量的十六烷基三甲基溴化铵ctab溶于一定量的去离子水中，加入一定量的氢氧化钠，其中ctab与氢氧化钠的摩尔比为3:1，制得ctab溶液；
36.s3：将卟啉原液加入到ctab溶液中，控制ctab与卟啉的摩尔比为18：1，使用盐酸或氢氧化钠溶液调节ph＝7，反应36小时，离心干燥；
37.s4：称取一定质量的n端暴露、c端接有树脂的抗菌肽于色谱纯nn
‑
二甲基甲酰胺dmf中；
38.s5：加入一定比例的苯并三氮唑
‑
n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐hbtu，其中hbtu与抗菌肽的摩尔比为1：1；
39.s6：加入一定比例的nn
‑
二异丙基乙胺diea，其中diea与抗菌肽的摩尔比为3：1，室温下避光搅拌1小时；
40.s7：将步骤s3产物加入到步骤s6产物中，控制卟啉与抗菌肽的摩尔比为1.8：1，氮气保护下常温反应12小时，得到卟啉
‑
抗菌肽树脂；
41.s8：使用色谱纯dmf反复清洗步骤s7的产物，直至上清液无色，使用甲醇冲洗产物，收集滤液，得到卟啉
‑
抗菌肽溶液；
42.s9：将卟啉
‑
抗菌肽溶液放置于
‑
20℃冰箱冷冻后，于冻干机内冻干，得到卟啉
‑
抗菌肽冻干料；
43.s10：取适量的卟啉
‑
抗菌肽冻干料于4℃溶解于去离子水中，控制卟啉
‑
抗菌肽冻干料浓度(w/v)为10％，25℃下放置成胶后，即得卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶。
44.所述步骤s1中所述的卟啉单体为5
‑
(4
‑
羧基苯基)
‑
10,15,20
‑
三(4
‑
叔丁基苯基)卟啉锌。
45.所述步骤s4中所述抗菌肽为蜜蜂抗菌肽。
46.实施例2
47.一种卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
48.s1：称取一定质量的卟啉单体于ph＝3的盐酸中，制成25mmol/l的卟啉原液；
49.s2：称取一定质量的十六烷基三甲基溴化铵ctab溶于一定量的去离子水中，加入一定量的氢氧化钠，其中ctab与氢氧化钠的摩尔比为2.8：1，制得ctab溶液；
50.s3：将卟啉原液加入到ctab溶液中，控制ctab与卟啉的摩尔比为10：1，使用盐酸或氢氧化钠溶液调节ph＝7.5，反应48小时，离心干燥；
51.s4：称取一定质量的n端暴露，c端接有树脂的抗菌肽于色谱纯nn
‑
二甲基甲酰胺dmf中；
52.s5：加入一定比例的苯并三氮唑
‑
n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐hbtu，其中hbtu与抗菌肽的摩尔比为1.25：1；
53.s6：加入一定比例的nn
‑
二异丙基乙胺diea，其中diea与抗菌肽的摩尔比为2.5：1，室温下避光搅拌1.5小时；
54.s7：将步骤s3产物加入到步骤s6产物中，控制卟啉与抗菌肽的摩尔比为1.5：1，氮气保护下常温反应20小时，得到卟啉
‑
抗菌肽树脂；
55.s8：使用色谱纯dmf反复清洗步骤s7的产物，直至上清液无色，使用甲醇冲洗产物，收集滤液，得到卟啉
‑
抗菌肽溶液；
56.s9：将卟啉
‑
抗菌肽溶液放置于
‑
20℃冰箱冷冻后，于冻干机内冻干，得到卟啉
‑
抗菌肽冻干料；
57.s10：取适量的卟啉
‑
抗菌肽冻干料于6℃溶解于na2co3溶液中，控制卟啉
‑
抗菌肽冻干料浓度(w/v)为12％，27℃下放置成胶后，即得卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶。
58.所述步骤s1中所述的卟啉单体为5
‑
(4
‑
羧基苯基)
‑
10,15,20
‑
三(4
‑
叔丁基苯基)卟啉锌。
59.所述步骤s4中所述抗菌肽为马加宁。
60.实施例3
61.一种卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
62.s1：称取一定质量的卟啉单体于ph＝3的硫酸溶液中，制成30mmol/l的卟啉原液；
63.s2：称取一定质量的十六烷基三甲基溴化铵ctab溶于一定量的去离子水中，加入一定量的氢氧化钠，其中ctab与氢氧化钠的摩尔比为5：1，制得ctab溶液；
64.s3：将卟啉原液加入到ctab溶液中，控制ctab与卟啉的摩尔比为20：1，使用盐酸或氢氧化钠溶液调节ph＝8，反应36小时，离心干燥；
65.s4：称取一定质量的n端暴露，c端接有树脂的抗菌肽于色谱纯nn
‑
二甲基甲酰胺dmf中；
66.s5：加入一定比例的苯并三氮唑
‑
n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐hbtu，其中hbtu与抗菌肽的摩尔比为1.5：1；
67.s6：加入一定比例的nn
‑
二异丙基乙胺diea，其中diea与抗菌肽的摩尔比为5：1，室温下避光搅拌2小时；
68.s7：将步骤s3产物加入到步骤s6产物中，控制卟啉与抗菌肽的摩尔比为2：1，氮气保护下常温反应24小时，得到卟啉
‑
抗菌肽树脂；
69.s8：使用色谱纯dmf反复清洗步骤s7的产物，直至上清液无色，使用甲醇冲洗产物，收集滤液，得到卟啉
‑
抗菌肽溶液；
70.s9：将卟啉
‑
抗菌肽溶液放置于
‑
20℃冰箱冷冻后，于冻干机内冻干，得到卟啉
‑
抗菌肽冻干料；
71.s10：取适量的卟啉
‑
抗菌肽冻干料于8℃溶解于生理盐水中，控制卟啉
‑
抗菌肽冻干料浓度(w/v)为15％，30℃放置成胶后，即得卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶。
72.所述步骤s1中所述的卟啉单体为5
‑
(4
‑
羧基苯基)
‑
10,15,20
‑
三(4
‑
叔丁基苯基)卟啉锌。
73.所述步骤s4中所述抗菌肽为buforin ii。
74.实施例4
75.一种卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
76.s1：称取一定质量的卟啉单体于ph＝3的硫酸溶液中，制成20mmol/l的卟啉原液；
77.s2：称取一定质量的十六烷基三甲基溴化铵ctab溶于一定量的去离子水中，加入一定量的氢氧化钠，其中ctab与氢氧化钠的摩尔比为2.8：1，制得ctab溶液；
78.s3：将卟啉原液加入到ctab溶液中，控制ctab与卟啉的摩尔比为20：1，使用盐酸或氢氧化钠溶液调节ph＝7.5，反应40小时，离心干燥；
79.s4：称取一定质量的n端暴露，c端接有树脂的抗菌肽于色谱纯nn
‑
二甲基甲酰胺dmf中；
80.s5：加入一定比例的苯并三氮唑
‑
n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐hbtu，其中hbtu与抗菌肽的摩尔比为1.5：1；
81.s6：加入一定比例的nn
‑
二异丙基乙胺diea，其中diea与抗菌肽的摩尔比为3：1，室温下避光搅拌2小时；
82.s7：将步骤s3产物加入到步骤s6产物中，控制卟啉与抗菌肽的摩尔比为2：1，氮气保护下常温反应24小时，得到卟啉
‑
抗菌肽树脂；
83.s8：使用色谱纯dmf反复清洗步骤s7的产物，直至上清液无色，使用甲醇冲洗产物，收集滤液，得到卟啉
‑
抗菌肽溶液；
84.s9：将卟啉
‑
抗菌肽溶液放置于
‑
20℃冰箱冷冻后，于冻干机内冻干，得到卟啉
‑
抗菌肽冻干料；
85.s10：取适量的卟啉
‑
抗菌肽冻干料于6℃溶解于去离子水中，控制卟啉
‑
抗菌肽冻干料浓度(w/v)为13％，27℃放置成胶后，即得卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶。
86.所述步骤s1中所述的卟啉单体为5
‑
(4
‑
羧基苯基)
‑
10,15,20
‑
三(4
‑
叔丁苯基)卟啉。
87.所述步骤s4中所述抗菌肽为蜜蜂抗菌肽。
88.实施例5
89.卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶的光动力抗菌评价
90.1、实验材料：实施例1、2、3、4制备的卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝胶
91.2、试验方法：
92.本实验以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为试验菌种，测试各实验材料的抗菌效果。48孔板中的每个孔中，加入灭菌后的水凝胶材料，再加入0.9ml菌液浓度为1
×
106cfu/ml的bl液体培养基。每个孔用405nm波长的汞灯光照射10s，37℃下孵育24h，在波长600nm处测其吸光度
93.3、试验结果：抗菌试验结果如表所示
94.表：抗菌试验结果
[0095][0096]
由表的结果可以看出，本发明实施例1
‑
4制得的卟啉
‑
抗菌肽超分子纳米抗菌水凝
胶在极短的光照时间下，就能对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很高的抗菌率，这说明本发明水凝胶在卟啉和抗菌肽的协同作用下，实现了更好的抗菌效果。