一种纳米凝胶的流动式合成装置

本实用新型属于生物医用材料合成技术领域，尤其涉及一种纳米凝胶的流动式合成装置。

背景技术：

蛋白治疗由于其高特异性、低毒性的特点，引起了人们的广泛关注。然而，直接递送蛋白，会存在递送效率低、引起免疫反应等问题。药物载体是解决这些问题的有效途径，然而，目前的药物载体大多使用间歇式合成装置、存在制备过程复杂、价格昂贵等问题，限制了其在临床中的应用和发展。因此，开发一种制备简单、生物相容性好、成本低的药物载体仍是目前亟待解决的问题。

聚乙二醇(peg)是目前纳米药物载体中常用的亲水性聚合物，具有良好的亲水性，生物相容性等优势。在纳米粒子表面连接peg可以抗血液中蛋白吸附，减少因调理作用而导致的药物被过早清除，延长药物在体内的循环时间，进而可以更好的利用增强渗透和滞留效应(epr)实现对肿瘤组织的被动靶向作用，提高药物的治疗效果。聚赖氨酸是一种天然高分子材料，具有很好的生物相容性和可生物降解性，目前已经被国家食品药品监督管理局批准用于食品、生物医用材料等领域。由于蛋白药物存在修饰后易失活等问题，目前聚赖氨酸和peg形成的纳米药物递送系统主要以自组装为主，这不可避免的出现药物泄漏、稳定性差等问题(yuj,lix,luoy,etal.colloidsandsurfacesb:biointerfaces,2013:213-219.)。因此，若能在不修饰蛋白药物的前提下，以共价键网络结构递送蛋白药物，可有效的解决上述存在问题。

在生产过程中，生产工艺也是需要考虑的主要问题。间歇式的合成装置是目前生产工艺中最常用的合成装置，特别是釜式合成装置，但是这种合成装置在进行放大实验时往往存在散热不均匀等问题。因此，利用管道装置，开发一种流动式的合成装置，有利于提高合成材料与外界之间的热交换，这对一些热敏感的物质以及热敏感的反应具有重要意义。基于peg和聚赖氨酸优异的生物相容性以及流动式装置良好的散热能力，本实用新型设计了一种纳米凝胶的流动式合成装置。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术纳米药物载体制备过程复杂、合成装置有限等问题，本实用新型提供一种纳米凝胶的流动式合成装置，该装置可以增大反应物与外界热交换的比表面积，降低温度对反应物及聚合反应的影响，有利于液体的混合均匀，该装置的合成条件温和，在生物医用领域具有广泛的应用前景。

为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：

一种纳米凝胶的流动式合成装置，包括依次连接的注射泵进样系统、管道合成系统、产品后处理系统、产品收集系统，所述注射泵进样系统包括液体进样系统、气体进样系统、液体混合管道，所述液体进样系统通过所述液体混合管道与所述管道合成系统一端连接，所述气体进样系统直接与所述管道合成系统连接。

作为本实用新型技术方案的优选，所述液体进样系统包括液体注射泵、与液体注射泵连接的液体进样器、与液体进样器连接的进液管道，所述进液管道与所述液体混合管道连接，所述气体进样系统包括气体注射泵、与气体注射泵连接的气体进样器、与气体进样器连接的进气管道，所述进气管道与所述管道合成系统连接。

本实用新型的技术方案中，所述液体进样器的数量为两个及以上。

所述气体进样系统位于液体进样系统与管道合成系统的交接处及交接处后附近，以使预混合的两种液体在液体混合管道内混合。

作为本实用新型的技术方案的优选，所述管道合成系统包括产品合成管道，所述产品后处理系统包括透析管道和产品透析池，所述透析管道浸在所述产品透析池内，所述产品收集系统包括产品收集管道和位于产品收集管道后的产品收集器；

进一步优选地，所述透析管道一端与所述产品合成管道连接，另一端与所述产品收集管道连接。

作为本实用新型的技术方案的优选，所述进液管道、所述进气管道、所述液体混合管道、所述产品合成管道、所述透析管道、所述产品收集管道的直径相匹配。

作为本实用新型技术方案的优选，所述进液管道和所述进气管道的长度分别为20-40cm；

作为本实用新型技术方案的优选，所述液体混合管道的长度为10-30cm，直径为1-3mm。

作为本实用新型技术方案的优选，所述产品合成管道的长度为0.5-10m，直径为1-3mm。

作为本实用新型技术方案的优选，所述透析管道长度为0.5m-5m，进一步优选地，所述透析管道为mw8000-15000da的透析袋。

一种利用上述纳米凝胶的流动式合成装置合成纳米凝胶的方法，按照下述步骤进行：

(1)将蛋白、巯基化聚赖氨酸的混合液作为第一溶液注入其中一个液体进样器中，将peg-mal作为第二溶液注入另一个液体进样器中，两种溶液在液体混合管道混合；

(2)通过气体注射器在管道合成系统中注射气体，使上述混合液体与气体注射器的气体混合，在气体剪切作用下，两液体进样器的液体以小液滴的形式在管道合成系统中合成产品；

(3)将所得产品在产品后处理系统进行透析；

(4)透析后的产品进入产品收集系统，得到以蛋白质为内核、以聚赖氨酸和聚乙二醇形成的高分子材料为外壳的纳米凝胶。

作为本实用新型技术方案的优选，所述步骤(1)中，蛋白的浓度为0.5-20mg/ml；优选地，巯基化聚赖氨酸浓度为1-28mg/ml；优选地，peg-mal浓度为0.1-23mg/ml；进一步优选地，蛋白：巯基化聚赖氨酸：peg-mal的摩尔比为1：60-300：2-25。

作为本实用新型技术方案的优选，所述步骤(1)中，通过注射泵控制液体进样器的流速为0.01ml/min-0.5ml/min，两所述液体进样器的流速比为1:1；

所述步骤(2)中，液体进样器流速：气体进样器流速为1:1-10；优选地，气体进样器的流速为：0.01ml/min-1ml/min。

作为本实用新型技术方案的优选，所述蛋白为牛血清白蛋白、过氧化氢酶、尼妥珠单抗、西妥昔单抗、颗粒酶b中的一种；所述peg-mal为8armpeg-mal、2armpeg-mal或4arm-peg-mal中的一种；所述气体进样器的气体为空气、氮气、氩气中的一种。

作为本实用新型技术方案的优选，所述巯基化聚赖氨酸的分子量为2kda-6kda，所述8arm-peg-mal的分子量为4kda-15kda。

在上述技术方案中，所述步骤(2)中，两种预混合液体通过进液管道后进入液体混合管道，随后进气管道中的气体将连续流动的混合液体分割成单个小液滴，液滴进入产品合成管道，纳米凝胶在产品合成管道中形成后流入产品后处理系统中进行后处理。

在上述技术方案中，在所述步骤(3)的产品后处理系统中，透析管道是mw为8000-15000da的透析袋，长度为0.5m-5m，透析池中的液体为ph7.4的磷酸盐缓冲液。

本实用新型的有益效果是：与现有的技术相比，本实用新型的装置结构简单，可以增大反应物与外界热交换的比表面积，降低温度对反应物及聚合反应的影响；而且气体将连续流动的液体分隔成小液滴，一方面气体促进了液体的混合均匀，另一方面，聚赖氨酸和peg以小液滴为单元，发生迈克尔加成反应，反应更易进行，反应更完全，从而形成纳米凝胶产率高，包覆均匀，包覆效果好，纳米凝胶粒径更均匀，多分散性更小。由于反应过程进行的是迈克尔加成反应，使聚赖氨酸和peg形成的纳米药物之间结合牢固，从而避免了现有技术自组装方式存在的药物泄露、稳定性差的问题，进一步可以延长蛋白在体内的循环时间，提高药物在病灶处的富集，从而提高药效；纳米凝胶的合成方法操作简单，合成条件温和，在生物医用领域具有广泛的应用前景。该体系采用的原材料均为生物相容性良好的大分子，可以有效避免有毒小分子的使用，反应条件温和且反应过程中无有害副产物，对环境污染小。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本实用新型的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本实用新型纳米凝胶流动式合成装置示意图；

图2为本实用新型实施例2合成的纳米凝胶粒径图；

图3为本实用新型实施例2合成的纳米凝胶多分散指数图；

图4为本实用新型实施例2合成的纳米凝胶核磁图。

图中：1、气体进样器；2、液体进样器；3、进液管道；4、液体混合管道；5、产品合成管道；6、产品透析池；7、进气管道；8、透析管道；9、产品收集管道；10、产品收集器。

具体实施方式

为了使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本实用新型作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本实用新型保护的范围。

实施例1

参照附图1所示的结构，图中1为气体进样器；2为液体进样器；3为进液管道；4为液体混合管道；5为产品合成管道；6为产品透析池；7为进气管道；8为透析管道；9为产品收集管道；10为产品收集器。

本实施例的纳米凝胶的流动式合成装置，包括依次连接的注射泵进样系统、管道合成系统、产品后处理系统、产品收集系统，注射泵进样系统包括液体进样系统、气体进样系统、液体混合管道，液体进样系统通过液体混合管道与管道合成系统一端连接，气体进样系统直接与管道合成系统连接。

本实施例的液体进样系统包括液体注射泵、与液体注射泵连接的液体进样器、与液体进样器连接的进液管道，进液管道与液体混合管道连接，气体进样系统包括气体注射泵、与气体注射泵连接的气体进样器、与气体进样器连接的进气管道，进气管道与管道合成系统连接。气体进样系统位于液体进样系统与管道合成系统的交接处及交接处后，以使预混合的两种液体在液体混合管道内混合。

在进行纳米凝胶合成时，要求进液管道和进气管道的长度分别为20-40cm；液体混合管道的长度为10-30cm，直径为1-3mm，以使两个液体进样器的液体充分预混合。

其中，液体进样器的数量为两个及以上。本实施例中根据需要液体进样器的数量为2个，气体进样器的数量为1个，两个液体进样器分别装有两种预混合液体，气体进样器中装有预与混合液体混合的气体，用于将连续流动的液体分隔成小液滴，促进液体混合反应。

在本实施例中，产品后处理系统包括透析管道和产品透析池，透析管道浸在产品透析池内，产品收集系统包括产品收集管道和设置在产品收集管道后方的产品收集器，产品收集器可与产品收集管道连接，也可以不连接，二者的连接形式不受限制，只要能起到收集产品的作用即可；管道合成系统包括产品合成管道，该产品合成管道一端与液体混合管道连接，另一端与透析管道连接，透析管道另一端与产品收集管道连接。

作为本实施例的较佳方案，在纳米凝胶合成时，选择产品合成管道的长度为0.5-10m，直径为1-3mm。以保证液体混合管道内的液体在气体的作用下被充分分割成小液体，利于液体的混合反应。

此外，作为本实施例的另一较佳方案，选择透析管道长度为0.5m-5m，本实施例选用透析管道为mw8000-15000da的透析袋。在透析池内装入需要的透析液，透析池中的液体为ph7.4的磷酸盐缓冲液，用于除去体系中未反应的材料。

本实施例的装置在整体连接过程中，进液管道、进气管道、液体混合管道、产品合成管道、透析管道、产品收集管道的直径要相匹配，进气管道作为支路与产品合成管道主路连接；或者进液管道、液体混合管道、产品合成管道、产品收集管道、进气管道为一体成型的管道结构。

该装置可以增大反应物与外界热交换的比表面积，降低温度对反应物及聚合反应的影响；通过气体将连续流动的液体分隔成小液滴，一方面气体促进了液体的混合，另一方面，以小液滴为单元进行反应，有利于液体的混合均匀。

利用本实施例的装置可以进行纳米凝胶的合成，方法简单，合成条件温和。

需要说明的是，凡是通过原料在流动过程中合成凝胶的结构或与本实用新型的合成原理相同或相似的装置，均属于本实用新型的保护范围。

下面介绍将蛋白、巯基化聚赖氨酸的混合液作为第一溶液注入其中一个液体进样器中，将peg-mal作为第二溶液注入另一个液体进样器中，两种溶液在气体作用下混合合成纳米凝胶的实施例，以进一步说明利用本发明的装置合成纳米凝胶的过程。

实施例2

将0.2ml牛血清白蛋白(bsa)(10mg/ml)和1.8ml巯基化聚赖氨酸(8.4mg/ml,mn：2kda)混合均匀作为第一预混合溶液，然后将2ml8arm-peg-mal(1.2mg/ml,mn：4kda)作为第二种预混合溶液。随后将在两种预混合溶液分别装入两个液体进样器中，空气装入气体进样器中。如图1所示，使用两个不同的注射泵，分别控制液体进样流速为0.05ml/min，空气进样流速为0.2ml/min，进液管道和进气管道的长度均为20cm，液体混合管道的长度为10cm。气液混合后，液体以微液滴形式在长度为1m、直径为1mm的产品合成管道中合成，进液管道、进气管道、液体混合管道的直径与产品合成管道相同，均为1mm，以使各管道直径匹配可以衔接，图1中各管道为一体成型结构。随后进入0.5m长的透析管道中对ph7.4的磷酸盐缓冲液透析，最后在收集系统中收集所得纳米凝胶产品。

将本实施例得到的纳米凝胶产品进行粒径测试和电泳测试，并进行核磁分析，具体操作过程如下。

粒径和多分散指数测试：分别取bsa溶液(1mg/ml)和上述样品100μl置于样品皿中，采用动态光散射仪(zetapals，美国布鲁克-海文公司)在25℃条件下，测定溶液的粒径和多分散指数。得到的纳米凝胶粒径图如图2所示，得到的纳米凝胶多分散指数如图3所示。

电泳测试：分别取fitc标记的bsa溶液(1mg/ml)和fitc标记的纳米凝胶溶液20μl加入4μl甘油，混合均匀后分别加入电泳槽中的琼脂糖凝胶孔洞中，采用电泳仪电源(dyy-6c型，北京六一仪器厂)在150v电压下，对电泳槽加压15-25min，随后取出凝胶用365nm紫外光激发，得到的纳米凝胶电泳图，观察荧光条带位置。

核磁分析：对合成的纳米凝胶溶液对去离子水透析48h，每4-6h换一次透析液，随后冻干处理，将冻干后样品溶于0.55mld2o并装入核磁谱中，室温下，采用400mhz液体核磁共振氢谱仪(德国布鲁克科技有限公司)测定氢谱。得到的纳米凝胶核磁谱图如图4所示。

从图2的粒径图中可以看出，bsa粒径在1.8nm-5.2nm，纳米凝胶的粒径与bsa的粒径相比明显增大，约为9.6-21.9nm，说明了纳米凝胶的成功制备。图3的多分散指数图中可以看出，流动式合成装置合成纳米凝胶的多分散指数是0.306±0.02，间歇式体系合成方式合成的纳米凝胶多分散指数是0.402±0.03，这说明流动式方法合成的纳米凝胶更加均匀。纳米凝胶的电泳图对包载结果进行了进一步验证，可以看到，纳米凝胶大部分在孔中，而bsa往正极方向移动表现为负电性，这是由于纳米凝胶中高分子壳层将bsa表面的电性覆盖，从而显示高分子材料中聚赖氨酸和peg的电性。在图4的¹hnmr中，可以看出，纳米凝胶既有巯基化聚赖氨酸在1.2-1.5ppm的亚甲基核磁峰，又有8arm-peg-mal在3.6ppm(-ch2cho-)的核磁峰，而马来酰亚胺基团(6.9ppm)的核磁峰消失，说明纳米凝胶表面形成了聚赖氨酸和聚乙二醇形成的高分子材料。综合以上结果，证明了纳米凝胶的成功制备。

实施例3

将3ml颗粒酶b(1mg/ml)和2.2ml巯基化聚赖氨酸(25mg/ml,mn3kda)混合均匀作为第一预混合溶液，然后将的5.2ml8arm-peg-mal(2.2mg/ml,mn6kda)作为第二种预混合溶液。随后将在两种预混合溶液分别装入两个液体进样器中，空气装入气体进样器中。使用两个不同的注射泵，分别控制控制液体进样流速为0.1ml/min，空气进样流速为0.1ml/min，进液管道和进气管道的长度均为25cm，液体混合管的长度为12cm，气液混合后，液体以微液滴形式在长度为2m的产品合成管道中合成，进液管道、进气管道、液体混合管、产品合成管道直径均为3mm，产品合成后进入0.6m长的透析管道中对ph7.4的磷酸盐缓冲液透析，最后在收集系统中收集。

实施例4

将0.8ml西妥昔单抗(5mg/ml)和7.2ml巯基化聚赖氨酸(16mg/ml,mn4kda)混合均匀作为第一预混合溶液，然后将8ml8arm-peg-mal(1.8mg/ml,mn10kda)作为第二种预混合溶液。随后将在两种预混合溶液分别装入两个液体进样器中，空气装入气体进样器中。使用两个不同的注射泵，分别控制液体进样流速为0.2ml/min，空气进样流速为0.4ml/min，进液管道和进气管道的长度均为30cm，液体混合管的长度为20cm，气液混合后，液体以微液滴形式在长度为5m的产品合成管道中合成，进液管道、进气管道、液体混合管、产品合成管道直径均为1mm，产品合成后进入0.5m长的透析管道中对ph7.4的磷酸盐缓冲液透析，最后在收集系统中收集。

实施例5

将0.5mlbsa(8mg/ml)和4.5ml巯基化聚赖氨酸(9mg/ml,mn6kda)混合均匀作为第一预混合溶液，然后将5ml8arm-peg-mal(1.6mg/ml,mn15kda)作为第二种预混合溶液。随后将在两种预混合溶液分别装入两个液体进样器中，氮气装入气体进样器中。使用两个不同的注射泵，分别控制液体进样流速为0.15ml/min，空气进样流速为0.35ml/min，进液管道和进气管道的长度均为24cm，液体混合管道的长度为10cm，气液混合后，液体以微液滴形式在长度为1.6m的产品合成管道中合成，进液管道、进气管道、液体混合管、产品合成管道直径均为2mm，产品合成后进入0.8m长的透析管道中对ph7.4的磷酸盐缓冲液透析，最后在收集系统中收集。

实施例6

将1mlbsa(12mg/ml)和9ml巯基化聚赖氨酸(12mg/ml,mn2kda)混合均匀作为第一预混合溶液，然后将10ml8arm-peg-mal(2mg/ml,mn8kda)作为第二种预混合溶液。随后将在两种预混合溶液分别装入两个液体进样器中，氩气装入气体进样器中。使用两个不同的注射泵，分别控制液体进样流速为0.12ml/min，空气进样流速为0.35ml/min，进液管道和进气管道的长度均为40cm，液体混合管道的长度为30cm，气液混合后，液体以微液滴形式在长度为8m的产品合成管道中合成，进液管道、进气管道、液体混合管、产品合成管道直径均为1mm，产品合成后进入1m长的透析管道中对ph7.4的磷酸盐缓冲液透析，最后在收集系统中收集。

实施例7

将5mlbsa(4mg/ml)和25ml巯基化聚赖氨酸(8.1mg/ml,mn6kda)混合均匀作为第一预混合溶液，然后将30ml4arm-peg-mal(1.6mg/ml,mn8kda)作为第二种预混合溶液。随后将在两种预混合溶液分别装入两个液体进样器中，氮气装入气体进样器中。使用两个不同的注射泵，分别控制液体进样流速为0.5ml/min，空气进样流速为1ml/min，进液管道和进气管道的长度均为24cm，液体混合管道的长度为30cm，气液混合后，液体以微液滴形式在长度为10m、直径为1.5mm的产品合成管道中合成，进液管道、进气管道、液体混合管、产品合成管道直径均为1.5mm，产品合成后进入0.8m长的透析管道中对ph7.4的磷酸盐缓冲液透析，最后在收集系统中收集。

以上对本实用新型的实例进行了详细说明，但所述内容仅为本实用新型的较佳实施例，不能被认为用于限定本实用新型的实施范围。凡依本实用新型申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本实用新型的专利涵盖范围之内。