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1.本发明涉及一种双抗体igy，包含一种igy抗体偶联物，能有效地抑制大肠癌肿瘤细胞的生长。
背景技术：
2.大肠癌是较常见的消化道恶性肿瘤，在全世界范围内其发病率位居第3～5位，肿瘤相关死亡率位居第4位。近年来我国大肠癌的发病率逐年上升。现已有好多专著论述大肠癌，其中李世荣专著中专设立章节论述大肠癌特异性免疫疗法，国外学者的相关资料显示，单克隆抗体治疗大肠癌死亡率和复发率分别减少30％～27％。
3.igy抗体有耐酸、耐碱、耐酶解等作用，适合口服治疗胃肠疾病。
4.抗体偶联药物的方法-赖氨酸一步法，暴露在抗体(mab)表面的赖氨酸残基由于其侧链的氨基是强亲核基因，常被选为偶联药物的位点。每个免疫球蛋白(igg)包含80～100个赖氨酸残基，它们中的大部分是充分暴露在分子表面或是反应可及的。
5.赖氨酸偶连的一个主要的简单化学反应是通过偶联药物的活化酯与赖氨酸残基形成稳定的酰胺键，其中，活化酯通常选用o-琥珀酰亚胺(o-succinimide)试剂，如n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimidyl，nhs)或n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)酯类。另一种反应是利用酰亚胺脂类化合物(如traut's试剂)与赖氨酸残基形成稳定脒键，脒键在生理ph下以质子化形式存在，因此可以保留单克隆抗体(mab)的天然电荷性质。不论何种合成策略，药物抗体偶联比率(dar)往往是较小的，相对而言，潜在的偶联位点却很多，这就导致了反应的随机性和产物的异质性，并且药物负载呈统计学分布，这常被称为赖氨酸偶联的“散弹枪随机装载”(random shotgun loading)。
6.此外，异(硫)氰酸酯可能形成稳定(硫)脲连接化学性质也是知得探讨的。此方法已经广泛用于抗体的荧光标记，如异硫氰酸荧光素。目前的报道中，此方法还未应用到adc的制备，但已应用于喜树碱和阿霉素于具有氨基反应活性生物聚合物的偶联，以及放射性标记抗体的制备。
7.最近有报道称一种具有特定框架结构的igg基于氮杂环丁酮化学实现了赖氨酸的定点偶联，该igg的重链各有一个反应活性很高的赖氨酸，因而提供了两个潜在的偶联位点。此赖氨酸的pka约为6，而非常见的10～11，这使β-内酰胺部分容易打开，从而形成β-丙氨酸肽键。目前，此方法还未应用于adc的制备，但用于多肽偶联的详细方法已有报道。
技术实现要素：
8.本发明利用大肠癌细胞免疫鸡获得igy抗体偶联5-氟-2
’‑
脱氧尿酐，同时细胞内皮生长因子(vegf-b186)作为抗原，免疫鸡获得vegf-b186的igy抗体，将两种抗体混合灌服实验小鼠，试验结果表明对肿瘤有明显的抑制作用。
具体实施方式：
9.一 免疫原的制备
10.1.1大肠癌细胞sw837
11.大肠癌细胞sw837，购买于上海纪宁实业有限公司，批号202009410。
12.1.2细胞内皮生长因子(vegf-b186)的表达与纯化
13.1.2.1 vegf-b186的合成
14.查阅相关文献，选取细胞内皮生长因子(vegf-b186)的基因序列，选择原核表达载体pet-32a，送去苏州泓迅生物公司合成，即构建表达载体vegf-b186，鉴定正确后用于表达目的蛋白。
15.1.2.2 vegf-b186的表达和纯化
16.取鉴定正确的菌液在小瓶中进行活化，过夜培养，第二天转入大瓶摇菌，生长处于对数期，od
600
为0.6～0.8时，加入终浓度为0.01mm的iptg诱导表达目的蛋白，诱导过夜培养，离心10000rpm，10min，收集菌体。
17.称取菌体，按1∶10加入破菌液进行超声破碎，确定vegf-b186蛋白表达在上清。超声破碎后离心收集上清，过镍柱纯化，采用梯度浓度的咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，根据sds-page凝胶电泳胶图，选取洗脱纯度和浓度都较高的洗脱样品，透析除去咪唑，测浓度后用于免疫。
18.二 免疫
19.2.1大肠癌细胞sw837免疫鸡
20.大肠癌细胞sw837扩大培养至106，免疫下蛋母鸡。在母鸡的翅膀皮下进行注射，第一次免疫，0.5ml，加完全佐剂。10天后进行第二次免疫，0.5ml，加不完全佐剂。10天后再次免疫，0.5ml，不加佐剂。免疫60天后收集鸡蛋进行即可纯化获得igy。
21.2.2 vegf-b186免疫鸡
22.在下蛋母鸡的翅膀皮下注射，第一次免疫，取vegf-b186抗原1mg溶于pbs 0.5ml，加完全佐剂。10天后进行第二次免疫，取vegf-b186抗原2mg溶于pbs 0.5ml，加不完全佐剂；10天后进行第三次免疫，取vegf-b186抗原2mg溶于pbs 0.5ml，不加佐剂。免疫60天后收集鸡蛋进行纯化。
23.三 igy的纯化
24.3.1将鸡蛋打孔，蛋黄分离蛋黄吸入烧杯中，取蛋黄进行纯化。
25.3.2用量筒称量毫克数，加十倍体积双蒸水搅拌均匀，至蛋黄完全溶解后放置4℃冰箱过夜。
26.3.3将溶解后的蛋黄离心，取上清液。
27.3.4将离心后的蛋黄放置搅拌器上，缓慢加入25％的硫酸铵沉淀后，放置4℃冰箱过夜。
28.3.5将硫酸铵沉淀后的蛋黄离心，取沉淀物加水至原体积回溶。
29.3.6回溶后放置搅拌器上缓慢加15％无水硫酸钠沉淀后室温过夜。
30.3.7将无水硫酸钠沉淀后的蛋黄离心取沉淀物加水至原体积回溶。
31.3.8回溶后的鸡蛋抗体用pbs透析(4小时一次，共16小时)。
32.3.9透析后的鸡蛋抗体离心取上清，加防腐剂、取小样、检测。
33.四 抗体igy偶联抗癌药物(5-氟-2'-脱氧尿酐)
34.4.1取100mg 5-氟-2
’‑
脱氧尿酐溶于3ml二氯甲烷，然后加入0.2ml三乙胺，40ml丁二酸酐，室温反应过夜，蒸干溶剂得到含羧基的5-氟-2'-脱氧尿酐单琥珀酸酯。
35.4.2取50mg 5-氟-2
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脱氧尿酐单琥珀酸酯溶于2mldmf中，加入活化剂edc 40mg、nhs 25mg，室温反应过夜，得到活化的5-氟-2
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脱氧尿酐单琥珀酸酯溶液。
36.4.3取10mg活化的5-氟-2
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脱氧尿酐单琥珀酸酯溶液，滴入溶有260mg igy(sw837)的pbs溶液中，搅拌过夜，装入透析袋pb充分透析。经高速冷冻离心机离心后取上清溶液得到最终偶联产物。
37.五 抗癌药物毒理实验
38.5.1急性中毒实验：动物实验结果无毒性。
39.5.2遗传精子实验：精子畸形率在正常范围内。
40.5.3嗜依红细胞微核试验结果表明该受试物对小鼠骨嗜多染红细胞没有致突变作用。
41.5.4 30天喂养试验：各组动物活动，生长正常，被毛浓密有光泽，食量正常，体重略有增加。
42.六 产品
43.6.1商品名称待定
44.6.2剂型：粉剂袋装或者液体瓶装。