一种能够快速生成蓝铜肽的冻干粉及其制备方法与流程

本发明属于美容多肽技术领域，具体涉及一种能够快速生成蓝铜肽的冻干粉及其制备方法。

背景技术：

多肽是由氨基酸通过肽键连接在一起形成的化合物，在皮肤组织细胞的增殖、细胞趋化与迁移、胶原蛋白合成与分泌、组织修复与再生、血管形成与重建、色素形成与清除、炎症相关因子的调节、细胞生长环境的改善等多种皮肤修复的过程中发挥着重要作用。由于多肽能显著改善各种皮肤问题，受到医疗美容行业的广泛关注。

三肽-1、蓝铜肽是常用的抗衰修复类多肽。三肽-1是由甘氨酸、组氨酸、赖氨酸组成的三肽，序列为ghk。三肽-1是一种matrikine信号肽，可以调节基质金属蛋白酶(mmp)和金属蛋白酶组织抑制因子(timp)的活性，促进胶原蛋白、糖胺聚糖等细胞外基质的合成，是皮肤修复和伤口愈合的重要调节因子。三肽-1与铜离子有很强的亲和力，形成三肽-1铜(ghk-cu)络合物，具体络合方式为三肽-1序列中组氨酸咪唑环上的氮原子、甘氨酸氨基端的氮原子、甘氨酸与组氨酸形成的肽键上的氮原子，上述3个氮原子与铜络合。因为三肽-1铜呈现蓝色，所以又被称为蓝铜肽。铜离子对伤口愈合以及人体内和皮肤上的许多酶促反应而言是一种非常重要的成分，同时也发挥信号功能，能够影响细胞的行为和代谢。三肽-1络合铜形成蓝铜肽，可以有效促进成纤维母细胞的增殖，促进增加胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖的合成，增加血管生长和抗氧化能力，修复皮肤屏障，还可刺激毛囊，促进毛发生长。

传统蓝铜肽合成工艺通过液相合成三肽-1，纯化后与铜络合，重结晶得到蓝铜肽。三肽-1与铜络合的工艺重现性较差，影响因素多，生产成本高。由于不同批次三肽-1中所含酸、盐及水的含量不同，在相同投料量下，得到的蓝铜肽晶体形状、颜色、质量差别较大，不同的外观性状会直接影响消费者的直观感受，从而会对蓝铜肽的销售造成很大影响。不同ph条件对蓝铜肽的合成也有影响。此外，三肽-1与铜络合之后，可能在放置过程中出现白色沉淀析出。

为了克服上述缺陷，需要研究一种通过三肽-1能够快速生成蓝铜肽，制备成本低，稳定性高，能够给消费者带来良好感观，且使用方便的产品。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明人通过将三肽-1制备成冻干粉，将铜离子溶液作为溶媒，两者独立共存于同一双腔瓶中，在临用前混合，即时生成蓝铜肽，现配现用，稳定性好，制备工艺简单，成本低，使用方便。与此同时，淡绿色的铜离子溶液通过与三肽-1冻干粉混合，快速变色，形成淡蓝色或蓝色溶液，颜色的变化可以给消费者直观感受，指示蓝铜肽的生成，而且这个过程在同一双腔瓶中进行，避免了冻干粉与溶媒独立包装导致的溶媒撒漏，操作过程污染等问题，由此完成了本发明。

因此，本发明要解决的技术问题是提供一种能够快速生成蓝铜肽的冻干粉及其制备方法，所述冻干粉比传统的三肽-1冻干粉具有更优的皮肤修复效果，而且应用范围更广，比传统的蓝铜肽冻干粉的生产成本更低，而且能够给消费者指示蓝铜肽的生成。

本发明所述一种能够快速生成蓝铜肽的冻干粉，包括冻干粉部分、溶媒部分，所述冻干粉部分由以下原料组成：三肽-1、甘露糖醇、海藻糖、去离子水，所述溶媒部分是铜离子溶液，所述冻干粉部分和溶媒部分隔开存储于同一双腔瓶中，所述双腔瓶的两个腔室通过连接部组合在一起，所述连接部具有可开启的连接通道。

所述冻干粉部分由以下质量百分比的组份制作而成：

三肽-1：1.5％-3.5％；

甘露糖醇：4.0％-8.0％；

海藻糖：0.5％-2.5％；

去离子水：88.0％-92.0％。

所述铜离子溶液是葡萄糖酸铜溶液或氯化铜溶液。

所述铜离子溶液是葡萄糖酸铜溶液。

所述葡萄糖酸铜溶液由以下质量百分比的组份制作而成：

葡萄糖酸铜：0.5％-2.0％；

甜菜碱：1.0％-4.0％；

泛醇：0.1％-1.0％；

尿囊素：0.1％-0.5％；

己二醇：0.1％-1.0％；

对羟基苯乙酮：0.1％-1.0％；

透明质酸钠：0.01％-0.1％；

甘油：1.0％-3.0％；

去离子水：90.0％-95.5％。

本发明所述的能够快速生成蓝铜肽的冻干粉的制备方法，包括冻干粉部分的制备方法和溶媒部分的制备方法。

所述冻干粉部分的制备方法包括以下步骤：

(1)按照质量百分比称取原料，将三肽-1、甘露糖醇、海藻糖、去离子水置于混合容器中，在500～800rpm转速下搅拌10～15min，混合溶解，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的溶液；

(2)将过滤后的溶液灌装至双腔瓶的底部腔中，灌装量为0.2～0.5ml，得到灌装好的溶液；

(3)预先开启真空冷冻干燥机，将冻干板层温度降至-45℃～-40℃，保温2-3小时；

(4)将灌装好的溶液放入真空冷冻干燥机，抽真空，真空度维持在30pa，升温至-5℃，保温10～15h，再升温至10℃，保温1～3h；

(5)真空度维持在30pa，继续升温至30℃，保温1～3h，升温至38℃，保温8-12h，完成冷冻干燥，得到所述冻干粉部分。

所述溶媒部分的制备方法包括以下步骤：

(1)按照质量百分比称取原料，将去离子水、甘油、透明质酸钠、尿囊素加入乳化锅中，升温至80℃～85℃，搅拌均匀；

(2)降温至60℃，加入对羟基苯乙酮、己二醇，搅拌10min～20min，溶解完全；

(3)继续降温至40℃～45℃，加入泛醇、甜菜碱、葡糖酸铜，搅拌5min～10min，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的铜离子溶液；

(4)将过滤后的铜离子溶液灌装至双腔瓶的瓶身腔中，灌装量为1.5～2.0ml，得到所述溶媒部分。

本发明所述冻干粉部分与溶媒部分通过连接部组合在一起，得到冻干粉部分与溶媒部分分隔开存储于同一双腔瓶中的冻干粉制剂。

所述冻干粉制剂在临用前开启连接部的连接通道，冻干粉部分与溶媒部分接触，摇匀，即快速生成蓝铜肽。

本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：

1、本发明通过将三肽-1制备成冻干粉，将铜离子溶液作为溶媒，两者独立共存于同一双腔瓶中，在临用前混合，即时生成蓝铜肽，现配现用，稳定性好，制备工艺简单，成本低。

2、本发明通过调整三肽-1与铜离子溶媒的投料比例，可以即时生成2：1蓝铜肽(ghk：cu＝2：1)，而传统工艺制备的是1：1蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，因此本发明的技术方案可以取得比传统蓝铜肽更优的皮肤修复效果。

3、本发明用淡绿色的铜离子溶液与三肽-1冻干粉混合，快速变色，形成淡蓝色或蓝色溶液，变色效应能够给消费者带来良好感观，同时可以给消费者指示蓝铜肽的生成，而且这个过程在同一双腔瓶中进行，避免了冻干粉与溶媒独立包装导致的在使用溶解时操作麻烦，溶媒撒漏，操作过程污染等问题。

4、本发明通过三肽-1冻干粉与铜离子溶液临用前混合，快速生成蓝铜肽，具有比传统的三肽-1冻干粉更优的皮肤修复效果，而且应用范围更广，除了用于皮肤修复，本发明所述能够快速生成蓝铜肽的冻干粉还可以应用于防脱生发方面。

5、本发明通过三肽-1冻干粉与铜离子溶液临用前混合，快速生成蓝铜肽，三肽-1与铜离子络合之后，可以提高对酶的抵抗作用，避免传统三肽-1冻干粉在使用过程中被蛋白酶降解的问题，具有比传统的三肽-1冻干粉更优的使用稳定性，更有利于效果的发挥。

附图说明

图1细胞迁移实验结果

图2促毛发生长实验结果

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例、测试例及附图对发明作详细的说明，然而，应当理解的是，这些实施例、测试例及附图仅用作说明目的，并且不旨在限制本发明的范围。

实施例1制备能够快速生成蓝铜肽的冻干粉

1.1制备三肽-1冻干粉

(1)将2.5％三肽-1、6％甘露糖醇、1.5％海藻糖、90％去离子水置于混合容器中，在700rpm转速下搅拌12min，混合溶解，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的溶液；

(2)将过滤后的溶液灌装至双腔瓶的底部腔中，灌装量为0.3ml，得到灌装好的溶液；

(3)预先开启真空冷冻干燥机，将冻干板层温度降至-45℃，保温2.5小时；

(4)将灌装好的溶液放入真空冷冻干燥机，抽真空，真空度维持在30pa，升温至-5℃，保温13h，再升温至10℃，保温2h；

(5)真空度维持在30pa，继续升温至30℃，保温2h，升温至38℃，保温10h，完成冷冻干燥，得到三肽-1冻干粉。

1.2制备葡萄糖酸铜溶媒

(1)将91.75％去离子水、2％甘油、0.05％透明质酸钠、0.2％尿囊素加入乳化锅中，升温至80℃～85℃，搅拌均匀；

(2)降温至60℃，加入0.5％对羟基苯乙酮、0.5％己二醇，搅拌15min，溶解完全；

(3)继续降温至40℃～45℃，加入0.5％泛醇、2.5％甜菜碱、2.0％葡萄糖酸铜，搅拌10min，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的铜离子溶液；

(4)将过滤后的铜离子溶液灌装至双腔瓶的瓶身腔中，灌装量为1.5ml，得到葡萄糖酸铜溶媒。

1.3将上述1.1与1.2步骤得到的冻干粉和溶媒，通过连接部组合在一起，得到冻干粉部分与溶媒部分分隔开存储于同一双腔瓶中的冻干粉制剂，临用前开启连接部的连接通道，冻干粉部分与溶媒部分接触，摇匀，即快速生成蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)。

实施例2制备能够快速生成蓝铜肽的冻干粉

2.1制备三肽-1冻干粉

(1)将2.5％三肽-1、6％甘露糖醇、1.5％海藻糖、90％去离子水置于混合容器中，在700rpm转速下搅拌12min，混合溶解，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的溶液；

(2)将过滤后的溶液灌装至双腔瓶的底部腔中，灌装量为0.3ml，得到灌装好的溶液；

(3)预先开启真空冷冻干燥机，将冻干板层温度降至-45℃，保温2.5小时；

(4)将灌装好的溶液放入真空冷冻干燥机，抽真空，真空度维持在30pa，升温至-5℃，保温13h，再升温至10℃，保温2h；

(5)真空度维持在30pa，继续升温至30℃，保温2h，升温至38℃，保温10h，完成冷冻干燥，得到三肽-1冻干粉。

2.2制备葡萄糖酸铜溶媒

(1)将92.75％去离子水、2％甘油、0.05％透明质酸钠、0.2％尿囊素加入乳化锅中，升温至80℃～85℃，搅拌均匀；

(2)降温至60℃，加入0.5％对羟基苯乙酮、0.5％己二醇，搅拌15min，溶解完全；

(3)继续降温至40℃～45℃，加入0.5％泛醇、2.5％甜菜碱、1.0％葡萄糖酸铜，搅拌10min，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的铜离子溶液；

(4)将过滤后的铜离子溶液灌装至双腔瓶的瓶身腔中，灌装量为1.5ml，得到葡萄糖酸铜溶媒。

2.3将上述2.1与2.2步骤得到的冻干粉和溶媒，通过连接部组合在一起，得到冻干粉部分与溶媒部分分隔开存储于同一双腔瓶中的冻干粉制剂，临用前开启连接部的连接通道，冻干粉部分与溶媒部分接触，摇匀，即快速生成蓝铜肽(ghk：cu＝2：1)。

对比例1制备传统三肽-1冻干粉

1.1制备三肽-1冻干粉

(1)将2.5％三肽-1、6％甘露糖醇、1.5％海藻糖、90％去离子水置于混合容器中，在700rpm转速下搅拌12min，混合溶解，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的溶液；

(2)将过滤后的溶液灌装至双腔瓶的底部腔中，灌装量为0.3ml，得到灌装好的溶液；

(3)预先开启真空冷冻干燥机，将冻干板层温度降至-45℃，保温2.5小时；

(4)将灌装好的溶液放入真空冷冻干燥机，抽真空，真空度维持在30pa，升温至-5℃，保温13h，再升温至10℃，保温2h；

(5)真空度维持在30pa，继续升温至30℃，保温2h，升温至38℃，保温10h，完成冷冻干燥，得到三肽-1冻干粉。

1.2制备常规溶媒

(1)将93.75％去离子水、2％甘油、0.05％透明质酸钠、0.2％尿囊素加入乳化锅中，升温至80℃～85℃，搅拌均匀；

(2)降温至60℃，加入0.5％对羟基苯乙酮、0.5％己二醇，搅拌15min，溶解完全；

(3)继续降温至40℃～45℃，加入0.5％泛醇、2.5％甜菜碱，搅拌10min，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的溶液；

(4)将过滤后的溶液灌装至双腔瓶的瓶身腔中，灌装量为1.5ml，得到常规溶媒。

1.3将上述1.1与1.2步骤得到的冻干粉和溶媒，通过连接部组合在一起，得到传统三肽-1冻干粉。

对比例2制备传统蓝铜肽冻干粉

1.1制备蓝铜肽冻干粉

(1)将2.5％蓝铜肽、6％甘露糖醇、1.5％海藻糖、90％去离子水置于混合容器中，在700rpm转速下搅拌12min，混合溶解，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的溶液；

(2)将过滤后的溶液灌装至双腔瓶的底部腔中，灌装量为0.3ml，得到灌装好的溶液；

(3)预先开启真空冷冻干燥机，将冻干板层温度降至-45℃，保温2.5小时；

(4)将灌装好的溶液放入真空冷冻干燥机，抽真空，真空度维持在30pa，升温至-5℃，保温13h，再升温至10℃，保温2h；

(5)真空度维持在30pa，继续升温至30℃，保温2h，升温至38℃，保温10h，完成冷冻干燥，得到蓝铜肽冻干粉。

1.2制备常规溶媒

(1)将93.75％去离子水、2％甘油、0.05％透明质酸钠、0.2％尿囊素加入乳化锅中，升温至80℃～85℃，搅拌均匀；

(2)降温至60℃，加入0.5％对羟基苯乙酮、0.5％己二醇，搅拌15min，溶解完全；

(3)继续降温至40℃～45℃，加入0.5％泛醇、2.5％甜菜碱，搅拌10min，再用0.22μm过滤膜过滤，得到过滤后的溶液；

(4)将过滤后的溶液灌装至双腔瓶的瓶身腔中，灌装量为1.5ml，得到常规溶媒。

1.3将上述1.1与1.2步骤得到的冻干粉和溶媒，通过连接部组合在一起，得到传统蓝铜肽冻干粉。

测试例1促细胞增殖实验

1.1试剂与材料

胎牛血清(fbs)、dmem培养基、pbs缓冲液、mtt、dmso、96孔板。

1.2仪器

酶标仪(md)、co2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。

1.3细胞株

小鼠皮肤成纤维细胞nih3t3，购自中国科学院上海细胞库。

1.4待测样品

给药组：实施例1、实施例2、对比例1、对比例2。

对照组：pbs空白对照。

1.5测试方法

取同一传代细胞，将细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板，每孔200μl细胞悬浮液，待细胞贴壁后，换含0.5％～1％fbs的培养基维持细胞24h使其同步化。再加入待测样品20μl，各设置5个复孔，对照组加pbs20μl，作用24～72h后，加入mtt试剂20μl反应4h后，离心去除上清，每孔加入dmso使结晶物充分溶解，酶标仪490nm测od值。

细胞活性(％)＝给药组od值/对照组od值×100％

1.6测试结果

将1.5步骤测得的od值按上述细胞活性的公式计算后，得到同一浓度下不同样品对成纤维细胞nih3t3增殖的影响，结果见表1。

表1测试样品对成纤维细胞nih3t3增殖的影响

由表1中结果可知，相对于空白对照组，实施例1、实施例2、对比例1、对比例2作用于成纤维细胞之后，均能促进成纤维细胞增殖。成纤维细胞在伤口愈合、皮肤修复过程中发挥着重要作用，通过细胞增殖，合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺多糖等细胞外基质来进行组织修复。相比于对比例1，实施例1对成纤维细胞的促增殖作用更加明显，说明三肽-1与葡萄糖酸铜溶媒混合，即时生成1：1蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，能取得比传统三肽-1冻干粉更好的皮肤修复效果。相比于对比例2，实施例1与对比例2对成纤维细胞的促增殖作用相当，说明三肽-1与葡萄糖酸铜溶媒混合，即时生成蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，能够取得与传统蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)冻干粉类似的皮肤修复效果，而实施例1的技术方案可以降低生产成本，同时伴随的从淡绿色变为淡蓝色的变色现象，可以指示铜肽的生成，有利于消费者识别，并增加消费者使用的兴趣。实施例2可以即时生成2：1蓝铜肽(ghk：cu＝2：1)，而传统工艺制备的是1：1蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，相对于对比例2，实施例2具有更高的促成纤维细胞增殖活性，因此实施例2具有比对比例2更优的皮肤修复效果。此外，实施例1、实施例2通过ghk与葡萄糖酸铜溶媒中的铜离子络合之后，溶液中的葡萄糖对皮肤也能起到一定的调理效果。

测试例2促细胞迁移实验

2.1细胞株

人永生化角质细胞hacat细胞株，购自中国科学院昆明细胞库。

2.2待测样品

给药组：实施例1、实施例2、对比例1、对比例2。

对照组：pbs空白对照。

2.3测试方法

将细胞以15万个/孔的密度接种于24孔板，每孔2ml细胞悬浮液，待细胞贴壁后，换含0.5％～1％fbs的培养基维持细胞24h使其同步化。用灭菌枪头进行划痕，pbs洗去掉落细胞，再加入含药培养基，各设置5个复孔，对照组加等量pbs，作用24h后，显微镜下观察从划痕处向中央生长的细胞迁移，并拍照。

利用imagej分析实验结果，并按照下面的公式计算细胞迁移率(％)。

细胞迁移率(％)＝(0h划痕宽度-培养24h后的划痕宽度)/0h划痕宽度×100％2.4测试结果

实施例1、实施例2、对比例1、对比例2及空白对照组在0h、24h的细胞状态见图1。

根据0h、24h的细胞迁移图片，按照公式计算细胞迁移率，结果见表2。

表2测试样品对人永生化角质细胞hacat细胞迁移的影响

由图1及表2的结果可知，相对于空白对照组，实施例1、实施例2、对比例1、对比例2作用于角质细胞之后，均能促进角质细胞迁移。角质细胞向创面中心迁移，有利于创面愈合。相比于对比例1，实施例1可以更明显地促进角质细胞迁移，说明三肽-1与葡萄糖酸铜溶媒混合，即时生成1：1蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，能取得比传统三肽-1冻干粉更好的加快伤口愈合效果。相比于对比例2，实施例1与对比例2对促进角质细胞迁移的作用相当，说明三肽-1与葡萄糖酸铜溶媒混合，即时生成蓝铜肽，能够取得与传统蓝铜肽冻干粉(ghk：cu＝1：1)类似的加快伤口愈合效果，而实施例1的技术方案可以降低生产成本，同时伴随的从淡绿色变为淡蓝色的变色现象，可以指示铜肽的生成，有利于消费者识别，并增加消费者使用的兴趣。实施例2可以即时生成2：1蓝铜肽(ghk：cu＝2：1)，而传统工艺制备的是1：1蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，相对于对比例2，实施例2具有更高的细胞迁移率，因此实施例2具有比对比例2更优的促进伤口愈合效果。此外，实施例1、实施例2通过ghk与葡萄糖酸铜溶媒中的铜离子络合之后，溶液中的葡萄糖对皮肤也能起到一定的调理效果。

测试例3促毛发生长动物实验

3.1实验动物

c57bl/6小鼠，spf级，雌性，6-8周龄，体重18-20g，皮肤粉红，毛发处于休止期。

实验动物购自广东省医学实验动物中心，许可证号scxk(粤)2018-0002。

3.2试剂与材料

水合氯醛(麦克林)、硫化钠(天津市大茂化学试剂厂)、75％医用酒精。

3.3测试方法

毛发生长期的诱导：小鼠以4％水合氯醛麻醉，电动剃毛刀剃毛，6％na2s脱毛，温水洗净。避免损伤皮肤。诱导毛发从休止期进入生长期。脱毛后用75％酒精消毒脱毛区。

实验动物分组：脱毛次日进行分组给药，随机分组，每组8只。分别5组：生理盐水对照组、实施例1、实施例2、对比例1、对比例2。在各个组小鼠的脱毛区域内涂抹相应的物质。

给药方法：脱毛后次日开始给药，涂抹量为0.2ml/只，2次/日，每次约0.1ml/只。涂药当天记为第1天，用药至实验结束。

每天观察小鼠新生毛发生长情况，连续观察至18天。

在第18天于每只小鼠用药区域内的相同部位随机拔取10根毛(排除断毛)，用游标卡尺测量其长度，取平均值。以10根毛的平均长度作为每只小鼠的新生毛发长度。

3.4测试结果

观察各组小鼠皮色变化，均由粉色变为黑色，再至长毛。与对照组比较，实施例1、实施例2及对比例2可明显缩短c57bl/6小鼠脱毛后皮肤颜色由粉红变黑的时间。0天与18天各组小鼠的毛发生长对比情况见图2。

使用18天后，检测新生毛发长度，结果见下表3。

表3测试样品使用18天后的新生毛发长度

由图2及表3的结果可知，相对于对照组、对比例1，实施例1、实施例2、对比例2能够明显促进小鼠的毛发生长。分别使用实施例1与对比例2，在第18天检测新生毛发长度，测得实施例1组与对比例2组的新生毛发长度相近，说明三肽-1与葡萄糖酸铜溶媒混合，即时生成蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，能够取得与传统蓝铜肽冻干粉(ghk：cu＝1：1)类似的促进毛发生长的效果，但实施例1的技术方案具有更低的生产成本。比较实施例2与对比例2的结果，实施例2促进毛发生长的作用更明显，使用18天之后，小鼠长出了更浓密的毛，且新生毛发长度更长，说明三肽-1与葡萄糖酸铜溶媒混合，即时生成蓝铜肽(ghk：cu＝2：1)，能够取得比传统蓝铜肽冻干粉(ghk：cu＝1：1)更优的促进毛发生长的效果。另一方面，使用18天后，测得对比例1组与对照组的新生毛发长度相差不大，对比例1对毛发生长的促进作用较弱，而实施例1、实施例2的技术方案可以明显促进毛发生长，说明实施例1、实施例2具有比传统的三肽-1冻干粉更广的应用范围，除了用于皮肤修复，本发明所述能够快速生成蓝铜肽的冻干粉还可以应用于防脱生发方面。

测试例4衰老皮肤修复试验

4.1受试者

150名50-65岁的健康女性，随机分为5组，平均每组30人。

4.2测试样品

实施例1、实施例2、对比例1、对比例2，以安慰剂作为空白对照。

4.3测试仪器

cutometer皮肤弹性测定仪(德国ck公司)

4.4评价方法

先测量脸部区域清洁后30min的空白值，然后将试验样品均匀涂布于脸部，一侧涂抹安慰剂，另一侧涂抹测试样品，一天两次，早晚坚持使用，不得使用其他化妆品，连续使用4周，分别测试记录试验区域在给药前后的皮肤机械性能，同时对受试者就产品的接受程度、使用效果进行问卷调查。同一个受试者的测试由同一个测量人员完成。

4.5测试结果

4.5.1问卷调查结果

实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、安慰剂的产品性状见下表4。

产品使用前、产品使用4周后，对受试者进行问卷调查，结果见下表5。

表4测试样品的性状

表5受试者问卷调查结果

问卷调查结果显示，受试者更愿意在测试结束后，继续使用实施例1与实施例2产品。实施例1在改善皮肤紧致度、皮肤弹性方面能取得比对比例1更优的效果，而其皮肤修复效果与对比例2相当。实施例2具有比对比例1、对比例2更优的皮肤修复效果。除了使用效果方面的考虑，受试者在产品接受度方面也会考虑视觉感受，实施例1、实施例2在临用前混合，即时生成蓝铜肽，伴随着淡绿色变成淡蓝色或蓝色的过程，可以增加消费者的使用兴趣，因此受试者对于实施例1、实施例2产品的接受度更高。

4.5.2皮肤修复测试结果

利用cutometer测试各样品使用前后的皮肤紧致性、皮肤张力、皮肤粘弹性和皮肤可塑性指标，以此评估皮肤机械性能，判断测试样品对衰老皮肤的修复效果。

计算测试样品使用4周之后的皮肤紧致性、皮肤张力、皮肤粘弹性和皮肤可塑性改善百分比，结果如下表6。

表6各组给药4周的皮肤紧致性、皮肤张力、皮肤粘弹性和皮肤可塑性改善百分比(％)

由表中数据可知，相对于安慰剂组，在活性多肽存在的条件下，实施例1-2及对比例1-2在使用4周后测得的皮肤紧致性、皮肤张力、皮肤粘弹性和皮肤可塑性均有所改善。相比于对比例1，实施例1具有更优的皮肤修复效果，说明三肽-1与葡萄糖酸铜溶媒混合，即时生成蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，能取得比传统三肽-1冻干粉更好的皮肤修复效果。相比于对比例2，实施例1与对比例2对皮肤修复的作用相当，说明三肽-1与葡萄糖酸铜溶媒混合，即时生成蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，能够取得与传统蓝铜肽冻干粉(ghk：cu＝1：1)类似的皮肤修复效果，而实施例1的技术方案可以降低生产成本，同时伴随的从淡绿色变为淡蓝色的变色现象，可以指示铜肽的生成，有利于消费者识别，并增加消费者使用的兴趣。实施例2可以即时生成2：1蓝铜肽(ghk：cu＝2：1)，而传统工艺制备的是1：1蓝铜肽(ghk：cu＝1：1)，因此实施例2具有比对比例2更优的皮肤修复效果。此外，实施例1、实施例2通过ghk与葡萄糖酸铜溶媒中的铜离子络合之后，溶液中的葡萄糖对皮肤也能起到一定的调理效果。

测试例5蛋白酶降解实验

5.1测试方法

添加1.5mg木瓜蛋白酶至实施例1、对比例1溶液。将所得溶液在40℃下孵育。加入木瓜蛋白酶后，分别在0h、1h、3h和24h采集样品，以1400rpm离心1min，使用0.45pm过滤器过滤上清液，并通过hplc进行分析。

5.2测试结果

实施例1、对比例1在木瓜蛋白酶作用下的稳定性结果见下表7。

表7测试样品在蛋白酶作用下的稳定性

由上表7的结果可知，实施例1能够更好地抵抗蛋白酶的降解，在木瓜蛋白酶作用下24h后，溶液中仍存在较高含量的多肽，而对比例1的多肽已被木瓜蛋白酶完全降解，说明实施例1通过三肽-1冻干粉与铜离子溶液临用前混合，快速生成蓝铜肽，三肽-1与铜离子络合之后，可以提高对蛋白酶的抵抗作用，避免传统三肽-1冻干粉在使用过程中被蛋白酶降解的问题，从而具有比传统的三肽-1冻干粉更优的使用稳定性，更有利于效果的发挥。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。