西青果多酚提取物在调控Nrf2信号通路中的应用

西青果多酚提取物在调控nrf2信号通路中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及西青果多酚提取物在调控nrf2信号通路中的应用。


背景技术：

2.西青果，为使君子科植物诃子的干燥幼果，其含有丰富的酚类成分，可以治疗各种症状和疾病。西青果果实中含有多种酚类化合物，如没食子酸，鞣花酸，柯里拉京诃子联苯酸和诃子酸等，据报道这些化合物具有抗氧化性、抗炎抗菌、保肝和神经保护的特性。基于西青果果实的药理活性，其可用作提取天然酚类化合物的重要来源。
3.氧化应激是由细胞过度产生的活性氧(ros)和亲电体引起的，而过量的ros又可以诱导自由基链反应，破坏细胞生物大分子如蛋白质、脂质和dna等，并诱发一系列生活习惯性疾病，如心脑血管疾病、老化、ⅱ型糖尿病、癌症等。机体为控制ros水平并防止其积累，形成了一套复杂的抗氧化防御体系，其中核因子nf
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e2相关因子(nuclear factor
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erythroid 2
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related factor 2,nrf2)是一种重要的氧化还原敏感性转录因子，其通过诱导调控细胞内ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的组成型和诱导型表达，有利于改善机体氧化应激状态，促进细胞存活以及维持细胞的氧化还原稳态。
4.nrf2蛋白分子包含neh1
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neh7共7个结构域，其中neh2、neh6、neh7可调节nrf2的稳定性，其中neh2有2个可以结合胞浆蛋白kelch样环氧氯丙烷相关蛋白
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1(kelch
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like ech
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associated protein
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1，keap1)的位点，正常生理情况下，nrf2被keap1锚定在细胞质中，而keap1作为滞蛋白3(cul3)依赖性e3泛素连接酶复合物的作用底物，能够促使nrf2发生泛素化且被蛋白酶体快速降解。但当细胞受到ros或亲电体的攻击时，nrf2从keap1中解离且快速转位进入细胞核，先与小maf蛋白形成异二聚体，再结合抗氧化反应元件(are)，转录激活受nrf2调控的抗氧化酶基因表达。
5.nrf2调控的抗氧化因子包括nad(p)h:醌氧化还原酶ⅰ(nqo1)、血红素氧合酶ⅰ(ho
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1)、超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、γ
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谷氨酰半胱氨酸合成酶(gcs
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γ)等。其中ho
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1主要催化血红素分解代谢成亚铁、一氧化碳和胆绿素，是一种重要的抗氧化酶。一方面，血红素基团的降解有利于阻止其促氧化作用。另一方面，副产物胆绿素及其还原型胆红素具有有效的ros清除活性，以抵御过氧化物、过氧亚硝酸盐、羟基和超氧化物自由基。gcs
‑
γ是谷胱甘肽(gsh)合成过程中的限速酶，细胞内γ
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gcs活性升高使gsh合成加速，从而提高细胞内外gsh的浓度，而gsh是机体一种重要的抗氧化剂。同时nrf2信号通路的激活还会抑制促炎介质的产生及表达，包括细胞因子、炎症趋化因子、细胞粘附因子、基质金属蛋白酶、环氧化酶2(cox
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2)、诱导性一氧化氮合酶(inos)。研究表明，nrf2信号通路参与抑制炎症相关疾病，如自身免疫疾病、风湿类关节炎、哮喘、肺气肿、胃炎、结肠炎和动脉粥样硬化等，


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供了西青果多酚提取物的新用途，即在调控nrf2信号通路中的应用，本发明从西青果多酚中进行分离提取得到了西青果多酚乙酸乙酯提取物(tpe)和西青果多酚正丁醇提取物(tpb)，并以bv2小胶质细胞构建了氧糖剥夺/复氧模型(ogd/r模型)，研究tpe和tpb对于ogd/r模型中nrf2信号通路的作用，结果发现tpe和tpb可促进nrf2蛋白从细胞质到细胞核的转运，增加了nrf2在细胞核中的含量，同时还发现tpe和tpb可增强ogd/r模型的nrf2信号通路中ho
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1蛋白和gcs
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γ蛋白的表达、抑制nrf2信号通路中inos蛋白的表达，并部分促进keap1蛋白的表达。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
8.西青果多酚提取物在调控nrf2信号通路中的应用，所述西青果多酚提取物为西青果多酚乙酸乙酯提取物和/或西青果多酚正丁醇提取物。
9.进一步的，所述西青果多酚提取物的浓度为10～40μg/ml。
10.进一步的，所述西青果多酚提取物促进nrf2蛋白从细胞质到细胞核的转运。
11.进一步的，所述西青果多酚提取物增加了nrf2蛋白在细胞核中的含量。
12.进一步的，所述西青果多酚提取物增强nrf2信号通路中ho
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1蛋白和gcs
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γ蛋白的表达。
13.进一步的，所述西青果多酚提取物抑制nrf2信号通路中inos蛋白的表达。
14.进一步的，40μg/ml西青果多酚乙酸乙酯提取物和40μg/ml西青果多酚正丁醇提取物增强nrf2信号通路中keap1蛋白的表达。
15.进一步的，所述西青果多酚提取物的制备方法为：取西青果破碎后用石油醚脱脂并用甲醇提取，提取液蒸发浓缩后得到浓缩液，将所述浓缩液用乙酸乙酯萃取浓缩后，上样到ab
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8大孔树脂进行纯化，用80％乙醇作为洗脱剂洗脱得到西青果多酚乙酸乙酯提取物；将所述浓缩液用正丁醇萃取浓缩后，上样到ab
‑
8大孔树脂进行纯化，用80％乙醇洗脱得到西青果多酚正丁醇提取物。
16.本发明还提供了所述西青果多酚提取物在制备预防和/或治疗氧化应激相关疾病的药物中的应用，所述西青果多酚提取物为西青果多酚乙酸乙酯提取物和/或西青果多酚正丁醇提取物。其中氧化应激相关的疾病包括但不限于缺血性脑中风、动脉粥样硬化等疾病。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明对西青果多酚提取物，西青果多酚乙酸乙酯提取物(tpe)和西青果多酚正丁醇提取物(tpb)在nrf2细胞通路上的作用进行了研究，并首次发现tpe和tpb在nrf2信号通路中的调控作用，具体为：tpe和tpb可促进nrf2蛋白从细胞质到细胞核的转运，增加了nrf2在细胞核中的含量，tpe和tpb还可增强ogd/r模型的nrf2信号通路中ho
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1蛋白和gcs
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γ蛋白的表达、抑制nrf2信号通路中inos蛋白的表达，并部分促进keap1蛋白的表达，因此可将西青果多酚提取物tpe和tpb用于制备与氧化应激反应相关疾病的药物，如用于预防和/或治疗缺血性脑中风、动脉粥样硬化等疾病。
附图说明
18.图1为本发明实施例1中西青果多酚提取物tpe和tpb的hplc色谱图，其中a为tpe的hplc色谱图，b为tpb的hplc色谱图；
19.图2为本发明实施例2中tpe和tpb对ogd/r模型中nrf2蛋白的影响，其中a为总蛋白、细胞质蛋白以及细胞核蛋白中nrf2表达情况的免疫印迹检测结果图，b为总蛋白、细胞质蛋白以及细胞核蛋白中nrf2表达量的统计结果，c为bv2小胶质细胞中nrf2的免疫荧光染色结果图；
20.图3为本发明实施例2中tpe和tpb对ogd/r模型的nrf2信号通路中抗氧化相关蛋白的影响，其中a为抗氧化相关蛋白表达情况的免疫印迹检测结果图，图b为抗氧化相关蛋白表达量的统计结果。
具体实施方式
21.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
22.本发明各实施例中的统计数据均采用spss17.0软件进行统计学分析，其中每个实验重复至少3次，所有的实验数据均以平均值
±
sd表示，组之间的统计差异通过lsd事后检验的单向方差分析(anova)计算。其中p＜0.05表示具有统计学差异，p＜0.01表示具有极显著差异。
23.实施例1西青果多酚提取物的制备和成分分析
24.1、西青果多酚提取物的制备
25.取西青果(terminalia chebula)果实，使用破碎机将干燥果实粉碎成粗粉，并用石油醚脱脂，然后用与西青果粉末的料液比为1:20(g/ml)的50％甲醇与70℃条件下提取2h，将提取液用旋转蒸发仪蒸发浓缩以除去过量的甲醇得到浓缩液，接着将浓缩液用乙酸乙酯溶剂或者正丁醇萃取。其中将所述浓缩液用乙酸乙酯萃取浓缩后，上样到ab
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8大孔树脂进行纯化，用水和乙醇去除多余的碳水化合物和低分子量化合物后用80％乙醇作为洗脱剂洗脱得到西青果多酚乙酸乙酯提取物(tpe)；将所述浓缩液用正丁醇萃取浓缩后，上样到ab
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8大孔树脂进行纯化，用水和乙醇去除多余的碳水化合物和低分子量化合物后用80％乙醇洗脱得到西青果多酚正丁醇提取物(tpb)。
26.2、tpe和tpb的成分分析
27.通过带有uv检测器的hplc(agilent 1260infinity)对tpe和tpb化学成分进行定量分析，具体为：使用pec18柱(4.6
×
250mm，5μm；perkinelmer，usa)分离化合物，流动相a为乙腈，流动相b为1％乙酸水溶液。检测波长为280nm。所有样品均应先通过0.45μm滤膜过滤，然后再用hplc
‑
uv检测。主要的化学成分和化学含量用参照标准化合物得到的标准曲线定量。测定结果如图1所示。
28.图1中a为tpe的hplc色谱图，b为tpb的hplc色谱图，由图1可知，根据相应的标准品液相色谱峰时间，鉴定出tpe和tpb中的主要成分为诃子联苯酸(18.178min)和诃子酸(20.239min)，定量分析结果表明，tpe中诃子联苯酸的含量为92.9mg/g，诃子酸含量为246.2mg/g，tpb中诃子联苯酸的含量为10.6mg/g，诃子酸含量为195.7mg/g。
29.实施例2西青果多酚提取物对ogd/r模型中nrf2信号通路的作用
30.1、氧糖剥夺/复氧(ogd/r)模型的建立
31.将bv2小胶质细胞培养在添加有10％胎牛血清(fbs)的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中，并放置于37℃，充满5％co2的培养箱中。在氧和葡萄糖剥夺实验中，将细胞用pbs洗涤两次，并将培养基替换为不含葡萄糖和fbs的dmem，然后将细胞转移到含有95％n2和5％co2混合气体的厌氧室中放置6h作为ogd组，对照组在更换新鲜的完全培养基后仍处于有氧环境中。经氧糖剥夺6h后，将ogd组恢复至有氧环境下，并用含有葡萄糖和fbs的dmem培养基培养3h，构建得到ogd/r模型。
32.将tpe和tpb完全溶解在dmso中，并在使用前用dmem培养基将其稀释至所需浓度。将bv2小胶质细胞培养于包含不同浓度tpe或tpb的培养基上并氧糖剥夺6h后，将细胞转移至于包含不同浓度tpe或tpb的完全培养基并移至有氧环境，持续3h，其中tpe或tpb的浓度分别为：0、10、20、40μg/ml。收集不同组的细胞，并以不添加有tpe或tpb的ogd/r模型作为阳性对照(ogd/r组)，不进行氧糖剥夺处理的正常细胞作为阴性对照(对照组)，分别用于以下实验。
33.2、tpe和tpb对ogd/r模型中nrf2蛋白的影响
34.取各组的细胞，使用细胞核和胞质细胞提取试剂盒分离bv2小胶质细胞的细胞质和细胞核组分。按照常规的蛋白质免疫印迹分析测定总蛋白、细胞质蛋白以及细胞核蛋白中nrf2蛋白的表达情况、进一步的，使用bca测定试剂盒进行定量分析。具体为：使用10％sds
‑
page分离等量的蛋白，然后将其印迹到pvdf膜上，将包含有蛋白的pvdf膜放于5％脱脂牛奶中，于室温下封闭1h，然后将膜与抗nrf2(1:500)抗体孵育，其中总蛋白和细胞质蛋白的内参为β
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肌动蛋白(β
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actin)(1:3000)，细胞核蛋白的内参为lamin b(1:1000)。然后将膜与辣根过氧化物酶(hrp)偶联的二抗杂交1h。免疫反应蛋白条带使用增强的化学发光(ecl)系统进行可视化，并使用图像j定量检测条带的相对强度。检测结果如图2的a和b所示，其中图a分别为总蛋白、细胞质蛋白以及细胞核蛋白中nrf2表达情况的免疫印迹检测结果图，图b为总蛋白、细胞质蛋白以及细胞核蛋白中nrf2表达量的统计结果。
35.接着，对上述各组的bv2小胶质细胞进行免疫荧光染色，具体为：收集细胞并用预冷的丙酮固定5分钟，然后用0.1％triton x
‑
100透化，接着用5％bsa封闭40分钟后，与nrf2抗体(1:200)在4℃孵育过夜，然后在37℃黑暗中用抗兔igg二抗(1：200)处理1小时。用pbs洗涤后，将细胞用hochest(1：1000)复染10分钟。用荧光显微镜(日本奥林巴斯)观察免疫荧光图像，荧光检测结果如图2的c所示。
36.结果显示，根据图2的a和b，与对照组相比，ogd/r组经过ogd刺激后，显著降低了总蛋白和细胞核蛋白中nrf2的表达。而与ogd/r组相比，tpe和tpb组显著或极显著增强了总蛋白和细胞核蛋白中nrf2的表达。根据图2的c显示，ogd/r组中红色和蓝色荧光的重叠较少，tpe和tpb组则相比ogd/r组增加了红色和蓝色荧光的重叠面积，即tpe和tpb处理可促进nrf2从细胞质到细胞核的转运，并显著增加了nrf2在细胞核中的含量。上述结果表明tpe和tpb可调控nrf2的表达和转运。
37.3、tpe和tpb对ogd/r模型的nrf2信号通路中抗氧化相关蛋白的影响
38.取各组的细胞，使用细胞核和胞质细胞提取试剂盒分离bv2小胶质细胞的细胞质和细胞核组分。按照上述方法分析测定几种抗氧化蛋白：kelch样环氧氯丙烷相关蛋白
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1(keap1)、血红素氧合酶ⅰ(ho
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1)、γ
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谷氨酰半胱氨酸合成酶(gcs
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γ)和诱导性一氧化氮合酶(inos)的表达情况，其中免疫反应蛋白条带使用增强的化学发光(ecl)系统进行可视化，
并使用图像j定量检测条带的相对强度。检测结果如图3所示，其中图a为抗氧化相关蛋白表达情况的免疫印迹检测结果图，图b为抗氧化相关蛋白表达量的统计结果。
39.结果显示，在ogd/r组，由于ogd/r诱导损伤，bv2小胶质细胞中的ho
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1，gcs
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γ和keap1蛋白的表达水平相较于对照组均极显著降低(p＜0.01)，而inos蛋白的表达量极显著增强(p＜0.01)，即ogd/r诱导了氧化应激。相较于ogd/r组，tpe和tpb组均显著增强了ho
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1蛋白和gcs
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γ蛋白的表达(p＜0.05)，并极显著降低了inos蛋白的表达量(p＜0.01)，此外，40μg/mltpe和40μg/ml tpb还增强了nrf2信号通路中keap1蛋白的表达。上述结果说明西青果多酚提取物tpe和tpb可调节nrf2信号通路中多种抗氧化相关蛋白的表达情况，参与到nrf2信号通路的调控中。因此可将西青果多酚提取物tpe和tpb制备成预防和/或治疗与氧化应激相关疾病的药物，如用于预防和/或治疗缺血性脑中风、动脉粥样硬化等。
40.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。