![用于疗法或预防法的防御素片段的制作方法](http://img.xjishu.com/img/zl/2021/9/28/tkp1xhp8q.jpg)
用于疗法或预防法的防御素片段
1.本发明涉及源自α防御素的特定肽序列及其在医学疗法和/或预防法中的用途。
2.厌氧和需氧微生物,尤其是细菌和酵母菌(即在氧气存在下存活、在氧气不存在情况下存活或能耐氧气的单细胞微生物)可引起各种临床征象(例如伤口感染和脓肿、脓毒症、感染),尤其是在腹腔中、在泌尿生殖道中、在皮肤上或者在口腔、眼睛、耳朵和下颌区域中。因此,这些病原性物种往往已经在皮肤和口腔区域,特别是在发炎的皮肤/湿疹、牙周组织、眼睛和耳朵中以及在胃粘膜皱襞的胃区域中和十二指肠中被发现,它们然后可引起局部炎症,但在一些情形下也引起全身急性和慢性炎症。即使在被相当稀疏地定殖的小肠中,许多兼性厌氧菌也可引起高度敏感的小肠粘膜的病理变化;在直肠(细菌菌群的主要部位)中,公认需氧细菌占主导地位,但在这里,厌氧菌也能引起结肠粘膜的严重炎症反应。念珠菌属一些种也在许多个体的粪便中被发现,并且是潜在病原性的。
3.目前,特别是此类疾病是用抗生素来治疗的,抗生素主要攻击和破坏细菌的细胞壁。用抗生素治疗这些炎症性疾病时出现的大问题是对所用抗生素的耐药性的形成,这在最近一段时间有了更进一步的进展。这使病原细菌/微生物能够减弱或完全中和抗生素物质的作用。如果随后证明微生物对常见抗生素具有耐药性,则疾病可变得危及生命。过去多重耐药性细菌菌株的数量大幅增加的原因是,由于它们快速生长且它们的培养期较短,因此细菌不断地能够发展新的策略来中和抗生素。因此,目前,除了抗生素外,例如还使用天然的,尤其是植物的和合成的油和乳液。
4.近年来,作为天然免疫系统的一部分并且对于上皮防御微生物感染至关重要的抗微生物肽获得了研究和治疗应用关注。
5.在健康人中,皮肤和粘膜形成针对微生物引起的感染的物理屏障。所述物理屏障由健康皮肤中的角质层和粘膜中的粘液层组成,在健康皮肤中的角质层和粘膜中的粘液层中脱屑和粘液分泌引起表面不断更新,同时引起粘附至表面上的微生物被不断清除。在与皮肤中也存在的脂质相互作用时,这种物理屏障可防止微生物渗透到活表皮中。
6.然而,撇开这个物理屏障不谈,为了使健康皮肤和粘膜抵御感染,还需要此外的因子;这些因子包括内源性抗微生物肽(amp)。溶菌酶例如是存在于鼻分泌物中并且尤其可杀死革兰氏阳性细菌的抗生物肽。在肠粘膜中也被称为抗微生物肽的是防御素,其存在似乎是必要的,尤其是考虑到肠上皮暴露于极大量细菌的情况下。除了具有微生物难以渗透的粘液层外,肠粘膜还含有帕内特细胞,所述帕内特细胞分泌人防御素5(一种α防御素),所述防御素5除其他功能外还保护对肠粘膜的持续更新而言重要的干细胞。在人中,仅α
‑
防御素和β
‑
防御素被表达。虽然α防御素主要在嗜中性粒细胞以及nk细胞和某些t淋巴细胞亚群中表达,但人防御素5和防御素6仅在小肠的帕内特细胞中表达,在这里它们有助于调节和维持肠腔中的微生物平衡。另一方面,β
‑
防御素分布最广,由许多种类的白细胞和上皮细胞分泌。此外的已知的amp是被称为牛皮癣素的肽,以及代表人中有效的内源性广谱抗生素的rnas
‑
7。
7.除了已知的内源性抗微生物肽外,现有技术中还已知许多抗生素;这些包括生物起源的物质和合成制造的物质,因此它们是(如原始意义上的)真菌或细菌的天然形成的低
分子量代谢产物,或者是化学合成的治疗剂。
8.特别是鉴于天然和合成抗生素的耐药性的发展正使微生物感染性疾病变得越来越难以治疗,因此还经常需要因副作用少且制造和处理简单而值得注意的新的抗微生物活性剂。
9.胃肠微环境由单细胞层上皮、粘液层、局部免疫系统和微生物组组成,并且这四种组分一起在维持健康时期的体内平衡方面发挥着至关重要的作用。人结肠具有每克肠道内容物10
11
‑
10
12
个细胞的高密度微生物群落,并且人类健康与肠中被统称为肠道微生物群的多样化微生物集密切相关。虽然在一方面,它们的丰度和流行程度与疾病相关——正如例如炎症性肠病(ibd)和感染性结肠炎中的普氏粪杆菌的情况一样,但是在另一方面,已经证明粘膜物种如脆弱拟杆菌和罗伊氏乳杆菌可抵御结肠炎。
10.因此,当在感染的情况下使用抗生素时,人结肠中的微生物组组成受到重大影响,并且微生物平衡受到干扰。防御素是小阳离子分子,以三个保守的二硫键为特征,并且代表一组主要的amp。迄今为止,已在人中鉴定出了6种α
‑
防御素,即四种人嗜中性粒细胞肽(hnp)1、2、3和4,以及两种人防御素(hd)5和6。虽然hnp形成嗜中性粒细胞的武器库的一部分,在这里它们参与系统性先天免疫,但hd在肠帕内特细胞中表达。如上所提及的,在小肠中,帕内特细胞在平衡微生物群组成与通过分泌多种amp来保护宿主免受入侵的病原体损害方面发挥关键作用,但最丰富的是两种α
‑
防御素5(hd 5)和
‑
6(hd 6)。
11.虽然hnp
‑
1、hnp
‑
2和hnp
‑
3仅在单个氨基酸上不同,但hnp
‑
4在其序列上不同,具有一个额外的正电荷并且与hnp
‑1‑
3相比表现出改进的杀菌活性
1,2
。全长抗微生物肽的活性受包括盐浓度、ph或氧化还原电位在内的环境条件影响3‑6。基于它的强大的抗微生物活性,我们使用hnp
‑
4作为具有抗微生物能力的新治疗剂的前体。虽然准确折叠的防御素的大规模表达是主要问题,但我们集中于hnp
‑
4的小片段。我们使用天然存在的蛋白酶来消化全长肽,且随后鉴定出了所生成的片段。我们测试了这些片段的抗细菌和抗真菌潜力,并且分析了它们的细胞毒性和溶血能力。
12.α
‑
防御素的抗微生物活性在过去得到了深入的研究,人们已经认识到,它们的特定序列的改变可导致它们的活性的重大变化,并且甚至可导致抗微生物活性的完全丧失。
技术实现要素:13.因此,本发明要解决的问题是提供一种这样的新的或替代的预防和/或治疗途径,用所述预防和/或治疗途径可以预防和/或有效治疗感染性疾病以及与生态失调疾患相关的其他疾病,例如代谢疾病、肺部疾病、泌尿生殖系统疾病、口腔疾病、眼睛和耳朵疾病以及皮肤疾病。
14.根据本发明,这一问题和其他问题通过提供具有抗微生物活性并具有源自α
‑
防御素片段的氨基酸序列的肽来解决,所述肽由介于6与27个之间的特别是较短的肽片段组成,所述肽片段可作为线性肽,例如具有7、9、11或13个连续氨基酸的线性肽来合成。
15.所述肽的共同点是它们是天然存在的α防御素hd
‑
5和hnp
‑
4的片段,并且可通过还原天然存在的肽并使用蛋白酶活性使它们经受裂解来产生。出人意料地,包含许多预测的裂解位点的相关肽hd
‑
6在相同条件下不能裂解。
16.天然存在的α
‑
防御素的这些短片段的优点在于它们可作为小的线性肽来化学合
成,因此使成本与全长肽的制造相比显著降低。此外,所述肽中的几种保留了天然存在的全长防御素的抗生素作用,同时在有效浓度下无毒。
17.这些肽可用于调节肠的微生物组和/或用作抗微生物剂,而不会引起健康微生物组的重大变化/干扰健康微生物组的平衡。
18.在本发明内,已经鉴定出了α
‑
防御素的肽序列,在一方面,所述α
‑
防御素的肽序列与全长肽相比在抗微生物测试中表现出对某些(特别是:病原性)细菌具有增加的抗微生物作用,而在另一方面,所述新鉴定出的肽对微生物多样性没有影响。
19.这些结果允许根据本发明的肽不仅适用于治疗微生物感染和细菌引起的疾病,甚至由抗生素耐药性细菌引起的那些疾病,而且适用于预防细菌感染以及适用于调节肠道微生物组和潜在的其他上皮表面(例如肺部、皮肤、泌尿生殖道、口腔、眼睛、耳朵等)的微生物组。
20.因此,在本发明内,并且如本领域普遍理解的,“调节微生物组”意指肽对存在于肠道和上皮表面中的微生物的有益影响。如上所提到的,肠道微生物是人类健康的包括免疫、代谢和神经行为特性在内的许多方面的关键。利用根据本发明使用的肽,可支持和促进肠道微生物组的细菌多样性以及潜在的其他上皮表面的细菌多样性。
[0021]“肠道微生物组”意指哺乳动物,特别是人的肠道。因此,本发明的优选实施方案涉及用于调节人肠道微生物组的肽。
[0022]
根据本发明的肽的实施方案,α
‑
防御素片段是hd
‑
5或hnp4的片段。
[0023]
正如开头提到的,hd
‑
5在小肠的帕内特细胞中表达。包括信号肽和前结构域(prodomain),hd 5包含94个氨基酸,其中成熟肽包含氨基酸数量63至94。
[0024]
hnp4,也如开头所述,在嗜中性粒细胞的颗粒中表达。包括信号肽和前域,hnp4包含97个氨基酸,其中成熟hnp4肽包含氨基酸数量64至96。
[0025]
根据本发明的优选实施方案,根据本发明使用的肽由源自hd
‑
5的介于6与27个之间的连续氨基酸组成,并且由所附序列表中的以下序列组成:
[0026]
序列hd
‑
51‑9atcycrtgr(seq id no.1)或
[0027]
seq id no.1的反向序列rgtrcycta(sq id no.2),
[0028]
经修饰的hd
‑
51‑9:ac
‑
atcycrtgr
‑
nh2(seq id no.5),
[0029]
hd
‑
51‑
13
,atcycrtgrcatr(seq id no.34),
[0030]
hd
‑
51‑
28
,atcycrtgrcatreslsgvceisgrlyr(seq id no.12),
[0031]
hd
‑57
‑
32
,tgrcatreslsgvceisgrlyrlccr(seq id no.14)
[0032]
hd
‑510
‑
32
,catreslsgvceisgrlyrlccr(seq id no.19),
[0033]
hd
‑514
‑
32
,eslsgvceisgrlyrlccr(seq id no.25)
[0034]
hd
‑510
‑
27
catreslsgvceisgrly(seq id no.28)或
[0035]
hd
‑526
‑
32
lyrlccr(seq id no.41)。
[0036]
一般而言,对于氨基酸序列,大写字母表示l
‑
氨基酸,并且小写字母表示d
‑
氨基酸。
[0037]
在优选的实施方案中,所述肽由以下的序列组成:
[0038]
atcycrtgr(seq id no.1)、
[0039]
rgtrcycta(seq id no.2)、
[0040]
ac
‑
atcycrtgr
‑
nh2(seq id no.5)、
[0041]
lyrlccr(seq id no.41)、
[0042]
atcycrtgrcatr(seq id no.34)、
[0043]
atcycrtgrcatreslsgvceisgrlyr(seq id no.12)或
[0044]
tgrcatreslsgvceisgrlyrlccr(seq id no.14)。
[0045]
更优选地,所述肽由以下的序列组成:
[0046]
atcycrtgr(seq id no.1)、
[0047]
rgtrcycta(seq id no.2)、
[0048]
ac
‑
atcycrtgr
‑
nh2(seq id no.5)或
[0049]
lyrlccr(seq id no.41)。
[0050]
优选的肽包括基于hd
‑
51‑9的那些:
[0051]
atcycrtgr(seq id no.1)、
[0052]
rgtrcycta(seq id no.2)或
[0053]
ac
‑
atcycrtgr
‑
nh2(seq id no.5)。
[0054]
根据本发明的一个优选实施方案,根据本发明使用的肽由7、9、11或13个连续氨基酸组成。
[0055]
根据本发明的一个优选实施方案,根据本发明使用的肽由源自hd
‑
5的9个连续氨基酸组成,并且优选地由所附序列表的序列atcycrtgr(seq id no.1)或seq id no.1的反向序列rgtrcycta(sq id no.2)组成。
[0056]
根据本发明的另一个优选实施方案,根据本发明使用的肽由源自hnp4的11个连续氨基酸组成,并且优选地由序列vcscrlvfcrr(seq id no.3)、seq id no.3的反向序列rrcfvlrcscv(seq id no.4),或经修饰的hnp
‑
41‑
11
:ac
‑
vcscrlvfcrr
‑
nh2(seq id no.6)组成。
[0057]
在一个实施方案中,本发明涉及一种制造本发明的肽的方法,所述方法包括使还原的hd5或hnp
‑
4经受蛋白酶活性(例如胰蛋白酶或糜蛋白酶),随后纯化。
[0058]
如本文所公开和描述的源自hd
‑
5或hnp4的肽已被证明能表现出优异的针对病原性细菌的抗微生物活性,同时不会显著影响共生微生物群,例如肠道微生物群。
[0059]
根据一个优选的实施方案,根据本发明使用的肽包含l
‑
和/或d
‑
氨基酸。
[0060]
当前且如普遍理解的,“l
‑
氨基酸”是指特定氨基酸的一种立体异构体,其氨基位于其fisher投影的左侧;而d
‑
氨基酸是指氨基酸的另一种立体异构体,其氨基位于其fisher投影的右侧。在本文的序列中,l
‑
氨基酸以大写字母示出,并且d
‑
氨基酸以小写字母示出。
[0061]
虽然大多数天然存在的肽由呈l
‑
构型的氨基酸组成,但d
‑
氨基酸已表现出对蛋白水解降解的强抗性。
[0062]
因此,根据一个优选的实施方案,根据本发明的肽由d
‑
氨基酸组成。
[0063]
根据另一个实施方案,根据本发明的肽由l
‑
氨基酸组成。
[0064]
根据另一个实施方案,根据本发明的肽由d
‑
氨基酸和l
‑
氨基酸的混合物,优选交替的d
‑
氨基酸和l
‑
氨基酸组成,或者优选包含一个l
‑
氨基酸,其余氨基酸为d
‑
氨基酸。
[0065]
根据一个优选的实施方案,根据本发明使用的肽包含n
‑
末端修饰和/或c
‑
末端修
饰。
[0066]
通过n
‑
末端修饰和/或c
‑
末端修饰,可以影响/增强例如根据本发明的肽的稳定性或半衰期,特别是在促进肽的游离n
‑
/c
‑
末端的降解和/或修饰的环境(例如由于那些环境中存在的蛋白酶)中的稳定性或半衰期。
[0067]
当前且如普遍理解的,c
‑
末端(也称为羧基末端(carboxyl
‑
terminus)、羧末端(carboxy
‑
terminus)、c
‑
末端尾(c
‑
terminal tail)、c
‑
末端或cooh
‑
末端)是氨基酸链(蛋白质或多肽)的由游离羧基(
‑
cooh)终止的末端,并且n
‑
末端(也称为氨基末端、nh2‑
末端、n
‑
末端或胺
‑
末端)是蛋白质或多肽的起始,是指位于多肽末端的游离胺基(
‑
nh2)。用于书写肽序列的惯例是将c
‑
末端放在右边,并且从n
‑
末端至c
‑
末端书写序列。
[0068]
根据一个优选的实施方案,在根据本发明使用的肽中,c
‑
末端修饰选自由以下组成的组中的一者:
‑
酰胺、
‑
酸、
‑
n
‑
烷基
‑
酰胺、
‑
醛、
‑
酯、
‑
对硝基苯胺和
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素。
[0069]
通过这些修饰,可保护肽的c
‑
末端,而不会在很大程度上影响肽的抗微生物活性。
[0070]
根据一个优选的实施方案,在根据本发明使用的肽中,n
‑
末端修饰选自由以下组成的组中的一者:乙酰基
‑
、甲酰基
‑
、焦谷氨酰基
‑
、脂肪酸
‑
、脲
‑
、氨基甲酸酯
‑
和烷基胺
‑
。
[0071]
应理解,这两个末端,即n
‑
末端和c
‑
末端中的任一者均可用任何上述修饰进行修饰,或者所述末端中的仅一者,即n
‑
末端或c
‑
末端可用任何上述修饰进行修饰。
[0072]
根据一个优选的实施方案,在根据本发明使用的肽中,n
‑
末端带有乙酰基
‑
(ac)修饰,而在c
‑
末端未带有修饰。
[0073]
根据一个优选的实施方案,根据本发明使用的肽,所述肽由d
‑
氨基酸组成(或者包含d
‑
氨基酸),并且在n
‑
末端带有乙酰基
‑
(ac)修饰,而在c
‑
末端未带有修饰。
[0074]
通过n
‑
末端乙酰化,去除肽的氨基末端的电荷;此外,通过乙酰基修饰,肽旨在模拟其在蛋白质中的天然结构。此外,这种修饰使所得到的肽稳定,防止由外肽酶引起的酶促降解。
[0075]
根据优选的实施方案,根据本发明的肽带有n
‑
末端乙酰基修饰和c
‑
末端酰胺
‑
修饰。
[0076]
通过c
‑
末端酰胺修饰,所述肽旨在模拟其在蛋白质中的天然结构。此外,这种修饰避免了在肽分子中引入额外的电荷。
[0077]
根据一个优选的实施方案,根据本发明的肽包含9个氨基酸,其中8个氨基酸是d
‑
氨基酸且1个氨基酸是l氨基酸,并且进一步优选地,这种肽包含n
‑
末端乙酰基修饰和c
‑
末端酰胺修饰。
[0078]
根据一个优选的实施方案,根据本发明的肽包含11个氨基酸,其中所有氨基酸都是d
‑
氨基酸,并且进一步优选地,这种肽包含n
‑
末端乙酰基修饰和c
‑
末端酰胺修饰。
[0079]
根据另一个优选的实施方案,根据本发明的肽是化学合成的肽或生物表达的肽。
[0080]
用于化学合成肽的多种方法是本领域已知的;虽然肽的化学合成可使用经典的溶液相技术进行,但这些溶液相技术在大多数研究和开发环境中已被固相方法所取代。可例如在stawikowski等人,("introduction to peptide synthesis",cur.prot.prot.sci.,(2012),suppl.69,18.1.1
‑
18.1.13)7中找到肽合成的概述。
[0081]
根据用于本发明的肽的一个实施方案,所述肽处于氧化或还原状态。
[0082]
在这一点上,“氧化”是指肽的状态,在该肽中二硫桥接,这发生在具有氨基酸残基(如半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸)的肽中。“还原”状态表示未形成二硫键的肽的形式。
[0083]
在本发明内,“生物表达的”肽应涵盖由已被修饰成表达一种或多种根据本发明使用的肽的遗传工程化的宿主细胞对所述一种或多种肽的表达。
[0084]
如本文所用,术语“宿主细胞”当前被定义为已被编码根据本发明使用的肽的外源多核苷酸序列转化或转染,或者能够被所述外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。
[0085]
多种宿主表达载体系统可用于表达编码根据本发明使用的肽的基因。此类宿主表达系统代表可用来产生并随后纯化目标编码序列的媒介物,但还代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时原位展现出用于本发明的基因产物的肽的细胞。
[0086]
对于重组产生,宿主细胞可被遗传工程化成并入了表达系统或其部分或编码根据本发明使用的肽的多核苷酸。可通过许多标准实验室手册中描述的方法实现将多核苷酸引入宿主细胞中,如davis等人,basic methods in molecular biology,(2012)8和sambrook等人,19899。
[0087]
因此,编码根据本发明的肽的多核苷酸可例如包含在待稳定转化/转染到宿主细胞中的载体中。在载体中,编码一种或多种本发明的肽的多核苷酸处于例如诱导型启动子的控制之下,使得所述基因/多核苷酸的表达能够被特异性地靶向,并且如果需要,可使所述基因以这种方式过表达。
[0088]
各种各样的表达系统可用于产生本发明的多肽。此类载体尤其包括染色体、附加体和病毒来源的载体,例如源自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒的载体,以及源自它们的组合的载体,如源自质粒和噬菌体遗传元件(如粘粒和噬菌粒)的载体。表达系统构建体可含有调控以及引发表达的控制区。一般地,可针对在这方面的表达使用适合于在宿主中维持、增殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任何系统或载体。适当的dna序列可通过各种各样的熟知且常规的技术中的任一种,例如如sambrook等人,参见上文中所列出的那些技术插入到表达系统中。
[0089]
根据一个优选的实施方案,根据本发明使用的肽选自以下中的至少一者:
[0090]
hd
‑
51‑9:atcycrtgr(seq id no.1)
[0091]
hd
‑
51‑
9rev
:rgtrcycta(seq id no.2)
[0092]
hd
‑
51‑
9mod
:ac
‑
atcycrtgr
‑
nh2(seq id no.5)
[0093]
hnp
‑
41‑
11
:vcscrlvfcrr(seq id no.3)
[0094]
hnp
‑
41‑
11rev
:rrcfvlrcscv(seq id no.4)
[0095]
hnp
‑
41‑
11mod
:ac
‑
vcscrlvfcrr
‑
nh2(seq id no.6)
[0096]
根据本发明的另一方面,所述肽在调节微生物组方面的用途由用于治疗和/或预防肠、肺部、泌尿生殖器、口腔、眼睛、耳朵或皮肤或与生态失调疾患相关的其他疾患或疾病的用途组成。
[0097]
如上所提及的,含有多样化的细菌微生物的健康肠道微生物组不仅对于完整的肠道是必不可少的,而且对于哺乳动物(尤其是人)的整体健康是必不可少的。不仅在患有诸如尤其炎症性肠病、乳糜泻的疾病中重复观察到较低的细菌多样性,而且在像肥胖和2型糖尿病之类的代谢疾病的人中重复观察到较低的细菌多样性,并且癌症的例如检查点抑制剂
治疗的功效也受到微生物组的高度影响,并且甚至像精神分裂症之类的cns疾病也被报告受到微生物组影响。多样性降低与疾病之间的关联表明,物种丰富的肠道生态系统对环境影响具有更强的鲁棒性,因为完整生态系统中功能相关的微生物可补偿其他缺失物种的功能。
[0098]
除了受遗传影响的肠疾病外,特定的食物和饮食模式以及药物也可影响肠道中不同类型的细菌的丰度。虽然通常与营养或饮食的改变相关联,并且也可以通过使用益生元和益生菌食物来观察对肠道微生物组的积极影响,但是根据本发明的肽由于其天然来源,提供了更广泛、更方便和高效的工具。同样使用根据本发明的肽,可以治疗对营养变化和影响高度敏感的受试者。
[0099]
利用根据本发明使用的肽,通过积极影响肠道的天然微生物组,可有效地预防和/或治疗肠疾病以及肺部、皮肤和脑的疾病。
[0100]
因此,在一个优选的实施方案中,根据本发明的肽用于预防/治疗选自以下的疾病:炎症性肠病,特别是克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、坏死性小肠结肠炎、肠易激综合征、旅游者腹泻、胃肠癌和肠移植物抗宿主病;和代谢疾病,优选糖尿病和糖尿病前期、肥胖症、nafld、nash、血脂异常;和肺部疾病,优选哮喘和copd;以及脑疾病,优选精神分裂症、帕金森症、双相情感障碍、自闭症和抑郁症。
[0101]
利用根据本发明的肽,可有效地预防和/或治疗与皮肤、口腔、眼睛、耳朵、阴道或循环系统的简单微生物组相关的疾病。
[0102]
因此,在一个优选的实施方案中,根据本发明的肽用于预防/治疗选自以下的疾病:脓毒症、特应性皮炎、酒渣鼻、脂溢性皮炎、湿疹、痈、葡萄球菌感染、念珠菌病、蜂窝组织炎、脓疱病、痤疮、藏毛囊肿、运动员脚、癣、软疣、皮肤淋巴瘤、牙周炎、龋齿、干眼症、舍格伦氏综合征、结膜炎、睑缘炎、麦粒肿、霰粒肿、眶周蜂窝织炎、泪囊炎、眼内炎、葡萄膜炎、虹膜炎、乳突炎、前庭神经细胞炎、大疱性鼓膜炎、肉芽性鼓膜炎、外耳炎、中耳炎、细菌性阴道病、滴虫性阴道炎、念珠菌病、非感染性阴道炎、炎症性阴道炎。
[0103]
根据另一方面,如本文所述的肽还可用作针对多重耐药性细菌诱导的感染的抗微生物剂。在本发明内,已经发现根据本发明的肽不仅可用于积极地影响天然肠道微生物组,而且可用作特异性地靶向多重耐药性细菌的工具,因此是用于治疗/预防由多重耐药性细菌引起的感染的高效工具。根据另一个目的,本发明还涉及包含根据本发明的肽和药学上可接受的载体的药物。
[0104]
当前且如本领域普遍理解的,“药学上可接受的载体”被理解为意指这样的任何赋形剂、添加剂或媒介物,所述赋形剂、添加剂或媒介物通常用于治疗前述疾病的领域并且简化或能够实现根据本发明的产品向生物的施用,和/或改善其稳定性和/或活性。所述药物组合物还可掺入有粘合剂、稀释剂或润滑剂。药物载体或其他添加剂的选择可基于预期的施用途径和标准药物实践进行。作为药学上可接受的载体,可使用溶剂、增量剂或其他液体结合介质,如分散剂或悬浮剂、表面活性剂、等渗剂、展着剂(spreader)或乳化剂、防腐剂、包封剂、固体结合介质,这取决于什么最适合于相应的剂量方案并且同样与根据本发明的化合物相容。此类另外成分的概述可在例如rowe(编辑)等人:handbook of pharmaceutical excipients,第7版,2012,pharmaceutical press
10
中找到。
[0105]
当被配制用于局部施用时,本发明的肽可用于治疗皮肤疾患。用于局部施用的方
法是本领域已知的。
[0106]
当被配制用于局部施用时,本发明的组合物可含有在局部药物或化妆品组合物中典型的成分,如载体、媒介物或介质。具体而言,所述载体、媒介物或介质与其将被施加至其中的组织(如皮肤、毛发、指甲、阴道、尿道、耳朵、口腔、鼻道、呼吸系统、眼部区域和/或粘膜)相容。本发明的组合物和组分适合用于与受感染的组织接触或者适合用于一般患者而没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等。适当时,本发明的组合物可包含在所考虑的领域中常规使用的任何成分。
[0107]
就形式而言,本发明组合物可包括溶液、乳液(包括微乳液)、悬浮液、乳膏、洗剂、凝胶、粉末或用于施用至可使用所述组合物的皮肤和其他组织的其他典型固体或液体组合物。此类组合物可含有:额外的抗微生物剂、保湿剂和水合剂、渗透剂、防腐剂、乳化剂、天然或合成油、溶剂、表面活性剂、洗涤剂、胶凝剂、润肤剂、抗氧化剂、芳香剂、填充剂、增稠剂、蜡、气味吸收剂、染料、着色剂、粉末、粘度控制剂和水,并且任选地包含麻醉剂、止痒活性剂、植物提取物、调理剂、增黑剂或增亮剂(lightening agent)、闪光剂、湿润剂、云母、矿物质、多酚、硅酮或其衍生物、防晒剂、维生素和植物药。在某些实施方案中,本发明的组合物与上述成分一起配制以长期稳定,如在意图持续或长期治疗的情况下可能是有益的。
[0108]
本发明的组合物可呈控制释放或持续释放组合物的形式,其中抗微生物肽连同另外的活性剂被包封或以其他方式包含在材料中,使得它们随时间推移以受控的方式释放到皮肤或受影响的区域上。本发明的组合物可包含在基质、脂质体、囊泡、微胶囊、微球等内或上,或者在固体颗粒材料内或上。
[0109]
本发明的组合物可施用于任何受影响或易感的区域,例如,腿部、肩部、背部(包括下背部)、腋窝、手掌、足部、颈部、腹股沟、背部或手或足部、肘部、上臂、膝盖、大腿、臀部、躯干、骨盆或身体的任何其他可能需要治疗或预防感染的部位。此种治疗也被考虑用于治疗和/或包扎伤口,如皮肤的割伤、擦伤和烧伤,以便治疗或预防受伤区域的感染。
[0110]
本发明的组合物适用于ph范围为约4.5至约6.3的生理环境,并且因此,所述组合物可在相似或等效的ph下配制。根据本发明的组合物可在室温或冷藏条件下储存。本发明的组合物含有一定量的对抗微生物作用有效的抗微生物肽。一般来说,所述组合物含有约0.01%(wt./vol.)至约20%的抗微生物肽。在某些实施方案中,所述组合物含有约0.5%至约10%的抗微生物肽,如约0.5%、约1%、约5%或约10%的抗微生物肽。
[0111]
根据本发明的肽的特征、特性和优点同样适用于根据本发明的药物。因此,含有根据本发明的肽的药物也可用于治疗和/或预防选自以下的疾病:炎症性肠病,特别是克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、坏死性小肠结肠炎、肠易激综合征、旅游者腹泻、胃肠癌和肠移植物抗宿主病;以及代谢疾病,优选糖尿病和糖尿病前期、肥胖症、nafld、nash、血脂异常;和肺部疾病,优选哮喘和copd;和皮肤疾病,如特应性皮炎、酒渣鼻、脂溢性皮炎、湿疹、痈、葡萄球菌感染、念珠菌病、蜂窝组织炎、脓疱病、痤疮、藏毛囊肿、运动员脚、癣、软疣、皮肤淋巴瘤;口腔疾病,如牙周炎和龋齿;眼部疾病,如干眼症、舍格伦氏综合征、结膜炎、睑缘炎、麦粒肿、霰粒肿、眶周蜂窝织炎、泪囊炎、眼内炎、葡萄膜炎、虹膜炎;耳部疾病,如乳突炎、前庭神经细胞炎、大疱性鼓膜炎、肉芽性鼓膜炎、外耳炎、中耳炎;阴道疾病,如细菌性阴道病、滴虫性阴道炎、念珠菌病、非感染性阴道炎、炎症性阴道炎;以及脓毒症和精神疾病,优选精神分裂症、帕金森病、双相情感障碍、抑郁症或自闭症。
[0112]
根据另一个优选的实施方案,所述肽以二聚体(优选同二聚体)形式存在。所述二聚体优选通过共价键(合适地二硫键)结合。
[0113]
肽的二聚化是本领域已知的。当前用于肽二聚化的化学性质涉及未受保护的肽之间的化学选择性反应。实例是以下键的形成,例如,cys
‑
马来酰亚胺硫醚、二硫化物或三唑。
[0114]
应当理解的是,上述特征和下文将要提到的特征不仅可在相应情况下以所指示的组合使用,而且可在不脱离本发明范围的情况下以其他组合或以分离的方式使用。
[0115]
现在借助于产生本发明的另外特征、特性和优点的实施方案进一步解释本发明。实施方案仅具有说明性质,并且不限制本发明的范围。
[0116]
具体实施方案中提到的特征也是本发明的一般特征,它们不仅适用于相应的实施方案,而且在本发明的任何实施方案的上下文中也可以分离的方式应用。
[0117]
本发明还通过参考以下附图进一步详细描述和解释:
[0118]
图1示出证明hd
‑
6纳米网形成不受十二指肠液影响的实验的结果:(a)示出在用2mm tcep还原后与十二指肠液一起孵育的hd
‑
6的色谱图。仅根据保留时间与m/z图以及2、3、4、5和6倍质子化离子和中性质量检测氧化和还原的全长肽。(b)示出与200μg/ml hd
‑
6或0.01%hac(对照)和十二指肠液或0.9%nacl(对照)一起孵育的被还原的珠粒。纳米网形成没有受到影响,因为这些网看起来与含0.9%nacl的hd
‑
6相同。放大条=0.2μm。
[0119]
图2示出实验的结果,其中hd
‑
5和十二指肠液的孵育产生了许多不同的片段。将hd
‑
5在用2mm tcep还原后与十二指肠液一起孵育。(a)示出来自被还原的hd
‑
5与十二指肠液的孵育的色谱图概览。在(b)中,所有可检测的片段均以灰色(a
‑
m)标记,并根据它们的保留时间列出。所有鉴定的片段的质荷比(m/z)图具有检测到的离子及其中性质量。选择肽(a)、(b)、(c)、(e)、(i)、(j)、(k)、(l)和(m)进行合成和深入研究它们的能力。(c)此处列出所选片段(灰色)以及其氨基酸序列及其在hd
‑
5序列中的分布。
[0120]
图3示出证明hd
‑
5片段是对抗共生细菌的抗微生物活性肽的实验的结果:(a)示出表格,所述表格总结根据对hd
‑
5片段的敏感性而对不同共生细菌进行的测试。在此热图中列出了所有细菌以及所述片段在rda中对抗它们的活性。在rda中,使用了2μg的全长和4μg的每个片段。大于5mm的抑菌区被确定为高活性,介于2.5与5mm之间为低活性,而2.5mm是冲压孔的直径并且因此没有活性。(b)在此,在图表中,来自(a)的原始数据与来自至少三个独立实验的平均值和标准偏差被放置在一起。(c)示出探究不同肽的作用模式的电子显微镜图片:将大肠杆菌mc1000与所有不同的片段一起孵育,并且执行透射电子显微术,并分析所得的表型。除全长肽hd
‑5fl
(1μm)外,所有图片的放大条均为0.5μm。
[0121]
图4示出证明不同片段对抗病原性细菌的抗微生物活性的实验的结果:(a)示出表格,所述表格总结hd
‑
5片段对抗病原性细菌的抗微生物活性的测试。使用具有高活性(rda中的抑制区>5mm)、低活性(2.5至5mm)和无活性(2.5mm)的热图系统。(b)示出(a)的数据与来自至少三个独立实验的平均值和标准偏差的图表。
[0122]
图5示出证明含有半胱氨酸和精氨酸取代的hd51‑9对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌突变体几乎没有任何抗微生物作用的实验的结果。在18小时后根据光密度(od
600
)的测量结果确定hd51‑9及其变体对(a)大肠杆菌bw 25113突变体和(b)金黄色葡萄球菌sa113突变体的最小抑制浓度(mic)。描绘了来自三个独立实验的结果与+/
‑
sem。
[0123]
图6示出hd51‑9和合成hd51‑9的还原导致其抗微生物活性完全消失的实验的图。在
18小时后根据光密度的测量结果确定几种浓度的被还原和氧化的hd51‑9和二聚体对(a)大肠杆菌bw 25113和(b)金黄色葡萄球菌sa113的最小抑制浓度(mic)。然后将细菌铺板以确认mic。描绘了来自三个独立实验的结果与+/
‑
sem。
[0124]
图7示出实验数据的图表,该实验数据表明几乎没有观察到经hd51‑9处理的细胞的代谢活性降低。为了分析经hd51‑9和二聚体处理的细胞的代谢活性,执行了wst
‑
1测定。将细胞系用浓度介于3.123
‑
100μm之间的hd51‑9或hd51‑9二聚体刺激并孵育24小时或48小时。将活性针对阴性对照作归一化。用2%triton x
‑
100处理的细胞用作阳性对照,而用0.01%乙酸进行的处理用作阴性对照。结果示出三个独立实验(a、b、c)的平均值与+/
‑
sem。
[0125]
图8示出hd51‑9的抗微生物作用模式。由hd51‑9诱导的细胞壁损伤在大肠杆菌atcc 25922与金黄色葡萄球菌sa113之间不同。为了检测由hd51‑9引起的细菌细胞损伤,执行流式细胞术分析。将1.5x106个大肠杆菌atcc 25922和金黄色葡萄球菌sa113与不同浓度的hd51‑9(6.25μm、12.5μm和50μm)一起孵育1小时。(a)碘化丙啶或(b)膜敏感性dibac3(3)染料被用于对细菌染色。使用12.5μm hbd3作为阳性对照,而未处理的细胞用作阴性对照。描绘了来自三个独立实验的结果与+/
‑
sem。(c)执行透射电子显微术以评估经hd51‑9(200μg/ml)处理的大肠杆菌mc1000的形态变化。为了比较,使用全长hd5(hd5
fl
),而用0.01%乙酸(hac)进行的处理充当阴性对照。条形:左上图:1μm;右上和左下:0.5μm;右下图:2μm。
[0126]
图9示出关于粪便中艾克曼菌(akkermansia)和对hd
‑
51‑9处理的敏感性的探究和实验的结果:(a)与经pbs处理的小鼠相比,从用hd
‑
51‑9或pbs处理7天的小鼠收集的粪便样品(第0、7、14天)中艾克曼菌的数量在经hd
‑
51‑9处理的动物中增加(线性混合效应模型;p=0.075)。这里示出的平均值具有来自每组n=6的80%置信区间。在(b)中,测试了嗜粘蛋白艾克曼菌(akkermansia muciniphila)是否对hd
‑
51‑9处理敏感。(b)示出在厌氧罐中在37℃下孵育72小时后与未处理的对照相比的生长率(%)。在这个测定中没有检测到hd
‑
51‑9对艾克曼菌的mic。所述图示出n=3的平均值与标准偏差。
[0127]
图10示出hd51‑9刺激的人pbmc的促炎和抗炎免疫应答。将人外周血单核细胞(pbmc)分离并用10μg/ml lps(鼠伤寒沙门氏菌)和不同浓度的hd51‑9刺激,然后孵育24小时。pbmc的上清液用于通过多分析物试剂盒(legendplex)定量所产生的细胞因子的数量。评估了以下细胞因子:促炎性细胞因子(a)tnf
‑‑
α(b)ifn
‑
γ(c)il
‑
1β(d)il
‑
6(e)il
‑
8和抗炎细胞因子(f)il
‑
10。使用未处理的细胞作为阴性对照,并且将细胞因子浓度针对阴性对照归一化。结果示出三个独立实验的平均值与+/
‑
sem。为了进行统计分析,进行了kruskal
‑
wallis检验。p>0.05=ns;p≤0.05=*;p≤0.01=**;p≤0.001=***;p<0.0001=****。
[0128]
图11示出hd51‑9及其二聚化形式的毒性特征未对人细胞系展示细胞毒性作用。hd51‑9和二聚体的(a)代谢活性和(b)细胞毒性是使用wst
‑
1测定和ldh测定确定的。将ht29
‑
mtx
‑
e12细胞用浓度介于3.123
‑
100μm之间的hd51‑9或hd51‑9二聚体刺激并孵育48小时。将活性针对阴性或阳性对照归一化。作为阳性对照,将细胞用2%triton x
‑
100处理,而用0.01%乙酸处理用作阴性对照。结果示出三个独立实验的平均值与+/
‑
sem。(c)此外,分析了hd51‑9的溶血活性。将红细胞悬浮液与不同浓度的hd51‑9一起孵育。将溶血活性针对0.1%triton x
‑
100的溶血活性归一化。实验一式两份进行。
[0129]
图12示出另外的毒性数据。肽处理后几乎没有观察到tr146细胞的细胞毒性作用。进行ldh测定以评估hd51‑9和二聚体的细胞毒性作用。将细胞系用浓度介于3.123
‑
100μm之
间的hd51‑9或hd51‑9二聚体刺激并孵育24小时或48小时。将活性针对阳性对照归一化。作为阳性对照,将细胞用2%triton x
‑
100处理,而用0.01%乙酸处理用作阴性对照。结果示出三个独立实验的平均值与+/
‑
sem。针对在24小时和48小时后(a)hd51‑9以及在24小时和48小时后(b)hd51‑9二聚体评估tr146细胞的细胞毒性作用。此外,在24小时后测定了(c)hd51‑9和二聚体对ht29
‑
mtx
‑
e12细胞的细胞毒性。
[0130]
图13a和13b示出总体粪便微生物群落。处理1周后使用所有小鼠(每组n=12)的加权和未加权的unifrac距离的pcoa,比较hd5
fl
与hd51‑9。
[0131]
图14a和14b示出总体小肠微生物群落。处理1周后使用第1周处死的所有小鼠(每组n=6)的加权和未加权的unifrac距离的pcoa,比较hd5fl与hd51‑9。
[0132]
图15a和15b示出受全长和片段化hd
‑
5处理不同影响的细菌属。使用所有小鼠在粪便微生物群第0、7和14天调整笼子的线性混合模型(注意,第0天和第7天每组n=12,并且第14天每组n=6)。仅呈现显著不同的属。
[0133]
图16:hd51‑9针对大肠杆菌atcc 25922和大肠杆菌bw 25113以及其lps突变体的抗微生物活性。(a)大肠杆菌bw 25113突变体的细胞壁构建。大肠杆菌atcc 25922含有全长lps,而大肠杆菌bw 25113中缺失o
‑
抗原。大肠杆菌bw 25113突变体
△
waag缺失外核,相比之下
△
waay在内核中缺乏一些磷酸酯残基。最后一个突变体
△
waap含有一个外核,但内核中没有磷酸酯残基。(b)18小时后根据光密度确定在不同肽浓度下hd51‑9针对大肠杆菌atcc 25922和大肠杆菌bw 25113突变体的最小抑制浓度(mic)。表示了来自至少两个独立实验的结果与平均值+/
‑
sem。
[0134]
图17:hd51‑9针对金黄色葡萄球菌sa113及其细胞壁突变体的抗微生物活性。(a)金黄色葡萄球菌sa113细胞壁突变体用于分析hd51‑9的电荷依赖性抗微生物作用。金黄色葡萄球菌突变体
△
dlta缺乏d
‑
丙氨酸,从而导致肽聚糖层带更多负电荷。类似的特征具有缺失l
‑
赖氨酸的突变体
△
mprf,从而导致细胞膜带负电荷。金黄色葡萄球菌突变体
△
tarh含有额外的磷壁酸,从而导致肽聚糖层的加强。(b)18小时后根据光密度确定在不同肽浓度下hd51‑9针对金黄色葡萄球菌sa113和突变体的最小抑制浓度(mic)。表示了来自两个独立实验的结果+/
‑
sem。
[0135]
图18:与二聚体形式相比,hd51‑9针对革兰氏阴性细菌的抗微生物作用有所不同。18小时后根据光密度确定在不同肽浓度下hd51‑9和hd51‑9‑
二聚体针对不同沙门氏菌物种的最小抑制浓度(mic)。表示了来自至少两个独立实验的结果与平均值+/
‑
sem。
[0136]
图19:与二聚体形式相比,hd51‑9针对革兰氏阳性细菌的抗微生物作用有所不同。18小时后根据光密度确定在不同肽浓度下hd51‑9和hd51‑9‑
二聚体针对金黄色葡萄球菌atcc25923和临床分离株金黄色葡萄球菌usa300的最小抑制浓度(mic)。表示了来自两个独立实验的结果与+/
‑
sem。
[0137]
图20:将还原的hnp
‑
4通过胰蛋白酶消化。(a)展示用2mm tcep还原后用胰蛋白酶孵育还原的hnp
‑
4的色谱图的概览。所有可检测的片段均以红色或灰色(a
‑
j)标记,并根据它们的保留时间列出。全长肽标记为(i)和片段hnp
‑
41‑
11
(d)。
[0138]
图21:hnp4衍生物展示针对共生细菌和病原性细菌的高抗微生物活性。
[0139]
使用rda分析了鉴定的片段及其经修饰型式针对共生细菌和病原性细菌的抗微生物潜力。示出热图,大于5mm的抑制区被确定为高活性,介于2.5与5mm之间为低活性,而
2.5mm的直径(冲压孔的直径)被标记为无活性。热图是基于至少三个独立实验。
[0140]
图22:hnp
‑
41
‑
11和hnp
‑
41
‑
11mod在高浓度下仅显示出轻微的细胞毒性和溶血活性。研究了hnp
‑
41‑
11
和hnp
‑
41‑
11mod
针对(a)caco2/tc7或(b)ht29 mtx e 29细胞的细胞毒性活性。每孔接种1500个细胞,并在24小时后用不同的肽浓度处理它们。使用celltiter glo2.0测定在96小时处理后测定活细胞。(c)与0.1%triton
‑
x处理相比,肽对人红细胞的溶血活性。
[0141]
材料和方法
[0142]
细菌菌株
[0143]
鲍氏不动杆菌4
‑
mrgn、肺炎克雷伯氏菌4
‑
mrgn、铜绿假单胞菌atcc27853、屎肠球菌475747、长双歧杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌和唾液链球菌唾液亚种以临床分离株的形式从robert
‑
bosch
‑
hospital(stuttgart,germany)获得。嗜粘蛋白艾克曼菌、枯草芽孢杆菌168trpc和金黄色葡萄球菌usa300获自institut fur mikrobiologie und lnfektionsmedizin(tubingen,germany)。青春双歧杆菌ni3,29c、短双歧杆菌由ardeypharm提供。普通拟杆菌dsm1447获自dsmz,并且鼠李糖乳杆菌由infektopharm(heppenheim,germany)提供。大肠杆菌atcc 25922获自deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen gmbh(德国波恩)。沙门氏菌物种以及金黄色葡萄球菌usa300、金黄色葡萄球菌atcc 25923、金黄色葡萄球菌sa133及其突变体的临床分离株由institute of medical microbiology and hygiene t
ü
bingen,germany提供。大肠杆菌bw25113以及其突变体获自interfaculty institute for microbiology and infection medicine,tubingen,germany。
[0144]
肽对于所有实验,使用氧化肽hd
‑
5和hd
‑
6(peptide institute,osaka,japan)。所有片段,即hd
‑
51‑9和hnp
‑
41‑
11
、hd
‑
51‑
13
、hd
‑
51‑
28
、hd
‑57
‑
32
、hd
‑510
‑
32
、hd
‑514
‑
32
、hd
‑510
‑
27
和hd
‑526
‑
32
(本发明的所有肽)由emc microcollections gmbh(t
ü
bingen,germany)合成。将所有肽以相似浓度溶解在0.01%乙酸(hac)中。
[0145]
测试了以下序列(根据本发明的肽)(n
‑
>c
‑
末端):
[0146]
hd
‑
51‑9:atcycrtgr(seq id no.1)
[0147]
hd
‑
51‑
9rev
:rgtrcycta(seq id no.2)
[0148]
hd
‑
51‑
9mod
:ac
‑
atcycrtgr
‑
nh2(seq id no.5)
[0149]
hnp
‑
41‑
11
:vcscrlvfcrr(seq id no.3)
[0150]
hnp
‑
41‑
11rev
:rrcfvlrcscv(seq id no.4)
[0151]
hnp
‑
41‑
11mod
:ac
‑
vcscrlvfcrr
‑
nh2(seq id no.6)
[0152]
胃镜检查期间收集十二指肠液。
[0153]
在常规胃镜检查期间从三个健康个体收集人十二指肠液。将十二指肠用0.9%nacl溶液洗涤,并再回收nacl溶液。患者在被告知后给予了书面知情同意书。样品收集先前已获得ethical committee of the university hospital of tuebingen,germany的批准。
[0154]
使用lc/ms筛选hd
‑
5和hd
‑
6的片段
[0155]
将2.5μg的hd
‑
5或hd
‑
6在含2mm三(2
‑
羧基乙基)膦的50mm nh4hco3缓冲液(ph 8.0)(fluka)中在37℃下孵育15分钟。然后添加人十二指肠液并在37℃下再孵育30分钟。最后,
分别加入最终浓度为0.5%和10%的甲酸和乙腈,并通过质谱分析对样品进行分析。利用lc/ms系统使用agilent 1200系列hplc用agilent advanced bio peptide map(2.1x150mm,2.7μm)柱以0.4ml/min的流速在55℃柱温下进行质谱分析,并用6540uhd q
‑
tof lc/ms系统(agilent)进行质量分析。用一定梯度的在0.1%甲酸中的乙腈分离样品。所述梯度从2%乙腈开始4分钟,然后在35分钟内增加至45%。质谱分析以单一ms模式从100至3400m/z以正离子极性执行,并通过agilent masshunter定量分析b 06.00软件进行分析。
[0156]
扫描电子显微术
[0157]
如先前所述的那样执行扫描电子显微术。简言之,将蛋白a包被的珠粒(spherotech inc.)与还原的hd
‑
6(200μg/ml)一起在含有1%(w/v)tsb的10mm磷酸钠缓冲液中在37℃下孵育1.5小时以允许净形成。随后将整个样品与十二指肠液一起在37℃下再孵育30分钟。使用0.01%乙酸(hac)作为对照。将所述珠粒离心并固定在karnovsky试剂中。将样品用pbs洗涤,并另外用含1%osq4的h2o固定。然后,将它们脱水至100%乙醇中并从co2进行临界点干燥,并在max planck institute for developmental biology(德国图宾根(tuebingen,germany))通过扫描电子显微术进行分析。
[0158]
透射电子显微术
[0159]
如先前所述的那样执行透射电子显微术实验
11
。将6x 108cfu大肠杆菌mc1000与200μg/ml的每种肽一起孵育2小时。将细菌固定在karnovsky固定液中,包埋在琼脂糖中,凝固,切成小块,并再次固定在karnovsky溶液中。在后固定和包埋在缩水甘油醚中后,使用超薄切片机对小块进行切割。将切片(30nm)安装在铜网上,并使用zeiss libra 120透射电子显微镜进行分析。
[0160]
径向扩散测定
[0161]
所有肽的抗微生物活性都通过lehrer等人
12
的改良径向扩散测定进行测试。简而言之,对数期细菌在液体胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)(becton dickinson)中生长(厌氧细菌与anaerogen,oxoid一起在厌氧罐中)。在数个用10mm磷酸钠缓冲液(ph 7.4)进行的洗涤步骤后,每次测定使用4x 106cfu/ml。为了测量所鉴定的肽片段的抗菌作用,将细菌在含有0.3mg/ml tsb粉末和1%(w/v)低eeo
‑
琼脂糖(applichem)的10mm磷酸钠(ph 7.4)中孵育。然后将肽片段吸移至冲压的孔中,并让其在37℃下扩散3小时。之后,将富含营养物的凝胶与含有6%tsb(w/v)和1%琼脂糖的10mm磷酸钠缓冲液一起倒在第一块凝胶的顶部上。在24小时后测量抑制区。使用0.01%乙酸作为阴性对照,其未显示出大于冲压孔的直径的抑制区。所有实验进行至少三次。
[0162]
浊度肉汤测定
[0163]
将测试的细菌在1x tsb肉汤中孵育过夜,离心并用含有1%(w/v)tsb肉汤的10mm磷酸钠缓冲液洗涤。将5x 105cfu/ml细菌与不同浓度的肽在含1%(w/v)tsb的10mm磷酸钠缓冲液中混合(最终体积100μl),并在37℃下孵育2小时。之后,添加100μl 2x tsb肉汤,并测量600nm处的光密度(spark 10m,tecan,austria)。监测细菌生长12小时,在每30分钟进行的测量过程中在振荡下使细菌在37℃下生长,但是嗜粘蛋白艾克曼菌除外,嗜粘蛋白艾克曼菌在厌氧罐中在37℃下孵育且在72小时后测量生长。
[0164]
如前所述的那样评估细胞壁靶标实验以及hd5二聚体实验中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株的杀菌活性。通过离心(2500rpm,10分钟,4℃)收集对数期细菌,用含有1%(w/
v)tsb肉汤的10mm磷酸钠缓冲液洗涤两次并且测定od600 nm(od600=0.1)处的光密度。将大约5x 105cfu/ml的细菌与系列浓度(1.17
–
150μm)的肽以100μl的最终体积在含1%(w/v)tsb肉汤的10mm磷酸钠缓冲液中在37℃下孵育2小时。在孵育后,添加100μl的6%tsb(w/v)并测量600nm处的吸光度(tecan,switzerland)并监测18小时。然后,将每孔100μl接种在lb板上,以从微生物学上确定活细菌的数量。杀菌活性表示为lc99.9,即杀死≥99.9%细菌的最低浓度。实验独立地重复至少三次。
[0165]
细胞的细胞毒性测定
[0166]
将caco2/tc7(x,x)和ht29 mtx e29(x,x)接种在96孔板中的90μl培养基(1500个细胞/孔)中,并在37℃下孵育24小时。之后开始用不同浓度的肽处理(10μl体积溶于0.01%乙酸中),并将细胞孵育96小时。未处理的和经1%triton
‑
x处理的细胞用作对照。在孵育后,添加100μl的celltiter glo2.0溶液并开始执行测量方案。测量在spark 10m(tecan)中进行,从12分钟连续振荡开始,然后是发光测量,积分时间从每孔1秒开始。实验一式两份进行。
[0167]
溶血测定
[0168]
在现有方案之后测量溶血活性
13
。从两名自愿供体获得血液(样品收集先前已获得ethical committee of the university hospital of t
ü
bingen,germany的批准),并且将1ml血液用pbs洗涤两次。然后以1000g离心血液,并在pbs中执行1%(v/v)血液悬浮。将血液悬浮液与不同浓度的肽(最终浓度0.5%)在37℃下孵育1小时。然后将样品以1000g离心10分钟,并收集上清液且在414nm下测量。所述溶血活性是针对0.1%triton x
‑
100的溶血活性确定的相对值。这些实验一式两份进行。
[0169]
体内微生物群分析
[0170]
为了评估对微生物群组成的功能性影响的概念证据,将hd
‑
51‑9施用至每笼3只的组中圈养的9周大的健康饲料喂养的雄性小鼠。使小鼠在实验开始前适应环境3周,并根据每笼的平均体重分成实验组,确保各组之间具有相等的体重分布。更详细地,将野生型c57bl/6j小鼠通过口服管饲法用以100μl pbs溶液施用的7.19μg/小鼠hd
‑
51‑9处理7天。将对照小鼠用等体积的pbs处理。最初,用每组6只小鼠执行了7天实验。基于这些结果,设计了新的研究,每组还包括6只小鼠,以研究肠道微生物调节的时间影响。在这项研究中,在口服管饲1周后纳入7天洗涤期。在第0、7和14天(处理组和对照组各自n=6)在9am从各个小鼠收集新鲜粪便样品,同时测量体重。在第14天,对小鼠实施安乐死并收集小肠内容物。
[0171]
按照制造商的说明书用nucelospin 96土壤试剂盒(macherey
‑
nagel)从在第0、7和14天收集的速冻粪便和尸体剖检时的小肠内容物提取细菌dna。bgi,欧洲使用内部标准操作程序进行了后续文库制备和dna测序。简言之,使用靶向v4 16s rdna区域的illumina衔接子使用以下引物对每个样品30ng细菌dna进行pcr扩增:515f:gtgccagcmgccgcggtaa(seq id no.7),806r:ggactachvgggtwtctaat(seq id no.8)。然后用ampurexp珠粒(agencourt)纯化pcr产物以除去非特异性产物。通过agilent 2100生物分析仪(agilent dna 1000试剂)测定平均分子长度。在hiseq2500系统上进行配对双端测序之前,通过实时定量pcr(evagreen
tm
)评估dna定量。
[0172]
使用r包dada2,版本1.4.0
14
进行读数的处理和质量控制,并从读数中修剪掉正向和反向引物。接下来,除去含有剩余未调用碱基或超过两个预期错误的所有读数。之后,从
100万个读数的随机子集中学习dada2误差模型的参数。然后使用此误差模型对所有序列进行去噪;即,推断asv。然后合并经去噪的读数(asv),并除去在正向与反向读取之间具有一个或多个冲突碱基的读数对。短于251个碱基和长于254个碱基的asv被丢弃。然后使用函数“removebimeradenovo”检测并除去嵌合序列。最后,使用silva参考16s rrna基因数据库,版本132将读数(asv)从界分类至属级,从而构建asv表,该表含有所有样品中的所有asv的读取计数。
[0173]
所有动物方案都是根据拉瓦尔大学动物护理和处理委员会(laval university animal care and handling committee)制定的指导方针进行的。将c57bl/6j雄性小鼠(jackson laboratories,bar harbor,me)圈养在12:12小时光照
‑
黑暗循环下的无病原体、温度受控的环境中,并在我们的动物饲养所的5周(3周适应和2周实验方案)内随意给它们喂食标准啮齿动物食物(harlan teklad t
‑
2018。
[0174]
统计分析
[0175]
除了微生物组分析外,所有数据均使用graphpad prism 7进行分析。p<0.05的值被认为是统计上显著的。所有结果均表示为平均值及其
±
标准偏差,以及平均值的标准误差或80%置信区间,如图例所示。使用r studio(r版本3.4.2和r studio版本1.0.136)和程序包phyloseq 1.22.3 15
、metagenomeseq 1.20.0 16
、vegan 2.4
‑417
、ime4 1.1
‑
15和ggplot2 2.2.1
18
进行生物信息学分析。对于小鼠研究,使用了笼子调整的p值。
[0176]
软件
[0177]
对于经由电脑模拟的消化分析,使用了来自sib生物信息学资源门户(https://web.expasy.org/peptide_mass/)的expasy peptidemass工具。
[0178]
结果
[0179]
天然人十二指肠液消化hd
‑
5,而形成hd
‑
6的纳米网具有蛋白酶抗性
[0180]
由于帕内特细胞防御素可被天然存在的硫氧还蛋白系统还原,因此研究了它们对蛋白水解消化物的敏感性。在实验程序开始之前,研究了肠蛋白酶对hd
‑
5和hd
‑
6的可能片段化。因此,expasy的peptidemass模块(sib生物信息学资源门户)被用于使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或两者的组合执行hd
‑
5和hd
‑
6的经由电脑模拟的消化,并被允许多达五个缺失的裂解。可能的片段根据它们各自的质量在以下表1中列出。
[0181]
表1:在存在胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶或两者的组合的情况下帕内特细胞hd
‑
5和hd
‑
6的经由电脑模拟的(正常字母)消化物以及在与十二指肠粘液一起孵育后的离体现实(粗体字母)消化物,最多为5个的缺失的裂解和大于500da的片段。使用expasy peptidemass模块确定不同的序列。在人肽与人十二指肠粘液一起孵育后可用质谱法鉴定的片段呈粗体。该表中的第一行表示两个全长肽,它们也可被鉴定。
[0182]
[0183]
[0184][0185]
理论上,两种帕内特细胞防御素似乎都对蛋白酶敏感,而与hd
‑
5相比,hd
‑
6显示出更多片段化的趋势(表1)。在第二步中,利用还原剂三(2
‑
羧乙基)膦(tcep)使hd
‑
5或hd
‑
6还原,并使所述肽经受天然存在的十二指肠液的攻击,已知所述十二指肠液具有蛋白水解活性。在执行质谱分析后,发现在存在2mm tcep的情况下hd
‑
6被部分还原,这与先前公布的工作一致。除了两种全长形式,即hd
‑6ox
(预期:3705.49da)和hd
‑6red
(3711.54da),出人意料地是没有鉴定出其他片段,所述其他片段可通过指示2
‑
、3
‑
、4
‑
、5
‑
、6
‑
倍质子化离子的质荷比(m/z)信号来进行鉴定。这一出人意料的观察结果表明hd
‑6red
可抵御蛋白水解消化,尽管原
因仍然难以捉摸,因为根据生物信息学预测到蛋白水解裂解位点。众所周知,hd
‑
6的独立于其氧化还原状态的这两种形式(hd
‑6ox
和hd
‑6red
)都能够形成纳米网。因此,假设网络形成可抵御蛋白酶降解,并且因此可能为观察到的肽保护提供机制解释。为了阐明纳米网形成是否产生更稳定的结构,对与十二指肠液一起孵育的被还原的hd
‑
6执行了扫描电子显微术(图1)。与此假设一致,独立于十二指肠液孵育观察到相同的纳米网(图1b)。综上所述,纳米网的形成似乎至少有助于阻止hd
‑
6发生蛋白水解消化。
[0186]
接下来,在相同的实验装置中研究了第二种且更丰富的帕内特细胞防御素hd
‑
5。在与2mm tcep和十二指肠液一起孵育后,hd
‑5ox
低于检测限(lod),而hd
‑5red
高度丰富。虽然hd
‑
5不能形成纳米网,但出人意料地,与hd
‑
6相比,十二指肠液对hd
‑
5具有不同的影响。与已知的蛋白酶裂解位点一致,鉴定出了在添加hd
‑
5之前不存在的不同片段(图2a,以粗体字母突出显示的表格)。对这些片段进行分析并列出了它们的质荷比,并且为每个片段示出不同的所观察到的质子化离子及其质量(图2b)。列出了所鉴定出的片段及其中性质量和保留时间,表明在存在十二指肠液的情况下hd
‑
5的片段化产生源自整个肽序列的大量片段。然而,我们仍然发现可检测量的全长hd
‑5red
,表明蛋白水解消化不完全。已知zn
2+
可保护hd
‑5red
免受蛋白水解消化,这在我们的设置中确实得到了证实(数据未示出)。总之,结果表明十二指肠液出人意料地对hd
‑
5和hd
‑
6产生不同的影响,并且局部微环境中的条件变化对防御素片段化具有影响。值得注意的是,hd
‑
6纳米网形成似乎可以防止被还原的全长肽被破坏,并且已知hd
‑
6的还原揭示了抗微生物活性。因此,还原改变了两种帕内特细胞防御素的活性,但hd
‑
6获得直接的抗微生物活性,而hd
‑
5被肠蛋白酶消化从而形成具生物活性的肽片段,所述具生物活性的肽片段具有潜在的具生物活性的抗微生物活性。
[0187]
hd
‑
5片段在径向扩散测定中具有抗微生物活性
[0188]
为了测试hd
‑
5片段的抗微生物活性,化学合成选定的片段以研究体外抗微生物功能(图2c)。使用4μg量的不同片段和2μg全长肽针对共生肠道和病原性细菌执行了几次径向扩散测定。令人感兴趣且出人意料地,观察到大多数hd
‑
5来源的片段在不同程度上对共生细菌和病原性细菌具有抗微生物活性。此外,发现不同的片段对所应用的细菌菌株表现出不同的活性模式(图3a和b)。正如预期的那样,全长hd
‑
5显示出广泛抗微生物活性。仍然出人意料地,hd
‑
51‑9在抗微生物活性方面以及在多功能性方面被鉴定为最具活性的肽,因为它针对所有测试的细菌都有活性。与hd
‑
51‑9相比,hd
‑510
‑
27
没有表现出可测出的活性。值得注意地,hd
‑
51‑
13
、hd
‑
51‑
28
、hd
‑57
‑
32
和hd
‑526
‑
32
也表现出抗微生物性质,尽管程度低于hd
‑
51‑9。为了进一步评估经肽处理的细菌的所得表型,将大肠杆菌mc1000与所有片段一起孵育并执行透射电子显微术(tem)(图3c)。据观察,hd
‑5fl
处理导致内膜分离且细菌细胞包膜周围有小囊泡结构(图8)。令人感兴趣地,所述细菌在与hd
‑
5的不同片段一起孵育后出人意料地显示出不同的典型表型,这表明作用模式存在差异。对于hd
‑
51‑9,可观察到内膜分离且在细菌的一个极具有额外的大液泡结构,而hd
‑
51‑
13
和hd
‑
51‑
28
处理导致细菌内部有更大的聚集(图8)。研究结果指示不同种类的细菌表型,并且这种多样性表明微小的序列差异(例如hd
‑
51‑9和hd
‑
51‑
13
)可能导致不同的宿主微生物相互作用机制。
[0189]
值得注意且出人意料地,这些观察结果表明不同肽的抗微生物活性不适用于某一类细菌。作为实例,双歧杆菌菌株青春双歧杆菌和长双歧杆菌对所述肽高度敏感,而短双歧杆菌则不然。总的来说,上面提及的结果表明,帕内特细胞hd
‑
5的蛋白水解消化产生小的抗
微生物活性片段,从而调节共生肠道细菌。
[0190]
接下来,研究了针对病原性革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌(图4a和b)的抗微生物活性。在这里发现,与之前测试的共生细菌类似,所述片段具有抗微生物活性,但片段之间的抗微生物作用差异很大。出人意料地,观察到hd
‑
51‑9、hd
‑
51‑
13
、h0
‑57
‑
32
和hd
‑5fl
对每种测试的细菌的生长具有较强影响,而其他片段如hd
‑
51‑
28
、hd
‑510
‑
32
和hd
‑526
‑
32
就不同菌株而言仅具有最低限度的活性或更具选择性。相比之下,hd
‑514
‑
32
和hd
‑510
‑
27
在所测试的条件下针对测试的细菌无活性。令人感兴趣地,hd
‑510
‑
32
的活性限于两种革兰氏阳性细菌。与第一实验(图3)中描述的发现一致,并且就杀死共生体的效率而言,hd
‑
51‑9对所有测试的菌株都具有活性而与革兰氏菌状态无关,表明此特定片段对细菌屏障破坏具有高度保护。相比之下,除肺炎克雷伯氏菌3
‑
mrgn外,hd
‑
51‑
13
强有力地调控所测试的病原性细菌。总而言之,这些结果表明,帕内特细胞hd
‑
5而非hd
‑
6的蛋白水解消化导致产生大量短且具活性的抗微生物片段。这一出人意料的发现的意义可被证明非常重要,因为这些片段根据当地环境条件扩大了基于单一全长肽的抗微生物差异。
[0191]
hd
‑
5片段及其对抗生素耐药细菌的最小抑制浓度
[0192]
为了进一步研究这些片段用于潜在抗生素治疗用途的潜力,我们测量了我们的肽对不同抗生素耐药性革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌菌株的最小抑制浓度(mic)。先前描述的rda实验的结果表明对共生细菌和病原性细菌具有有前景的抗微生物活性。为了更详细地了解不同hd
‑
5片段的抗微生物能力,我们执行了浊度肉汤测定以确定这些肽的mic。将mic确定为在所有实验中12小时后检测不到细菌生长时的浓度。使用此参数,我们能够检测hd
‑
51‑9、hd
‑
51‑
13
、hd
‑
51‑
28
、hd
‑57
‑
32
和hd
‑510
‑
32
的抗微生物活性(参见以下表2)。
[0193]
表2:以μm和μg/ml计的hd
‑
5片段对病原性细菌的mic。每个实验进行至少三次。mic被确定为在每个实验中孵育12小时后没有任何细菌生长时的浓度。
[0194][0195]
将这些片段的mic(以μm为单位)与全长肽的mic(以μm为单位)进行比较,出人意料地,大多数防御素片段与全长肽一样具有活性。然而,当比较肽片段的μg/ml mic浓度时,它
们需要的μg/ml mic浓度更低,并且基于此浓度
‑
特别是hd
‑
51‑9比全长肽活性更高。值得注意地,除了hd
‑
51‑9对鲍氏不动杆菌4
‑
mrgn和屎肠球菌475747的mic外,所观察到的mic都相对较高,表明具有抗微生物活性的物质在肠屏障中的作用仅限于高浓度区域,如隐窝。为了阐明它们在体内的功能能力,我们的目的是研究它们的肠微生物组调节功能,特别是因为帕内特细胞天然地位于肠道中。
[0196]
通过对革兰氏阴性和阳性细菌以及念珠菌属物种(fejl!etbogmaerke kan ikke henvise til sig selv.)的最小抑制浓度来确定抗微生物活性以探究hd51‑9作用模式是否依赖于二硫键和电荷。因此,合成了hd51‑9的几种变体,包括将半胱氨酸用α
‑
氨基丁酸(abu)交换以及将精氨酸用瓜氨酸(cit)取代得到的变体。此外,测试了hd51‑9的反向(rgtrcycta)和随机(ctratycrg)氨基酸结构。hd51‑9对大肠杆菌bw25113显示出较强的杀菌作用,而hd51‑9对肠道沙门氏菌肠炎血清型变种的抗微生物活性较低。观察到反向变体rgtrcycta对这两种革兰氏阴性菌有类似的作用。
[0197]
如果所述序列是随机的并且当缺少半胱氨酸或精氨酸氨基酸时,hd51‑9变体出人意料地失去了它们的针对所测试的革兰氏阴性细菌的抗微生物活性。对于这两种葡萄球菌属物种,未测定到hd51‑9或其变体的杀菌作用。相比之下,hd51‑9对粪肠球菌显示出较强的细菌活性。然而,hd51‑9的半胱氨酸和精氨酸取代导致杀菌作用的完全消失,随机序列rgtrcycta和ctratycrg也是如此。与粪肠球菌不同,hd51‑9及其变体均未表现出针对屎肠球菌的杀菌作用。另外研究了在24小时后hd51‑9和变体对两种念珠菌属物种的抗微生物活性。对于显示出低抗微生物谱的热带念珠菌,可观察到对真菌生长的抑制。hd51‑9的半胱氨酸和精氨酸取代对真菌生长抑制没有影响。对于白色念珠菌观察到了类似的效应,而hd51‑9和变体未显示出抗微生物活性。总之,结果强烈强调了存在的半胱氨酸和精氨酸残基以及hd51‑9的原始氨基酸结构对于诱导抗微生物作用的重要性。
[0198]
下表3给出了hd51‑9对所测试细菌和念珠菌属物种的抗微生物活性。18小时或24小时后根据光密度确定不同浓度的hd51‑9对大肠杆菌bw 25113、肠道沙门氏菌肠炎血清型变种、金黄色葡萄球菌sa113、表皮葡萄球菌evans 1916、粪肠球菌atcc 19433、屎肠球菌atcc 19434、热带念珠菌atcc 4563和白色念珠菌atcc 10231的最小抑制浓度(mic)。给出了来自三个独立实验的结果:
[0199][0200]
下表4还给出了根据本发明的hnp
‑
4片段的作用。从此表可看出,根据本发明的hnp
‑
4肽片段显示出与hd
‑
51‑9肽相似的抗微生物行为。
[0201]
表4:下表4给出hd51‑9、hd51‑
9;mod
、hnp
‑
41‑
11
和hnp
‑
41‑
11;mod
对所测试的细菌和白色念珠菌的抗微生物活性。12小时后根据光密度确定不同浓度的肽对鲍氏不动杆菌4
‑
mrgn、鲍氏不动杆菌dsm30007、屎肠球菌475747、屎肠球菌dsm 20477、肺炎克雷伯氏菌3
‑
mrgn、肺炎克雷伯氏菌dsm 301404、铜绿假单胞菌4
‑
mrgn、铜绿假单胞菌atcc 27853、铜绿假单胞菌pao1、铜绿假单胞菌xpat1、铜绿假单胞菌xpat2、金黄色葡萄球菌usa300、金黄色葡萄球菌atcc 25923、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌bw 25113、小肠结肠炎耶尔森氏菌和白色念珠菌525l的最小抑制浓度(mic)。给出了来自三个独立实验的结果:
[0202][0203]
hd
‑
51‑9处理影响某些细菌属,但不影响微生物多样性。
[0204]
为了探究所鉴定的hd
‑
5片段的微生物组调节功能,将饲料喂养的小鼠用hd
‑
51‑9或pbs经口处理7天(7.19μg/小鼠),随后7天清除期。两组小鼠的微生物群组成在基线时无法区分(使用bray curtis距离的adonis permanova,p=0.22)。hd
‑
51‑9处理7天后,粪便样品中的整体微生物群组成与对照相比存在临界差异(使用bray curtis距离的adonis permanova,p=0.08),但与所述组的基线微生物群相比则没有此差异(使用bray curtis距离的adonis permanova,p=0.38,数据未示出)。由于hd
‑
5由小肠的帕内特细胞自然分泌,因此我们在尸检时探究了小肠的微生物群落。在7天清除期后与对照组相比,hd
‑
51‑9处理的小鼠未表现出小肠中微生物群落结构的统计学变化(使用bray curtis距离的adonis permanova,p=0.09,数据未示出)。该结果与初始实验一致,暗示hd
‑
51‑9尽管具有显著抗微生物功效,但出人意料地不会改变健康的饲料喂养小鼠的整体粪便微生物群组成(图12)。
[0205]
粪便微生物群组成的shannon多样性在基线时在所述组之间相等(wilcoxon检验,
p=1),并且在hd
‑
51‑9处理7天后(wilcoxon检验,p=0.18)以及在第14天清除期后(wilcoxon检验,p=0.07)仍然相似(数据未示出)。在第14天时,小肠微生物群的多样性在这两组之间同样相似(wilcoxon检验,p=0.45,图5b右),但在第7天则不如此,在第7天时,与媒介物管饲的对照小鼠相比,hd
‑
51‑9处理的小鼠出人意料地表现出增加的细菌多样性(p=0.004,数据未示出)。
[0206]
所述实验设计进一步允许利用对潜在共笼效应进行分层的线性混合模型以及从同一只小鼠的重复取样来对粪便样品进行配对分析。鉴定出hd
‑
51‑9对粪便样品中的一些低丰度微生物属具有显著影响。更具体地,观察到副萨特氏菌属和candidatus stoquefichus的相对丰度增加,而毛螺菌科的gca
‑
900066575和产氢厌氧杆菌属因hd
‑
51‑9处理而减少。艾克曼菌属(akkermansia)在粪便样品中因hd
‑
51‑9处理而呈边缘性增加(线性混合模型,p=0.0754,(数据未示出)),这证实了艾克曼菌属因hd
‑
51‑9处理而特异性地增加(线性混合模型,p=0.0748)的初步实验发现。尽管hd
‑
51‑9增加了艾克曼氏菌的相对丰度(线性混合模型,p=0.0085),但在第14天时,小肠微生物群在这两组之间大致相似,这与来自先前实验的结果相符(线性混合模型,p=0.017)。此外,瘤胃球菌科的瘤胃球菌属_1的相对丰度增加,而肠单胞球菌、梭菌科的asf356和瘤胃球菌科的瘤胃球菌科_ucg
‑
013的相对丰度下降(数据未示出)。
[0207]
综合起来,这些结果表明hd
‑
51‑9改变了粪便微生物群中某些低丰度细菌的量,出人意料地,而不影响健康的饲料喂养小鼠的整体群落结构或多样性。
[0208]
此外,还测试了嗜粘蛋白艾克曼菌在浊度肉汤测定中是否对hd
‑
51‑9敏感。研究发现表明,甚至小浓度的hd
‑
51‑9也会略微降低嗜粘蛋白艾克曼菌的生长,但不会杀死该细菌(图9b)。
[0209]
测试了hd51‑9的促炎和抗炎作用,并且尽管事实上抗炎作用低且具有降低ifn
‑
γ和il
‑
8的剂量依赖性趋势,但这在统计学上不显著,并且增加il
‑
10的剂量依赖性趋势在统计学上也不显著(图10)。
[0210]
hd51‑9的毒性作用也在许多体外实验中进行了测试(图11和12),但尽管hd51‑9是短的线性肽,但出人意料地未观察到毒性。
[0211]
大肠杆菌bw25113和金黄色葡萄球菌sa113的突变体中细胞壁靶标的鉴定
[0212]
使用大肠杆菌bw 25113和金黄色葡萄球菌sa113的细胞壁突变体鉴定了hd51‑9的作用模式。目的是分析细胞壁的哪些组分对hd51‑9的结合很重要,以及电荷是否起关键作用。如上文描述的那样执行浊度测定。通过测定mic来探究具有不同lps结构的大肠杆菌菌株(图16)。野生型大肠杆菌bw 25113以及大肠杆菌atcc 25922用作对照。最后一个含有与大肠杆菌bw 25113相似的细胞壁组成,但另外地o抗原因此具有全长lps。突变型大肠杆菌bw 25113
△
waag在内膜中含有与野生型相同的数量的磷酸酯残基,且因此具有相似的电荷,但缺失外核。突变体
△
waay包含外核,而内核中的一些磷酸酯残基缺失。最后一个大肠杆菌突变体
△
waap也具有外膜,但内膜中没有磷酸酯残基,导致内膜带有更多的正电荷
19
。
[0213]
分析了hd51‑9对不同大肠杆菌菌株和突变体的抗微生物活性。具有全长lps的大肠杆菌atcc 25922与缺乏o抗原的测试的大肠杆菌bw25113一样对hd51‑9高度敏感。为了阐明在hd51‑9与细菌细胞壁结合过程中外核的功能,使用了突变体
△
waag。mic的测定结果表明hd51‑9对
△
waag的抗微生物作用与对大肠杆菌atcc 25922和大肠杆菌bw25113的抗微生物
作用相似。出人意料地,缺少一个内核磷酸酯的大肠杆菌
△
waay和缺少两个内核磷酸酯的大肠杆菌
△
waap对hd51‑9的抗性并不更强。这一观察结果出人意料,因为已知阳离子抗微生物肽由于静电相互作用而与细胞壁中的阴离子磷脂相互作用。细胞壁内核中缺少这种负电荷通常会使得肽结合在细菌细胞壁上的能力降低。但是hd51‑9在大约12.5μm的浓度下出人意料地对所有描述的大肠杆菌突变体表现出杀菌作用。一种解释可能是抗微生物活性不仅取决于细胞壁的负电荷,而且革兰氏阴性细菌中必须存在额外的结合位点。
[0214]
探究了hd51‑9和变体对具有不同细胞壁突变的各种金黄色葡萄球菌sa113菌株的抗微生物活性(图17)。目的是研究hd51‑9如何能够与革兰氏阳性细菌的细胞壁结合,以及电荷是否对hd51‑9的抗微生物活性起决定性作用。
[0215]
第一突变体
△
dlta在肽聚糖层中不含d
‑
丙氨酸,导致肽聚糖层带有更多的负电荷
20
。突变体
△
mprf缺乏l
‑
赖氨酸,导致细胞膜带有更多的负电荷
21
。最后一个突变体
△
tarh另外含有壁磷壁酸,导致肽聚糖的增强
22
。
[0216]
hd51‑9未表现出对野生型金黄色葡萄球菌sa113的生长抑制,而含有带更多负电荷的肽聚糖层的金黄色葡萄球菌
△
dlta突变体对hd51‑9要敏感得多,显示出6.25μm的mic(图15)。hd51‑9也显示出对缺乏l
‑
赖氨酸的
△
mprf突变体的杀菌作用,这导致细菌细胞膜带更多负电荷。然而,由于金黄色葡萄球菌
△
tarh突变体中额外的磷壁酸所导致的肽聚糖层的增强出人意料地降低了hd51‑9的抗微生物作用。
[0217]
这些结果强调了细胞壁电荷对于hd51‑9与革兰氏阳性细菌结合的重要性,而细胞壁电荷对于与革兰氏阴性细菌的结合似乎不太重要。
[0218]
对hd51‑9和hd51‑9‑
二聚体对不同细菌的抗微生物活性的表征
[0219]
hd5具有使其能够形成二聚体的亮氨酸残基。对hd5的亮氨酸的取代导致其抗微生物活性和杀死微生物的能力下降,表明hd5的二聚化对其功能是重要的(rajabi等人,2008,2012;szyk等人,2006)
23
‑
25
。此外,由于二硫键或氢键,hd5的半胱氨酸残基能够组成二聚体。研究表明,hd5的半胱氨酸突变影响氧化折叠、抗菌活性、革兰氏阴性细菌膜渗透以及蛋白水解稳定性(wanniarachchi等人,2011)
26
。
[0220]
因此,我们可以合理地假设,由于半胱氨酸残基的存在,hd51‑9也能够形成二聚体。hd51‑9的两个单体通过二硫键连接,从而产生二聚化。目的是探究以二聚体形式构建的hd51‑9与以单体形式构建的hd51‑9相比对选定细菌的抗微生物活性。hlpc和质谱法将所述二聚体鉴定为具有2058的mw,与两个单体之间存在一个二硫键一致。
[0221]
在浊度测定中测定了对用针对hd51‑9的相同浓度处理的革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌物种)和革兰氏阴性细菌(沙门氏菌属物种)的最小抑制浓度。
[0222]
所进行的实验证实,hd51‑9对所测试细菌的的抗微生物活性出人意料地与其二聚体形式相似,或甚至更好。hd51‑9以及其二聚体形式对不同沙门氏菌属物种的抗微生物活性几乎相同(图18)。然而,出人意料地与单体形式的hd51‑9相比,二聚化的hd51‑9对金黄色葡萄球菌物种展现出的杀菌活性要好得多(图19)。这暗示了两种形式的hd51‑9的出人意料的不同作用模式。
[0223]
胰蛋白酶消化后新hnp
‑
4片段的鉴定
[0224]
将hnp
‑
4与2mm tcep一起孵育以打开二硫键,从而形成更易受蛋白水解消化物影响的线性结构。我们通过lc/ms方法分析了与胰蛋白酶一起孵育的被还原的hnp
‑
4,并且能
够检测到几个片段(图20a)。根据观察到的离子及其质荷比,我们能够清楚地鉴定这些片段,它们主要位于基于胰蛋白酶裂解位点的n末端区域。由于普遍认为amp的净电荷可对其抗微生物活性起重要作用,因此我们重点研究了具有+3正净电荷的hnp
‑
41‑
11
。
[0225]
hnp
‑
41‑
11
的抗微生物功效
[0226]
由于短线性肽的天然稳定性较弱,所以我们使用了hnp
‑
41‑
11
的另外的经修饰形式(hnp
‑
41‑
11mod
)。在此,我们将l
‑
氨基酸与d
‑
氨基酸交换并修饰了n
‑
末端(乙酰化)和c
‑
末端(酰胺化)。这两种修饰都应导致稳定性增加
27,28
,因此可能产生更强的抗微生物活性。为了分析hnp
‑4fl
、hnp
‑
41‑
11
和hnp
‑
41‑
11mod
的抗微生物活性,我们针对不同的共生细菌和病原性细菌的亚群使用rda。所有测试的肽都表现出对大多数测试的细菌的强抗微生物活性(图21)。虽然rda是用于测定不同肽的一般抗微生物活性的合适测定法,但根据不同的肽在琼脂糖凝胶中的不同能力(例如扩散)对它们进行比较是不可能的。我们因此接下来使用浊度肉汤测定来测定hnp
‑4fl
、hnp
‑
41‑
11
和hnp
‑
41‑
11mod
对病原性(一些多重耐药性)革兰氏阴性和阳性细菌以及一种真菌菌株的mic(表5)。虽然所有肽都展现出对所测试细菌的抗微生物活性(唯一的例外:hnp
‑4fl
展现出对肺炎克雷伯氏菌dsm30104的抗微生物活性),但hnp
‑
41‑
11
与hnp
‑4fl
的摩尔浓度出人意料地相等,表明产生hnp
‑4fl
的天然复合物的抗微生物功效仅依赖于前11个氨基酸(hnp
‑
41‑
11
)。要进一步指出的是,预计会表现出与未修饰型式相比增加的稳定性的这种线性片段,hnp
‑
41‑
11mod
具有增强的杀菌功效优于hnp
‑4fl
和hnp
‑
41‑
11
两者,mic比针对天然存在的全长肽所观察到的低几倍。因此,我们通过胰蛋白酶消化释放出全长肽的抗微生物活性,由此我们鉴定出了具有在摩尔水平上超过了全长肽的抗微生物潜力的显著抗微生物潜力的单个片段。出人意料地,我们观察到所述肽的抗微生物功效在多重耐药性菌株与非耐药性菌株之间同等地有效。因此,amp的蛋白水解消化可用于产生新的活性序列,这可能产生克服抗生素耐药性细菌的新策略。
[0227][0228]
hnp
‑
41‑
11
和hnp
‑
41‑
11mod
的细胞毒性和溶血作用
[0229]
为了确定hnp
‑
41‑
11
和hnp
‑
41‑
11mod
作为治疗剂在体内应用的潜力,我们使用了两种不同的细胞系来研究它们的细胞毒性能力。虽然我们仅观察到在较高肽浓度下对caco2/tc7细胞的轻微细胞毒性作用(图22a),但ht29 mtx e29细胞对这两种测试的肽衍生物更敏感(图22b)。重要地,在较低浓度下(例如12.5μm,在此情况下hnp
‑
41‑
11mod
具有强抗微生物作用),这些片段仅表现出适度的细胞毒性。我们另外检查了所述肽的溶血活性(图22c)。虽然hnp
‑
41‑
11mod
在150μm下具有20%的溶血作用(远远超过杀菌功效所需的最高浓度),但在≤18.75μm(即最高的生物相关浓度)时的毒性可忽略不计。因此,与在1.25μm下显示出80%的溶血作用的蜜蜂毒素蜂毒肽相比,hnp
‑
41‑
11
和hnp
‑
41‑
11mod
两者均具有低溶血活性。总之,所鉴定出的细胞毒性浓度的量级比相应的杀菌浓度高得多。
[0230]
总结
[0231]
在如上所呈现的研究和发明中,取得了关于α
‑
防御素及其对蛋白酶的敏感性的几个新发现。从hd
‑
6的经由电脑模拟的消化表明,相当出人意料的是hd
‑
6不受十二指肠液中天然存在的蛋白酶的影响。与hd
‑
6不同,hd
‑
5被降解,并且其片段出人意料地含有针对共生细菌和病原性细菌的抗微生物活性。
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