肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物的制作方法

1.本发明涉及肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物。


背景技术：

2.肝细胞生长因子是具有多种生理作用的生长因子，已知除了最初发现的肝细胞增殖作用以外，还具有抗细胞凋亡作用、血管生成作用、血管扩张作用、抗器官纤维化作用、抗上皮间充质转化作用等，正在尝试针对各种疾病的临床应用。然而，由于肝细胞生长因子的生物体内半衰期短至30分钟左右，所以为了使其作用持续，需要频繁地给予大量的肝细胞生长因子(非专利文献1)。
3.另外，作为肝细胞生长因子的活性片段，已知有天然型剪接变体即nk1 (非专利文献2)和nk2 (非专利文献3)、以及通过重组技术制作的nk4 (非专利文献4)，已明确它们在体外和体内具有生理活性。
4.聚乙二醇是生物适应性高的聚合物性高分子，为了延长蛋白药物的生物体内半衰期或降低免疫原性，而被广泛用作蛋白质的修饰剂。
5.关于肝细胞生长因子，还报道了聚乙二醇修饰物(专利文献1)。另外，还报道了作为肝细胞生长因子的拮抗剂片段的nk4的聚乙二醇修饰物(专利文献2)。
6.现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利第5,977,310号说明书；专利文献2：日本特开2010
‑
174034号公报；非专利文献非专利文献1：liu k. x.等人, american journal of physiology, 1998年, 第275卷, 第835
‑
842页；非专利文献2：jakubczak j. l.等人, molecular and cellular biology, 1998年, 第18卷, 第3号, 第1275
‑
1283页；非专利文献3：otsuka t.等人, molecular and cellular biology, 2000年, 第20卷, 第6号, 第2055
‑
2065页；非专利文献4：date k.等人, febs letters, 1997年, 第420卷, 第1号, 第1
‑
6页。


技术实现要素：

7.发明所要解决的课题然而，已知在基于聚乙二醇修饰的理想效果的另一方面，在具有生理活性的蛋白质的聚乙二醇修饰中，生理活性依赖于聚乙二醇的结合位置而降低或消失。例如，记载了在肝细胞生长因子的随机位置结合有多个聚乙二醇的修饰物，但其生物体内半衰期的延长效果较低，而且观察到生理活性降低30%以上(专利文献1)。
8.因此，在现有技术中认为基于聚乙二醇修饰的生物体内半衰期的延长与生理活性的保持相反，期望同时满足这些的聚乙二醇修饰物。
9.因此，本发明的目的在于：提供兼顾了基于聚乙二醇修饰的生物体内半衰期的延长效果和保持生理活性的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物。
10.用于解决课题的手段为了解决上述课题，本发明人反复进行了深入研究，结果发现了兼顾基于聚乙二醇修饰的生物体内半衰期的延长效果和保持生理活性的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物，从而完成了本发明。
11.本发明包含以下特征。
12.(1) 肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物，其中，1分子的叉形聚乙二醇与2分子的肝细胞生长因子或其活性片段的各自的羧基末端区域进行共价键合而形成同源二聚体(同型二聚体)。
13.(2) 上述(1)所述的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物，其由通式(i)表示：[化学式1]式中，peg表示叉形聚乙二醇的结构部分，l表示对水解稳定的支链部分，hgf表示肝细胞生长因子或其活性片段，x表示键合部分，该键合部分提供叉形聚乙二醇与肝细胞生长因子或其活性片段的共价键合。
[0014]
(3) 上述(2)所述的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物，其中，在通式(i)中，peg表示包含
‑
(ch2ch2o)n
‑
的结构，该结构形成直链结构或支链结构，n为2～2300。
[0015]
(4) 上述(1)～(3)中任一项所述的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物，其由通式(ii)表示：[化学式2]式中，x和hgf如上述所定义。
[0016]
(5) 上述(1)～(4)中任一项所述的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物，其中，上述叉形聚乙二醇的支链部分的支链原子与官能团的距离为20
å
以下，该官能团提供上述叉形聚乙二醇与上述肝细胞生长因子或其活性片段的共价键合。
[0017]
(6) 上述(1)～(5)中任一项所述的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物，其中，上述肝细胞生长因子的活性片段为nk1。
[0018]
(7) 上述(6)所述的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物，其中，上述
nk1由序列表的seq id no: 2所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列构成。
[0019]
(8) 药物，该药物含有上述(1)～(7)中任一项所述的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物作为有效成分。
[0020]
发明效果本发明的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物在延长生物体内半衰期的同时保持其生理活性，因此可用作以少于非修饰物的给药频率发挥其药效的药物。
附图说明
[0021]
[图1]是显示添加有his
‑
cys的人nk1和叉形聚乙二醇修饰nk1二聚体的sds电泳图像的图。
[0022]
[图2]是显示肝素二聚体化nk1、叉形聚乙二醇修饰nk1二聚体和直链型聚乙二醇修饰nk1二聚体的生理活性的图。
[0023]
[图3]是显示尾静脉内给予添加有his
‑
cys的人nk1 (虚线)或叉形聚乙二醇修饰nk1二聚体(实线)时的小鼠血清中浓度的时间变化的图。
具体实施方式
[0024]
本发明的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物的特征在于：肝细胞生长因子或其活性片段形成同源二聚体，1分子的叉形聚乙二醇与上述同源二聚体的两方的单体的羧基末端区域进行共价键合而形成二聚体。
[0025]
＜肝细胞生长因子及其活性片段＞肝细胞生长因子(以下，也称为“hgf”。)是具有多种生理活性的生长因子。hgf从氨基末端侧起由n结构域、kringle (三环) 1、kringle 2、kringle 3、kringle 4和sph结构域构成，n结构域、kringle 1、kringle 2、kringle 3和kringle 4构成α链，sph结构域构成β链。hgf在表达时以单链pro
‑
hgf的形式进行生物合成，在分泌时被去除分泌信号序列后，在细胞外从起始蛋氨酸数起在第494位的精氨酸残基与第495位的缬氨酸残基之间接受基于蛋白酶的处理，形成α链与β链通过二硫键进行键合而得的异源二聚链，成为活性型(miyazawa k.等人, the journal of biological chemistry, 1996年, 第271卷, 第7号, 第3615
‑
3618页)。本发明的hgf是指具有生理活性的活性型hgf。
[0026]
在人肝细胞生长因子(hgf)的情况下，以由728个氨基酸残基(包括分泌信号序列(从起始蛋氨酸起31个氨基酸残基)) (genbank登录号：m29145)构成的分泌蛋白质的形式进行生物合成，在分泌时成为由去除了分泌信号序列的697个氨基酸残基构成的蛋白质(seq id no: 1)。
[0027]
上述的肝细胞生长因子(hgf)不仅包含具有与天然存在的hgf (以下，记作天然型hgf)的氨基酸序列相同的氨基酸序列的hgf，还包含具有在天然型hgf的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被缺失、取代或添加(或插入)而得的氨基酸序列、并且具有作为hgf的生理活性的hgf的氨基酸突变体，而且还包含天然型hgf的糖链部分被修饰而得的hgf和不具有糖链部分的hgf。作为hgf的突变体，优选为与天然型hgf的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的突变体，更优选为具有95%以上的序列同一性的突变体，进一步优选为具有98%以
2000年,第20卷,第6号,第2055
‑
2065页)。
[0036]
另外，作为肝细胞生长因子(hgf)的活性片段，例如可列举：通过重组技术制作的nk4。据报道，nk4由hgf的氨基末端侧的n结构域、kringle1、kringle2、kringle3和kringle4构成，作为拮抗剂起作用(datek.等人,febsletters,1997年,第420卷,第1号,第1
‑
6页)。
[0037]
上述的肝细胞生长因子(hgf)的活性片段不仅包含具有与来自天然型hgf的氨基酸序列的氨基酸序列相同的氨基酸序列的活性片段，还包含具有在来自天然型hgf的氨基酸序列的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被缺失、取代或添加而得的氨基酸序列、并且具有作为hgf的生理活性(激动剂活性)或hgf的拮抗剂活性的突变体，而且还包含来自天然型hgf的糖链部分被修饰、或不具有来自天然型hgf的糖链部分的突变体。作为hgf的活性片段的突变体，优选与天然型hgf的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的突变体，更优选具有95%以上的序列同一性的突变体，进一步优选具有98%以上的序列同一性的突变体。例如，作为nk1高活性型突变体，可列举：1k1(liethad.等人,theembojournal,2001年,第20卷,第20号,第5543
‑
5555页)和m2.2(jonesd.s.等人,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2011年,第108卷,第32号,第13035
‑
13040页)。
[0038]
上述的肝细胞生长因子或其活性片段优选为肝细胞生长因子(hgf)(也包括突变体)、nk1(也包括突变体)、nk2(也包括突变体)或nk4(也包括突变体)，优选为天然型hgf、缺损型hgf(kinosakim.等人,febsletters,1998年,第434卷,第165
‑
170页)、nk1(也包括突变体)、nk2(也包括突变体)或nk4(也包括突变体)，更优选为nk1(也包括突变体)或nk2(也包括突变体)，进一步优选为nk1(也包括突变体)，最优选为由seqidno:2所示的氨基酸序列构成的人nk1。需要说明的是，seqidno:2中不包含来自人hgf的分泌信号序列(mwvtkllpalllqhvllhllllpiaipyaeg：seqidno:3)。
[0039]
另外，上述的肝细胞生长因子或其活性片段包含来自哺乳动物的氨基酸序列，优选为来自人、猫或狗的氨基酸序列，更优选为来自人的序列。
[0040]
上述的肝细胞生长因子或其活性片段可以为了蛋白质的纯化等目的而添加有标签序列等人工序列。作为标签序列，例如可列举：6
×
his标签、hat标签、c
‑
myc标签、flag标签、dykddddk标签、strep标签、ha标签、gst标签和mbp标签等。而且，为了在纯化后去除这些标签序列，还可在上述的hgf或其活性片段与标签之间进一步插入间隔序列或蛋白酶切割序列等人工序列。这种情况下，在上述的肝细胞生长因子或其活性片段中可包含间隔序列或蛋白酶切割序列等人工序列的切割片段。
[0041]
上述的肝细胞生长因子或其活性片段可利用由组织提取、采用了基因重组技术的蛋白质合成、使用了表达肝细胞生长因子或其活性片段的重组细胞(或表达肝细胞生长因子的天然细胞)的生物学制造等已知方法来获得。另外，作为hgf或其活性片段，还可使用市售的肝细胞生长因子或其活性片段。
[0042]
关于基因重组技术，例如可按照molecularcloning,第2版,1989年,coldspringharborlaboratory中记载的方法来进行。以下，对这样的技术的一个例子进行说明。
[0043]
准备编码hgf或其活性片段的dna。该dna可通过从由人组织或细胞制作的cdna文
库中选择、取出，并施行pcr法等dna扩增法而获得。或者，该dna例如可使用利用了亚磷酰胺法的dna合成仪进行化学合成。
[0044]
将上述的dna插入到适当的载体中，制作表达载体。这样的载体包含用于表达该dna (根据需要进行分泌)所需的调节序列等元件。元件的具体例子包括：翻译起始密码子和终止密码子、启动子、增强子、终止子、核糖体结合位点(或shine
‑
dalgarno序列)、选择标记序列、信号序列等，在载体中插入必要的元件。
[0045]
关于启动子，根据宿主细胞选择合适的启动子。例如，适合于作为原核生物的埃希氏菌属(escherichia)细菌的细胞的启动子例如为trp启动子、lac启动子、reca启动子、λpl启动子等，适合于芽孢杆菌属(bacillus)细菌的细胞的启动子例如为spo1启动子、spo2启动子、penp启动子等。适合于酵母细胞的启动子例如为pho5启动子、pgk启动子、gap启动子、adh启动子、aox启动子等。适合于植物细胞的启动子例如为花椰菜花叶病毒(camv)启动子等。适合于昆虫细胞的启动子例如为p10启动子、多角体蛋白启动子等。适合于哺乳动物细胞的启动子例如为劳斯肉瘤病毒、多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(smv)、猿猴病毒40(sv40)、痘苗病毒等病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子等。
[0046]
关于选择标记，例如为his3基因、leu2基因、trp1基因、ura3基因、二氢叶酸还原酶基因(甲氨蝶呤(mtx)抗性)、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。
[0047]
关于表达载体，选择适合于宿主细胞的载体，例如质粒、噬菌体、粘粒、病毒载体、人工染色体(例如，bac、yac等)等是通常使用的载体。关于原核生物用载体，为来自大肠杆菌的质粒、例如pcr系质粒、pbr系质粒、puc系质粒等、来自枯草杆菌的质粒例如pub110、ptp5、pc194等。关于酵母用载体，为来自酵母的质粒、例如psh系质粒等。关于植物细胞用载体，为双元载体等。关于哺乳类细胞用载体，为pbk
‑
cmv、pcdna3.1、pzeosv (invitrogen公司、stratagene公司)等市售载体、病毒载体(例如，腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、仙台病毒、痘苗病毒、sv40等。
[0048]
宿主细胞为大肠杆菌、枯草杆菌等原核生物细胞、以及酵母、植物细胞、动物细胞(例如，哺乳类细胞、昆虫细胞等)等真核生物细胞。在对宿主细胞转化或转染上述表达载体时，例如可采用电穿孔法、显微注射法、细胞融合法、deae葡聚糖法、磷酸钙法、粒子枪法、农杆菌(agrobacterium)法等已知的方法。
[0049]
已知肝细胞生长因子或其活性片段可使用原核生物细胞或真核生物细胞进行表达，通过将编码nk1蛋白质的核酸序列(dna)暂时性或稳定地引入到细胞中，可使重组蛋白质表达。酵母表达系统是在培养上清中分泌表达重组蛋白质，也适合于具有二硫键的蛋白质的折叠，另一方面，也可较哺乳类细胞简便地进行培养。因此，在分子内具有多个二硫键的肝细胞生长因子或其活性片段的表达中优选酵母表达系统。
[0050]
本说明书中的“同源二聚体”是指具有同一氨基酸序列的2分子的蛋白质所形成的二聚体。另外，本说明书中的“单体”是指形成二聚体的一方的蛋白质。在肝细胞生长因子(hgf)中，具有同一氨基酸序列的2分子的hgf形成同源二聚体，与hgf受体结合以体现其生理活性(gherardi e.等人, proceedings of the national academy of sciences of the united states of america, 2006年, 第103卷, 第11号, 第4046
‑
4051页)。另外，hgf的活性片段是在肝素样物质的存在下具有同一氨基酸序列的2分子的活性片段形成同
源二聚体，与hgf受体结合以体现其生理活性(激动剂活性)(chirgadzedy.等人,naturestructuralbiology,1999年,第6卷,第1号,第72
‑
79页)。或者，hgf的活性片段在肝素样物质的不存在下以单体形式与hgf受体结合，体现拮抗剂活性。
[0051]
例如，根据人nk1的二聚体晶体结构(pdbid：3mkp)(chirgadzedy.等人,naturestructuralbiology,1999年,第6卷,第1号,第72
‑
79号)，显示出：2分子的人nk1以左右对称地配对的形式形成二聚体，各自的kringle结构内的氨基酸序列与作为hgf受体的c
‑
met的胞外结构域内的序列进行结合。
[0052]
＜叉形聚乙二醇＞已知聚乙二醇(以下，记作peg)是生物适应性高的聚合物性高分子，通过使peg与蛋白质结合，带来提高物理稳定性、热稳定性、对蛋白分解酶的抵抗性、溶解性、降低生物体内的分布容积、提高血中滞留性等效果，增加临床上的有效性(inada等人,j.bioactandcompatiblepolymers,1990年,第5卷,第343页；delgado等人,criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems,1992年,第9卷,第249页；katre,advanceddrugdeliverysystems,1993年,第10卷,第91页)。
[0053]
peg是具有互换性且包含水溶性聚(环氧乙烷)的物质。典型的是，peg包含重复单元结构
“‑
(ch2ch2o)n
‑”
，末端基团或peg部分整体的结构可发生变化。例如，根据是否存在末端氧的取代，可包含
“‑
ch2ch2‑
o(ch2ch2o)n
‑
ch2ch2‑”
和
“‑
(och2ch2)no
‑”
。通常使用的peg是末端封端的peg，在该末端封端的peg中，peg的一个末端用比较惰性的基团(代表性的是甲氧基(
‑
och3)这样的烷氧基)封端，相对于此，另一个末端是可任意地进行化学修饰的羟基等。peg能以市售品的形式获取，或者，可按照已知的方法通过环氧乙烷的开环聚合进行调制(sandlerandkaro,polymersynthesis,academicpress,newyork,第3卷,第138
‑
161页)。
[0054]
用于制作上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物的peg是叉形peg。叉形peg在该技术领域是已知的。典型的是，叉形peg在peg的一个末端具有支链部分和与支链部分连接的2个羟基(之后可接受化学修饰)。例如，叉形peg在国际专利公开wo99/45964号中进行说明。叉形peg的peg结构部分可以是直链，也可以是支链。特别优选的叉形peg是支链型。
[0055]
上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物的叉形peg的分子量优选为5,000以上且240,000以下、更优选为10,000以上且80,000以下、进一步优选为20,000以上且45,000以下、最优选为20,000。已知基于peg修饰的生物体内半衰期的延长效果与peg的分子量相关(sundqvistt.等人,computersandbiomedicalresearch,1988年,第21卷,第2卷,第110
‑
116页)，如果是20,000以上，则可期待生物体内半衰期的充分的延长效果。另一方面，已知高分子量的peg修饰会使组织转移性降低，因此最优选20,000。
[0056]
需要说明的是，1分子的peg由多个重复单元结构
“‑
(ch2ch2o)n
‑”
构成，通常peg的分子量根据各个分子而不同，故用平均分子量表示。因此，本说明书中的peg的分子量是指平均分子量。
[0057]
根据上述的肝细胞生长因子或其活性片段与peg的结合方法，需要活化用于共价键合反应的peg的末端，可使用末端被n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯、硝基苯磺酸酯、马来酰亚胺、邻二硫吡啶、乙烯砜、碘乙酰胺、羧酸、叠氮化物、膦或胺结构活化的peg，这些被活化的peg可
通过已知方法进行合成。另外，还能以市售品的形式获取。例如，作为被活化的叉形peg，可列举：油化产业株式会社的sunbright (注册商标) pte2系列。本说明书中，将以显示与蛋白质的结合反应性的方式添加在peg末端的官能团简记作“官能团”或“peg官能团”，将具有这些末端结构的peg记作“用官能团活化的peg”、“被活化的peg”或“含官能团的peg”。
[0058]
在使叉形peg与上述的肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端区域进行共价键合时，使用用2个官能团活化的叉形peg。官能团可以是具有2个同一官能团的同源官能性和具有2个不同官能团的异源官能性的任一种。上述的叉形peg优选为用2个同一官能团活化的叉形peg。更具体而言，用2个同一官能团活化的叉形peg优选由下述式(iii)表示。
[0059]
[化学式3]式中，
“‑”
表示键合，“n”通常为2～约2300的范围。“n”可根据所期望的peg分子量进行适当确定。
[0060]
这里，将“使peg与蛋白质结合”还称为“用peg对蛋白质进行化学修饰或修饰、或peg化”，肝细胞生长因子或其活性片段与peg进行共价键合而得的共价键合体也称为用peg进行了化学修饰的肝细胞生长因子或其活性片段、或肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物。
[0061]
为了使peg与上述的肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端区域进行共价键合，可使用肝细胞生长因子或其活性片段中所含的氨基酸、或利用已知的基因重组技术向肝细胞生长因子或其活性片段中人工引入的半胱氨酸或非天然氨基酸的氨基(
‑
nh2)、硫醇基(
‑
sh)和羧基(
‑
cooh)。例如，在人肝细胞生长因子(hgf)的情况下，氨基存在于从羧基末端氨基酸起第4个和第10个残基的赖氨酸残基的侧链，可进行使用n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯基作为peg官能团的选择性修饰。另外，例如硫醇基存在于人工插入到羧基末端区域的半胱氨酸残基的侧链，同侧链中的硫醇基没有形成分子内和分子间二硫键，所以可进行使用马来酰亚氨基作为peg官能团的选择性修饰。另外，例如在人nk1的情况下，羧基存在于从羧基末端氨基酸起第8个残基的天冬氨酸的侧链、从羧基末端氨基酸起第2个残基的谷氨酸的侧链或作为羧基末端氨基酸的谷氨酸的侧链和羧基末端，可进行使用氨基等的修饰。另外，作为将非天然型氨基酸插入到肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端区域的方法，报道了通过更换密码子引入叠氮基苯丙氨酸和叠氮基
‑
z
‑
赖氨酸等的方法(日本特开2009
‑
207490号公报)，可对这些非天然型氨基酸中所含的叠氮基进行使用三烯丙膦的选择性修饰。
[0062]
为了使peg与上述的hgf或其活性片段的羧基末端区域进行共价键合，优选在上述的肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端区域人工插入显示选择性的反应性的氨基酸。特别是，更优选在上述的肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端区域人工插入半胱氨酸残基、叠氮基苯丙氨酸残基或叠氮基
‑
z
‑
赖氨酸残基，进一步优选人工插入半胱氨酸残基。这种情况下，优选使用peg官能团为马来酰亚氨基的被活化的peg，由此，可对插入到肝细胞
生长因子或其活性片段的羧基末端区域的半胱氨酸残基进行部位选择性的peg修饰。
[0063]
＜肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物＞上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物，通过1分子的叉形peg与形成同源二聚体的各单体(即1分子的肝细胞生长因子或其活性片段)的羧基末端区域进行共价键合而形成二聚体。形成上述的肝细胞生长因子或其活性片段的同源二聚体的各单体的氨基末端彼此在肝细胞生长因子(hgf)受体所存在的细胞膜侧接近，另一方面，各单体的羧基末端彼此在细胞间隙侧接近。因而，上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物是peg与肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端区域进行共价键合，所以可保持肝细胞生长因子或其活性片段的生理活性。在对肝细胞生长因子或其活性片段的氨基末端或其附近的peg修饰中，无法得到所期望的效果。
[0064]
peg进行共价键合的、肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端区域包括：肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端氨基酸或其附近。即，包括从羧基末端氨基酸到第10个残基的氨基酸残基。例如，在人肝细胞生长因子(hgf) (genbank登录号：m29145 (seq id no: 5 (核苷酸序列)、seq id no: 6 (氨基酸序列))的情况下，在seq id no: 6的氨基酸序列中，以起始蛋氨酸为第1位，相当于从第718位到第728位(羧基末端氨基酸)的氨基酸残基的区域。另外，例如在人nk1 (是指genbank登录号：m29145中从seq id no: 6的氨基酸序列的第32位的谷氨酰胺到第210位的谷氨酸)的情况下，在seq id no: 6的氨基酸序列中，以起始蛋氨酸为第1位，相当于从第200位到第210位(羧基末端氨基酸)的氨基酸残基的区域。如果是该羧基末端区域内的氨基酸残基，则可以是肝细胞生长因子或其活性片段(也包括突变体)中本来包含的氨基酸或人工引入的氨基酸。优选的是，肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端区域优选为从羧基末端氨基酸到第10个残基，更优选从羧基末端氨基酸到第4个残基，最优选为羧基末端氨基酸。
[0065]
为了使peg与上述的hgf或其活性片段的羧基末端区域进行共价键合，可通过已知方法进行实施。例如，使peg与蛋白质的氨基进行共价键合的方法记载在美国专利第4917888号和国际公开第1987/00056号中。使peg与蛋白质的硫醇基进行共价键合的方法记载在国际公开第1999/55377号中。使peg与蛋白质中所引入的非天然氨基酸进行共价键合的方法记载在bioorganic＆medicinal chemistry letters, 2004年, 第14卷, 第5743
‑
5745页中。
[0066]
上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物的纯化或浓缩，可在肝细胞生长因子或其活性片段与叉形peg的共价键合反应后，采用已知方法进行实施。例如，可通过离子交换、凝胶过滤、使用了疏水或亲和性载体的层析等方法、或这些方法的组合，去除未反应的肝细胞生长因子或其活性片段或叉形peg、副产物，来纯化或浓缩肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物。
[0067]
具体而言，上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物由下述式(i)表示。
[0068]
[化学式4]
式中，
“‑”
表示键合，“peg”表示叉形聚乙二醇的结构部分，“l”表示对水解稳定的支链部分，“x”表示键合部分，该键合部分提供叉形聚乙二醇对肝细胞生长因子或其活性片段的共价键合，“hgf”表示肝细胞生长因子或其活性片段。肝细胞生长因子或其活性片段与叉形聚乙二醇的键合(x)对水解稳定。
[0069]“peg”是叉形聚乙二醇的结构部分，包含聚乙二醇的重复单元
“‑
(ch2ch2o)n
‑”
的结构可形成直链结构，也可形成支链结构。作为具有支链结构的peg，例如可列举：双链支化型、三链支化型、四链支化型，支链数也包括其以上的数，但优选为双链支化型。支链结构的支链原子(支化点)可包含在“l”中。
[0070]“l”可表示
“‑
ch
‑”
这样的单一基团，或者，可在“peg”侧进一步包含更长的原子链(例如，包括亚烷基键(
‑
ch2‑
)、醚键(
‑
o
‑
)、酯键(
‑
o
‑
co
‑
或
‑
co
‑
o
‑
)、酰胺键(
‑
conh
‑
或
‑
nhco
‑
)或它们的组合)。例如，作为“l”基，可列举：赖氨酸、甘油、季戊四醇或山梨糖醇。支链部分内的典型的特定支链原子(成为支化点的原子)为碳原子。
[0071]“x”为键合部分，其提供叉形聚乙二醇对肝细胞生长因子或其活性片段的共价键合，以支链原子与官能团的距离为20
å
以下为条件，可仅表示来自如上述式(iii)所示的官能团的原子，或者，除来自官能团的原子以外，还可在“l”侧进一步包含更长的原子链(例如，包括亚烷基键(
‑
ch2‑
)、醚键(
‑
o
‑
)、酯键(
‑
o
‑
co
‑
或
‑
co
‑
o
‑
)、酰胺键(
‑
conh
‑
或
‑
nhco
‑
)或它们的组合)。如上所述，适当的官能团的选择依赖于其与肝细胞生长因子或其活性片段的键合部位。在所得的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物中对应的“x”优选通过肝细胞生长因子或其活性片段的适当的反应部位与被活化的叉形peg的反应结果而产生。例如，在被活化的叉形peg包含n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯这样的活化酯的情况下，经由肝细胞生长因子或其活性片段的胺部位的键合而形成对应的酰胺键。
[0072]
本说明书中，“官能团”是叉形聚乙二醇末端部或上述原子链末端部的反应性基团，用于提供与肝细胞生长因子或其活性片段的共价键合。
[0073]
更具体而言，上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物优选由下述式(ii)表示。
[0074]
[化学式5]式中的x和hgf的定义与上述式(i)相同。需要说明的是，
“‑
(ch2ch2o)n
‑”
的n数可适当确定使达到所期望的peg分子量(上述)。
[0075]“对水解稳定的”键合是指在水中实质上是稳定(即，经过长时间在可感知的程度上在生理条件下不水解)的化学键合(代表性的是共价键合)。作为对水解稳定的键合的例
子，可列举：碳
‑
碳键(例如，脂肪族的链内)、醚键、酰胺键、氨基甲酸乙酯键等。通常，对水解稳定的键合是在生理条件下每1天显示约1%～小于2%的水解速度的键合。
[0076]
上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物的叉形peg的支链原子、与提供上述叉形聚乙二醇与上述肝细胞生长因子或其活性片段的共价键合的官能团(例如，叉形peg官能团)的距离，只要是肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物保持其生理活性的距离即可，没有限定，优选为20
å
以下、更优选为1.5～19
å
、进一步优选为1.5～8
å
、最优选为7.2
å
。
[0077]
peg的支链原子是指成为上述式(i)中的“l”内的支化点的原子、即支链原子。作为支链原子，优选碳原子。
[0078]
peg的支链原子与peg官能团的距离是指从上述的支链原子到peg官能团的键合部位(例如，马来酰亚氨基的5元环氮原子)的距离。即，表示上述式(i)中的从“l”内的支链原子到“x”内的官能团的键合部位的距离。peg的支链原子与peg官能团的距离例如可通过结构模拟来计算。另外，若从肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物的观点来看，则peg的支链原子与peg官能团的距离是指形成肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物(同源二聚体)的各单体(即1分子的肝细胞生长因子或其活性片段)的羧基末端间的距离的一半的距离。例如，在peg的支链原子与peg官能团的距离为20
å
的情况下，各单体的羧基末端间的距离为40
å
。
[0079]
为了使通过peg修饰形成同源二聚体的上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物保持其生理活性，希望形成二聚体的各单体(即1分子的肝细胞生长因子或其活性片段)的羧基末端间的距离重现肝细胞生长因子或其活性片段的二聚体晶体结构。
[0080]
推测人nk1的seqidno:6的氨基酸序列中从第1位的起始蛋氨酸数起第206位的半胱氨酸残基(相当于seqidno:2的氨基酸序列的第175位的半胱氨酸残基。)在分子内形成二硫键，其后的从第207位的丝氨酸残基到第210位的谷氨酸(相当于seqidno:2的氨基酸序列的第176位的丝氨酸残基～第179位的谷氨酸。)可灵活地变动，根据人nk1二聚体晶体结构(pdbid：3mkp)(chirgadzed.y.等人,naturestructuralbiology,1999年,第6卷,第1号,第72
‑
79页)，使用chemicalcomputinggroup公司的molecularoperatingenvironment(2013.08版)，在对上述从第1位的起始蛋氨酸数起从第207位的丝氨酸残基到第210位的谷氨酸可灵活地变动的情况下的人nk1形成二聚体时的各单体(即1分子的人nk1)的羧基末端间的距离进行结构模拟时，最小距离为3
å
、最大距离为38
å
(即，peg的支链原子与peg官能团的距离的可接受的范围是最小为1.5
å
、最大为19
å
)。
[0081]
另外，在上述的肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端添加有标签序列或间隔序列等人工序列的情况下，上述的肝细胞生长因子或其活性片段形成二聚体时的各单体的羧基末端间的距离可进一步增大。例如，在人nk1的羧基末端添加有6
×
his标签的情况下，推测人nk1的seqidno:2的氨基酸序列的从第176位的丝氨酸残基到第179位的谷氨酸(seqidno:6的氨基酸序列中从第1位的起始蛋氨酸数起第207位的丝氨酸残基～第210位的谷氨酸)和6
×
his标签部分为止可灵活地变动，在实施与上述同样的结构模拟时，人nk1二聚体的羧基末端间距离是最小距离为3
å
、最大距离为88
å
(即，peg的支链原子与peg官能团的距离的可接受的范围是最小为1.5
å
、最大为44
å
)。
[0082]
因此，上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物更优选形成二聚体时的
各单体的羧基末端间的距离为3～38
å
。然而，如上所述，在肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端插入有人工序列的情况下，各单体的羧基末端间的距离实质上可延长。人工序列的例子是：由任意的氨基酸构成的氨基酸数为2～30的肽、例如包含上述标签序列的肽、例如seq id no: 4的肽(hhhhhhc)。
[0083]
在为了对肝细胞生长因子或其活性片段进行peg修饰以形成二聚体，而使用peg的两个末端用2个官能团活化而得的直链型peg的情况下，希望是官能团间为40
å
以下的peg链长，但由于这种情况下的peg分子量为1,000以下，所以无法得到生物体内半衰期的充分的延长效果。另一方面，在使用用2个官能团活化的叉形peg的本发明的情况下，即使peg的支链原子与peg官能团的距离是作为优选范围的20
å
以下，peg分子量也不受限制。另外，如果用叉形peg修饰肝细胞生长因子或其活性片段，则可控制形成二聚体的各单体(即1分子的肝细胞生长因子或其活性片段)的羧基末端间的距离，在peg修饰后也可维持肝细胞生长因子或其活性片段的生理活性。
[0084]
上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物的优选实施方式为如下的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物：肝细胞生长因子或其活性片段形成同源二聚体，peg的支链原子与peg官能团的距离为7.2
å
且peg分子量为20,000的1分子的叉形peg、与人工插入到该同源二聚体的两个单体的羧基末端区域的半胱氨酸残基进行共价键合而形成二聚体。由于该肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物控制形成二聚体时的各单体的羧基末端间的距离，故可保持生理活性，进一步用分子量为20,000的peg进行修饰，因此具有生物体内半衰期的延长效果。
[0085]
上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物的更优选的实施方式由下述式(iv)表示。
[0086]
[化学式6]肝细胞生长因子或其活性片段(式中的“hgf”)与马来酰亚氨基(官能团)的键合是人工插入到肝细胞生长因子或其活性片段的羧基末端区域的半胱氨酸残基键合以进行
“‑
s
‑”
键合。需要说明的是，
“‑
(ch2ch2o)n
‑”
的n数根据peg分子量(上述)来确定。
[0087]
＜药物＞上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物保持肝细胞生长因子或其活性片段本来所具备的生理活性，还进一步具有基于peg修饰的生物体内半衰期的延长效果，因此可用作药物(可换成“治疗药”或“药物組成物”。)的有效成分。
[0088]
上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物的生理活性可使用培养细胞简便地进行测定。例如，可将天然型肝细胞生长因子的作用即c
‑
met磷酸化诱导作用、细胞增殖作用、细胞迁移作用和抗细胞凋亡作用等作为指标(rubin j. s.等人, the journal of biological chemistry, 2001年, 第276卷, 35号, 第32977
‑
32983页；lietha d.等人, the embo journal, 2001年, 第20卷, 第20号, 第5543
‑
5555页；liu y, american journal of physiology, 1999年, 第277卷, 第4号, 第624
‑
633页)。
[0089]
另外，上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物的生物体内半衰期可通过测定在对模型动物进行静脉内给药、腹腔内给药、皮下给药或皮内给药时的血中浓度来计算。特别是，通过对上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物进行放射线标记，可进行简便的测定。
[0090]
含有上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物作为有效成分的药物可用于治疗利用了肝细胞生长因子或其活性片段的生理活性的各种疾病。例如可用于治疗急性炎性疾病、慢性炎性疾病、急性缺血性疾病、慢性缺血性疾病、肌萎缩性侧索硬化症、器官纤维化、糖尿病、脊髄损伤、腹膜粘连、移植治疗、创伤治愈、神经性疼痛等。
[0091]
上述的药物可用作对哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、猴、牛、羊或人)、特别是对人有效的治疗药。在将上述药物用作对人有效的治疗药的情况下，上述的肝细胞生长因子或其活性片段优选基于来自人的肝细胞生长因子的氨基酸序列。
[0092]
作为上述药物的给药方式，可将作为有效成分的上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物直接或作为药物可接受的载体进行掺混，来进行口服或胃肠外给药。优选通过皮下、肌肉内或静脉内注射进行给药。
[0093]
作为上述药物的用于口服给药的剂型，例如可列举：片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂或悬浮剂，这些可按照已知方法进行制造，含有制剂领域中通常使用的载体或赋形剂和根据需要的添加剂。作为片剂用载体和赋形剂，例如可列举：乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉或硬脂酸镁。作为添加剂，可列举：粘合剂、崩解剂、保存剂(防腐剂)、缓释剂、着色剂、风味剂、稳定剂、溶解剂、增稠剂、乳化剂等。
[0094]
作为上述药物的用于胃肠外给药的剂型，例如可列举：注射剂、滴眼剂、软膏剂、湿布剂(湿敷料)、栓剂、经鼻吸收剂、经肺吸收剂、经皮吸收剂或局部缓释剂，这些可按照已知方法进行制造。溶液制剂例如可将作为有效成分的上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物溶解于用于注射剂的无菌水溶液或在提取液中进行悬浮和乳化，以包埋于脂质体中的状态进行调制。固体制剂例如可在作为有效成分的上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物中加入甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、乳糖或葡萄糖等作为赋形剂，以冻干物的形式进行调制。还可将其进一步粉末化后进行使用。另外，还可将这些粉末与聚乳酸或乙醇酸等混合制成固体后进行使用。凝胶化剂例如可将作为有效成分的上述的肝细胞生长因子或其活性片段的peg修饰物溶解于甘油、peg、甲基纤维素、羧甲基纤维素、透明质酸或硫
酸软骨素等增稠剂或多糖中进行调制。另外，根据需要，可在制剂中加入上述的添加剂。
[0095]
上述的药物可根据患者的年齢、体重、给药对象的疾病、症状、给药方式、给药途径、peg的分子量等进行适当确定，通常可按0.001mg～100mg/kg/次、优选0.01mg～10mg/kg/次，以1次/月～1次/天、优选1次/月～1次/周的范围进行给药。
[0096]
利用以下的实施例进一步具体地说明本发明，但本发明的技术范围并不受作为示例而提供的该实施例的限制。
实施例
[0097]
(实施例1) 人nk1蛋白质的表达使用市售的酵母表达试剂盒多拷贝毕赤酵母表达试剂盒(multi
‑
copy pichia expression kit，invitrogen)，实施了重组人nk1蛋白质的表达。
[0098]
使用in
‑
fusion hd克隆试剂盒(in
‑
fusion hd cloning kit，takara bio)将dna插入到多拷贝毕赤酵母表达试剂盒(invitrogen)所附带的ppic9k表达载体中，该dna编码在去除了分泌信号序列的人nk1蛋白质的羧基末端依次添加有6
×
his标签和半胱氨酸残基(即添加hhhhhhc (seq id no: 4) )而得的人nk1蛋白质(以下，记作添加有his
‑
cys的人nk1)。利用限制酶将所制作的表达用质粒进行线状化后，通过电穿孔法对上述试剂盒所附带的gs115株进行基因引入。
[0099]
基因引入后的菌体用组氨酸缺损琼脂培养基进行第1阶段选择培养，之后将所生成的菌落用含有4mg/ml geneticin (注册商标) (roche)的琼脂培养基进行第2阶段选择培养，从而分离了多拷贝引入有目标基因的酵母株。利用bmgy培养基将分离株在30℃恒温漕内进行预培养后，转移到含有0.5%甲醇的bmmy培养基中，在20℃恒温漕内进行3天的正式培养，从而诱导了目标蛋白质即添加有his
‑
cys的人nk1的表达。
[0100]
(实施例2) 人nk1蛋白质的纯化对实施例1中得到的酵母培养上清进行离心澄清化后，使用镍树脂和肝素树脂对上清中的添加有his
‑
cys的人nk1进行纯化。
[0101]
使已离心澄清化的酵母培养上清液通过预先用pbs(
‑
)平衡化的肝素树脂(ge healthcare)，从而使添加有his
‑
cys的人nk1与肝素树脂结合。然后，使pbs(
‑
)中所含的nacl浓度在150mm～2000mm的浓度范围变化的缓冲液按照nacl浓度的升序通过，得到了各洗脱组分。对各洗脱组分进行sds电泳，确认了添加有his
‑
cys的人nk1洗脱组分。
[0102]
接下来，使利用肝素树脂纯化得到的添加有his
‑
cys的人nk1洗脱组分通过预先用含300mm nacl的pbs(
‑
)平衡化的complete his
‑
tag 纯化树脂(roche)，从而使添加有his
‑
cys的人nk1与树脂结合。然后，使在含300mm nacl的pbs(
‑
)中添加有咪唑(0mm～500mm的浓度范围)而得的缓冲液按照咪唑浓度的升序通过，得到了各洗脱组分。将各洗脱组分进行sds电泳，确认了添加有his
‑
cys的人nk1洗脱组分。所得的添加有his
‑
cys的人nk1洗脱组分使用amicon ultra
‑
15 (mwco=10,000；merck millipore)进行浓缩，得到了目标蛋白质即添加有his
‑
cys的人nk1。
[0103]
(实施例3) peg修饰nk1二聚体的合成利用以下的方法合成了通过1分子的peg与2分子的添加有his
‑
cys的人nk1的羧基末端进行共价键合而二聚体化的nk1 (以下，记作peg修饰nk1二聚体)。
[0104]
在将实施例2中制作的添加有his
‑
cys的人nk1调整至1.0mg/ml而得的溶液(以下，记作nk1溶液)(组成：含1.0mol/lnacl的pbs(
‑
)、ph7.4)中加入0.07倍量的38mg/ml的2
‑
巯基乙胺(以下，记作2
‑
mea)溶液，在37℃下培养30分钟。使经培养的nk1溶液通过用磷酸缓冲液(0.3mol/lnacl、0.002mol/ledta、0.1mol/l磷酸(ph6.0))平衡化的凝胶过滤柱(zeba脱盐离心柱7kda；thermofisherscientific)，从该溶液中去除了2
‑
mea。
[0105]
在2
‑
mea去除处理后的nk1溶液中添加叉形peg(sunbrightpte2
‑
200ma2、2个官能团、peg官能团=马来酰亚氨基、peg的支链原子与peg官能团的距离=7.2
å
、分子量20,000；油化产业株式会社)或直链型peg(sunbrightde
‑
100ma、2个官能团、peg官能团=马来酰亚氨基、peg官能团间的距离=约400
å
、分子量10,000；油化产业株式会社)使反应摩尔比为5：1(peg：添加有his
‑
cys的人nk1)。在25℃下反应16～18小时，制作了peg修饰nk1二聚体。需要说明的是，将用叉形peg修饰的peg修饰nk1二聚体称为叉形peg修饰nk1二聚体，将用直链型peg修饰的peg修饰nk1二聚体称为直链型peg修饰nk1二聚体。
[0106]
将包含peg修饰nk1二聚体的反应后的溶液用不含nacl的pbs(
‑
)稀释10倍后，通过sp载体(sp
‑
sepharose6fastflow；gehealthcare)，从该溶液中去除了未反应的peg试剂。用含1.0mol/lnacl的pbs(
‑
)洗脱sp载体上所吸附的peg修饰nk1二聚体后，利用amiconultra
‑
30(mwco=30,000；merckmillipore)进行浓缩。
[0107]
图1显示添加有his
‑
cys的人nk1和叉形peg修饰nk1二聚体的sds电泳图像。
[0108]
叉形peg修饰nk1二聚体或直链型peg修饰nk1二聚体是1分子的peg与2分子的添加有his
‑
cys的人nk1的羧基末端所存在的人工添加的半胱氨酸残基进行共价键合而二聚体化。叉形peg修饰nk1二聚体由以下的式(v)表示，直链型peg修饰nk1二聚体由下述的式(vi)表示。
[0109]
[化学式7]式中，“cys
‑6×
his
‑
nk1”表示添加有his
‑
cys的人nk1，人工插入到人nk1羧基末端的半胱氨酸残基的硫醇基(
‑
sh)与马来酰亚氨基(官能团)键合而进行
“‑
s
‑”
键合。需要说明的是，
“‑
(ch2ch2o)n
‑”
的n数根据peg分子量来确定。
[0110]
[化学式8]式中，“cys
‑6×
his
‑
nk1”和“nk1
‑6×
his
‑
cys”表示添加有his
‑
cys的人nk1，人工插入到人nk1羧基末端的半胱氨酸残基的硫醇基(
‑
sh)与马来酰亚氨基(官能团)键合而进行
“‑
s
‑”
键合。需要说明的是，
“‑
(ch2ch2o)n
‑”
的n数根据peg分子量来确定。
[0111]
(实施例4) peg修饰nk1二聚体的生理活性以人肺上皮细胞株a549的细胞表面所存在的hgf受体的磷酸化诱导活性为指标，通过in
‑
cell elisa法评价了peg修饰nk1二聚体的生理活性。需要说明的是，作为生理活性的比较对照的添加有his
‑
cys的人nk1是通过预先与含1μg/ml猪纯化肝素(sigma)的mem培养基进行混和而诱导肝素依赖性的二聚体化，形成了二聚体(以下，记作肝素二聚体化nk1)。
[0112]
将a549细胞悬浮于含有10%fcs的mem培养基中，以1.5
×
104/孔的密度接种于成像用96孔板(becton/dickinson)，培养一昼夜。在细胞铺满70%左右之后，将培养基换成不含血清的mem培养基，培养16小时以上，从而形成血清饥饿状态。在处于血清饥饿状态的细胞中添加肝素二聚体化nk1、叉形peg修饰nk1二聚体或直链型peg修饰nk1二聚体(10或250ng/ml)，之后在37℃下反应10分钟。
[0113]
利用含有4%福尔马林的pbs(
‑
)来固定细胞，然后利用含有0.3%triton
‑
x、0.6%过氧化氢的pbs(
‑
)对细胞膜进行透过处理后，利用10% bsa对细胞进行封闭处理。在封闭处理后的细胞中加入作为一次抗体的抗磷酸化c
‑
met抗体和作为二次抗体的hrp标记二次抗体，使之反应，之后添加了1
×
quantared增强型化学荧光hrp底物(thermo fisher scientific)。在室温下培养后，使用酶标仪(plate reader) (envision；perkinelmer)测定波长590nm下的荧光强度(rfu)，作为hgf受体磷酸化诱导量。
[0114]
其结果见图2。图2的纵轴显示表示hgf受体磷酸化诱导量的荧光强度(rfu)，横轴显示肝素二聚体化nk1、叉形peg修饰nk1二聚体或直链型peg修饰nk1二聚体的处理浓度(ng/ml)。
[0115]
叉形peg修饰nk1二聚体保持与肝素二聚体化nk1同等的生理活性，但直链型peg修饰nk1二聚体与肝素二聚体化nk1相比生理活性大幅减弱。因此，显示出：为了在保持nk1的生理活性的同时利用peg修饰进行二聚体化，使用可控制nk1的羧基末端间距离的叉形peg较为重要。
[0116]
(实施例5) 叉形peg修饰nk1二聚体的血中动力学通过对小鼠尾静脉内给予
[125i]
标记的叉形peg修饰nk1二聚体，评价了叉形peg修
饰nk1二聚体的血中动力学。需要说明的是，作为血中动力学的比较对照，使用了添加有his
‑
cys的人nk1。
[0117]
添加有his
‑
cys的人nk1或叉形peg修饰nk1二聚体的
[125i]
标记使用na
[125i] (放射性核素碘
‑
125；perkinelmer)通过iodo
‑
beads法来进行。需要说明的是，测定tca沉淀后的上清和沉淀物的放射线活性，确认了用于给药的蛋白质的
[125i]
标记率为90%以上。
[0118]
对crlj：cd1 (icr)系雄性小鼠尾静脉内给予
[125i]
标记的添加有his
‑
cys的人nk1或叉形peg修饰nk1二聚体(25μg/0.5mbq/kg)，以放射线活性为指标，测定了给药后5分钟～24小时的血清中浓度。
[0119]
其结果见图3。图3的纵轴表示小鼠血清中浓度(ng eq./ml)，横轴表示给药后的时间(小时)。虚线显示
[125i]
标记的添加有his
‑
cys的人nk1的结果，实线显示
[125i]
标记的叉形聚乙二醇修饰nk1二聚体的结果。
[0120]
叉形peg修饰nk1二聚体截止到给药后1小时显示了与添加有his
‑
cys的人nk1几乎同样的浓度变化，但在给药后4小时以后与添加有his
‑
cys的人nk1相比血清中浓度的减少得到缓解。而且，在给药后24小时与添加有his
‑
cys的人nk1相比在血清中观察到约4.2倍浓度的叉形peg修饰nk1二聚体。另外，在添加有his
‑
cys的人nk1给药中半衰期(t1/2)为7.9小时，但在叉形peg修饰nk1二聚体中半衰期为15.4小时，延长了约2倍。因此，叉形peg修饰nk1二聚体也显示出作为peg修饰的效果的生物体内半衰期的延长效果。
[0121]
产业实用性本发明的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰物在延长生物体内半衰期的同时保持其生理活性，因此可用作以少于非修饰物的给药频率发挥其药效的药物。
[0122]
序列表自由文本seq id no: 1是不含分泌信号序列的人hgf的氨基酸序列；seq id no: 2是不含分泌信号序列的人nk1的氨基酸序列；seq id no: 3是来自人hgf的分泌信号序列；seq id no: 4是添加在人nk1蛋白质的羧基末端的6
×
his标签和半胱氨酸残基的氨基酸序列；seq id no: 5是人hgf的核苷酸序列；seq id no: 6是人hgf的氨基酸序列。