新型癌抗原及所述抗原的抗体的制作方法

本公开涉及分离的抗体，其与xpr1，nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，manscl，slc12a2，cdcp1，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，tmprss4中任一种蛋白质结合，或识别该蛋白质。
背景技术：
：因为抗体在血浆中是高度稳定的并且引起很少的副作用，因此已经作为药物受到关注。其中许多igg型抗体药物已推出，并且目前正在开发大量抗体药物(非专利文献1和2)。迄今为止，针对cd20的利妥昔单抗(rituxan)、针对egfr的西妥昔单抗(cetuximab)、针对her2的曲妥珠单抗(herceptin)等已被批准为使用抗体药物的癌症治疗药物(非专利文献3)。这些抗体分子与他们在癌细胞上表达的抗原相结合，从而通过adcc活性等针对癌细胞发挥细胞毒性。已知这种基于adcc活性等的细胞毒性活性取决于治疗性抗体的靶细胞上所表达的抗原数目(非专利文献4)。因此，从治疗性抗体的效果的观点来看，靶向抗原的高表达水平是优选的。然而，如果抗原(尽管具有高表达水平)是在正常组织中表达，则针对正常细胞发挥基于adcc活性等的细胞毒性。因此，副作用成为了严重问题。因此，治疗性抗体作为癌症治疗药物所靶向的抗原，优选在癌细胞上特异性表达。例如，针对已知为癌抗原的epcam的抗体分子，作为癌症治疗药物被认为是有前景的。但是已知epcam也会在胰腺中表达。实际上，在临床试验中已有报道，由于针对胰腺的细胞毒性，施用抗epcam抗体导致胰腺炎作为副作用(非专利文献5)。在基于adcc活性发挥细胞毒性的抗体药物成功之后，已经报道了发挥强大细胞毒性活性的第二代改良抗体分子作为以下各项的结果：例如，通过从天然人igg1fc区的n连接寡糖去除岩藻糖来增强adcc活性(非专利文献6)，或通过经由天然人igg1fc区的氨基酸置换增强与fcγriiia的结合而增强adcc活性(非专利文献7)。也已经报道了改进的抗体分子和小分子抗体作为在如上所述的nk细胞介导的adcc活性以外的机制下发挥针对癌细胞的细胞毒性活性的抗体药物，其中所述改进的抗体分子发挥更强的细胞毒性活性，诸如含有与具有强细胞毒性活性的药物缀合的抗体的抗体药物缀合物(adc)(非专利文献8)，其中所述小分子抗体通过招募t至癌细胞来发挥对癌细胞的细胞毒性活性(非专利文献9)。这样的发挥更强细胞毒性活性的抗体分子对即使表达不高水平的抗原的癌细胞也发挥细胞毒性活性，但也对低水平表达抗原的正常组织发挥细胞毒性活性，与癌细胞类似。实际上，与西妥昔单抗(针对egfr的天然的人igg1)相比，egfr-bite(一种针对cd3和egfr的双特异性抗体)能够通过将t细胞招募到癌细胞而对癌细胞发挥强烈的细胞毒性活性并发挥抗肿瘤作用。另一方面，还发现通过将egfr-bite施用至食蟹猴出现严重的副作用，因为egfr也在正常组织中表达(非专利文献10)。此外，由于cd44v6也在正常组织中表达，因此临床上已经发现含有与针对在癌细胞上高表达的cd44v6的抗体缀合的dm1(mertansine)的adc比伐珠单抗(bivatuzumab)dm1会引起严重的皮肤毒性和肝毒性(非专利文献11)。如上所述，使用能够对低水平表达抗原的癌细胞发挥强细胞毒性活性的抗体需要靶抗原以极其癌症特异性的方式表达。然而，考虑到曲妥珠单抗的靶抗原her2或西妥昔单抗的靶抗原egfr也在正常组织中表达，只有有限数量的癌抗原可以以极其癌症特异性的方式表达。因此，尽管可以增强针对癌症的细胞毒性活性，可归因于对正常组织的细胞毒性作用的不良反应可能成为问题。已经开发了各种技术作为适用于第二代抗体药物的技术。例如，已经报道了改善效应子功能、抗原结合能力、药代动力学或稳定性或降低免疫原性风险的技术(非专利文献12)，为了解决前述副作用，使抗体药物特异性作用于目标癌组织，仍存在对在正常组织中几乎确认不到表达或较轻微表达而在癌细胞中特异性表达的抗原进行鉴定的需要。现有技术文献非专利文献非专利文献1：monoclonalantibodysuccessesintheclinic.janicemreichert，clarkjrosensweig，laurabfaden&amp；matthewcdewitz，nat.biotechnol.(2005)23，1073-1078非专利文献2：thetherapeuticantibodiesmarketto2008.pavlouak，belseymj.，eur.j.pharln.biopharm.(2005)59(3)，389-396非专利文献3：monoclonalantibodies：versatileplatformsforcancerimmunotherapy.weinerlm，suranar，wangs.，nat.rev.immunol.(2010)10(5)，317-327非专利文献4：differentialresponsesofhumantumorcelllinestoanti-p185her2monoclonalantibodies.lewisgd，figarii，fendlyb，wongwl，carterp，gormanc，shepardhm，cancerimmunol.immunotherapy(1993)37，255-263非专利文献5：ing-1，amonoclonalantibodytargetingep-caminpatientswithadvancedadenocarcinomas.debonojs，tolcheraw，foreroa，vanhovegf，takimotoc，bauerrj，hammondla，patnaika，whiteml，shens，khazaelimb，rowinskyek，lobuglioaf，clin.cancerres.(2004)10(22)，7555-7565非专利文献6：non-fucosylatedtherapeuticantibodiesasnext-generationtherapeuticantibodies.satohm，iidas，shitarak.，expertopin.biol.ther.(2006)6(11)，1161-1173非专利文献7：optimizingengagementoftheimmunesystembyanti-tumorantibodies：anengineer′sperspective.desjarlaisjr，lazarga，zhukovskyea，chusy.，drugdiscov.today(2007)12(21-22)，898-910非专利文献8：antibody-drugconjugates：targeteddrugdeliveryforcancer.alleysc，okeleynm，senterpd.，curr.opin.chem.biol.(2010)14(4)，529-537非专利文献9：bite：teachingantibodiestoengaget-cellsforcancertherapy.baeuerlepa，kuferp，bargour.，curr.opin.mol.ther.(2009)11(1)，22-30非专利文献10：tcell-engagingbiteantibodiesspecificforegfrpotentlyeliminatekras-andbraf-mutatedcolorectalcancercells.lutterbueser，raumt，kischelr，hoffmannp，mangolds，rattelb，friedrichm，thomaso，lorenczewskig，raud，schallere，herrmanni，wolfa，urbigt，baeuerlepa，kuferp.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2010)107(28)，12605-12610非专利文献11：phaseitrialwiththecd44v6-targetingimmunoconjugatebivatuzumabmertansineinheadandnecksquamouscellcarcinoma.riechelmannh，sautera，golzew，hanftg，schroenc，hoermannk，erhardtt，gronaus.，oraloncol.(2008)44(9)，823-829非专利文献12：antibodyengineeringforthedevelopmentoftherapeuticantibodies.kimsj，parky，honghj.，mol.cells.(2005)20(1)，17-29技术实现要素：发明所要解决的问题本公开的发明是鉴于前述情形作出的，在非限定的一种实施方式中，本发明的目的在于提供抗体，其结合或识别在正常组织中几乎确认不到表达或较轻微表达而在癌细胞中特异性高表达的抗原。解决问题的手段在非限定的一种实施方式中，发明人进行了深入研究，结果作为在癌组织中的蛋白质表达较高而在邻接正常组织及正常组织中表达较低的细胞表面蛋白质，发现了xpr1，nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，cdcp1，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21及tmprss4。另外，发明人发现这些蛋白质为在大肠癌组织(特别是具有kras突变的大肠癌组织)和/或在肺癌组织中高表达的、癌特异性高的抗原。本公开是基于这样的见解作出的，具体而言包括以下例示记载的实施方式。[1]分离的抗体，其与下述任一种蛋白质结合：xpr1，nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，manscl，slcl2a2，cdcpl，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，tmprss4。[2]根据[1]所述的抗体，其与前述蛋白质的胞外域结合。[3]根据[1]或[2]所述的抗体，其与下述任一种结合，(1)如seqidno：1所示的xpr1，(2)如seqidno：2所示的nox1，(3)如seqidno：3所示的marveld3同工型1，(4)如seqidno：4所示的marveld3同工型2，(5)如seqidno：5所示的spint2，(6)如seqidno：7所示的manscl，(7)如seqidno：8所示的slc12a2，(8)如seqidno：9所示的cdcp1，(9)如seqidno：12所示的sez6l2，(10)如seqidno：13所示的flvcr1，(11)如seqidno：14所示的slc7a5，(12)如seqidno：15所示的steap1，(13)如seqidno：16所示的mmp14，(14)如seqidno：17所示的tnfrsf21，及(15)如seqidno：18所示的tmprss4。[4]根据[1]或[2]所述的抗体，其与下述任一种结合，(1)xpr1的胞外域，其为如seqidno：1所示的氨基酸序列中的下述任一个：氨基酸第1位～第108位，第111位～第122位，第159位～第171位，第177位～第216位，第423位～第448位，第473位～第502位，第660位～第670位，第674位～第696位，第177位～第190位，第428位～第448位，第660位～第670位，第244位，第256位～第273位，第257位～第270位，第258位～第264位，第258位～第268位，第256位～第270位，第258位～第273位，第260位～第270位，第293位～第314位，第336位～第343位，第337位～第344位，第338位～第341位，第340位～第342位，第340位～第344位，第343位～第344位，第340位～第345位，第368位～第372位，第392位～第398位，第397位～第401位，第398位～第402位，第420位～第442位，第420位～第506位，第465位～第479位，第497位～第507位，第498位～第508位，第529位～第555位，第529位～第570位，第582位～第586位，第1位～第234位，第1位～第236位，第293位～第318位，第367位～第442位，第369位～第473位，第500位～第507位，第529位～第696位，第589位～第696位，(2)nox1的胞外域，其为如seqidno：2所示的氨基酸序列中的下述任一个：氨基酸第44位～第54位，第131位～第161位，第242位～第258位，第1位～第4位，第1位～第11位，第18位～第55位，第28位～第44位，第31位～第44位，第32位～第46位，第34位～第50位，第70位～第102位，第70位～第103位，第117位～第176位，第120位～第172位，第122位～第166位，第122位～第172位，第124位～第168位，第190位～第208位，第191位～第204位，第223位～第266位，第223位～第267位，第227位～第269位，第228位～第391位，第228位～第396位，第404位，第420位～第564位；(3)marveld3同工型1的胞外域，其为如seqidno：3所示的氨基酸序列中的下述任一个：氨基酸第222位～第266位，第223位～第269位，第227位～第264位，第227位～第268位，第229位～第263位，第231位～第265位，第321位～第362位，第322位～第357位，第323位～第357位，第324位～第357位，第324位～第358位；及(4)marveld3同工型2的胞外域，其为如seqidno：4所示的氨基酸序列中的下述任一个：氨基酸第101位～第111位，第163位～第198位，第1位～第266位，第1位～第270位，第216位～第271位，第222位～第269位，第226位～第271位，第227位～第268位，第227位～第271位，第248位～第271位，第316位～第364位，第322位～第360位，第323位～第359位，第324位～第360位，第326位～第360位，第327位～第360位。[4a]根据[1]，[2]，[3](1)，[4](1)中任一项所述的抗体，其能够与xpr1结合，所述抗体选自下组：(a1)抗体，其包含由seqidno：35的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：36的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：37的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：38的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：39的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：40的氨基酸序列组成的hvr-l3；(a2)包含seqidno∶41的vh序列及seqidno：42的vl序列的抗体；(a3)与(a1)～(a2)中的任一抗体与xpr1中的相同表位结合的抗体；(a4)与(a1)～(a2)中的任一抗体与xpr1的结合进行竞争的抗体；(a5)在竞争测定中，将(a1)～(a2)中的任一抗体与xpr1的结合阻止50％以上的抗体；(a6)包含与seqidno：41的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：42的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体。[4b]根据[1]，[2]，[3](2)，[4](2)中任一项所述的抗体，其能够与nox1结合，所述抗体选自下组：(b1)抗体，其包含由seqidno：67的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：68的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：69的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：70的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：71的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：72的氨基酸序列组成的hvr-l3；(b2)抗体，其包含由seqidno：75的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：76的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：77的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：78的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：79的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：80的氨基酸序列组成的hvr-l3；(b3)包含seqidno：73的vh序列及seqidno：74的vl序列的抗体；(b4)包含seqidno：81的vh序列及seqidno：82的vl序列的抗体；(b5)与(b1)～(b4)中的任一抗体与nox1中的相同表位结合的抗体；(b6)与(b1)～(b4)中的任一抗体与nox1的结合进行竞争的抗体；(b7)在竞争测定中，将(b1)～(b4)中的任一抗体与nox1的结合阻止50％以上的抗体；(b8)包含与seqidno：73的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：74的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体；(b9)包含与seqidno：81的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：82的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体。[4c]根据[1]，[2]，[3](3)，[3](4)，[4](3)，[4](4)中任一项所述的抗体，其能够与marveld3同工型1和/或marveld3同工型2结合，所述抗体选自下组：(c1)抗体，其包含由seqidno：43的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno∶44的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：45的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：46的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：47的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：48的氨基酸序列组成的hvr-l3；(c2)抗体，其包含由seqidno：51的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：52的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：53的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：54的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：55的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：56的氨基酸序列组成的hvr-l3；(c3)包含seqidno：49的vh序列及seqidno：50的vl序列的抗体；(c4)包含seqidno：57的vh序列及seqidno：58的vl序列的抗体；(c5)与(c1)～(c4)中的任一抗体与marveld3同工型1和/或marveld3同工型2中的相同表位结合的抗体；(c6)与(c1)～(c4)中的任一抗体与marveld3同工型1和/或marveld3同工型2的结合进行竞争的抗体；(c7)在竞争测定中，将(c1)～(c4)中的任一抗体与marveld3同工型1和/或marveld3同工型2的结合阻止50％以上的抗体；(c8)包含与seqidno：49的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：50的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体；(c9)包含与seqidno：57的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：58的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体。[5]根据[1]～[4c]中任一项所述的抗体，其具有细胞毒活性。[6]根据[1]～[5]中任一项所述的抗体，其具有内化活性。[7]根据[1]～[6]中任一项所述的抗体，其为单克隆抗体。[8]根据[1]～[7]中任一项所述的抗体，其为人抗体，人源化抗体或嵌合抗体。[9]根据[1]～[8]中任一项所述的抗体，其为抗体片段。[10]根据[1]～[8]中任一项所述的抗体，其为全长igg抗体。[11]根据[1]～[10]中任一项所述的抗体，其为多特异性抗体。[12]根据[11]所述的抗体，其进一步包含t细胞受体复合体结合结构域。[13]根据[11]或[12]所述的抗体，其中，前述多特异性抗体包含一个针对前述蛋白质的结合结构域。[14]根据[11]～[13]中任一项所述的抗体，其包含与fc7受体的结合活性降低的fc区。[15]根据[14]所述的抗体，其中，前述fc区具有低于igg1，igg2，igg3，或igg4的fc区的fcγ受体结合活性。[16]根据[12]或[15]所述的抗体，其中，前述抗体具有细胞毒活性，该细胞毒活性为t细胞依赖性细胞毒活性。[17]根据[12]～[16]中任一项所述的抗体，其中，前述t细胞受体复合体结合结构域为具有对于t细胞受体的结合活性的t细胞受体结合结构域。[18]根据[12]～[16]中任一项所述的抗体，其中，前述t细胞受体复合体结合结构域为具有对于cd3的结合活性的cd3结合结构域。[19]根据[18]所述的抗体，其中，前述cd3结合结构域能够与cd3g链结合。[20]根据[18]或[19]所述的抗体，其中，前述cd3结合结构域为包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区的结构域。[20a]根据[18]～[20]中任一项所述的抗体，其中，前述cd3结合结构域选自下组：(d1)结构域，其含有具有由seqidno：59的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：60的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：61的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：62的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：63的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：64的氨基酸序列组成的hvr-l3的抗体可变区；(d2)结构域，其含有具有seqidno：65的vh序列及seqidno：66的vl序列的抗体可变区；(d3)结构域，其含有与(d1)～(d2)中的任一抗体可变区与cd3中的相同表位结合的抗体可变区；(d4)结构域，其含有与(d1)～(d2)中的任一抗体可变区与cd3的结合进行竞争的抗体可变区；(d5)在竞争测定中，将(d1)～(d2)中的任一抗体可变区与cd3的结合阻止50％以上的抗体可变区含有结构域；(d6)结构域，其含有具有与seqidno：65的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：66的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体可变区。[21]根据[11]～[20a]中任一项所述的抗体，其中，前述多特异性抗体为双特异性抗体。[22]分离的核酸，其编码[1]～[21]中任一项所述的抗体。[23]宿主细胞，其包含[22]所述的核酸。[24][1]～[21]中任一项所述的抗体的制备方法，包括培养[23]所述的宿主细胞以制备抗体。[25]根据[24]所述的方法，其进一步包括从前述宿主细胞回收前述抗体的步骤。[26]免疫缀合物，其包含[1]～[21]中任一项所述的抗体及细胞毒性剂。[27]药物制剂，其包含[1]～[21]中任一项所述的抗体及药学上允许的载体。[28]根据[1]～[21]中任一项所述的抗体，其用作药物。[29]根据[1]～[21]中任一项所述的抗体，其用于治疗癌症。[30]根据[29]所述的抗体，其中，前述癌症为肺癌，前述抗体与xpr1，spint2，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，tmprss4中的任一种结合。[31]根据[30]所述的抗体，其中，前述肺癌为不具有选自egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达中的一个以上的肺癌。[32]根据[30]或[31]所述的抗体，其中，前述肺癌为肺腺癌。[33]根据[29]所述的抗体，其中，前述癌症为大肠癌，前述抗体与nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，cdcp1中的任一种结合。[34]根据[33]所述的抗体，其中，前述大肠癌为具有kras突变的大肠癌。[35]根据[1]～[21]中任一项所述的抗体，其用于诱导细胞毒活性。[36]根据[1]～[21]中任一项所述的抗体在制备药物中的用途。[37]根据[1]～[21]中任一项所述的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。[38]根据[37]所述的用途，其中，前述癌症为肺癌，前述抗体与xpr1，spint2，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，tmprss4中的任一种结合。[39]根据[38]所述的用途，其中，前述肺癌为不具有选白egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达中的一个以上的肺癌。[40]根据[38]或[39]所述的用途，其中，前述肺癌为肺腺癌。[41]根据[37]所述的用途，其中，前述癌症为大肠癌，前述抗体与nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，cdcp1中的任一种结合。[42]根据[41]所述的用途，其中，前述大肠癌为具有kras突变的大肠癌。[43]根据[1]～[21]中任一项所述的抗体在制备诱导细胞毒活性的药物中的用途。[44]治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括将[1]～[21]中任一项所述的抗体的有效量施用于该个体。[45]根据[44]所述的方法，其中，前述癌症为肺癌，前述抗体与xpr1，spint2，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，tmprss4中的任一种结合。[46]根据[45]所述的方法，其中，前述肺癌为不具有选自egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达中的一个以上的肺癌。[47]根据[45]或[46]所述的方法，其中，前述肺癌为肺腺癌。[48]根据[44]所述的方法，其中，前述癌症为大肠癌，前述抗体与nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，cdcp1中的任一种结合。[49]根据[48]所述的方法，其中，前述大肠癌为具有kras突变的大肠癌。[50]在个体中诱导细胞毒活性的方法，所述方法包括为了诱导细胞毒活性，将[1]～[21]中任一项所述的抗体的有效量施用于该个体的步骤。[51]生物学样品中xpr1，nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，cdcp1，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，或tmprss4的存在的检测方法，所述方法包括使能与作为检测对象的蛋白质结合的[1]～[21]中任一项所述的抗体在允许与作为检测对象的蛋白质结合的条件下，与该生物学样品进行接触。[52]生物学样品中癌细胞的检测方法，所述方法包括使[1]～[21]中任一项所述的抗体在允许与作为该抗体的抗原的蛋白质结合的条件下，与该生物学样品进行接触。[53]生物学样品中大肠癌细胞的检测方法，所述方法包括，使能够与nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，或cdcp1结合的[1]～[21]中任一项所述的抗体在允许与作为该抗体的抗原的蛋白质结合的条件下，与该生物学样品进行接触。[54]生物学样品中具有kras突变的大肠癌细胞的检测方法，所述方法包括使能够与nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，或cdcp1结合的[1]～[21]中任一项所述的抗体在允许与作为该抗体的抗原的蛋白质结合的条件下，与该生物学样品进行接触。[55]生物学样品中肺癌细胞的检测方法，所述方法包括，使能够与xpr1，spint2，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，或tmprss4结合的[1]～[21]中任一项所述的抗体在允许与作为该抗体的抗原的蛋白质结合的条件下，与该生物学样品进行接触。[56]生物学样品中不具有选自egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达中的一个以上的肺癌细胞的检测方法，所述方法包括使能够与xpr1，spint2，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，或tmprss4结合的[1]～[21]中任一项所述的抗体在允许与作为该抗体的抗原的蛋白质结合的条件下，与该生物学样品进行接触。附图说明[图1-1]示出各目标抗原候选的蛋白质表达的图。纵轴表示分子名称和蛋白质表达的定量值(ibaq值)，横轴表示经分析的组织。对源自各组织的所有样品的lc-ms数据(n＝3)全部进行作图。·在大肠癌组织中表示具有kras突变的样品，在肺癌组织中表示具有驱动突变的样品，o表示不具有前述突变的样品。[图1-2]参考图1-1的说明。[图1-3]参考图1-1的说明。[图1-4]参考图1-1的说明。[图1-5]参考图1-1的说明。[图1-6]参考图1-1的说明。[图1-7]参考图1-1的说明。[图1-8]参考图1-1的说明。[图1-9]参考图1-1的说明。[图1-10]参考图1-1的说明。[图1-11]参考图1-1的说明。[图1-12]参考图1-1的说明。[图1-13]参考图1-1的说明。[图1-14]参考图1-1的说明。[图1-15]参考图1-1的说明。[图1-16]参考图1-1的说明。[图2]示出marveld3的同工型1及2的氨基酸序列(分别为seqidno：3及4)的对齐的图。基于raleighd.r.etal.，mol.biol.cell21，2010的fig1a，用下划线示出了细胞外区域的部分。[图3-1]大肠癌样品中的marveld3同工型1及2特异性的肽的表达量比较。图3-1为示出marveld3同工型2的表达量，图3-2为示出marveld3同工型1的表达量的图。作为同工型2特异性的肽鉴定了ekpaemfef，作为同工型1特异性的肽鉴定了qldqqytilr，因此通过这些肽的信号强度比较了表达量。纵轴表示同工型1及2特异性的肽的信号强度，横轴表示大肠癌及邻接正常组织的样品名称(对于各样品，以n＝3实施了lc-ms分析)。黑色的误差棒为具有kras突变的样品，灰色的误差棒为不具有kras突变的样品。[图3-2]参考图3-1的说明。[图4-1]示出xpr1，nox1，marveld3同工型2(分别为seqidno：1，2，及4)的细胞表面局部分布分析结果的图。在各蛋白质的全长氨基酸序列中，在uniprot的拓扑(topology)信息中，跨膜区域以单线框圈出，细胞外区域以双线框圈出。虚线表示在过量表达细胞中鉴定的肽，黑下划线并将氨基酸加粗体的部分表示从内源性的蛋白鉴定的肽。[图4-2]参考图4-1的说明。[图4-3]参考图4-1的说明。[图5-1]示出nci-h2227细胞和hlc-1细胞中的xpr1表达量的图。[图5-2]示出caco-2细胞中的marveld3同工型2的表达量的图。[图6]示出被celltracefarred染色的级分(导入空质粒载体的细胞)和未被celltracefarred染色的级分(导入了人xpr1-myc表达质粒载体的细胞)的分别的alexa488染色的图。[图7]示出抗人xpr1/抗人cd3双特异性抗体的细胞增殖抑制率的图。[图8]示出抗人xpr1/抗人cd3双特异性抗体的细胞增殖抑制率的图。[图9]示出被celltracefarred染色的级分(导入空质粒载体的细胞)和未被celltracefarred染色的级分(导入了人marveld3同工型2表达质粒载体的细胞)的分别的alexa488染色的图。[图10]示出抗人marveld3同工型2/抗人cd3双特异性抗体的细胞增殖抑制率的图。[图11]示出未被celltracefarred及celltraceviolet染色的级分(导入了人nox1-strep的细胞)，被celltracefarred及celltraceviolet染色的级分(导入了nox1_nx1b_564-myc的细胞)，仅被celltracefarred染了色的级分(导入了空质粒载体的细胞)的分别的alexa488染色的图。具体实施方式i.定义术语“抗目标蛋白质抗体”或“与目标蛋白质结合的抗体”指这样的抗体：所述抗体能够以足够的亲和性与目标蛋白质结合，使得在当该抗体以目标蛋白质为靶时作为诊断剂和/或治疗剂有用。在一种实施方式中，对抗目标蛋白质抗体与无关的非目标蛋白质的结合的程度而言(例如通过放射免疫测定方法(radioimmunoassay：ria))测定时，为与抗体的目标蛋白质的结合的低于约10％。在特定的实施方式中，与目标蛋白质结合的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如：10-8m以下，例如10-8m～10-13m，例如：10-9m～10-13m)的解离常数(kd)。在特定的实施方式中，抗目标蛋白质抗体与目标蛋白质的表位结合，所述表位在来自不同物种的目标蛋白质之间处于保守。“亲和性”指在分子(例如：抗体)的1个结合部位与分子的结合配偶体(例如：抗原)之间的，非共价键的相互作用的合计强度。如果没有特别说明，在本说明书中使用的“结合亲和性”为反映某个结合对的成员(例如：抗体和抗原)之间的1：1相互作用的，固有的结合亲和性。分子x与其配偶体y的亲和性通常可以用解离常数(kd)来表示。对亲和性而言，可以用该
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中已知的普通方法，包括在本说明书中记载的那些进行测定。在下文中阐述作为用于测定结合亲和性的具体实例及例示性的实施方式。相对于参比多肽序列为“百分比(％)氨基酸序列同一性”的定义为：在以能得到最大的百分比序列同一性的方式将序列排列(且在必要时导入空位(gap))后，并将任何保守取代也不看做序列同一性的一部分时，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率比。对于以决定百分比氨基酸序列同一性为目标的比对而言，可以通过使用在该
技术领域：
的技术范围内的各种方法，例如：blast，blast-2，align，megalign(dnastar)软件，或genetyx(注册商标)(genetyxcorporation)等能够公开获取的计算机软件实现。本领域技术人员可以确定用于取得序列的对齐的适当参数，包括用于在要比较的序列的全长中实现最大的对齐而需要的任意算法。align-2序列比较计算机程序为genentech公司的著作，其源代码在美国著作权局(u.s.copyrightoffice，wasingtond.c.，20559)与用于使用者的文件一起被提交，以美国著作权登记编号txu510087登记。align-2程序能够从genentech公司(genentech，inc.，southsanfrancisco，california)公开获取，也可以从源代码编译。align-2程序被编译为用于在包含digitalunixv4.0d的unix操作系统上使用。全部的序列比较参数由align-2程序设定，未加更改。在氨基酸序列比较中使用align-2的情况下，给予的氨基酸序列a的对于给予的氨基酸序列b的，或与其的，或相对于其的％氨基酸序列同一性(或者也可以称为具有或包含对于给予的氨基酸序列b的，或与其的，或相对于其的某％氨基酸序列同一性的给予的氨基酸序列a)而言，如下计算：分率x/y的100倍。这里，x为根据序列比对程序align-2，在该程序的a及b的比对中相同的、作为一致评分的氨基酸残基的数量，y为b中的氨基酸残基的总数。应理解，在氨基酸序列a的长度与氨基酸序列b的长度不相等的情况下，a与b的％氨基酸序列同一性并不相等于b与a的％氨基酸序列同一性。如果没有特别说明，本说明书中使用的全部的％氨基酸序列同一性值为在前述较近段中所叙述的那样，使用align-2计算机程序而得到。在本说明书中术语“抗体”以最广泛的含义使用，只要显示期望的抗原结合活性即可，包括各种抗体结构，所述抗体结构包括单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如：双特异性抗体)及抗体片段，但不限于这些。“抗体片段”指这样的分子，所述分子包含与完全抗体进行结合的抗原发生结合的该完全抗体的一部分，但与该完全抗体不同。抗体片段的例子包括fv，fab，fab′，fab′-sh，f(ab′)2；双体(diabody)；线型抗体；单链抗体分子(例如：scfv)；及由抗体片段形成的多特异性抗体(多特异性抗体)，但不限于这些。术语“全长抗体”，“完全抗体”，及“全部抗体”在本说明书中能够相互交换使用，指具有与天然型抗体结构实质上类似的结构，或具有包含如本说明书中定义的fc区的重链的抗体。“天然型抗体”指伴之天然产生的各种结构的免疫球蛋白分子。例如，天然型igg抗体为由以二硫键键合的2个相同轻链和2个相同重链构成的，约150,000道尔顿的杂四聚体糖蛋白质。从n末端向c末端，各重链具有可变重链结构域或者也称为重链可变结构域的可变区(vh)，其后接续3个稳定结构域(ch1，ch2及ch3)。同样的，从n末端向c末端，各轻链为具有可变轻链结构域或者也称为轻链可变结构域的可变区(vl)，其后接续稳定轻链(cl)结构域。对抗体的轻链而言，根据其稳定结构域的氨基酸序列，可以归属于称为kappa(κ)及lambda(λ)的2种类型之一。术语“可变区”或“可变结构域”指抗体的重链或轻链的结构域，其参与抗体与抗原的结合。在天然型抗体的重链及轻链的可变结构域(分别为vh及vl)中，各结构域通常具有类似的结构，所述结构包含4个保守的框架区(fr)及3个超变区(hvr)。(例如参考kindtetal.kubyimmunology，6thed.，w.h.freemanandco.，page91(2007)。)利用1个vh或vl结构域就足以赋予抗原结合特异性了。再者，与某特定的抗原结合的抗体也可以是使用来自与该抗原结合的抗体的vh或vl结构域，筛选分别与vl或vh结构域互补的库并被分离而来。参考例如，portolanoetal.，j.immunol.150：880-887(1993)；clarksonetal.，nature352：624-628(1991)。本说明书中使用的术语“超变区”或“hvr”指抗体的可变结构域的各区域，所述区域在序列中是超级可变的(“互补决定区”或“cdr”(complementaritydeterminingregion))，和/或形成结构上确定的环(“超可变环”)，和/或包含抗原接触残基(“抗原接触”)。通常而言抗体包含6个hvr：：在vh中3个(h1，h2，h3)，及在vl中3个(l1，l2，l3)。本说明书中的例示的hvr包含以下情况：(a)在氨基酸残基26-32(l1)，50-52(l2)，91-96(l3)，26-32(h1)，53-55(h2)，及96-101(h3)的位置产生的超可变环(chothiaandlesk，j.mol.biol.196：901-917(1987))；(b)在氨基酸残基24-34(l1)，50-56(l2)，89-97(l3)，31-35b(h1)，50-65(h2)，及95-102(h3)的位置产生的cdr(kabatetal.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md(1991))；(c)在氨基酸残基27c-36(l1)，46-55(l2)，89-96(l3)，30-35b(h1)，47-58(h2)，及93-101(h3)的位置产生抗原接触(maccallumetal.j.mol.biol.262：732-745(1996))；及，(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，其包含hvr氨基酸残基46-56(l2)，47-56(l2)，48-56(l2)，49-56(l2)，26-35(h1)，26-35b(h1)，49-65(h2)，93-102(h3)，及94-102(h3)。如果没有特别说明，hvr残基及可变结构域中的其它残基(例如：fr残基)按照本说明书中的前述的kabat等进行编号。“构架区”或“fr”指除了超变区(hvr)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的fr通常包含4个fr结构域：fr1，fr2，fr3及fr4。据此，hvr及fr的序列通常按以下顺序表现在vh(或vl)中：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。本说明书中的术语“fc区”用于定义至少包含恒定区的一部分的免疫球蛋白重链的c末端区域。该术语包括天然型序列的fc区及突变体fc区。在一种实施方式中，人igg重链fc区为从cys226，或从pro230延伸到重链的羧基末端。其中，fc区的c末端的赖氨酸(lys447)或甘氨酸-赖氨酸(gly446-lys447)任选存在或不存在。在本说明书中如果没有特别限定，fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号遵循kabatetal.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.publichealthservice，naionalinstitutesofhealth，bethesda，md1991中记载的eu编号(numbering)系统(也称为euindex)。“功能性fc区”具备天然型序列fc区的“效应子功能”。例示的“效应子功能”包括c1q结合；cdc；fc受体结合；adcc；吞噬作用；细胞表面受体(例如：b细胞受体；bcellreceptor：bcr)的下游控制等。这样的效应子功能一般而言，fc区需要与结合结构域(例如：抗体可变结构域)组合，进而可使用例如在本说明书的定义中公开的各种测定方法进行评价。抗体的“类”指在抗体的重链中具备的稳定结构域或恒定区的类型。抗体中存在5个主要的类：iga，igd，ige，igg，及igm。然后，也可以在这之中再分为若干亚类(同种型)。例如：igg1，igg2，igg3，igg4，iga1，及iga2。将不同类的免疫球蛋白相对应的重链稳定结构域分别称为α，δ，ε，γ，及μ。“人抗体”为由人或者人细胞产生的抗体，或来自人抗体储备库(repertoiry)，或者具备与其它使用人抗体编码序列的非人供给源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。该人抗体的定义中明确地排除了含有非人的抗原结合残基的人源化抗体。“人源化”抗体指嵌合抗体，其包含来自非人hvr的氨基酸残基及来自人fr的氨基酸残基。在某些实施方式中，人源化抗体中实质上全部包含至少1个，典型为2个的可变结构域，在该可变区中，全部的、或者实质上全部的hvr(例如cdr)与非人抗体的那些相对应，并且，全部的、或者实质上全部的fr与人抗体的那些相对应。在人源化抗体中可以任意地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如：非人抗体)的“人源化形态”指经过人源化的抗体。术语“嵌合”抗体指所述抗体的重链和/或轻链的一部分来自于特定的供给源或物种，另一方面，重链和/或轻链的其余的部分来自不同的供给源或物种。本说明书中所述的术语“单克隆抗体”指从实质上均一的抗体的群体得到的抗体。即，构成该群体的各个抗体中，除了可能产生的突变抗体(例如：自然地产生的含有突变的突变抗体，或在单克隆抗体制备物的制备中产生的突变抗体。这样的突变体通常以少量存在)以外是相同的，和/或与相同的表位结合。与典型地包含对于不同决定基(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相对照，单克隆抗体制备物中的各单克隆抗体针对的是抗原上的单一的决定基。因此，限定词“单克隆”表示的抗体的特征为：从实质上均一的抗体的群体得到的，不应解释为通过任何特定的方法进行的抗体的制备求出的那些。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过包括但不限于杂交瘤法，重组dna法，噬菌体展示法，利用包含人免疫球蛋白基因位点的全部或一部分的转基因动物的方法在内的各种方式进行制备，用于制备单克隆抗体的这样的方法及其它例示的方法记载在本说明书中。参比抗体和“与相同表位结合的抗体”是指在竞争测定中，阻止该参比抗体与自身的抗原的结合的50％以上的抗体，另外，反过来说，参比抗体在竞争测定中将前述的抗体与自身的抗原进行的结合阻止50％以上。例示的竞争测定提供于本说明书中。在例示的竞争测定中，将固定了的目标抗原(xpr1，nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，cdcp1，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，或tmprss4)在包含与该目标抗原结合的第1已标记的抗体(例如：xpb0062，nxa0125，nxa0164，mda0279，或mda0314)，及对于关于与该目标抗原的结合而言与第1抗体的竞争能力进行测试的第2未标记的抗体的溶液中进行孵育。第2抗体可在杂交瘤上清液中存在。作为对照，将固定了的目标抗原在包含第1已标记的抗体，而不包含第2未标记的抗体的溶液中孵育。在允许相对于第1抗体的目标抗原的结合的条件下进行孵育后，将多余的未结合的抗体除去，对与固定了的目标抗原发生了结合的标记的量进行测定。在与对照样品相比，与固定了的目标抗原发生了结合的标记的量在测试样品中实质上减少的情况下，这显示关于第2抗体与目标抗原的结合而言与第1抗体发生竞争。参考harlowandlane(1988)antibodies：alaboratorymanualch.14(coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，ny)。fc受体“fc受体”或“fcr”指与抗体的fc区结合的受体。在一些实施方式中，fcr为天然型人fcr。在一些实施方式中，fcr为与igg抗体结合的(伽马受体)，包括fcγri，fcγrii，及fcγriii亚类的受体(包括这些受体的等位基因突变体及基于选择性剪接得到的形态)。fcγrii受体包括fcγriia(“活化受体”)及fcγriib(“抑制受体”)，它们主要在其细胞质结构域中具有不同而类似的氨基酸序列。活化受体fcγriia在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif：itam)。抑制受体fcγriib在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitionmotif：itim)。(参考例如，daeron，annu.rev.immunol.15：203-234(1997)。)fcr例如在ravetchandkinet，annu.rev.immunol9：457-92(1991)；capeletal.，immunomethods4：25-34(1994)；及dehaasetal.，j.lab.clin.med126：330-41(1995)中进行了总论。对其它fcr(包括将来鉴定出的那些)而言，也包含在本说明书的术语“fcr”中。术语“fc受体”或“fcr”还包括新生儿型受体fcrn，新生儿型受体fcrn承担母体的igg向胎儿的移动(guyeretal.，j.immunol.117：587(1976)及kimetal.，j.immunol.24：249(1994))以及免疫球蛋白的体内平衡的调节。测定与fcrn的结合的方法是公知的(参考例如，ghetieandward.，immunol.today18(12)：592-598(1997)；ghetieetal.，naturebiotechnology，15(7)：637-640(1997)；hintonetal.，j.biol.chem.279(8)：6213-6216(2004)；wo2004/92219(hintonetal.))。对与体内的人fcrn的结合及人fcrn高亲和性结合多肽的血浆半衰期而言，可例如在表达人fcrn的转基因小鼠或者转染而成的人细胞系中，或施用了带有突变fc区的多肽的灵长类中测定。在wo2000/42072(presta)中记载了与fcr的结合增加或减少的抗体突变体。也参考例如，shieldsetal.j.biol.chem.9(2)：6591-6604(2001)。“效应子功能”是指因为抗体的fc区造成的，在抗体的同种型之间不同的生物学活性。在抗体的效应子功能的实例中，包含以下情况：c1q结合及补体依赖性细胞毒性(complementdependentcytotoxicity：cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity：adcc)；吞噬作用；细胞表面受体(例如：b细胞受体)的下游控制；及b细胞活化。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”指细胞毒性的一种形态，其中，抗体的fc区与在特定的细胞毒性细胞(例如：nk细胞，中性粒细胞及巨噬细胞)上存在的fc受体(fcr)结合，由此使得这些细胞毒性效应细胞变得能够与具有抗原的目标细胞进行特异性结合，从而在之后通过细胞毒性杀伤该目标细胞。作为adcc介导的初级细胞的nk细胞仅表达fcγriii，单核白细胞表达fcγri，fcγrii，及fcγriii。关于造血细胞上的fcr的表达汇总于ravetchandkinet，annu.rev.immunol9：457-92(1991)的第464页的表3。为了评价目标分子的adcc活性，可实施体外adcc测定方法，例如美国专利第5,500,362号或者第5,821,337号或美国专利第6,737,056号(presta)中记载的那些。对于这样的测定方法有用的效应细胞包括pbmc及nk细胞。可替换或附加地，目标分子的adcc活性也可以在例如诸如clynesetal.pnas(usa)95：652-656(1998)公开的动物模型的动物模型中，在体内进行评价。补体依赖性细胞毒性“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”指在补体的存在下的目标细胞的溶解。对经典补体途径的活化而言，通过(适当的亚类的)抗体与(与相应抗原结合)的补体系统的第1要素(c1q)的结合开始。为了评价补体活化，可实施例如gazzano-santoroetal.，j.immunol.methods202：163(1996)中记载的cdc测定方法。带有经改造的fc区氨基酸序列的多肽突变体(带有突变fc区的多肽)，及发生增加或减少的c1q结合能力记载于例如美国专利第6,194,551号b1及wo1999/51642中。也参考例如idusogieetal.j.immunol.164：4178-4184(2000)。人效应细胞“人效应细胞”指表达1个或多个fcr，发挥效应子功能的白细胞。在特定的实施方式中，该细胞至少表达fcγriii，发挥adcc效应子功能。adcc介导的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell：pbmc)，自然杀伤(nk)细胞，单核白细胞，细胞毒性t细胞及中性粒细胞。效应细胞可从天然的供给源，例如血液进行分离。本公开的抗体与药物的复合体被摄入到细胞内时，通过与该复合体连接的增殖抑制剂或毒性肽等细胞毒性物质，能够在摄入了该抗体的细胞中诱导细胞死亡。因此，连接有增殖抑制剂或毒性肤等细胞毒性物质的抗体优选进一步具有内化活性。在本公开中，“具有内化活性的抗体”是指，与细胞表面上的靶蛋白质结合时被输送到细胞内(细胞质内、小胞内、其他小器官内等)的抗体。抗体是否具有内化活性，可以利用本领域技术人员所公知的方法来确认。例如，可以通过下述方法来确认：使结合有标记物质的抗体与表达该靶蛋白质的细胞接触，确认该标记物质是否被摄入到细胞内的方法：使结合有增殖抑制剂或毒性肤等细胞毒性物质的抗抗体与表达该靶蛋白质的细胞接触，结果，确认是否在该细胞中诱导细胞死亡的方法等。“免疫缀合物”为与1个或多个异源分子缀合而成的抗体(异源分子包括但不限于细胞毒性剂)。本说明书中的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻碍细胞的功能，和/或成为细胞死亡或破坏的原的物质。细胞毒性剂包括但不限于，放射性同位素(例如：211at，131i，125i，90y，186re，188re，153sm，212bi，32p，212pb及lu的放射性同位素)；化学疗法剂或化学疗法药(例如：甲氨蝶呤，阿霉素，长春花生物碱类(长春新碱，长春碱，依托泊苷)，多柔比星，美法仑，丝裂霉素c，氯霉素，柔红霉素，或其它嵌入剂)；增殖抑制剂；核酸分解酶等酶及其片段；抗生素；例如，低分子毒素或来源于细菌，真菌，植物，或动物的为酶活性的毒素(包括其片段和/或突变体)等毒素；及在下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。“裸抗体”指没有与异源的部分(例如：细胞毒部分)或放射性标记进行缀合的抗体。裸抗体也可以存在于药物制剂中。术语“药物制剂”指在其中包含的有效成分的生物学活性能够发挥效果的形态的制备物，且所述制备物不含有对施用制剂的受试者具有不允许程度的毒性的追加要素。“药学上允许的载体”指对于受试者无毒的，在药物制剂中的除有效成分以外的成分。药学上允许的载体包括但不限于，缓冲液，赋形剂，稳定剂或保存剂。某剂(例如药物制剂)的“有效量”指用于实现期望的治疗或预防结果有效的，在需要的用量中及在需要的期间里的量。本说明书中使用的“治疗”(及其语法上的衍生词例如“进行治疗”，“的治疗”等)意指意图在于改变被治疗的个体的自然经过的临床介入，也可以用于预防，也可以在临床的病情的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于，防止疾病的产生或复发，减轻症状，减弱由疾病引起的任意的直接或间接的病理性影响，防止转移，降低疾病的发展速度，恢复或缓和疾病状态，及缓解或预后的改善。在一些实施方式中，本公开的抗体用于减慢疾病的发病，或推迟疾病的发展。“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，饲养动物(例如，牛，绵羊，猫，犬，马)，灵长类(例例如，人，及猴等非人灵长类)，兔以及啮齿类(例如小鼠及大鼠)。在特定的实施方式中，个体或受试者为人。癌症术语“癌症”及“癌性”指或说明哺乳动物中的生理学状态，其由不受调控的细胞生长/增殖而典型地表征。癌的实例包括但不限于癌瘤(carcinoma)，淋巴瘤(例如：霍奇金及非霍奇金淋巴瘤)，母细胞瘤，肉瘤，及白血病。这些癌的更具体实例包括：扁平上皮细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，肺的扁平上皮癌，腹膜的癌，肝细胞癌，消化道癌，胰癌，神经胶质瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝细胞癌，白血病及其它淋巴细胞增殖性障碍，以及各种类型的头颈癌。肿瘤术语“肿瘤”指不论是恶性或良性的，全部的新生物性细胞生长及增殖以及全部的癌前期及癌性细胞及组织。当术语“癌”，“癌性”，“细胞增殖性障碍”，“增殖性障碍”及“肿瘤”在本说明书中提及时，不理解为相互排除的。在本说明书中，“驱动突变”是指成为癌的产生、恶性化的直接原因的基因突变，例如作为肺癌、大肠癌的重要的驱动突变，可列举在alk，ret/ros1，kras，egfr，braf，erbb2中的基因突变。作为驱动突变的非限定的例子，可列举例如记载于表2中的突变。在一种实施方式中，本公开的抗体对肺癌的治疗，预防，及诊断中的至少一种而言有用。在特定的实施方式中，本公开的抗体对不具有选自egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达中的一个以上的肺癌的治疗，预防，及诊断中至少一种而言有用。在另外的实施方式中，本公开的抗体对大肠癌的治疗，预防，及诊断中的至少一种而言有用。在特定的实施方式中，本公开的抗体对具有kras突变的大肠癌的治疗，预防，及诊断中的至少一种而言有用。“分离的”抗体为从其原本的环境的成分中分离而成的。在一些实施方式中，抗体通过例如电泳(例如，sds-page，等电点分离法(isoelectricfocusing：ief)，毛细管电泳)或色谱(例如：离子交换或反相hplc)进行测定，纯化至超过95％或99％的纯度。作为用于评价抗体的纯度方法的总论，参考例如，flatmanetal.，j.chromatogr.b848：79-87(2007)。“分离的”核酸指从其原本的环境的成分中分离的核酸分子。分离的核酸中，包括在通常包含该核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外，或存在于与原本的染色体上的位置不同的染色体上的位置。本公开的抗体“编码......的分离的核酸”指编码抗体的重链及轻链(或其片段)的1个或多个核酸分子，包括置于1个载体或各自的载体中的核酸分子，及存在于宿主细胞中的1个或多个位置的核酸分子。本说明书中使用的术语“载体”指核酸分子，其能够将与其连接的另一个核酸进行增加。该术语中包括作为自己复制核酸结构的载体，及组装到其被导入的宿主细胞的基因组中的载体。对某载体而言，能够执行与自身以致动性连接的核酸的表达。这样的载体在本说明书中也称为“表达载体”。术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，及“宿主细胞培养物”能够相互交换使用，意指导入有外来核酸的细胞(包括这样的细胞的后代)。宿主细胞中包括“转化体”及“转化细胞”，这其中包括初代的转化细胞及来自该细胞的后代(不论传代数)。后代可以在核酸的内容中与亲代细胞不完全相同，也可以包含突变。与原本的转化细胞在进行筛选或选择时使用的那些相比，具有相同功能或生物学活性的突变体后代也包括在本说明书中。ii.组合物及方法一方面，本公开一部分是基于在肺癌，大肠癌等癌中特异性高表达的蛋白质的发现。在特定的实施方式中，提供与xpr1，nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，cdcp1，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，tmprss4中任一目标蛋白质结合的抗体。本公开的抗体在例如肺癌，大肠癌等癌的诊断或治疗有用。例示的目标蛋白质对本说明书中的术语“目标蛋白质”而言，如果没有特别说明，指包括灵长类(例如：人)及啮齿类(例如：小鼠及大鼠)等哺乳动物的，来自任意脊椎动物供给源的任意天然型目标蛋白质。该术语也包括没有经受“全长”的加工的目标蛋白质，及因为细胞中的加工而产生的任何形态的目标蛋白质。该术语还包括自然产生的目标蛋白质的突变体，例如拼接突变体、等位基因突变体。将例示的本公开的目标蛋白质的氨基酸序列示于seqidno：1(xpr1)，seqidno：2(nox1)，seqidno：3(marveld3同工型1)，seqidno：4(marveld3同工型2)，seqidno：5(spint2)，seqidno：7(mansc1)，seqidno：8(slc12a2)，seqidno：9(cdcp1)，seqidno：12(sez6l2)，seqidno：13(flvcr1)，seqidno：14(slc7a5)，seqidno：15(steap1)，seqidno：16(mmp14)，seqidno：17(tnfrsf21)，及seqidno：18(tmprss4)中。例示的本公开的目标蛋白质的说明记载于下文中。xpr1xpr1(异嗜性和多嗜性逆转录病毒受体，xenotropicandpolytropicretrovirusreceptor)为用于异嗜性/多嗜性小鼠白血病病毒(xenotropic/polytropicmouseleukemiaviruses)(x/p-mlvs)感染而侵入细胞内的受体。xpr1包含696个氨基酸，其序列中具有6处天冬酰胺型糖链结合序列，8个跨细胞膜结构域，以及4个细胞外环(procnatlacadsciusa.1999；96：927-932.doi：10.1073/pnas.96.3.927.，procnatlacadsciusa.1999；96：1385-1390.doi：10.1073/pnas.96.4.1385.，natgenet.1999；21：216-219)。本蛋白质在细胞中原本的功能不明。在哺乳动物中没有找到与xpr1同源性高的分子，但确认在酵母中与参与g蛋白质结合分裂信号的syg1蛋白质(jbiolchem.1995；270：25435-25444)有一定的同源性。另外，在xpr1的n末端亲水性区域中，也发现了与脉孢菌(粗糙脉孢菌，neurosporacrassa)的nuc-2s，芽殖酵母(s.cerevisiae)的pho81和pho85(trendsgenet.1995；11：209-211，trendsbiochemsci.1996；21：383-387，molgengenet.1996；252：709-716)的同源性，虽然较低。这些分子参与磷酸的输送控制，因此考虑xpr1是否参与了信号传导，磷酸输送的调节(procnatlacadsciusa.1999；96：1385-1390.doi：10.1073/pnas.96.4.1385.)。另外，报告了在骨髓细胞、巨噬细胞中，xpr1的mrna表达由于rankl刺激而升高，提示了xpr1的表达受rankl-rank信号所控制(biochembiophysrescommun.2010aug20；399(2)：129-32)。xpr1具有4个细胞外环(ecl1～4)，尤其是作为用于病毒进行侵入的受体而重要的是ecl3和ecl4，已知该区域的氨基酸突变影响对病毒感染的敏感性的差异。(jvirol.2007oct；81(19)：10550-7，retrovirology.2009oct7；6()：87，jvirol.2010nov；84(22)：11970-80，jvirol.1999nov；73(11)：9362-8，retrovirology.2005dec15；2()：76，retrovirology.2010nov30；7：101，virology.2016oct；497：53-58)对于xpr1在癌中的表达、功能至今没有报告。xpr1[np_004727.2](seqidno：1)包含696个氨基酸，根据基于各种拓扑几何预测软件(psortii，uniprot，phobius，polyphobius)的分析，及论文信息(procnatlacadsciusa.1999；96：927-932.doi：10.1073/pnas.96.3.927.，procnatlacadsciusa.1999；96：1385-1390.doi：10.1073/pnas.96.4.1385.，natgenet.1999；21：216-219)，作为识别xpr1同工型1的trab抗体的表位，可认为是以下氨基酸区域：244，256-273，257-270，258-264，258-268，258-273，260-270，293-314，336-343，337-344，338-341，340-342，340-344，340-345，368-372，392-398，397-401，398-402，420-442，420-506，465-479，497-507，498-508，529-555，529-570，582-586。另一方面，两个拓扑几何预测软件(tmhmm，tmpred)对细胞外区域的预测有较大不同，作为识别xpr1同工型1的trab抗体的表位，可认为是以下氨基酸区域：1-234，1-236，293-318，367-442，369-473，500-507，529-696，589-696。nox1(nadphoxidasehomolog1，nadph氧化酶同源物1，noh1，mitogenicoxidase1，mox1，gp91-2)nadph氧化酶为承担产生ros的膜结合酶复合体，由为催化剂结构域的nox家族和其它数种蛋白质构成。nox家族已知有7种家族成员，即，nox1～5，duox1，2，nox1为其家族成员之一(physiolrev.2007，87，245-313，cellmollifesci.2012，69，2327-2343)。认为ros通常作为细胞毒性物质，致突变性物质发挥作用，通过对细胞造成损伤由此参与各种慢性疾病(动脉硬化，高血压，炎症)的发病(freeradicalbiol.med.，2007，43，332-347，cancersci.，2009，100(8)，1382-1388)。一方面，在癌中确认到ros水平的升高，认为ros对癌的进展起重要的功能(cancer.lett.，2008，266(1)，37-52)，实际上在众多癌种类中确认了nox/duox的表达升高(anticanceragentsmedchem.2013，13(3)：502-14，clinicalscience，2015，128，863-875)。在大肠癌中也确认了nox1的表达升高，特别是有报告称k-ras突变和nox1的表达一致(intjcancer.2008，123(1)：100-7)。报告称伴随着基于kras突变下游信号的活化而诱导衰老，但通过nox1产生的ros在衰老的诱导中发挥重要的功能(genescells.2013jan；18(1)：32-41)。nox1[np_008983.2](seqidno：2)包括546个氨基酸，根据基于各种拓扑几何预测软件(psortii，uniprot，tmhmm，tmpred，phobius，polyphobius)的分析，及论文信息(gene.2001，16；269(1-2)：131-40，biochembiophysrescommun.2014，17；443(3)：1060-5)，作为识别nox1的trab抗体的表位，可认为是以下氨基酸区域：1-4，1-11，18-55，28-44，31-44，32-46，34-50，70-102，70-103，117-176，120-172，122-166，122-172，124-168，190-208，191-204，223-266，223-267，227-269，228-391，228-396，404，420-564。marveld3(marveld3，marveld3，marvel3)上皮细胞、内皮细胞的细胞间贴附面称为紧密连接(tightjunction，tj)，由claudin，闭合蛋白(occludin)，tricellulin，及maveld3这4种蛋白质构成。其中闭合蛋白，tricellulin，及marveld3由于具有marvel结构域，因此被称为tj-associatedmarvel蛋白(tamp)家族。认为这些tj蛋白质均为在细胞内具有它们的n末端，c末端结构域，并具有2个细胞外环的4次跨膜蛋白质(mol.biol.cell.2010，21，1200-1213.doi：10.1091/mbc.e09-08-0734)。在marveld3中存在2个同工型(bmccellbiol.2009，dec22；10：95.doi：10)。同工型1[np_001017967.2](seqidno：3)编码410个氨基酸，同工型2[np_443090.4](seqidno：4)编码401个氨基酸。在使用了tmpred的基于氨基酸序列的结构预测中，marveld3也被推测为与其它tj蛋白质同样地，n末端，c末端在细胞内，且具有4个跨膜结构域和2个细胞外环的蛋白质(http：//www.ch.embnet.org/software/tmpred_form.html)。另外，在比较2个同工型的氨基酸序列时，n末端侧的198个氨基酸在两者中是共同的，但其以后的c末端侧序列在两个同工型中完全不同(bmccellbiol.2009，dec22；10：95.doi：10)。在培养细胞、各种内脏器官中，确认了同工型1，2两者在基因水平的表达，但对蛋白质水平的表达没有进行分析(bmccellbiol.2009，dec22；10：95.doi：10)。再者，对于2个同工型的功能差异等也不清楚。在内源性表达株或者强制表达株中的任意中，确认了marveld3与闭合蛋白一起在细胞连接中共同局部分布(bmccellbiol.2009，dec22；10：95.doi：10)。再者，显示，marveld3与homophilic在细胞膜上以顺式(cis)结合，且闭合蛋白，tricellulin也与heterophilic以顺式结合，显示通过与其它tamp的相互作用而参与tj形成(jcellsci2013，126：554-564)。对在癌中marveld3的功能而言，除了有报告在未分化的胰腺癌细胞，及在由snail蛋白诱导了emt的胰腺癌细胞中表达降低以外，几乎不知道(expcellres.2011，oct1；317(16)：2288-98)。通过基于各种拓扑几何预测软件(psortii，uniprot，tmhm，tmpred，phobius，polyphobius)基于分析，及论文信息(mol.biol.cell.2010，21，1200-1213.doi：10.1091/mbc.e09-08-0734，bmccellbiol.2009，dec22；10：95.doi：10)，作为识别marveld3同工型1的trab抗体的表位，可认为是以下氨基酸区域：222-266，223-269，227-264，227-268，229-263，231-265，321-362，322-357，323-357，324-357，324-358。同理，作为识别marveld3同工型2的trab抗体的表位，可认为是以下氨基酸区域：1-266，1-270，216-271，222-269，226-271，227-268，227-271，248-271，316-364，322-360，323-359，324-360，326-360，327-360。需要说明的是，在一部分预测软件的分析结果中，与前述不同，为具有3个跨膜结构域的结果。spint2spint2(kunitz-typeproteaseinhibitor2，kunitz型蛋白酶抑制剂2)[np_066925.1](seqidno：5)为抑制丝氨酸蛋白酶的具有二个细胞外kunitz结构域的跨膜蛋白质(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_066925.1)。mansc1mansc1(manscdomain-containingprotein1，含有mansc结构域的蛋白1)为[np_060520.2](seqidno：7)中所示的蛋白质(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_060520.2)。slc12a2slc12a2(solutecarrierfamily12member2，溶质运载蛋白家族12成员2)[np_001037.1](seqidno：8)为参与钠、氯化物的分泌、摄取的膜蛋白质，据称在离子平衡和细胞容积的控制中担负重要的功能(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_001037.1)。cdcp1cdcp1(cubdomain-containingprotein1，含有cub结构域的蛋白1)[np_073753.3](seqidno：9)为具有3个胞外域的跨膜蛋白质，已知其可被src家族激酶进行磷酸化(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_073753.3)。sez6l2sez6l2(seizure6-likeprotein2，seizure6样蛋白2)[np_963869.2](seqidno：12)为局部分布于细胞膜的蛋白质，据称可能与神经细胞中的内质网功能相关(https：//www.uniprot.org/uniprot/q6uxd5；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_963869.2)。flvcr1flvcr1(felineleukemiavirussubgroupcreceptor-relatedprotein1，猫白血病病毒c亚群受体相关蛋白1)[np_054772.1](seqidno：13)为血红素转运体的一种，认为在红细胞的形成中发挥重要功能(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_054772.1)。slc7a5slc7a5(solutecarrierfamily7member5，溶质载体家族7成员5)为[np_003477.4](seqidno：14)中所示的蛋白质，也称为大中性氨基酸转运小亚基1(largeneutralaminoacidstransportersmallsubunit1)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_003477.4)。steap1steap1(metalloreductasesteap1，金属还原酶steap1)为[np_036581.1](seqidno：15)中所示的蛋白质，作为金属还原酶具有将fe3+还原为fe2+的能力，及将cu2+还原为cu1+的能力(https：//www.uniprot.org/uniprot/q9uhe8；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_036581.1)。mmp14mmp14(基质金属蛋白酶14)为[np_004986.1](seqidno：16)中所示的蛋白质，具有分解细胞外基质等的内肽酶(endopeptidase)活性(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_004986.1)。tnfrsf21tnfrsf21(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember21，肿瘤坏死因子受体超家族成员21)为[np_055267.1](seqidno：17)中所示的蛋白质，认为其通过活化nfkappa-b、丝裂原活化蛋白激酶8而诱导细胞凋亡。也称为死亡受体6(dr6)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_055267.1)。tmprss4tmprss4(transmembraneproteaseserine4，跨膜蛋白酶丝氨酸4)为[np_063947.1](seqidno：18)中所示的蛋白质，可能为丝氨酸蛋白酶之一(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_063947.1)。a.例示的抗体在一个方面中，本公开提供与xpr1，nox1，marveld3同工型1，marveld3同工型2，spint2，mansc1，slc12a2，cdcp1，sez6l2，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，tmprss4中的任一目标蛋白质结合的，分离的抗体。在特定的实施方式中，本公开的抗体与前述目标蛋白质的胞外域结合。在特定的实施方式中，本公开的抗体具有细胞毒活性。在特定的实施方式中，本公开的抗体具有内化活性。在一个方面中，本公开提供能够与xpr1结合的抗体(xpr1结合抗体)。在特定的实施方式中，本公开的xpr1结合抗体以seqidno：1所示的xpr1氨基酸序列中的下组中任一种所示的序列作为表位：氨基酸第1位～第108位，第111位～第122位，第159位～第171位，第177位～第216位，第423位～第448位，第473位～第502位，第660位～第670位，第674位～第696位，第177位～第190位，第428位～第448位，第660位～第670位，第244位，第256位～第273位，第257位～第270位，第258位～第264位，第258位～第268位，第256位～第270位，第258位～第273位，第260位～第270位，第293位～第314位，第336位～第343位，第337位～第344位，第338位～第341位，第340位～第342位，第340位～第344位，第343位～第344位，第340位～第345位，第368位～第372位，第392位～第398位，第397位～第401位，第398位～第402位，第420位～第442位，第420位～第506位，第465位～第479位，第497位～第507位，第498位～第508位，第529位～第555位，第529位～第570位，第582位～第586位，第1位～第234位，第1位～第236位，第293位～第318位，第367位～第442位，第369位～第473位，第500位～第507位，第529位～第696位，第589位～第696位。在特定的实施方式中，本公开的xpr1结合抗体为以下(a1)～(a6)中的任一种：(a1)抗体，其包含由seqidno：35的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：36的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：37的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：38的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：39的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：40的氨基酸序列组成的hvr-l3；(a2)包含seqidno：41的vh序列及seqidno：42的vl序列的抗体；(a3)与(a1)～(a2)中的任一抗体与xpr1中的相同表位结合的抗体；(a4)与(a1)～(a2)中的任一抗体与xpr1的结合进行竞争的抗体；(a5)在竞争测定中，将(a1)～(a2)中的任一抗体与xpr1的结合阻止50％以上的抗体；(a6)包含与seqidno：41的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：42的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体。在一个方面中，本公开提供能够与nox1结合的抗体(nox1结合抗体)。在特定的实施方式中，本公开的nox1结合抗体为，seqidno：2所示的氨基酸序列中的下述任一种所示的序列作为表位：氨基酸第44位～第54位，第131位～第161位，第242位～第258位，第1位～第4位，第1位～第11位，第18位～第55位，第28位～第44位，第31位～第44位，第32位～第46位，第34位～第50位，第70位～第102位，第70位～第103位，第117位～第176位，第120位～第172位，第122位～第166位，第122位～第172位，第124位～第168位，第190位～第208位，第191位～第204位，第223位～第266位，第223位～第267位，第227位～第269位，第228位～第391位，第228位～第396位，第404位，第420位～第564位。在特定的实施方式中，本公开的nox1结合抗体为以下(b1)～(b9)中的任一种：(b1)抗体，其包含由seqidno：67的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：68的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：69的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：70的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：71的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：72的氨基酸序列组成的hvr-l3；(b2)抗体，其包含由seqidno：75的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：76的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：77的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：78的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：79的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：80的氨基酸序列组成的hvr-l3；(b3)包含seqidno：73的vh序列及seqidno：74的vl序列的抗体；(b4)包含seqidno：81的vh序列及seqidno：82的vl序列的抗体；(b5)与(b1)～(b4)中的任一抗体与nox1中的相同表位结合的抗体；(b6)与(b1)～(b4)中的任一抗体与nox1的结合进行竞争的抗体；(b7)在竞争测定中，将(b1)～(b4)中的任一抗体与nox1的结合阻止50％以上的抗体；(b8)包含与seqidno：73的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：74的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体；(b9)包含与seqidno：81的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：82的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体。在一个方面中，本公开提供能够与marveld3同工型1结合的抗体(marveld3同工型1结合抗体)。在特定的实施方式中，本公开的marveld3同工型1结合抗体以seqidno：3所示的氨基酸序列中的下组中任一种所示的序列作为表位：氨基酸第222位～第266位，第223位～第269位，第227位～第264位，第227位～第268位，第229位～第263位，第231位～第265位，第321位～第362位，第322位～第357位，第323位～第357位，第324位～第357位，第324位～第358位。在一个方面中，本公开提供能够与marveld3同工型2结合的抗体(marveld3同工型2结合抗体)。在特定的实施方式中，本公开的marveld3同工型2结合抗体以seqidno：4所示的氨基酸序列中的下组任一种所示的序列作为表位：氨基酸第101位～第111位，第163位～第198位，第1位～第266位，第1位～第270位，第216位～第271位，第222位～第269位，第226位～第271位，第227位～第268位，第227位～第271位，第248位～第271位，第316位～第364位，第322位～第360位，第323位～第359位，第324位～第360位，第326位～第360位，第327位～第360位。在特定的实施方式中，本公开的marveld3同工型2结合抗体为以下(c1)～(c9)中的任一种：(c1)抗体，其包含由seqidno：43的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：44的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：45的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：46的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：47的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：48的氨基酸序列组成的hvr-l3；(c2)抗体，其包含由seqidno：51的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：52的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：53的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：54的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：55的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：56的氨基酸序列组成的hvr-l3；(c3)包含seqidno：49的vh序列及seqidno：50的vl序列的抗体；(c4)包含seqidno：57的vh序列及seqidno：58的vl序列的抗体；(c5)与(c1)～(c4)中的任一抗体和marveld3同工型1和/或marveld3同工型2中的相同表位结合的抗体；(c6)与(c1)～(c4)中的任一抗体与marveld3同工型1和/或marveld3同工型2的结合进行竞争的抗体；(c7)在竞争测定中，将(c1)～(c4)中的任一抗体与marveld3同工型1和/或marveld3同工型2的结合阻止50％以上的抗体；(c8)包含与seqidno：49的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：50的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体；(c9)包含与seqidno：57的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：58的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体。在本公开的另一个方面中，基于前述实施方式中任意项目的抗目标蛋白质抗体为单克隆抗体，所述单克隆抗体包含嵌合的，人源化的，或人抗体。在一种实施方式中，抗目标蛋白质抗体为抗体片段，所述抗体片段为例如：fv，fab，fab′，scfv，双体，或f(ab′)2片段等。在另外的实施方式中，抗体为例如：全长igg抗体、或本说明书中定义的其它抗体种类的全长抗体或同种型的全长抗体。在另一个方面中，对基于前述实施方式的任意项目的抗目标蛋白质抗体而言，可以单独或组合地具备以下项目1～7中记载的任意特征。1.抗体的亲和性在特定的实施方式中，本说明书中提供的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm或≤0.001nm(例如：10-8m以下，例如10-8m～10-13m，例如10-9m～10-13m)的解离常数(kd)。在一种实施方式中，kd通过放射性标记抗原结合测定方法(radiolabeledantigenbindingassay：ria)进行测定。在一种实施方式中，ria使用目标抗体的fab形式及其抗原进行实施。例如，对fab对于抗原的溶液中结合亲和性而言，可通过在非标记抗原的递增量系列的存在下，用最小浓度的(125i)标记抗原使fab平衡，然后用包被有抗fab抗体的板捕获结合的抗原而进行测定。(参考例如，chenetal.，j.mol.biol.293：865-881(1999))。为了构建测定条件，用在50mm碳酸钠(ph9.6)中的5μg/ml的用于捕获的抗fab抗体(cappellabs)将microtiter(注册商标)多孔板(thermoscientific)包被过夜，之后利用pbs中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)进行封闭2～5小时。在非吸附板(nunc#269620)中，将100pm或26pm的[125i]-抗原(例如，与prestaetal.，cancerres.57：4593-4599(1997)中的抗vegf抗体，fab-12的评价同样地)与目标fab的梯度稀释物混合。然后，将目标fab孵育过夜，该孵育为了切实实现平衡，可以继续更长的时间(例如约65小时)。之后，将混合物移至用于室温孵育(例如：1小时)的捕获板中。然后除去溶液，用pbs中0.1％的聚山梨酯20(tween-20(注册商标))将板洗涤8次。待板干燥后，添加150μl/孔的闪烁体(scintillant)(microscint-20(商标)，packard)，在topcount(商标)伽玛计数器(packard)中将板计数了10分钟。将提供最大结合的20％以下的各fab的浓度选择用于竞争结合分析中。根据另外的实施方式，kd使用biacore(注册商标)表面等离子共振测定进行测定。例如，使用biacore(注册商标)-2000或biacore(注册商标)-3000(biaco，re，inc.，piscataway，nj)的测定方法，使用固定有约10反应单位(responseunit：ru)的抗原的cm5芯片在25℃实施。在一种实施方式中，按照供应商的指示，使用n-乙基-n′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)及n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)对羧基甲基化葡聚糖生物传感器芯片(cm5，biacore，inc.)进行活化。在将抗原以达到约10反应单位(ru)的蛋白质的结合的方式，以5μl/分钟的流速进行注入之前，使用10mm乙酸钠，ph4.8稀释至5μg/ml(约0.2μm)。注入抗原之后，为了封闭未反应基团而注入1m乙醇胺。为了动力学测定，以25℃，约25μl/分钟的流速将fab在含有0.05％聚山梨酯20(tween-20(商标))表面活性剂的pbs(pbst)中的2倍梯度稀释物(0.78nm～500nm)注入。对结合速度(kon)及解离速度(koff)而言，使用单纯的1对1langmuir结合模型(biacore(注册商标)评价软件3.2版)，通过同时拟合，对结合及解离的传感图线(sensorgram)进行了计算。平衡解离常数(kd)作为koff/kon比进行计算。参考例如，chenetal.，j.mol.biol.293：865-881(1999)。当根据前述表面等离子共振测定的结合速度(on速度)超过106m-1s-1的情况下，结合速度可使用荧光猝灭技术确定，所述荧光猝灭技术中，测定在存在递增浓度的抗原的情况下在pbs，ph7.2中的20nm的抗抗原抗体(fab形态)于25℃的荧光发光强度(激发＝295nm；发光＝340nm，带通(bandpass)16nm)的增加或减少，其中，所述荧光发光强度是在分光计(例如，止流式分光光度计(avivinstruments)或使用搅拌比色皿的8000系列的slm-aminco(商标)分光光度计(thermospectronic))中测定的。2.抗体片段在特定的实施方式中，本说明书中提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于fab，fab′，fab′-sh，f(ab′)2，fv，及scfv片段，以及后述的其它片段。作为对特定的抗体片段的总论，参考hudsonetal.nat.med.9：129-134(2003)。作为scfv片段的总论，参考例如，pluckthun，inthepharmacologyofmonoclonalantibodies，vol.113，rosenburgandmooreeds.，(springer-verlag，newyork)，pp.269-315(1994)；以及wo93/16185；以及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。作为对包含补救(salvage)受体结合表位残基，体内(invivo)的半衰期延长的fab及f(ab′)2片段的论述，参考美国专利第5,869,046号。双体(diabody)可以为二价或双特异性的，伴有2个抗原结合部位的抗体片段。参考例如，ep404,097号；wo1993/01161；hudsonetal.，nat.med.9：129-134(2003)；hollingeretal.，proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448(1993)。三体(triabody)、四体(tetrabody)也记载于hudsonetal.，nat.med.9：129-134(2003)中。单一结构域抗体为包含抗体的重链可变结构域的全部或者一部分，或轻链可变结构域的全部或者一部分的抗体片段。在特定的实施方式中，单一结构域抗体为人单一结构域抗体(domantis，inc.，waltham，ma；例如参考美国专利第6,248,516号b1)。抗体片段可以通过包括本说明书中记载的利用完全抗体的蛋白质的分解消化、重组宿主细胞(例如：大肠杆菌(e.coli)或噬菌体)产生的各种方式进行制备，但不限于此。3.嵌合及人源化抗体在特定的实施方式中，本说明书中提供的抗体为嵌合抗体。特定的嵌合抗体记载于例如美国专利第4,816,567号；及，morrisonetal.，proc.natl.acad.sci.usa，81：6851-6855(1984)中。一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(源自例如：小鼠，大鼠，仓鼠，兔，或猴等非人灵长类的可变区)及人恒定区。另一个实例中，嵌合抗体为与亲本抗体的类或亚类相比，类或亚类发生改变的“类转换(classswitch)”抗体。嵌合抗体也包括其抗原结合片段。在特定的实施方式中，嵌合抗体为人源化抗体。典型地，非人抗体为了保持亲本非人抗体的特异性及亲和性不变并减少对人的免疫原性，进行了人源化。通常，人源化抗体包含1个或多个可变结构域，在该可变结构域中，hvr(例如cdr(或其部分))来自于非人抗体，fr(或其部分)来自于人抗体序列。在人源化抗体中可任意地包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，例如为了恢复或改善抗体的特异性或亲和性，人源化抗体中的一些fr残基被来自非人抗体(例如作为hvr残基的来源的抗体)的相应的残基所取代。人源化抗体及其制备方法总论于almagroandfransson，front.biosci.13：1619-1633(2008)中，另外，进一步记载于例如：riechmannetal.，nature332：323-329(1988)；queenetal.，proc.nat’lacad.sci.usa86：10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号，第7,527,791号，第6,982,321号，及第7,087,409号；kashmirietal.，methods36：25-34(2005)(记载了特异性决定区域(specificitydeterminingregion：sdr)移植)；padlan，mol.immunol.28：489-498(1991)(记载了表面重塑)；dall’acquaetal.，methods36：43-60(2005)(记载了fr改组(shuffling))；以及，osbournetal.，methods36：61-68(2005)及klimkaetal.，br.j.cancer，83：252-260(2000)(记载了用于fr改组的“选择指南”方法)。人源化中能够使用的人框架区包括但不限于：使用“bestfit”法(参考simsetal.j.immunol.151：2296(1993))选择的框架区；框架区，其来自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的保守序列(参考carteretal.proc.natl.acad.sci.usa，89：4285(1992)及prestaetal.j.immunol.，151：2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人生殖细胞系框架区(参考例如，almagroandfransson，front.biosci.13：1619-1633(2008))；及，来自于fr库的筛选的框架区(参考bacaetal.，j.biol.chem.272：10678-10684(1997)及rosoketal.，j.biol.chem.271：22611-22618(1996))。4.人抗体在特定的实施方式中，本说明书中提供的抗体为人抗体。人抗体可通过该
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中已知的各种方式制备。人抗体概述于vandijkandvandewinkel，curr.opin.pharmacol.5：368-74(2001)及lonberg，curr.opin.immunol.20：450-459(2008)中。人抗体也可以通过以下制备：以产生具有对抗原攻击(负荷)进行应答的完全人抗体或人可变区的完全抗体的方式，对经改造的转基因动物施用免疫原而制备。典型地，这样的动物包含人免疫球蛋白基因位点的全部或者一部分，并且人免疫球蛋白基因位点的全部或者一部分以取代为内因性的免疫球蛋白基因位点、或在染色体外或者该动物的染色体内无规地掺入的状态存在。在这些转基因小鼠中，内因性的免疫球蛋白基因位点通常是不活化的。作为从转基因动物得到人抗体的方法的总论，参考lonberg，nat.biotech.23：1117-1125(2005)。另外，一并参考例如，记载了xenomouse(商标)技术的美国专利第6,075,181号及第6,150,584号；记载了humab(注册商标)技术的美国专利第5,770,429号；记载了k-mmouse(注册商标)技术的美国专利第7,041,870号；以及记载了velocimouse(注册商标)技术的美国专利申请公开第2007/0061900号。对来自由这样的动物生成的完全抗体的人可变区而言，也可以例如与不同的人恒定区进行组合等而进一步修饰。人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。用于制备人单克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人杂骨髓瘤细胞系已有记载。(参考例如，kozborj.immunol.，133：3001(1984)；brodeuretal.，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications，pp.51-63(marceldekker，inc.，newyork，1987)；及boerneretal.，j.immunol.，147：86(1991)。)在lietal.，proc.natl.acad.sci.usa，103：3557-3562(2006)中也记载了通过人b细胞杂交瘤技术生成的人抗体。作为追加方法，包括例如：美国专利第7,189,826号(记载自杂交瘤细胞系的单克隆人igm抗体的制备)，及，ni，xiandaimianyixue，26(4)：265-268(2006)(记载人-人杂交瘤)中记载的那些。在vollmersandbrandlein，histologyandhistopathology，20(3)：927-937(2005)及vollmersandbrandlein，methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology，27(3)：185-91(2005)中也记载了人杂交瘤技术(trioma技术)。人抗体也可通过将选自来自人的噬菌体展示库中的fv克隆可变结构域序列进行分离而生成。这样的可变结构域序列可以接下来与期望的人稳定结构域进行组合。从抗体库选择人抗体的方式在下文记述。5.来自库的抗体本公开的抗体也可以对于具有期望的1个或多个活性的抗体在组合文库中进行筛选而分离。对于例如用于噬菌体展示库的生成、在这样的库中筛选具备期望的结合特性的抗体的各种方法，在该
技术领域：
是已知的。这样的方法在hoogenboometal.inmethodsinmolecularbiology178：1-37(o′brienetal.，ed.，humanpress，totowa，nj，2001)中总论，进一步记载于例如：mccaffertyetal.，nature348：552-554；clacksonetal.，nature352：624-628(1991)；marksetal.，j.mol.biol.222：581-597(1992)；marksandbradbury，inmethodsinmolecularbiology248：161-175(lo，ed.，humanpress，totowa，nj，2003)；sidhuetal.，j.mol.biol.338(2)：299-310(2004)；leeetal.，j.mol.biol.340(5)：1073-1093(2004)；fellouse，proc.natl.acad.sci.usa101(34)：12467-12472(2004)；及leeetal.，j.immunol.methods284(1-2)：119-132(2004)中。在特定的噬菌体展示法中，vh及vl基因的储备库利用聚合酶连接反应(polymerasechainreaction：pcr)分别进行克隆，随机地在噬菌体库中进行再结合，该噬菌体库如winteretal.，ann.rev.immunol.，12：433-455(1994)所述那样操作，可对抗原结合噬菌体进行筛选。噬菌体典型地以单链fv(scfv)片段形式或fab片段形式中任一个进行抗体片段的提呈。对来自经免疫的供给源的库而言，不需要构建杂交瘤，提供相对于免疫源的高亲和性抗体。或者，也可以如griffithsetal.，emboj，12：725-734(1993)中记载那样，(例如：从人)克隆天然的储备库，不进行免疫，提供广泛的对于非自身及自身抗原的抗体的单一供给源。最后，天然库也可以如hoogenboom和winter，j.mol.biol.，227：381-388(1992)中记载那样通过如下合成性地制备：从干细胞克隆进行重编程前的v-基因段，使用用于仅编码超可变cdr3区域且在体外(invitro)实现重构的，包含随机序列的pcr引物。记载了人抗体噬菌体库的专利文献包括例如：美国专利第5,750,373号，以及美国专利申请公开第2005/0079574号，2005/0119455号，第2005/0266000号，第2007/0117126号，第2007/0160598号，第2007/0237764号，第2007/0292936号，及第2009/0002360号。从人抗体库分离的抗体或抗体片段在本说明书中视为人抗体或人抗体片段。6.多特异性抗体在特定的实施方式中，本说明书中提供的抗体为多特异性抗体(例如双特异性抗体)。多特异性抗体为具有与至少2个不同部位结合的特异性的单克隆抗体。在特定的实施方式中，结合特异性中1个是对于目标蛋白质的，另一个是对于其它任意抗原的。在特定的实施方式中，双特异性抗体也可以与目标蛋白质的2个不同表位结合。双特异性抗体也可以用于在表达目标蛋白质的细胞上使细胞毒性剂局部存在。双特异性抗体可作为全长抗体或作为抗体片段制备。在特定的实施方式中，本说明书中提供的多特异性抗体为t细胞重定向抗体(tcellredirectingantibody：trab)。这样的抗体与2种以上的本公开的目标蛋白质，即，在癌细胞中特异性高表达的蛋白质及在t细胞表达的蛋白质相互作用，因此，有通过具有细胞毒活性的t细胞与癌细胞交叉结合(crosslink)而提高抗肿瘤活性的作用。已知blinatumomab(其是bite分子)和catumaxomab为识别t细胞上表达的蛋白(cd3ε或tcr)和癌细胞上表达的蛋白(癌抗原)的双特异性抗体。这些分子可以用它们的两个抗原结合结构域(scfv或fab)中的每个结合癌症抗原和t细胞上表达的cd3ε链，并且在t细胞和表达癌症抗原的细胞之间形成细胞间交联。这种方式，该t细胞重定向抗体可以使用t细胞作为效应细胞针对表达癌症抗原的细胞的诱导强烈的细胞毒活性。在特定的实施方式中，本公开的多特异性抗体包含对于本公开的目标蛋白质的结合结构域，和t细胞受体复合体结合结构域，任意地，具有t细胞依赖性的细胞毒活性。这样的本公开的多特异性抗体，将t细胞重定向至在细胞表面表达本公开的目标蛋白质的细胞，能够诱导由t细胞进行的对于该细胞的细胞毒活性。在特定的实施方式中，本公开的多特异性抗体包含与fcγ受体的结合活性降低的fc区，任意地，包含具有与igg1，igg2，igg3，或igg4的fc区相比更低的fcγ受体结合活性的fc区。在特定的实施方式中，本公开的多特异性抗体包含一个对于本公开的目标蛋白质的结合结构域。对本公开的多特异性抗体中包含的t细胞受体复合体结合结构域而言，在一种实施方式中具有对于t细胞受体的结合活性的t细胞受体结合结构域，在另外的实施方式中具有对于cd3的结合活性的cd3结合结构域。在特定的实施方式中，本公开的多特异性抗体中包含的cd3结合结构域能够与cd3ε链结合，任意地，包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区的结构域。在特定的实施方式中，本公开的多特异性抗体中包含的cd3结合结构域为以下(d1)～(d6)中的任一种：(d1)结构域，其含有具有由seqidno：59的氨基酸序列组成的hvr-h1，由seqidno：60的氨基酸序列组成的hvr-h2，由seqidno：61的氨基酸序列组成的hvr-h3，由seqidno：62的氨基酸序列组成的hvr-l1，由seqidno：63的氨基酸序列组成的hvr-l2，及由seqidno：64的氨基酸序列组成的hvr-l3的抗体可变区；(d2)结构域，其含有具有seqidno：65的vh序列及seqidno：66的vl序列的抗体可变区；(d3)结构域，其含有与(d1)～(d2)中的任一抗体可变区与cd3中的相同表位结合的抗体可变区；(d4)结构域，其含有与(d1)～(d2)中的任一抗体可变区与cd3的结合进行竞争的抗体可变区；(d5)结构域，其含有在竞争测定中，将(d1)～(d2)中的任一抗体可变区与cd3的结合阻止50％以上的抗体可变区；(d6)结构域，其含有具有与seqidno：65的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vh序列及与seqidno：66的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的vl序列的抗体可变区；用于制备多特异性抗体的方式包括但不限于具有不同特异性的2个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参考milsteinandcuello，nature305：537(1983)，wo93/08829，及trauneckeretal.，emboj.10：3655(1991))，及杵臼(knob-in-hole)技术(参考例如，美国专利第5,731,168号)。多特异性抗体也可以通过如下制备：为了制备fc异源二聚体分子而操作静电转向效果(electrostaticsteeringeffects)(wo2009/089004a1)；将2个以上的抗体或片段交联(参考美国专利第4,676,980号及brennanetal.，science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链制备具有2种特异性的抗体(参考kostelnyeta1.，j.immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双体”技术制备双特异性抗体片段(参考hollingeretal.，proc.natl.acad.sci.usa，90：6444-6448(1993))；及，使用单链fv(scfv)二聚体(参考gruberetal.，j.immunol.，152：5368(1994))；及，例如tuttetal.j.immunol.147：60(1991)中记载那样制备三重特异性抗体。在本说明书中，也包含具有3个以上的功能性抗原结合部位的改造抗体，包括“octopus抗体”，(参考例如，美国专利申请公开第2006/0025576号a1)。在本说明书中，在抗体或片段中也包括“dualactingfab”或“daf”，其含有与目标蛋白质以外的不同的抗原进行结合的1个抗原结合部位(参考例如，美国专利申请公开第2008/0069820号)。7.抗体突变体在特定的实施方式中，将本说明书中提供的抗体的氨基酸序列突变体也纳入考虑。有时期望例如改善抗体的结合亲和性和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列突变体可以通过在编码抗体的核苷酸序列中导入适当的修饰，或通过肽合成进行制备。这样的修饰包括例如，来自抗体的氨基酸序列的缺失，和/或在抗体的氨基酸序列中的插入，和/或在抗体的氨基酸序列中的残基的取代。以最终构建物具备期望的特征(例如：抗原结合性)为前提，为了达成最终构建物可以进行缺失，插入，及取代的任意组合。a)取代，插入及缺失突变体在特定的实施方式中，提供具有1个或多个氨基酸取代的抗体突变体。取代性突变导入的目标部位包括hvr及fr。将保存性取代示于表1的“优选取代”的标题下。将更实质的变更，在表1的“例示的取代”的标题下一起提供，在提及氨基酸侧基的类同时在下文进行详述。氨基酸取代可以被导入目标抗体，对于产物可以针对例如：保持/改善的抗原结合性、减少的免疫原性、或改善的adcc或cdc等，期望的活性进行筛选。[表1]原本的残基示例性取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；asp，lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu氨基酸可根据共同的侧基特性进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸，甲硫氨酸(met)，丙氨酸(ala)，缬氨酸(val)，亮氨酸(leu)，异亮氨酸(ile)；(2)中性的亲水性：半胱氨酸(cys)，丝氨酸(ser)，苏氨酸(thr)，天冬酰胺(asn)，谷氨酰胺(gln)；(3)酸性：天冬氨酸(asp)，谷氨酸(glu)；(4)碱性：组氨酸(his)，赖氨酸(lys)，精氨酸(arg)；(5)影响链取向的残基：甘氨酸(gly)，脯氨酸(pro)；(6)芳香族性：色氨酸(trp)，酪氨酸(tyr)，苯丙氨酸(phe)。非保守的取代指这些类中的1个成员交换为另外的类的成员。取代突变体的1个类型包括亲本抗体(例如：人源化或人抗体)的1个或多个超变区残基的取代。通常，对其结果所产生的，选择用于进一步研究的突变体而言，相比于亲本抗体具有特定的生物学特性的修饰(例如：改善)(例如：增加的亲和性，减少的免疫原性)，和/或实质上保持了亲本抗体的特定的生物学特性。例示的取代突变体为亲和性成熟抗体，其可使用例如噬菌体展示基础上的亲和性成熟技术(例如本说明书中记载的那些)适当制备。简要而言，使1个或多个hvr残基突变，并且使突变抗体提呈在噬菌体上，针对特定的生物学活性(例如：结合亲和性)进行筛选。对改造(例如：取代)而言，可以例如为了改善抗体的亲和性而在hvr中进行。这样的改造可以在hvr的“热点”，即，通过利用体细胞成熟过程期间以高频率发生突变的密码子编码的残基(参考例如，chowdhury，methodsmol.biol.207：179-196(2008))和/或与抗原接触的残基中进行，得到的突变vh或vl可对于结合亲和性进行测试。来自二次库构建及由再选择进行的亲和性成熟记载于例如：hoogenboometal.inmethodsinmolecularbiology178：1-37(o’brienetal.，ed.，humanpress，totowa，nj，(2001))中。在一些亲和性成熟的实施方式中，多样性通过任意各种方法(例如：易错(errorprone)pcr，链改组或寡核苷酸指向突变导入)导入选择的用于成熟的可变基因中。然后，制备二次库。然后，在该库中，为了鉴定具有期望的亲和性的任意抗体突变体而进行筛选。导入多样性的另外的方法包括，将一些hvr残基(例如：一次4～6个残基)进行随机化的hvr指向方法。对参与抗原结合的hvr残基而言，可使用例如丙氨酸扫描突变导入或建模进行具体的特别确定。特别地，cdr-h3及cdr-l3是常常被靶向的。在特定的实施方式中，对取代，插入，或缺失而言，这样的改造只要实质上没有减少抗体与抗原结合的能力，就可以在1个或多个hvr内进行。例如，实质上没有减少结合亲和性的保守改造(例如诸如本说明书中提供的保守取代)可以在hvr中进行。这样的改造例如可在hvr的抗原接触残基的外侧。在前述的突变vh及vl序列的特定的实施方式中，各hvr不被改造，或仅含有1个，2个，或者3个氨基酸取代。鉴定用于突变导入的可被靶向的抗体的残基或区域的有用方法为cunninghamandwells(1989)science，244：1081-1085记载的，被称为“丙氨酸扫描突变导入”的方法。在该方法中，鉴定一个残基或一组目标残基(例如：带电荷残基，例如精氨酸，天冬氨酸，组氨酸，赖氨酸，及谷氨酸)，并利用带中性或带负电的氨基酸(例如：丙氨酸或者聚丙氨酸)进行取代，确定抗体和抗原的相互作用是否受影响。在对该初期取代显示出功能的敏感性的氨基酸位置上，可进一步导入取代。可替换或附加地，为了鉴定抗体和抗原之间的接触点，也可以对抗原抗体复合体的结晶结构进行分析。这样的接触残基及邻近的残基可以作为取代候选进行靶向，或也可以从取代候选中排除。对突变体而言，可以为了确定它们是否包含期望的特性而进行筛选。对氨基酸序列的插入而言，与向序列内部插入单一或多个氨基酸残基时相同，也包括在包含氨基末端和/或羧基末端中的1个残基～100个残基以上的多肽的长度范围中的融合。末端的插入的实例包括在n末端具有甲硫氨酰残基的抗体。对抗体分子的其它插入突变体而言，包括在抗体的n-或c-末端，与使酶(例如，用于adept的)或抗体的血浆半衰期增加的多肽进行融合而成的那些。b)糖基化突变体在特定的实施方式中，本说明书中提供的抗体被改造使得抗体被糖基化的程度增加或减少。对于对抗体的糖基化部位的追加或删除而言，可以通过产生或除去1个或多个糖基化部位的方式而改造氨基酸序列，从而简便地实现。在抗体包含fc区的情况下，可以改造在该处附加的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然型抗体中，典型地包含发生分支的二个支链的低聚糖，该低聚糖通常由n-连接附加在fc区的ch2结构域的asn297处。参考例如，wrightetal.tibtech15：26-32(1997)。低聚糖包括例如：甘露糖，n-乙酰葡糖胺(glcnac)，半乳糖，及唾液酸等各种碳水化合物，另外，也包括附加在二个支链的低聚糖结构的“主干”中的glcnac处的岩藻糖。在一些实施方式中，本公开的抗体中的低聚糖的修饰可以为了制作具有特定的改善特性的抗体突变体而进行。在一种实施方式中，提供具有碳水化合物结构体的抗体突变体，所述碳水化合物结构体欠缺被附加(直接地或间接地)在fc区的岩藻糖。例如在这样的抗体中的岩藻糖的量可以为1％～80％，1％～65％，5％～65％或20％～40％。岩藻糖的量通过如下计算确定：例如，如wo2008/077546中记载那样，计算相对于通过maldi-tof质量分析测定的在asn297处附加的全部糖结构体(例如：复合，杂合及高甘露糖结构体)之和的，asn297处的糖链内的岩藻糖的平均量。asn297表示位于fc区的大约297位的天冬酰胺残基(fc区残基的eu编号)。其中，由于在多个抗体间的少许序列多样性，asn297也可能位于297位的±3氨基酸上游或下游，即294位～300位之间。这样的岩藻糖化突变体可具有改善的adcc功能。参考例如，美国专利申请公开第2003/0157108号(presta，l.)；第2004/0093621号(kyowahakkokogyoco.，ltd)。涉及“脱岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷”抗体突变体的出版物的实例包括us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；okazakietal.j.mol.biol.336：1239-1249(2004)；yamane-ohnukietal.biotech.bioeng.87：614(2004)。可以产生脱岩藻糖化抗体的细胞系的实例包括，欠缺蛋白质的岩藻糖化的lec13cho细胞(ripkaetal.arch.biochem.biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请公开第us2003/0157108号a1，presta，l；及wo2004/056312a1，adamsetal.，特别是实施例11)及敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因fut8敲除的cho细胞(参考例如，yamane-ohnukieta1.biotech.bioeng.87：614(2004)；kanda，y.etal.，biotechnol.bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及wo2003/085107)。进一步提供例如在抗体的fc区附加的二支链型低聚糖由glcnac而发生二分枝而成的，具有二分枝的低聚糖的抗体突变体。这样的抗体突变体为可具有减少的岩藻糖化和/或改善的adcc功能。这样的抗体突变体的实例记载于例如wo2003/011878(jean-mairetetal.)；美国专利第6,602,684号(umanaetal.)；及us2005/0123546(umanaetal.)中。也提供抗体突变体，其在fc区中附加的低聚糖中至少具有1个半乳糖残基。这样的抗体突变体可具有改善的cdc功能。这样的抗体突变体记载于例如：wo1997/30087(pateletal.)；wo1998/58964(raju，s.)；及wo1999/22764(raju，s.)中。c)fc区突变体在特定的实施方式中，可以在本说明书中提供的抗体的fc区中导入1个或多个氨基酸修饰，由此生成fc区突变体。fc区突变体在1个或多个氨基酸位置之处包含氨基酸修饰(例如：取代)，可以包含人fc区序列(例如如seqidno：6，19，20，21分别所示的人igg1，igg2，igg3，或igg4的fc区)。在特定的实施方式中，具备全部或若干效应子功能的抗体突变体也在本公开的考虑内，该效应子功能对抗体的体内半衰期是重要的，所述功能使抗体在不需要特定的效应子功能(补体及adcc等)，或特定的效应子功能有害时成为适用的良好候选。为了确认cdc和/或adcc活性的减少/缺乏，可以进行体外和/或体内的细胞毒测定。例如，fc受体(fcr)结合测定可为了确认抗体一方面欠缺fcγr结合性(由此欠缺adcc活性的可能性较高)，另一方面保持fcrn结合能力而进行。作为介导adcc的初级细胞的nk细胞仅表达fcγriii，另一方面，单核白细胞则表达fcγri，fcγrii，fcγriii。造血细胞上的fcr的表达汇总于ravetchandkinet，annu.rev.immunol.9：457-492(1991)的第464页的表3中。用于评价目标分子的adcc活性的体外测定方法(测定)的非限定的实例，记载于美国专利第5,500,362号(参考例如，hellstrom，i.etal.proc.nat′lacad.sci.usa83：7059-7063(1986))及hellstrom，ietal.，proc.nat′lacad.sci.usa82：1499-1502(1985)；美国专利第5,821,337号(参考bruggemann，m.etal.，j.exp.med.166：1351-1361(1987))中。或者，非放射性的测定方法可以使用(例如：act1(商标)流式细胞术的非放射性细胞毒性试验(celltechnology，inc.mountainview，ca)；及，cytotox96(注册商标)非放射性细胞毒性试验法(参考promega，madison，wi))。对这样的测定方法有用的效应细胞包括：外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell：pbmc)及自然杀伤(naturalkiller：nk)细胞。可替换或附加地，目标分子的adcc活性可以在例如：clynesetal.proc.nat′lacad.sci.usa95：652-656(1998)中记载的动物模型中进行体内评价。另外，为了确认抗体不能与c1q结合因而欠缺cdc活性，可以进行c1q结合测定。参考例如：wo2006/029879及wo2005/100402的c1q及c3c结合elisa。另外，为了评价补体活化，可以进行cdc测定(参考例如：gazzano-santoroetal.，j.immunol.methods202：163(1996)；cragg，m.s.etal.，blood101：1045-1052(2003)；及cragg，m.s.andm.j.glennie，blood103：2738-2743(2004))。再者，对fcrn结合性及体内的清除/半衰期的确定而言，也可使用该
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中已知的方法进行(参考例如，petkova，s.b.etal.，int′l.immunol.18(12)：1759-1769(2006))。具有减少的效应子功能的抗体中，包括具有fc区残基238，265，269，270，297，327，及329的1个或多个取代的那些(美国专利第6,737,056号)。这样的fc突变体包括具有氨基酸位置265，269，270，297，及327中的2个以上的取代的fc突变体，前述2个以上的取代的fc突变体包括具有对残基265及297的丙氨酸的取代的所谓“dana”fc突变体(美国专利第7,332,581号)。已有记载具有对fcrs的增加或减少的结合性的特定的抗体突变体。(参考美国专利第6,737,056号；w02004/056312，及shieldsetal.，j.biol.chem.9(2)：6591-6604(2001))。在特定的实施方式中，抗体突变体包含具有改善adcc的1个或多个氨基酸取代(例如：fc区的位置298，333，和/或334(eu编号时的残基)处的取代)的fc区。在一些实施方式中，例如美国专利第6,194,551号，wo99/51642，及idusogieetal.j.immunol.164：4178-4184(2000)中记载那样，对带来经改造的(即，发生增加或减少中的任一个)c1q结合性和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)的改造而言，在fc区中进行。具有增加的半衰期，及对于新生儿型fc受体(fcrn：负责将母体的igg类移动到胎儿的功能(guyeretal.，j.immunol.117：587(1976)andkimetal.，j.immunol.24：249(1994)))增加的结合性的抗体记载于美国专利申请公开第2005/0014934号a1(hintonetal.)中。这些抗体包含fc区，所述fc区中具有增加fc区对fcrn的结合性的1个或多个取代。这样的fc突变体包括具有fc区残基：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424，或434中的1个或多个处的取代(例如：fc区残基434的取代(美国专利第7,371,826号))的那些。关于fc区突变体的其它实例，参考duncan&winter，nature322：738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；及wo94/29351。d)半胱氨酸改造抗体突变体在特定的实施方式中，期望产生半胱氨酸改造抗体(例如：“thiomabs”)，其中抗体中的1个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定的实施方式中，接受取代的残基在抗体的能够进行接近(access)的部位产生。通过将残基用半胱氨酸取代，使得反应性的巯基配置在抗体的能够进行接近的部位，该反应性的巯基可以用于使该抗体与其它部分(药物部分或接头-药物部分等)进行缀合，以本说明书中进一步详述的方式产生免疫缀合物。在特定的实施方式中，以下残基的任意1个或复数可以被取代为半胱氨酸：轻链的v205(kabat编号)；重链的a118(eu编号)；及重链fc区的s400(eu编号)。半胱氨酸改造抗体可以如例如美国专利第7,521,541号中记载那样操作生成。e)抗体衍生物在特定的实施方式中，本说明书中提供的抗体可以进一步修饰，使得包含该
技术领域：
中已知且能容易获取的追加的非蛋白质部分。抗体的适于衍生物化的部分包含但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限定的实例包括但不限于，聚乙二醇(peg)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚1，3二氧杂环戊烷，聚1，3，6，三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物中的任一均可)，及，葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇类(例如丙三醇)，聚乙烯醇及这些的混合物。聚乙二醇丙醛因对水的稳定性而在制备中有利。聚合物可以是任何分子量，可以有支链也可以没有。对附加至抗体的聚合物的数量而言，只要有宽度即可，如果是1个以上的聚合物进行附加，它们可以为相同的分子，也可以为不同的分子。通常，用于衍生物化的聚合物的数量和/或类型可以在考虑应予改善的抗体的特定的特性或功能，抗体衍生物是否能够用于在规定的条件下的疗法等的基础上确定，但不限于此。在另外的实施方式中提供缀合物，其为抗体与可通过在放射线中暴露而选择性的加热非蛋白质部分的缀合物。在一种实施方式中，非蛋白质部分为碳纳米管(kametal.，proc.natl.acad.sci.usa102：11600-11605(2005))。放射线可以为任何波长，包括但不限于将非蛋白质部分加热到如下温度的波长：对普通细胞没有伤害，但使与抗体-非蛋白质部分接近的细胞杀灭。b.抗体制备方法制备具有期望的结合活性的抗体的方法是本领域技术人员公知的，并且所述抗体可以以多克隆或者单克隆抗体获得。作为本申请的抗体，可以适当制备来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包含通过杂交瘤产生的抗体和通过遗传工程技术由携带抗体基因的表达载体转化的宿主细胞产生的抗体。为了获得抗体而免疫的哺乳动物不限于特定的动物，优选地，通过考虑与用于制备杂交瘤的细胞融合中使用的亲本细胞的相容性而选择。一般地，适当使用兔、猴以及啮齿类动物例如小鼠、大鼠和仓鼠。按照公知的方法用敏化抗原免疫前述动物。例如，作为一般的方法，通过向哺乳动物的腹腔内或者皮下注射而施用敏化抗原，实施免疫。具体地，用磷酸缓冲盐水(pbs)、生理盐水等以适当稀释敏化抗原。如果需要，将常规的佐剂例如弗式完全佐剂与抗原混合，并将混合物乳化。然后将该敏化抗原以4至21日间隔向哺乳动物施用数次。在免疫时可以将适当的载体与敏化抗原一起使用。特别地，当小分子量部分肽用作敏化抗原时，有时期望用与载体蛋白质如白蛋白、匙孔血蓝蛋白缀合该敏化抗原肽，用于免疫。备选地，产生期望抗体的杂交瘤可以使用如下所述dna免疫制备。dna免疫是这样的免疫方法，将可使得表达编码该抗原蛋白质的基因而构建的载体dna的施用于免疫动物中，造成在该免疫动物体内表达敏化抗原，而赋予免疫刺激。与向免疫动物施用蛋白质抗原的一般的免疫方法相比，dna免疫如下述预期是优异的：-在维持膜蛋白质的结构的同时能够给予免疫刺激-无需纯化抗原用于免疫。为了使用dna免疫得到本申请的单克隆抗体，首先，向要免疫动物施用表达抗原蛋白质的dna。编码抗原蛋白质的dna可以通过公知的方法如pcr合成。得到的dna插入适当的表达载体中，并且随后将其向免疫动物施用。优选使用的表达载体包括例如市售的表达载体如pcdna3.1。载体向生物体的施用方法可以利用一般应用的方法。例如，通过将表达载体包被的金粒子用基因枪向要免疫动物个体内细胞中导入，进行dna免疫。如前述免疫哺乳动物后，确认血清中与抗原结合的抗体效价升高。然后从哺乳动物收集免疫细胞，并随后进行细胞融合。尤其是，脾细胞特别用作免疫细胞。哺乳动物的骨髓瘤细胞用作与前述免疫细胞融合的细胞。骨髓瘤细胞优选具有用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物赋予细胞在特定的培养条件下存活(或死亡)的性质。次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺失(以下简称为hgprt缺失)、或胸苷激酶缺失(以下简称为tk缺失)已知为选择标记物。具有hgprt或tk缺失的细胞具有次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷敏感性(以下简称为hat敏感性)。hat敏感性的细胞在hat选择培养基中不能进行dna合成并因此被杀灭。但是，当细胞与正常细胞融合时，它们则能够利用正常细胞的补救途径继续dna合成，并且因而即使在hat选择培养基中也能增殖。hgprt缺失和tk缺失的细胞可以在包含6-硫代鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简称为8ag)、或5′-溴脱氧尿苷的培养基中选择。因为在dna中掺入这些嘧啶类似物，正常细胞死亡。同时，因为没有掺入这些嘧啶类似物，缺失这些酶的细胞能够在选择培养基中生存。此外，称为g418抗性的选择标记物通过新霉素抗性基因赋予对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。适于细胞融合的各种类型骨髓瘤细胞是公知的。例如，可以优选使用包括以下细胞的骨髓瘤细胞：p3(p3x63ag8.653)(j.immunol.(1979)123(4)，1548-1550)；p3x63ag8u.1(currenttopicsinmicrobiologyandimmunology(1978)81，1-7)；ns-1(c.eur.j.immunol.(1976)6(7)，511-519)；mpc-11(cell(1976)8(3)，405-415)；sp2/0(nature(1978)276(5685)，269-270)；fo(j.immunol.methods(1980)35(1-2)，1-21)；s194/5.xx0.bu.1(j.exp.med.(1978)148(1)，313-323)；r210(nature(1979)277(5692)，131-133)等。基本上使用已知方法，例如kohler和milstein等的方法(methodsenzymol.(1981)73，3-46)，进行免疫细胞与骨髓瘤细胞之间的细胞融合。更具体地，例如，在细胞融合促进剂存在下在常规的培养液中，可以实施前述细胞融合。融合促进剂包括例如聚乙二醇(peg)和仙台病毒(hvj)。如果需要，为了进一步提高融合效率，还添加辅助物质如二甲亚砜等。免疫细胞与骨髓瘤细胞的比例可以任意设定。优选地，相对于骨髓瘤细胞，免疫细胞为1至10倍。用于细胞融合的培养基，包括例如，适于骨髓瘤细胞系的增殖的培养基，如rpmi1640培养液和mem培养液以及用于这种类型的细胞培的其他常规培养基。进一步地，可以优选添加血清补充物，如胎牛血清(fcs)至培养基中。对于细胞融合，将预定量的前述免疫细胞与骨髓瘤细胞在前述培养液中充分混合。然后将预先加温至37℃左右的peg溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60％(w/v)的浓度添加于其中。将混合溶液轻轻混合，以产生期望的融合细胞(杂交瘤)。随后，向细胞逐渐添加前述适当的培养液，并且然后反复离心除去上清。这样，能够除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。如此得到的杂交瘤可以通过常规的选择培养基例如hat培养液(包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基)培养而选择。应用前述hat培养基继续培养足够时期以杀死期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)。通常，所述足够时期是数日至数周。随后，通过常规的有限稀释法，进行产生期望抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。如此得到的杂交瘤可以利用根据用于细胞融合的骨髓瘤具有的选择标记物的选择培养基选择。例如，hgprt或tk缺失的细胞可以通过使用hat培养基(包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基)培养而选择。具体而言，在hat敏感性骨髓瘤细胞用于细胞融合的情况下，在hat培养基中，与正常细胞成功进行细胞融合的细胞可以选择性增殖。应用前述hat培养液继续培养足够时期以杀死期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)。具体地，一般通过数日至数周的培养，可以选择期望的杂交瘤。随后，通过常规的有限稀释法，可以进行产生期望抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。期望抗体的筛选和单一克隆可以通过基于已知的抗原抗体反应的筛选方法适当实施。期望抗体可以例如通过荧光激活细胞分选术(facs)筛选。facs是这样的系统，其通过用激光束分析与荧光抗体接触的细胞并测定各个细胞发出的荧光而能够测定抗体与细胞表面的结合。为了通过facs筛选产生本申请的单克隆抗体的杂交瘤，首先配制表达由产生的抗体结合的抗原的细胞。用于筛选的优选细胞是强制表达该抗原的哺乳动物细胞。通过使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞作为对照，能够选择性检测抗体对细胞表面的抗原的结合活性。也即，通过选择产生不与宿主细胞结合、与强制表达抗原的细胞结合的抗体的杂交瘤，能够获得产生期望单克隆抗体的杂交瘤。备选地，将表达研究的抗原的细胞固定，并且能够基于elisa的原理评价抗体对该抗原表达细胞的结合活性。例如，在elisa板的孔中固定抗原表达细胞。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定细胞接触，检测与固定细胞结合的抗体。在单克隆抗体衍生自小鼠的情况下，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。通过这些筛选选择的产生对抗原具有结合能力的期望抗体的杂交瘤可以通过有限稀释法等克隆。如此制备的产生单克隆抗的杂交瘤可以在常规的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。按照常规方法培养前述杂交瘤，能够从该培养上清获得期望的单克隆抗体。备选地，将杂交瘤施用于与其具有相容性的哺乳动物并增殖，能够从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于得到高纯度的抗体。也可以适当应用从抗体产生细胞如杂交瘤克隆抗体基因所编码的抗体。通过将克隆的抗体基因掺入适当的载体导入宿主，表达该基因所编码的抗体。用于抗体基因的分离、所述基因向载体的导入、以及宿主细胞的转化的方法例如，已经由vandamme等确立(eur.j.biochem.(1990)192(3)，767-775)。如下述的重组抗体的制备方法也是另外已知的。为了获得编码抗体的可变区(v区)的cdna，通常，首先从杂交瘤提取总rna。用于从细胞提取mrna的方法可以利用例如如下的方法：-胍超速离心法(biochemistry(1979)18(24)，5294-5299)，和-agpc法(anal.biochem.(1987)162(1)，156-159)。提取的mrna可以使用例如mrnapurificationkit(gehealthcarebioscience制)等纯化。或者，如quickprepmrnapurificationkit(gehealthcarebioscience制)等的用于从细胞直接提取总mrna的试剂盒也是市售的。应用这样的试剂盒，能够从杂交瘤获得mrna。从得到的mrna，可以用逆转录酶合成编码抗体v区的cdna。cdna可以通过amvreversetranscriptasefirst-strandcdnasynthesiskit(生化学工业公司制)等合成。另外，为了cdna的合成和扩增，可以适当利用smartracecdna扩增试剂盒(clontech制)和应用pcr的5′-race法(proc.natl.acad.sci.usa(1988)85(23)，8998-9002、nucleicacidsres.(1989)17(8)，2919-2932)。进一步，在这样的cdna合成过程中，可以在cdna的两个末端导入后述的适当限制酶位点。从得到的pcr产物纯化目的cdna片段，随后与载体dna连接。如此制备重组载体，并导入大肠杆菌等重。克隆选择后，可以从形成该克隆的大肠杆菌配制期望的重组载体。随后，关于该重组载体是否具有目的cdna的核苷酸序列，通过已知方法例如双脱氧核苷酸链终止法确认。为了分离编码可变区的基因，使用引物扩增可变区基因的5′-race法是方便使用的。首先，使用由杂交瘤细胞提取的rna为模板通过合成cdna，得到5′-racecdna文库。5′-racecdna文库的合成中适当应用市售的试剂盒如smartracecdna扩增试剂盒。以得到的5′-racecdna文库为模板，通过pcr法扩增抗体基因。基于已知的抗体基因序列，可以设计用于小鼠抗体基因扩增的引物。这些引物的核苷酸序列按照免疫球蛋白的亚类不同。因此，期望预先用市售试剂盒如isostrip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(rochediagnostics)等确定亚类。具体地，例如，利用允许扩增编码γ1、γ2a、γ2b和γ3重链以及κ链和λ链轻链的基因的引物，来分离编码小鼠igg的基因。为了扩增igg的可变区基因，一般地，利用与靠近可变区的恒定区位点退火的引物作为3′侧的引物。另一方面，利用5′racecdna文库构建试剂盒所附带的引物作为5′侧的引物。利用如此扩增的pcr产物，可以重构由重链和轻链的组合形成的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白对抗原的结合活性为指标，可筛选期望抗体。例如可以通过以下步骤进行筛选；(1)使含有由杂交瘤得到的cdna编码的v区的抗体与期望的抗原表达细胞接触；(2)检测该抗原表达细胞与抗体的结合；和(3)选择与该抗原表达细胞结合的抗体。检测抗体与该抗原表达细胞的结合的方法是已知的。具体地，通过前述技术如facs，能够检测抗体与该抗原表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可以适当利用该抗原表达细胞的固定样本。对于使用结合活性作为指标的抗体筛选方法，也适当应用利用使用噬菌体载体的淘选方法。在从作为重链和轻链的亚类的文库的多克隆抗体表达细胞群获得抗体基因的情况下，利用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因可以通过用适当的接头序列连接形成单链fv(scfv)。通过将编码scfv的基因插入噬菌体载体，可以获得在表面表达scfv的噬菌体。该噬菌体与研究的抗原接触。然后，通过收集与抗原结合的噬菌体，能够分离编码具有目的结合活性的scfv的dna。能够通过按照需要重复该操作，富集具有期望结合活性的scfv。得到编码目的抗体的v区的cdna后，利用识别在该cdna的两个末端插入的限制酶位点的限制酶消化该cdna。优选的限制酶识别并消化构成抗体基因的核苷酸序列中出现频率低的核苷酸序列。此外，为了以正确方向在载体中插入1个拷贝的消化片段，优选插入产生粘性末端的限制酶。通过将编码如前述消化的抗体的v区的cdna插入适当的表达载体，能够获得抗体表达载体。此时，如果编码抗体恒定区(c区)的基因与编码前述v区的基因符合读框地融合，则获得嵌合抗体。此处，“嵌合抗体”指恒定区与可变区的来源不同的抗体。因此，除小鼠/人等异种嵌合抗体之外，人/人同种嵌合抗体也包含在本公开的嵌合抗体中。通过在已经具有恒定区的表达载体中插入前述v区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，在携带编码期望抗体恒定区(c区)的dna的表达载体的5′侧，可以适当配置消化前述v区基因的限制酶的限制酶识别序列。通过由相同组合限制酶消化的两个基因符合读框地融合，构建嵌合抗体表达载体。为了产生单克隆抗体，将抗体基因插入表达载体从而在表达调节区域的控制下表达基因。用于表达抗体的表达调节区域包含例如增强子和启动子。另外，可以在氨基末端添加适当的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。信号序列从表达的多肽的羧基末端切断，并且得到的抗体可分泌到细胞外。随后，利用表达载体转化适当的宿主细胞，能够获得表达编码抗体的dna的重组细胞。为了抗体基因的表达，将编码抗体重链(h链)和轻链(l链)的dna分别插入不同的表达载体。利用插入h链和l链的载体，通过同时转化相同的宿主细胞(共转染)，能够表达具有h链和l链的抗体分子。或者，通过将编码h链和l链的dna插入单一的表达载体，能够转化宿主细胞(参考国际公开wo94/11523)。存在和多用于通过将分离的抗体基因引入适当的宿主制备抗体的宿主细胞和表达载体的组合。所有这些表达系统可用于分离前述与本申请的靶蛋白质结合的结构域和t细胞受体复合体结合结构域。用作宿主细胞的适当真核细胞，包括动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体地，动物细胞，包括例如下列细胞。(1)哺乳类细胞：cho、cos、骨髓瘤、幼仓鼠肾(bhk)、hela、vero等(2)两栖类细胞：爪蟾卵母细胞等(3)昆虫细胞：sf9、sf21、tn5等。或者，作为植物细胞，已知应用源自烟草(nicotiana)属如普通烟草(nicotianatabacum)的细胞的抗体基因表达体系。植物细胞的转化可适当应用愈伤组织培养细胞。此外，真菌细胞可利用下列细胞。-酵母：酵母(saccharomyces)属如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母属如毕赤酵母(pichiapastoris)；和-丝状真菌：曲霉菌(aspergillus)属如黑曲霉(aspergillusniger)。此外，利用原核细胞的抗体基因的表达系统也是已知的。例如，在应用细菌细胞的情况下，可以适当地在本公开中利用大肠杆菌(e.coli)、枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)等细菌细胞。在这些细胞中通过转化导入包含目的抗体基因的表达载体。通过体外培养转化细胞，并且能够从该转化细胞的培养物获得期望抗体。除前述宿主细胞之外，也可以利用转基因动物产生重组抗体。也即，从导入了编码期望抗体的基因的动物，可以得到该抗体。例如，抗体基因可以通过符合读框地插入编码乳汁中固有地产生的蛋白质的基因的内部而作为融合基因构建。乳汁中分泌的蛋白质可以利用例如，山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的dna片段注射到山羊胚胎中，将该注射的胚胎导入雌性山羊。从接受胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁，可以获得期望抗体，其为与乳汁蛋白质的融合蛋白质。另外，为了增加从转基因山羊产生的包含期望抗体的乳汁量，可以对转基因山羊施用激素(bio/technology(1994)，12(7)，699-702)。在对人施用本说明书中记载的抗原结合分子的情况下，例如，作为该分子中的各种结合结构域，在应用包含抗体的可变区的结构域的情况下，为了降低对人的异种抗原性等，可以适当采用人为改变的基因重组型抗体衍生的抗原结合结构域。基因重组型抗体中包含例如人源化(humanized)抗体。这些改变的抗体应用已知的方法适当制备。用于制备本说明书中记载的抗原结合分子中的各种结合结构域的抗体可变区通常由被4个构架区(fr)分开的3个互补决定区(complementarity-determiningregion，cdr)构成。cdr是实质上决定抗体的结合特异性的区域。cdr的氨基酸序列富于多样性。另一方面，构成fr的氨基酸序列即使在具有不同的结合特异性的抗体之间也常常显示高同一性。因此，一般地，通过cdr的移植，某一抗体的结合特异性可以移植到其它抗体中。人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体。具体地，人以外的动物、例如小鼠抗体的cdr移植到人抗体的人源化抗体等是已知的。用于获得人源化抗体的一般的基因重组技术也是已知的。具体地，作为用于将小鼠的抗体的cdr移植到人的fr的方法，例如重叠延伸pcr(overlapextensionpcr)是已知的。在重叠延伸pcr中，在用于合成人抗体的fr的引物中，添加编码要移植的小鼠抗体的cdr的核苷酸序列。对4个fr各自制备引物。一般地，在将小鼠cdr移植到人fr中，选择与小鼠fr同一性高的人fr对于cdr的功能的维持是有利的。也即，一般地，优选利用包含与要移植的小鼠cdr邻接的fr的氨基酸序列同一性高的氨基酸序列的人fr。设计连接的核苷酸序列使其互相符合读框地连接。利用各自的引物个别合成人fr。其结果是，得到其中编码小鼠cdr的dna与各fr编码dna连接的产物。设计编码各产物的小鼠cdr的核苷酸序列使其互相重叠。随后，进行使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠cdr区域退火的互补链合成反应。通过该反应，人fr经由小鼠cdr的序列连接。使用与其5′末端或3′末端退火的附加了适当限制酶识别序列的引物，扩增最终3个cdr与4个fr连接的全长v区基因。通过使如前述得到的dna和编码人抗体c区的dna符合读框地融合地插入表达载体中，能够制备人源化抗体表达用载体。将该重组载体导入宿主建立重组细胞之后，培养该重组细胞，并且表达编码该人源化抗体的dna，该人源化抗体在该细胞培养物中产生(参考欧洲专利公开号ep239400和国际专利公开号wo1996/002576)。通过对如前述制备的人源化抗体与抗原的结合活进行定性或定量测定、评价，能够适当选择人抗体的fr，其在经由cdr连接时允许该cdr形成良好的抗原结合部位。按照需要，也可以置换fr的氨基酸残基，使得重构人抗体的cdr形成适当的抗原结合部位。例如，通过应用用于将小鼠cdr向接枝入人fr的pcr方法，可以在fr中导入氨基酸序列的突变。更具体地，与fr退火的引物中可以导入部分核苷酸序列突变。在通过使用该引物合成的fr中，导入核苷酸序列突变。通过用前述方法测定和评价置换了氨基酸的突变型抗体与抗原的结合活性，能够选择具有期望性质的突变fr序列(sato，k.等，cancerres，1993，53，851-856)。另外，通过利用dna免疫免疫具有人抗体基因的整体组库(repertoire)的转基因动物，可以获得所需的人抗体(参见wo1993/012227、wo1992/003918、wo1994/002602、wo1994/025585、wo1996/034096、wo1996/033735)。进一步地，已知使用人抗体文库，通过淘选获取人抗体的技术。例如，人抗体的v区作为单链抗体(scfv)通过噬菌体展示法在噬菌体表面表达。可选择表达与抗原结合的scfv的噬菌体。通过对所选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体的v区的dna序列。确定了与抗原结合的scfv的dna序列后，使该v区序列与所需的人抗体c区的序列符合读框地融合，然后插入适当的表达载体，由此可制备表达载体。将该表达载体导入前述例举的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，由此可获得该人抗体。这些方法已知(参照国际公开wo1992/001047、wo1992/020791、wo1993/006213、wo1993/011236、wo1993/019172、wo1995/001438、wo1995/015388)。除噬菌体展示法以外，作为应用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术，已知使用无细胞翻译系统的技术、在细胞或病毒表面展示抗原结合分子的技术、使用乳剂的技术等。例如，作为使用无细胞翻译系统的技术，可以使用通过终止密码子除去等经由核糖体形成mrna与翻译的蛋白质的复合物的核糖体展示法、应用嘌呤霉素等化合物使基因序列和翻译的蛋白质共价结合的cdna展示法、mrna展示法、应用核酸的结合蛋白质形成基因和翻译的蛋白质的复合物的cis展示法等。另外，作为在细胞或者病毒表面展示抗原结合分子的技术，除噬菌体展示法以外，也可使用大肠杆菌展示法、革兰氏阳性菌展示法、酵母展示法、哺乳类细胞展示法、病毒展示法等。作为使用乳剂的技术，可以使用通过在乳剂中包入基因以及翻译相关分子的体外病毒展示法等。这些方法是已知的(natbiotechnol.2000dec；18(12)：1287-92、nucleicacidsres.2006；34(19)：e127、procnatlacadsciusa.2004mar2；101(9)：2806-10、procnatlacadsciusa.2004jun22；101(25)：9193-8、proteinengdessel.2008apr；21(4)：247-55、procnatlacadsciusa.2000sep26；97(20)：10701-5、mabs.2010sep-oct；2(5)：508-18、methodsmolbiol.2012；911：183-98)。c.测定方法(测定)本说明书中提供的抗目标蛋白质抗体可以根据该
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中已知的各种测定方法进行鉴定，进行筛选，或对于物理/化学特性和/或生物学活性进行揭明。1.结合测定方法及其它测定方法在一个方面中，本公开的抗体根据例如elisa，western印迹等公知的方法对于其抗原结合活性进行测试。2.活性测定方法在一个方面中，提供测定方法，其用于鉴定具有生物学活性的本公开的抗体的生物学活性。生物学活性可包括例如：细胞毒活性(adcc活性，cdc活性等)及内化活性。另外，提供在体内和/或体外具有这样的生物学活性的抗体。d.免疫缀合物本公开为另外提供包含本公开的抗体的免疫缀合物，其中，所述抗体与1个或多个细胞毒性剂(例如化学疗法剂或化学疗法药，增殖抑制剂，毒素(例如细菌，真菌，植物或者动物起源的蛋白质毒素，为酶活性的毒素，或者它们的片段)或放射性同位素)缀合。在一种实施方式中，免疫缀合物为抗体与以下1个或多个药物(包含但不限于这些)缀合而成的抗体-药物缀合物(antibody-drugconjugate：adc)：美登素类(maytansinoid，参考美国专利第5,208,020号，第5,416,064号，及欧洲专利第0,425,235号b1)；澳瑞他汀(auristatin)，例如单甲基澳瑞他汀药物部分de及df(mmae及mmaf)(参考美国专利第5,635,483号及第5,780,588号及第7,498,298号)；dolastatin；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参考美国专利第5,712,374号，第5,714,586号，第5,739,116号，第5,767,285号，第5,770,701号，第5,770,710号，第5,773,001号，及第5,877,296号；hinmanetal.，cancerres.53：3336-3342(1993)；以及lodeetal.，cancerres.58：2925-2928(1998))；道诺霉素(daunomycin)或多柔比星等蒽环素(参考kratzetal.，currentmed.chem.13：477-523(2006)；jeffreyeta1.，bioorganic&med.chem.letters16：358-362(2006)；torgovetal.，bioconj.chem.16：717-721(2005)；nagyetal.，proc.natl.acad.sci.usa97：829-834(2000)；dubowchiketal.，bioorg.&med.chem.letters12：1529-1532(2002)；kingetal.，j.med.chem.45：4336-4343(2002)；及美国专利第6,630,579号)；甲氨蝶呤；长春地辛；多西他赛，紫杉醇，拉罗他赛(larotaxel)，替司他赛(tesetaxel)，及奥他赛(ortataxel)等紫杉烷；单端孢霉烯(trichothecene)；以及cc1065。另外的实施方式中，免疫缀合物含有(包括但不限于)与以下的有酶活性的毒素或其片段进行缀合的本说明书中记载的抗体：白喉a链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素a链(源自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))，蓖麻毒素(ricin)a链，相思豆毒素(abrin)a链，蒴莲根毒蛋白(modeccin)a链，α-八叠球菌素(alfa-sarcin)，油桐(aleuritesfordii)蛋白质，石竹毒蛋白(dianthin)，美洲商陆(phytolaccaamericana)蛋白质(papi，papii及pap-s)，苦瓜毒蛋白(momordicacharantia)抑制剂，泻果素(curcin)，巴豆毒素(crotin)，皂草毒蛋白(saponariaofficinalis)抑制剂，白树毒蛋白(gelonin)，迈托毒素(mitogellin)，局限曲菌素(retstrictocin)，酚霉素(phenomycin)，伊诺霉素，以及单端孢霉烯。在另外的实施方式中，免疫缀合物包含为了形成放射性缀合物而与放射性原子缀合的本说明书中记载的抗体。在放射性缀合物的制备中能够利用各种放射性同位素。实例包括，211at，131i，125i，90y，186re，188re，153sm，212bi，32p，212pb及lu的放射性同位素。用于检测放射性缀合物而使用时，放射性缀合物可以含有用于闪烁扫描检验用的放射性原子(例如tc-99m或者123i)，或用于核磁共振(nmr)成像(磁共振成像，也称为mri)的自旋标记(例如，在此也有碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰，或铁)。抗体及细胞毒性剂的缀合物可使用各种二官能性蛋白质连接剂进行制备。例如n-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(spdp)，琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)，亚氨基噻吩(it)，亚胺酯的二官能性衍生物(例如：己二亚氨二盐酸二甲酯)，活性酯(例如：辛二酸二琥珀酰亚胺)，醛(例如：戊二醛)，双叠氮化合物(例如：双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(例如：双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)，二异氰酸酯(例如：甲苯2，6-二异氰酸酯)，及双活性氟化合物(例如：1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如赖氨酸免疫毒素可如vitettaetal.，science238：1098(1987)中记载那样进行制备。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(mx-dtpa)用于对抗体的放射性核种类的共轭的例示的螯合剂。参考wo94/11026。接头可以为促进细胞毒性药在细胞内的放出的“可切割接头”。可使用例如，酸不稳定性接头，肽酶敏感性接头，光不稳定性接头，二甲基接头，或含有二硫化物的接头(charietal.，cancerres.52：127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。本说明书的免疫缀合物或adc为，明确考虑使用包含但不限于(例如自piercebiotechnology,inc.，rockford，il.，u.s.a)市售的bmps，emcs，gmbs，hbvs，lc-smcc，mbs，mpbh，sbap，sia，siab，smcc，smpb，smph，磺基-emcs，磺基-gmbs，磺基-kmus，磺基-mbs，磺基-siab，磺基-smcc，及磺基-smpb，以及svsb(琥珀酰亚胺-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)的交联试剂进行制备的缀合物，但不限于这些。e.用于诊断及检测的方法及组合物在特定的实施方式中，本说明书中提供的抗目标蛋白质抗体均对于检测生物学样品中的目标蛋白质的存在有用。本说明书中使用的术语“检测”包括定量的或定性的检测。在特定的实施方式中，生物学样品包括细胞或组织，例如心脏，肝，肺，肾脏，脾脏，大肠，骨髓的细胞或组织。在一种实施方式中，提供用于在诊断方法或检测方法中使用的本公开的抗体。在另一个方面中，提供检测生物学样品中的目标蛋白质的存在的方法。在特定的实施方式中，该方法包括：在允许本说明书中记载的抗体与目标蛋白质结合的条件下，使本说明书中记载的抗体与生物学样品接触，及检测该抗体和目标蛋白质之间是否形成了复合体。这样的方法可以为体外的方法或体内的方法。在一种实施方式中，例如在目标蛋白质为用于选择患者的生物标记的情况下，本公开的抗体可用于选择适合使用本公开的抗体治疗的受试者。使用本公开的抗体可诊断的例示的障碍包括肺癌(例如肺腺癌)，大肠癌等癌。在特定的实施方式中，提供已标记的抗目标蛋白质抗体。标记包括但不限于，直接检测的标记或部分(例如：荧光标记，显色标记，高电子密度标记，化学发光标记，及放射性标记)以及，例如通过酶反应或分子间相互作用而间接检测的部分(例如酶或配体)。例示的标记包括但不限于以下：放射性同位素32p，14c，125i，3h及131i，稀土类螯合物等荧光基团或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰(dansyl)，伞形酮，萤火虫萤光素酶及细菌萤光素酶(美国专利第4,737,456号)等萤光素酶，荧光素(luciferin)，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase：hrp)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，糖化酶，溶菌酶，单糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶及葡萄糖-6--磷酸脱氢酶)，尿酸酶及黄嘌呤氧化酶等杂环氧化酶，与使用过氧化氢将染料前体进行氧化的酶(例如hr，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)连接的那些，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的无自由基类，以及与这些类似的物质。f.药物制剂在一个方面中，本公开提供本说明书中记载的抗目标蛋白质抗体的药物制剂。在特定的实施方式中，本公开的药物制剂为癌治疗剂，癌预防剂，或癌诊断剂。这样的制剂通过如下制备：将具有期望的纯度的抗体与1个或多个任意的药学上允许的载体(remington′spharmaceuticalsciences16thedition，osol，a.ed.(1980))进行混合，由此以冷冻干燥制剂或水溶液的形态制备。药学上允许的载体通常而言，在使用时的用量及浓度下对于接受者为非毒性，包括但不限于以下：磷酸盐，柠檬酸盐，及其它有机酸等的缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；保存剂(十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基，或苯甲醇；甲基或丙基对羟基苯甲酸酯等烷基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚等)；低分子(低于约10个残基)多肽；血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白等蛋白质；聚乙烯基吡咯烷酮等亲水性聚合物；甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸等氨基酸；单糖，二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；edta等螯合剂；砂糖类：蔗糖，甘露糖醇，海藻糖，山梨糖醇等；钠等成盐反荷离子类；金属络合物(例如：zn-蛋白质络合物)；和/或聚乙二醇(peg)等非离子型表面活化剂。本说明书的例示的药学上允许的载体进一步包含，可溶性中性活性型透明质酸酶糖蛋白质(shasegp)(例如：rhuph20(hylenex(注册商标)，baxterinternational，inc.)等人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白质)等间质性药物分散剂。特定的例示的shasegp及其使用方法(包括rhuph20)记载于美国专利申请公开第2005/0260186号及第2006/0104968号中。在一个方面中，shasegp与软骨素酶等1个或多个追加的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)组合。例示的冷冻干燥抗体制剂记载于美国专利第6,267,958号中。水溶液抗体制剂包括在美国专利第6,171,586号及wo2006/044908中记载的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸酯缓冲液。如果为了治疗或预防的特定的适合症而需要，本说明书的制剂中可以包含多于一种有效成分。优选为具有互相不造成不良影响的互补的活性的那些。例如期望进一步提供细胞毒性剂。这样的有效成分以对于要求的目标而言有效的量进行合适的组合而存在。有效成分例如也可以包含于通过液滴形成(凝聚，coacervation)方式或界面聚合制备成的微胶囊(分别例如为：羟基甲基纤维素或明胶微胶囊，及聚(甲基丙烯酸甲基)微胶囊)中，也可以包含于胶体状药物递送系统(例如：脂质体，白蛋白小球体，微乳液，纳米粒子，及纳米胶囊)中，也可以包含于粗滴乳液中。这样的方式公开于remington′spharmaceuticalsciences16thedition，osol，a.ed.(1980)中。也可以制备缓释性制剂。缓释性制剂的优选实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半透过性基质，该基质为例如膜或微胶囊等成型制品的形态。用于在活体内(invivo)施用的制剂通常为无菌的。无菌状态通过例如通过灭菌过滤膜的过滤等可容易地实现。g.治疗方法及治疗用组合物本说明书中提供的抗体均可用于治疗方法。在一个方面中，提供用作药物的本公开的抗体。在另一个方面中，提供用于癌的治疗的本公开的抗体。在特定的实施方式中，提供用于治疗方法中的本公开的抗体。在特定的实施方式中，本公开提供用于治疗患有癌症(例如：肺癌，大肠癌)的个体的方法中的本公开的抗体，所述方法包括对该个体施用本公开的抗体的有效量的步骤。在这样的实施方式之一中，所述方法进一步包括对该个体施用至少1个(例如后述那样的)追加治疗剂的有效量的步骤。进一步的实施方式中，本公开提供用于诱导细胞毒活性的本公开的抗体。在特定的实施方式中，本公开提供用于在个体中诱导细胞毒活性的方法的本公开的抗体，所述方法包括为了诱导细胞毒活性而对该个体施用本公开的抗体的有效量的步骤。前述实施方式的任意情况中涉及的“个体”优选为人。在另一个方面中，本公开提供本公开的抗体在药物的制造或制备中的使用。在一种实施方式中，药物用于癌症(例如：肺癌，大肠癌)的治疗。进一步的实施方式中，药物用于在治疗癌症(例如：肺癌，大肠癌)的方法中使用，所述方法包括对患有癌症(例如：肺癌，大肠癌)的个体施用药物的有效量的步骤。在这样的实施方式之一中，所述方法进一步包括对该个体施用至少1个(例如后述那样的)追加治疗剂的有效量的步骤。进一步的实施方式中，药物用于诱导细胞毒活性。进一步的实施方式中，药物用于在个体中诱导细胞毒活性的方法，所述方法包括为了诱导细胞毒活性而对该个体施加药物的有效量的步骤。前述实施方式的任意情况中涉及的“个体”可以为人。在前述方面的一种实施方式中，在该方面的一种实施方式中，本公开提供用于治疗肺癌的本公开的抗体或药物，所述抗体或药物用于评价从肺癌患者得到的生物试样中有无选自egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达中的一个以上，选择不具有选自egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达中的一个以上的肺癌患者并作为对利用本公开的抗体或药物进行的治疗的应答者，对该选择的肺癌患者进行施用。在另外的实施方式中，本公开提供用于治疗大肠癌的本公开的抗体或药物，所述抗体或药物用于评价从大肠癌患者得到的生物试样中有无kras突变，选择具有kras突变的大肠癌患者作为对利用本公开的抗体或药物进行的治疗的应答者，对该选择的大肠癌患者进行施用。对评价有无egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达，及kras突变的方法而言，为当
技术领域：
中公知的，可列举例如记载于本说明书的实施例中的方法。在另一个方面中，本公开提供治疗癌症(例如肺癌，大肠癌)的方法(与治疗患有癌症的个体的方法同义使用)。在一种实施方式中，所述方法包括对这样的患有癌症(例如：肺癌，大肠癌)的个体施用本公开的抗体的有效量的步骤。在这样的实施方式之一中，所述方法进一步包括对该个体施用至少1个(后述那样的)追加治疗剂的有效量的步骤。前述实施方式的任意情况中涉及的“个体”可以为人。在前述方面的一种实施方式中，前述方法包括：评价从具有肺癌的个体得到的生物试样中有无选自egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达中的一个以上；选择不具有选自egfr的驱动突变，braf的驱动突变，erbb2的驱动突变，alk融合基因表达，ret/ros1融合基因表达中的一个以上的个体作为对利用本公开的抗体进行的治疗的应答者；及对该选择的个体施用本公开的抗体。在另外的实施方式中，前述方法包括：评价从具有大肠癌的个体得到的生物试样中有无kras突变；选择具有kras突变的个体作为对利用本公开的抗体的治疗的应答者；及该选择的个体施用本公开的抗体。在另一个方面中，本公开提供用于在个体中诱导细胞毒活性的方法。在一种实施方式中，所述方法包括，为了诱导细胞毒活性而对个体施用本公开的抗体的有效量的步骤。在一种实施方式中，“个体”为人。在另一个方面中，本公开提供(例如用于前述治疗方法中的任意方法的)药物制剂，所述药物制剂包含本说明书中提供的抗体中的任意抗体。在一种实施方式中，药物制剂包含本说明书中提供的抗体中的任意抗体和药学上允许的载体。另外的实施方式中，药物制剂包含本说明书中提供的抗体中的任意抗体和至少1个(例如后述那样的)追加治疗剂。本公开的抗体在疗法中，可以以单独或与其它剂组合中的任一种方式使用。例如：本公开的抗体可以与至少1种追加的治疗剂同时施用。在特定的实施方式中，追加治疗剂为细胞毒性剂。如上所述的组合使用疗法包括组合使用施用(在相同或不同的制剂中包含2个以上的治疗剂)及个别施用，在个别施用的情况下，本公开的抗体的施用可以在追加治疗剂的施用之前，和同时，和/或接下来进行。在一种实施方式中，本公开的抗体的施用及追加治疗剂的施用在互相，约1个月以内，或约1，2，或3周以内，或约1，2，3，4，5，或6天以内进行。本公开的抗体也可以与放射线疗法组合使用。本公开的抗体(及任意的追加治疗剂)可通过任意合适的办法施用，包括非口服给药，肺内施用，及经鼻施用，另外在期望用于进行局部处理时在病灶内施用。非肠胃给药注入中包括肌内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。对给药而言，可一部分根据施用是短期的还是长期的而通过利用例如：静脉内注射或皮下注射等的注射等任意合适的路径进行。各种给药日程纳入本说明书的考虑内，包括但不限于单次施用或覆盖各种时间点的重复施用，大剂量(bolus)施用，及脉冲注入。本公开的抗体以与优良医疗规范(goodmedicalpractice)一致的实行方式制成制剂，进行给药，及进行施用。从该观点出发应考虑的因素包括：被治疗的特定的障碍，被治疗的特定的哺乳动物，各个患者的临床症状，障碍的原因，送达药剂的部位，施用方法，施用的日程，及医疗工作者所公知的其它因素。对抗体而言，虽然不是必须的，任意地可与现在使用的，用于预防或治疗作为问题的障碍的1种或多种药剂一起制成制剂。这样的其它药剂的有效量取决于在制剂中存在的抗体的量，障碍或治疗的类型，及在上文中提及的其它因素。它们为通常以与本说明书中叙述的相同用量及施用路径，或以与本说明书中叙述用量的约1～99％，或在经验上/临床上判断为合适的任意用量及任意路径进行使用。为了预防或治疗疾病，本公开的抗体的适当的用量(单独使用时，或与1个或复数其它追加治疗剂一起使用时)，取决于治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重程度及经过，抗体是以预防目的进行施用，还是以治疗目的进行施用，或、用药史，患者的临床病史及对于抗体的应答，以及主治医生的裁断。抗体以1次，或在一系列的处理中适当施用于患者。根据疾病的类型及严重程度，例如不论是通过1次或多次的分别施用，还是通过连续注入进行，可将约1μg/kg至15mg/kg(例如：0.1mg/kg～10mg/kg)的抗体作为用于对患者施用的开始的候选用量。取决于前述因素，一种典型的1日用量为约1μg/kg～100mg/kg以上，也可以有浮动范围。在进行经历数天或更长的反复施用的情况下，根据情况而定，治疗通常保持到疾病症状发生期望的抑制。抗体的一种例示性用量在约0.05mg/kg～约10mg/kg的范围内。因此，可以将约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg，或者10mg/kg的1个或多个用量(或它们的任意组合)施用于患者。这样的用量可以间歇地，例如每1周或每3周(例如，使得患者接受约2～约20，或例如约6用量的抗体的方式)施用。在较高的初次负荷用量后，可以施用1次或多次的低用量。其中，其它给药疗程也可以是有用的。该疗法的经过可以通过以往的方式及测定方法容易地进行监测。应理解，关于前述的制剂或治疗方法中的任一种，均可以代替本公开的抗体或在其上追加而使用本公开的免疫缀合物进行实施。h.产品在本公开的其他方面提供产品，所述产品包含对前述的障碍的治疗，预防，和/或诊断有用的器材。产品包含容器，及该容器上的标志或该容器附属的所附文件。作为优选的容器，包括例如：瓶，小瓶(vial)，注射器，静脉输液袋等。容器类可由玻璃、塑料等各种材料形成。对容器而言，可以将组合物以单体进行保持，也可以与对于症状的治疗，预防，和/或诊断有效的另外的组合物进行组合而保持，另外，任选具有无菌的接入端口(例如，容器可为具有能被皮下注射针刺穿的瓶塞的静脉内施用溶液袋或小瓶(vial))。组合物中至少1种有效成分为本公开的抗体。标志或所附文件显示，组合物是为了治疗选择的症状而使用的。再者，产品可以包括：(a)第一容器，具有收容其中的包含本公开的抗体的组合物；及，(b)第二容器，具有收容其中的进一步包含细胞毒性剂或其以外的治疗性药剂的组合物。本公开的该实施方式中的产品可以进一步包含显示出组合物可用于治疗特定症状的所附文件。可替换或附加地，产品可以进一步包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含抑菌注射用水(bwfi)，磷酸缓冲生理盐水，林格氏液，及葡萄糖溶液等药学上允许的缓冲液。可以进一步包含其它缓冲液，稀释剂，过滤器，针，及注射器等其它从商业观点或使用者的角度期望的器材。应理解对前述产品中的任一种，均可以代替本公开的抗体或在其上追加而包含本公开的免疫缀合物。实施例(实施例1)人组织及其基因分析(1-1)大肠癌组织，肺癌组织，邻接正常组织及正常组织的获取作为分析对象的人组织从asterand公司，ilsbio公司，及allcells公司购买。作为大肠癌组织及与大肠癌组织邻接的正常组织，将12组源自相同供体(iii或iv期)的大肠癌组织及与大肠癌组织邻接的正常组织对(源自12名供体的合计24个被检物)，加上来自该12名供体中的2名供体的淋巴结转移的癌组织每人各2个被检物，获得了合计28个被检物。作为肺癌组织及与肺癌组织邻接的正常组织，获得了肺腺癌(lungadenocarcinoma)组织14个被检物及与肺腺癌邻接的正常组织10个被检物。这其中，源自相同供体的癌组织和邻接正常组织有2组，除此以外，没有源自相同供体的情况。作为正常组织，心脏，肝，肺，肾脏，脾脏，大肠，骨髓的正常组织或邻接正常组织各获取了3个被检物。(1-2)人肺癌组织的alk，ret融合基因分析(rna-seq分析)为了检查实施例1-1中获取的肺癌组织是否具有驱动融合基因(alk，ret/ros1)，进行了rna-seq分析(takarabio株式会社)。从3mm左右大小的组织片2～3片中，使用nucleospintissue(macherey-nagel公司)以制造商建议的方法提取了总rna。使用truseqrnasampleprep试剂盒v2(illumina公司)，以制造商建议的方法从总rna样品制备了dna文库。将制备成的dna文库混合，使用illumina公司测序仪hiseq，实施1泳道，100个碱基的两末端测序分析，用测序仪附带的软件得到了碱基序列(读取序列)。融合基因分析使用star-fusion(https：//github.com/star-fusion/star-fusion)进行。结果可知，在获取的肺癌组织14个样品中没有具有ret/ros1融合基因的样品，存在1例具有alk融合基因的样品(485475rf)(表2)。(1-3)人大肠癌组织及肺癌组织的驱动突变分析(exome-seq分析)为了检查实施例1-1中获取的癌组织是否具有驱动突变(kras，egfr，braf，erbb2)，进行了exome-seq分析(takarabio株式会社)。使用nucleospintissue(macherey-nagel公司)以制造商建议的方法，从3mm左右大小的组织片2～3片提取了基因组dna。使用sureselectxthumanallexonv6(agilent公司)，以制造商建议的方法从基因组dna样品制备了dna文库。将制备成的dna文库混合，使用illumina公司测序仪hiseq，实施100个碱基的两末端分析，用测序仪附带的软件得到了碱基序列(读取序列)。突变分析使用clcgenomicsserver(qiagen公司)进行。结果可知，在大肠癌组织中，在源自12名供体的样品中，7例(1170614f，1171659f，39694ft，39697ft，39698ft，39705ft，40644ft)中具有kras的驱动突变。另外，可知在肺癌组织中，具有egfr的驱动突变的存在3例(1191924f，1160304f，1245371f)，具有braf的驱动突变的存在2例(1186142f，1209913f)，具有kras的驱动突变情况存在3例(1177695f，1185682f，463102xf)(表2)。[表2]大肠癌及肺癌组织的驱动突变，融合基因解析结果的汇总id组织krasegfrbraferbb2融合基因1119061f大肠癌1136277f大肠癌1145808f大肠癌1170614f大肠癌gly12asp1171659f大肠癌gly12valils39694ft1大肠癌gly12cysils39697ft1大肠癌gln61argils39698ft1大肠癌gly13aspils39705ft1大肠癌gly12serils40183ft4大肠癌ils40636ft4大肠癌ils40636fm1大肠癌淋巴结转移ils40636fm2大肠癌淋巴结转移ils40644ft1大肠癌gly12valils40644fm1大肠癌淋巴结转移gly12valils40644fm2大肠癌淋巴结转移gly12val463118zf肺癌1081042f肺癌1177695f肺癌gly12cys1184871f肺癌1185682f肺癌gly12cys1204668f肺癌1245371f肺癌gly719ala463102×f肺癌gly12cysils31537d3肺癌485475rf肺癌alk1186142f肺癌gly466ala1191924f肺癌glu746_ala750del1160304f肺癌leu858arg1209913f肺癌val600glu关于检测的驱动突变，汇总于表2。ils40636fm1，ils40636fm2，ils40644fm1，及ils40644fm2为转移到淋巴结的癌组织的结果，除此以外为大肠癌及肺癌组织的结果。(实施例2)人组织的蛋白质表达分析(蛋白质组学分析)将实施例1-1中获取的组织块直接以冷冻状态放入加入有液氮的研钵，用研杵敲打，使成为大小约3mm的组织片。将组织片中的2～3片移至管中，利用多珠振荡器(multi-beadshocker，安井器械)细细粉碎。在粉碎的组织中添加组织溶解缓冲液(2％脱氧胆酸/100mm碳酸氢铵，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(roche)，phosstop(roche))，使用acousticsolubilizer(covaris公司)或bioruptor(sonicbioco，.ltd.)进行超声波破碎，通过15,000rpm，30min的离心除去不溶物，回收上清液，制成了组织提取液。用pbs洗涤骨髓之后，在沉淀的细胞中加入组织溶解缓冲液，与其他的组织同样进行而得到了组织提取液。将组织提取液中的蛋白质用二硫苏糖醇进行还原，用碘乙酰胺进行烷基化，之后通过tca/丙酮沉淀使蛋白质沉淀。将蛋白质用8m尿素/400mm碳酸氢铵溶液进行溶解，将蛋白质裂解液用蒸馏水稀释4倍，对于稀释的蛋白质裂解液使用reds(rapidenzymedigestionsystem)(amr，inc.)，利用赖氨酰内肽酶及胰蛋白酶消化蛋白质，得到了肽溶液。肽溶液使用monospinc18(glscience)以制造商建议的方法进行脱盐。之后，脱盐的肽溶液使用piercetm高ph值反相肽分离试剂盒(thermofisherscientific)或assaymapbravocartridgerp-s(agilent)，以制造商建议的方法进行了分级，各个级分在与nano-lcsystem(ultimate3000，dionex公司)相连了q-exactive(thermofisherscientific)而成的lc-ms分析系统中进行分析。使用lc-ms分析之后的原始数据(rawdata)，用maxquant(http：//www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant)进行数据库检索，鉴定蛋白质，获得了定量值(ibaq)。数据库检索利用以下参数进行。taxonomy：uniprothuman，fixedmodification：carbamidomethylation(c)，variablemodification：oxidation(m)；deamidation(nq)，acetyl(proteinn-term)，fdr(protein，peptide)＜1％。对于maxquant的输出文件″proteingroups.txt”进行以下处理，算出定量值。1.对分配至相同基因的蛋白组的信号强度(intensity)进行合计，计算出基因水平的强度。2.对每个基因，利用通过胰蛋白酶处理可产生的片段数将强度归一化，计算ibaq得分。3.对每个样品实施归一化，使得得分的平均值为1,000,000。鉴定了合计10,000种以上的蛋白质，得到了各蛋白质的ibaq值。选择了在癌中蛋白质表达较高，在邻接正常组织及正常组织中表达较低的细胞表面蛋白质，从大肠癌中选择了7种蛋白质(spint2，marveld3，mansc1，nox1，slc12a2，cdcp1，ceacam5)，从肺癌中选择了10种蛋白质(spint2，pvrl4，sez6l2，xpr1，flvcr1，slc7a5，steap1，mmp14，tnfrsf21，tmprss4)作为目标抗原候选。将选择的候选蛋白质的表达示于图1-1～图1-16。在大肠癌样品的分析中，ceacam5(seqidno：10)为目前实施临床试验中的抗原，成为比较抗原的表达谱(profile)的指标。对ceacam5而言，虽然在正常组织，邻接正常组织中也可见一定程度的表达，但在癌中在基本全部例子中为该程度以上的高表达。对nox1，marveld3，mansc1而言，无法确认在正常组织中的蛋白质表达，在具有kras突变的3～4例的大肠癌组织中为高表达(中位数以上)，可见与在大肠癌组织邻接的正常组织中的表达水平具有较大差异，显示了与ceacam5不同类型的表达谱。对spint2，slc12a2，cdcp1而言，在正常组织及与大肠癌组织邻接的正常组织中可见一定程度的表达，但在大肠癌组织中为该程度以上的高表达，表现了与ceacam5相似的表达谱。在肺癌样品的分析中，pvrl4(seqidno：11)已经在进行临床试验，成为比较抗原的表达谱的指标。对pvrl4及xpr1而言，无法确认正常组织中的蛋白质表达，为在肺癌组织中高表达的癌症特异性极高的抗原。对tmprss4及tnfrsf21而言，没有确认到在正常组织的表达，但在肺癌组织中的表达量为中等程度。对slc7a5，steap1，flvcr1，sez6l2，mmp14及spint2而言，在正常组织及与肺癌组织邻接的正常组织中可见一定程度的表达，在肺癌组织中为该程度以上的高表达。(实施例3)来自大肠癌的目标抗原候选marveld3的同工型表达分析已知marveld3中存在同工型1和2，在细胞内区域的氨基酸序列非常十分相似，但细胞外区域大不相同(图2)。为了检查在癌组织中高表达的是哪一种同工型，确认了在蛋白质组学分析中鉴定的marveld3的肽片段在lc-ms中的峰强度。对鉴定肽的列表及定量值而言，使用了在实施例1-2中分析出maxquant的输出文件之一的modificationspecificpeptides.txt。在具有kras突变的大肠癌组织的7个被检物中的4个被检物中(3次lc-ms分析中2次以上)，除了同工型1，2共同的肽片段以外，检测到同工型2特异性的片段，在邻接正常组织中，没有3次中被检出2次以上的片段(图3-1)。在具有kras突变的大肠癌组织7个被检物中的2个被检物中，检测到同工型1特异性的片段(图3-2)。因此，推测同工型2在更多的具有kras突变的大肠癌组织中为高表达。(实施例4)目标候选抗原的细胞表面局部分布分析为了确认xpr-1，marveld3(同工型2)，nox1的细胞表面局部分布，使用以制造商建议的方法使用expifectamine(thermofisherscientific公司)，在expi293细胞(thermofisherscientific公司)中过量表达添加了myc-tag的xpr-1及marveld3(同工型2)而成的细胞，及推测高表达这3种蛋白质的c2bbe1，sw403，sw1463，dms79(atcc)及hlc-1细胞(riken)实施了细胞表面蛋白质组学分析。细胞用pbs洗涤之后，通过与细胞膜不透过性的生物素试剂(sulfo-nhs-lc-biotin，thermofisherscientific公司)进行孵育，对细胞表面蛋白质的n末端及赖氨酸的侧链的氨基进行了生物素标记。使用covaris公司的acousticsolubilizer或bioruptor(sonicbioco，.ltd.)将回收的细胞进行超声波破碎，得到了细胞提取液。用甲醇/氯仿法使细胞提取液中的蛋白质发生沉淀，溶解于8m尿素/400mm碳酸氢铵溶液中。利用二硫苏糖醇进行还原，利用碘乙酰胺进行烷基化，之后利用胰蛋白酶消化蛋白质，得到了肽溶液。肽溶液-neutravidinfgbeads(多摩川精机)和混合，洗涤之后，洗脱进行，生物素化肽-纯化的。纯化的生物素化肽使用与nano-lcsystem(ultimate3000，dionex公司)相连的q-exactive(thermofisherscientific)或orbitrapfusionlumos(thermofisherscientific)而成的lc-ms分析系统进行了分析。使用lc-ms分析之后的原始数据(rawdata)，用maxquam(http：//www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant)进行数据库检索，鉴定生物素化肽及蛋白质，获得了定量值。数据库检索利用以下参数进行。taxonomy：uniprothuman，fixedmodification：carbamidomethylation(c)，variablemodification：oxidation(m)，acetyl(proteinn-term)，nhs-lc-biotin(n-term)；nhs-lc-biotin(k)，fdr(protein，peptide)＜1％。对鉴定肽的列表及定量值而言，使用了maxquant的输出文件之一的modificationspecificpeptides.txt。从利用该方法检测的生物素化肽的序列和表达量，能够辨别分析对象蛋白质是否在细胞膜表达，也能够特别确定细胞外区域。从xpr1过量表达细胞检测到了氨基酸编号1-108，111-122，159-171，177-216，423-448，473-502，660-670，674-696的生物素化肽(图4)。另外，从hlc-1或者dms-79细胞的内源性蛋白质检测到了氨基酸编号177-190，428-448，660-670的生物素化肽(图4-1)。由此确认了xpr1在细胞表面为局部分布，提示在uniprot中被认为是细胞内区域的区域为细胞外区域。对nox1而言，由于从c2bbel，sw1463，或者sw403细胞检测到氨基酸编号44-54，131-161，242-258的生物素化肽，因此，确认了在细胞表面局部分布。(图4-2)。对marveld3同工型2而言从过量表达细胞检测到氨基酸编号101-111及163-198的生物素化肽，但没有从进行分析的细胞中检测到内源性蛋白质的生物素化肽(图4-3)。由于marveld3同工型2的被认为是细胞外区域的部分被生物素标记的赖氨酸的数量较少，因此，可能较难检测到生物素化肽。(实施例5)细胞系的蛋白质表达分析(蛋白质组学分析)将hlc-1细胞(riken)，nci-h2227细胞(atcc)，caco-2细胞(riken)细胞悬浊在溶解缓冲液(1％np-40，50mmtris-cl(ph7.5)，150mmnacl，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(roche))中，利用acousticsolubilizer(covaris公司)进行超声波破碎，成为细胞提取液。细胞提取液中的蛋白质用二硫苏糖醇进行还原，用碘乙酰胺进行烷基化，之后通过甲醇/氯仿沉淀进行沉淀。将沉淀的蛋白质溶解于8m尿素/400mm碳酸氢铵溶液中，用蒸馏水稀释4倍，之后用赖氨酰内肽酶及胰蛋白酶消化，得到了肽溶液。肽溶液使用monospinc18(glscience)以制造商建议的方法进行脱盐。之后，脱盐的肽溶液使用assaymapbravocartridgerp-s(agilent)以制造商建议的方法进行了分级，各个级分在与nano-lcsystem(thermofisherscientific)相连的q-exactive(thermofisherscientific)而成的lc-ms分析系统中进行分析。lc-ms分析之后的原始数据(rawdata)使用maxquant(http：//www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant)进行数据库检索，鉴定蛋白质，，获得了定量值(ibaq，intensitybasedabsolutequantification)。数据库检索利用以下参数进行。taxonomy：uniprothuman，fixedmodification：carbamidomethylation(c)，variablemodification：oxidation(m)；deamidation(nq)，acetyl(proteinn-term)，fdr(protein，peptide)＜1％。记载于maxquant的输出文件“proteingroups.txt”中的xpr1及marveld3的ibaq值示于图5-1及图5-2。(实施例6)抗xpr1抗体的制备制备了表达在人xpr1全长(seqidno：1)的c末端添加了tt肽序列(fnnftvsfwlrvpkvsashle，seqidno：22)的分子(人xpr1-tt，碱基seqidno：23，氨基酸seqidno：24)的质粒载体。利用制备的质粒载体，通过基因枪法及体内电穿孔(invivoelectroporation)法免疫4只新西兰白兔(kitayamalabesco.ltd.)6次，从最终免疫起1周后的兔回收了外周血单核细胞及脾细胞。从回收的源自兔的细胞中，使用pe标记抗兔igg抗体(southernbiotech)将表面igg阳性b细胞通过macs进行浓缩，进行培养。从培养的b细胞中，将分泌与人xpr1结合的抗体b细胞利用micromanipulatorcellcelector(als)附带的荧光显微镜进行鉴定，通过你micromanipulatorcellcelector(als)回收至微孔板。通过rt-pcr从回收的b细胞克隆了构成兔免疫球蛋白的可变区的基因。为了制备重组抗体，这些兔免疫球蛋白的可变区的dna片段被插入至包含igg恒定区的表达载体中。通过本领域技术人员公知的方法制备抗人xpr1抗体。制备的抗人xpr1抗体示于表3。[表3]抗体名称xpb0062hvr_h1seqidno：35hvr_h2seqidno：36hvr_h3seqidno：37hvr_l1seqidno：38hvr_l2seqidno：39hvr_l3seqidno：4ovhseqidno：41vlseqidno：42作为抗人cd3抗体，通过本领域技术人员公知的方法制备了与构成t细胞受体的cd3ε链结合，诱导t细胞受体的活化信号的ce115tr(重链可变区seqidno：65，轻链可变区seqidno：66)。发明人通过本领域技术人员公知的方法制备了自抗人xpr1抗体和抗cd3抗体形成的双特异性抗体。制备的抗人xpr1/抗人cd3双特异性抗体示于表4。双特异性抗体的抗人xpr1侧的重链恒定区序列为seqidno：83所示的序列，抗人xpr1侧的轻链恒定区序列为seqidno：85所示的序列，抗人cd3侧的重链恒定区序列为seqidno：84所示的序列，抗人cd3侧的轻链恒定区序列为seqidno：86所示的序列。[表4](实施例7)确认抗人xpr1抗体的与人xpr1的结合构建了在哺乳细胞中表达在人xpr1全长(氨基酸seqidno：1)的c末端添加了myc标签序列(eqkliseedl，seqidno：25)的分子(人xpr1-myc，碱基seqidno：26，氨基酸seqidno：27)的质粒载体。通过将构建的质粒载体导入expi293细胞(thermofisherscientific)，由此在expi293细胞中暂时性地表达了蛋白质。同时作为对照也制备了导入了空质粒载体的expi293细胞。将导入了空质粒载体的expi293细胞用celltracefarred(thermofisherscientific)染色之后，与使其表达人xpr1-myc的expi293细胞混合后，使其与实施例6中制备的抗人xpr1抗体进行反应。之后，与抗人iggfccross-adsorbedalexa488(invitrogen)进行反应，将抗人xpr1抗体染色。死细胞用dapi(sigma-aldrich)染色。与抗体发生反应的细胞通过facsariaiii(becton，dickinsonandcompany)进行测定。得到的数据通过flowjover.10进行分析。对没有被dapi荧光染色的活细胞级分而言，被分为被celltracefarred染色的级分(导入了空质粒载体的细胞)和未被celltracefarred染色的级分(导入了人xpr1-myc表达质粒载体的细胞)，对于它们分别确认了alexa488染色，结果确认相对于被celltracefarred染色的级分(导入空质粒载体的细胞)，未被celltracefarred染色的级分(导入了人xpr1-myc表达质粒载体的细胞)的alexa488染色更优(图6)。由此，确认了实施例6制备的抗人xpr1抗体与在细胞中表达的人xpr1结合。(实施例8)抗人xpr1/抗人cd3双特异性抗体的细胞毒活性测定使用人pbmc(外周血单核细胞)的ldh细胞毒活性测定对实施例6制备的抗人xpr1/抗人cd3双特异性抗体的细胞毒活性而言，通过ldh释放法(ldh细胞毒性检测试剂盒：takara)进行评价。首先，将用培养液(在rpmi1640中添加了10％fbs的溶液)稀释为终浓度4倍的各浓度(0.04，0.004，0.0004mg/ml)的抗体溶液以每孔50μl添加到96孔u底板中。接着，作为目标细胞，将hlc-1调整使得为1x10e5细胞/ml，将nci-h2227调整使得为2x10e5细胞/ml，以使得各孔的最终细胞数为1x10∧4细胞/孔的方式以各100μl/孔，或50μl/孔进行接种，u底板在室温静置15分钟。作为效应细胞，将人pbmc(外周血单核细胞)调整使得为4x10e6细胞/ml或2x10e6细胞/ml，对接种有hlc-1细胞的孔添加4x10e6细胞/ml的细胞，对接种有nci-h2227细胞的孔添加2x10e6细胞/ml的细胞，各孔添加了50μl。之后，u底板在5％二氧化碳气体培养箱中于37℃静置约24小时左右，进行离心。在u底板中，除了添加了前述目标细胞和效应细胞和抗体的孔以外，也准备了仅添加培养液的孔，仅添加目标细胞和效应细胞(没有添加抗体)的孔，添加了目标细胞和效应细胞和tritonx-100(没有添加抗体)的孔。将u底板的各孔中的培养上清液100μl移至96孔平底板中。将催化剂溶液溶解于1mlh2o中，以使得催化剂溶液：染料溶液为1：45的方式与染料溶液混合。将催化剂溶液及染料溶液的混合溶液移液于移去了培养上清液的96孔平底板中，平底板于室温静置15-30分钟。测定各孔的492nm的吸光度，同时使用测定的对照波620nm的吸光度算出492-620nm吸光度。将各孔的492-620nm吸光度代入下式，算出细胞增殖抑制率(cytotoxicity，细胞毒性)。a：添加了目标细胞和效应细胞和抗体的孔的492-620nm吸光度b：仅添加了目标细胞和效应细胞的孔的492-620nm吸光度c：添加了目标细胞和效应细胞和tritonx-100的孔的492-620nm吸光度d：仅培养液的孔(空白)的492-620nm吸光度平均值抗人xpr1/抗人cd3双特异性抗体显示了容量依赖性的细胞增殖抑制活性(图7，图8)。(实施例9)抗人marveld3同工型2抗体的制备构建了表达人marveld3同工型2(碱基seqidno：28，氨基酸seqidno：4)的质粒载体。利用构建的质粒载体，通过基因枪法及体内电穿孔(invivoelectroporation)法免疫4只新西兰白兔(kitayamalabesco.ltd.)6次，从最终免疫起1周后的兔回收了外周血单核细胞及脾细胞。从回收的源自兔的细胞中，使用pe标记抗兔igg抗体(southernbiotech)将表面igg阳性b细胞通过macs进行浓缩，进行培养。从培养的b细胞中，将分泌与人marveld3同工型2结合的抗体b细胞利用micromanipulatorcellcelector(als)附带的荧光显微镜进行鉴定，通过你micromanipulatorcellcelector(als)回收至微孔板。通过rt-pcr从回收的b细胞克隆了构成兔免疫球蛋白的可变区的基因。为了制备重组抗体，这些兔免疫球蛋白的可变区的dna片段被插入至包含igg恒定区的表达载体中。抗人marveld3同工型2抗体通过本领域技术人员公知的方法制备。制备的抗人marveld3同工型2抗体示于表5。[表5]抗体名称mda0279mda0314hvr_h1seqidno：43seqidno：51hvr_h2seqidno：44seqidno：52hvr_h3seqidno：45seqidno：53hvr_l1seqidno：46seqidno：54hvr_l2seqidno：47seqidno：55hvr_l3seqidno：48seqidno：56vhseqidno：49seqidno：57vlseqidno：50seqidno：58作为抗人cd3抗体，通过本领域技术人员公知的方法制备了与构成t细胞受体的cd3ε链结合，诱导t细胞受体的活化信号的ce115tr(重链可变区seqidno：65，轻链可变区seqidno：66)。发明人通过本领域技术人员公知的方法制备了自抗人marveld3同工型2抗体和抗cd3抗体形成的双特异性抗体。制备的抗人marveld3同工型2/抗人cd3双特异性抗体示于表6。双特异性抗体的抗人marveld3同工型2侧的重链恒定区序列为seqidno：83所示的序列，抗人marveld3同工型2侧的轻链恒定区序列为seqidno：85所示的序列，抗人cd3侧的重链恒定区序列为seqidno：84所示的序列，抗人cd3侧的轻链恒定区序列为seqidno：86所示的序列。[表6](实施例10)确认抗人marveld3同工型2抗体与marveld3同工型2的结合将在哺乳细胞中表达在人marveld3同工型2全长(氨基酸seqidno：4)的n末端甲硫氨酸之后增加了myc标签的序列(eqkliseedl，seqidno：25)的分子(myc-人marveld3，碱基seqidno：29，氨基酸seqidno：30)的质粒载体导入expi293细胞(thermofisherscientific)中，在expi293细胞中暂时性表达了蛋白质。同时作为对照也制备了导入了空质粒载体的expi293细胞。将导入空质粒载体的expi293细胞用celltracefarred(thermofisherscientific)染色之后，与使其表达人marveld3同工型2的expi293细胞混合，使其与实施例9制备的抗人marveld3同工型2抗体进行反应。之后，与抗人iggfccross-adsorbedalexa488(invitrogen)进行反应，将抗人marveld3同工型2抗体染色。死细胞用dapi(sigma-aldrich)染色。与抗体发生反应的细胞通过facsariaiⅱ(becton，dickinsonandcompany)进行测定。得到的数据通过flowjover.10进行分析。对没有被dapi荧光染色的活细胞级分而言，被分为被celltracefarred染色的级分(导入了空质粒载体的细胞)和未被celltracefarred染色的级分(导入了人xpr1-myc表达质粒载体的细胞)，对于它们分别确认了alexa488染色，结果确认相对于被celltracefarred染色的级分(导入空质粒载体的细胞)，未被celltracefarred染色的级分(导入了人marveld3-同工型2表达质粒载体的细胞)的alexa488染色更优(图9)。由此，确认了实施例9制备的抗人marveld3同工型2抗体与在细胞中表达的人marveld3同工型2结合。(实施例11)抗人marveld3同工型2/抗人cd3双特异性抗体的细胞毒活件测定使用人外周血单核细胞的细胞毒活性测定对实施例9制备的抗人marveld3同工型2/抗人cd3双特异性抗体的细胞毒活性而言，基于使用xcelligence实时细胞分析仪(rochediagnostics)确定的细胞增殖抑制率进行了评价。使用的目标细胞为caco-2细胞。首先在e-plate96(rochediagnostics)板的各孔中每孔加入50μl培养基。从平皿剥下caco-2细胞，以1.3x103细胞/孔(50μl/孔)进行接种。接着，使用xcelligence实时细胞分析仪开始了活细胞测定。次日，从xcelligence实时细胞分析仪拆下板，将调整为各种浓度(0.1，1.0，10μg/ml)的各抗体50μl加入至板的各孔中。进一步加入50μl的人pbmc悬浊液(5x104细胞/孔)。板再次置于xcelligence实时细胞分析仪上，开始了活细胞测定。反应在37℃，5％二氧化碳气体中实施。对细胞增殖抑制率(％)而言，使用从人pbmc添加起72小时之后的细胞指数(index)值按照以下所示的式确定。用于计算中的细胞指数值以使得在即将添加抗体之前的细胞指数值为1的方式进行了归一化。a表示抗体非添加孔(仅靶标细胞和人pbmc)的平均细胞指数值，b表示各孔的平均细胞指数值。测定重复了3次。对抗klh/cd3双特异性抗体，tr01h113//mda0279，tr01h113//mda0314的细胞毒活性而言，使用pbmc(外周血单核细胞)测定。相对于作为对照的抗klh/cd3双特异性抗体，tr01h113//mda0279，及tr01h113//mda0314显示了高细胞增殖抑制率(图10)。(实施例12)人nox1蛋白质的制备合成了编码在人nox1全长序列(氨基酸seqidno：2)的c末端添加了twin-strep标签序列(wshpqfekgggsgggsggsawshpqfek，seqidno：31)的分子(人nox1-strep，氨基酸seqidno：34)的基因，克隆至用于哺乳细胞表达的载体中。通过将该表达载体导入expi293细胞(thermofisherscientific)中，由此暂时性表达了蛋白质。得到的细胞通过离心而回收，添加了终浓度1％fos-choline14/0.2％胆固醇半琥珀酸酯，使人nox1--strep蛋白质增溶。增溶的蛋白质样品通过使用strep-tactinxtsuperflow(ibagmbh)的亲和层析法进行了纯化。回收包含人nox1--strep蛋白质的级分，添加了终浓度为2mg/ml的amphipola8-35溶液(anatrace)。然后立即添加bio-beadssm-2adsorbentmedia(bio-rad)，于4℃孵育12-16小时，由此在除去fos-choline14/胆固醇半琥珀酸酯的同时，于amphipola8-35中重构了人nox1--strep蛋白质。重构的人nox1--strep蛋白质样品通过使用superdex200increase10/300柱(gehealthcare)的凝胶过滤色谱进行了纯化。回收包含人nox1--strep蛋白质的级分，使用50kdamwco的超滤膜进行浓缩。对于浓缩后的样品添加了终浓度为2mg/ml的amphipola8-35，制成了最终制备品。(实施例13)抗人nox1抗体的制备使用实施例12制备的人nox1-strep蛋白质免疫2只新西兰白兔(kitayamalabesco.ltd.)4次，从最终免疫起6天后的兔回收了外周血单核细胞及脾细胞。合成了编码在人nox1(seqidno：2)的第1～第564位的氨基酸的n末端融合了neurexin1b-delta的信号序列和跨膜区域(cell.2018nov1；175(4)：1131-1140.e11.)，在c末端添加了myc标签序列(eqkliseedl)的分子(nox1_nx1b_564-myc，碱基seqidno：32，氨基酸seqidno：33)的基因，克隆至用于哺乳细胞表达的载体中。使用构建的质粒载体，通过基因枪法装置及tropis(pharmajet)免疫8只新西兰白兔(kitayamalabesco.ltd.)6次，从最终免疫起6天或者7天后的兔回收了脾细胞。从回收的源白兔的细胞中，使用pe标记抗兔igg抗体(southernbiotech)将表面igg阳性b细胞通过macs及facs进行浓缩，进行培养。从培养的b细胞中，将分泌与人nox1结合的抗体b细胞利用micromanipulatorcellcelector(als)附带的荧光显微镜进行鉴定，通过你micromanipulatorcellcelector(als)回收至微孔板。通过rt-pcr从回收的b细胞克隆了构成兔免疫球蛋白的可变区的基因。为了制备重组抗体，这些兔免疫球蛋白的可变区的dna片段被插入至包含igg恒定区的表达载体中。抗人nox1抗体通过本领域技术人员公知的方法制备。制备的抗人nox1抗体示于表7。[表7]抗体名称nxa0125nxa0164hvr_h1seqidno：67seqidno：75hvr_h2seqidno：68seqidno：76hvr_h3seqidno：69seqidno：77hvr_l1seqidno：70seqidno：78hvr_l2seqidno：71seqidno：79hvr_l3seqidno：72seqidno：80vhseqidno：73seqidno：81vlseqidno：74seqidno：82作为抗人cd3抗体，通过本领域技术人员公知的方法制备了与构成t细胞受体的cd3ε链结合，诱导t细胞受体的活化信号的ce115tr(重链可变区seqidno：65，轻链可变区seqidno：66)。发明人通过本领域技术人员公知的方法制备了自抗人nox1抗体和抗cd3抗体形成的双特异性抗体。制备的抗人nox1/抗人cd3双特异性抗体示于表8。双特异性抗体的抗人nox1侧的重链恒定区序列为seqidno：83所示的序列，抗人xpr1侧的轻链恒定区序列为seqidno：85所示的序列，抗人cd3侧的重链恒定区序列为seqidno：84所示的序列，抗人cd3侧的轻链恒定区序列为seqidno：86所示的序列。[表8](实施例14)确认抗人nox1抗体与人nox1的结合通过将表达人nox1-strep(氨基酸seqidno：34)的质粒载体或者表达nox1_nx1b_564-myc(氨基酸seqidno：33)的质粒载体导入expi293细胞(thermofisherscientific)，暂时性表达了蛋白质。同时作为对照也制备了导入了空质粒载体的expi293细胞。这些细胞用4％多聚甲醛及1％洋地黄皂苷处理。将导入了空质粒载体的expi293细胞用celltracefarred(thermofisherscientific)染色，将导入了表达人nox1-strep的质粒载体的expi293细胞用celltracefarred及celltraceviolet(thermofisherscientific)染色之后，与使其表达nox1_nx1b_564-myc的expi293细胞混合，使其与实施例13制备的抗人nox1抗体进行反应。之后，与抗人iggfccross-adsorbedalexa488(invitrogen)进行反应，将抗人nox1抗体染色。与抗体发生反应的细胞通过facsariaiii(becton，dickinsonandcompany)进行测定。得到的数据通过flowjover.10进行分析。分为被celltracefarred染色的级分(导入空质粒载体的细胞)，未染色的级分(导入人nox1-strep的细胞)，被celltracefarred及celltraceviolet(导入nox1_nx1b_564-myc的细胞)染色的级分，对于它们分别确认了alexa488染色。确认了相对于被celltracefarred染色的级分(导入空质粒载体的细胞)而言，未染色的级分(导入人nox1-strep的细胞)，被celltracefarred及celltraceviolet(导入nox1_nx1b_564-myc的细胞)染色的级分的染色更优(图11)。由此，确认了实施例13制备的抗人nox1抗体与在细胞中表达的人nox1结合。前述的发明中出于帮助理解清楚的目的而详细记载了实例及例示，但本说明书中的记载及例示不应解释为对本公开的范围进行任何限定。本说明书中引用的全部的专利文献及科学文献的公开，均以其全部通过参考而明确地并入本说明书。工业实用性本公开的抗体具有细胞毒活性及内化活性中的至少一种，对癌症(例如肺癌、大肠癌)的治疗及预防中的一者或两者有用。当前第1页12