自组装肽纳米颗粒和其用途的制作方法

自组装肽纳米颗粒和其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年1月12日提交的美国临时专利申请62/791,795的优先权，所述美国临时专利申请的内容通过明确的引用以其整体具体地并入本文。
3.关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
4.不适用。
5.联合研究协议的缔约方名称
6.不适用。
技术领域
7.本公开涉及纳米颗粒，所述纳米颗粒包括：多个阳离子细胞穿透肽(cpp)，每个阳离子细胞穿透肽共价连接到疏水性治疗性肽，例如，抗原肽；以及任选的至少一或多种tlr(toll样受体)配体，所述tlr配体非共价结合到cpp连接的治疗性肽。cpp连接的治疗性肽的这种两亲性性质能够与带负电荷的核酸(如cpg、poly(i:c)、mrna、sirna和dna)和疏水性mpla在中性条件(ph＝7.0)下自组装形成纳米颗粒，但在酸性条件(ph<5)下被破坏。所得的含有cpp连接的治疗性肽和tlr配体或mrna的自组装纳米颗粒允许共同递送到抗原呈递细胞(apc)中用于有效呈递以激活t细胞，从而产生对癌症和其它疾病的强效免疫。因此，本公开还提供了用于通过采用cpp
‑
t细胞肽/tlr配体组装的纳米颗粒来治疗和/或预防癌症(包含各种肿瘤或感染性疾病)的方法。


背景技术：

8.1.癌症免疫疗法
9.癌症是美国和世界范围内的主要死亡原因，构成了重大公共健康问题。癌症免疫疗法一直是一种有前景的治疗癌症的方法(迪洛伦佐(di lorenzo)等人,2011；莱斯特休斯(lesterhuis)等人,2011；罗森伯格(rosenberg),2011；王(wang)和王(wang),2017)。若干基于免疫疗法的检查点阻断药物，如细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)单克隆抗体(ab)、伊匹单抗(ipilimumab)(yervoy)、程序性细胞死亡(pd)
‑
l ab、派姆单抗(pembrolizumab)(keytruda)已被美国食品药品监督管理局(fda)批准用于治疗许多类型的癌症(巴奇(bagcchi),2014；霍迪(hodi),2010；坎托夫(kantoff)等人,2010；本德(bender),2017)。此外，使用经t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)工程化的t细胞的基于细胞的免疫疗法已在血癌(如白血病和淋巴瘤)中示出有前景的临床应答。
10.尽管取得了这些快速进展，但大多数癌症患者通常对检查点阻断疗法没有应答。例如，大约20％的肺癌患者对免疫检查点疗法有应答。仅13％
‑
18％的乳腺癌和前列腺癌患者对免疫检查点疗法有应答(南达(nanda)等人,2016；权(kwon)等人,2014)。car
‑
t细胞免疫治疗技术在血癌中很有效(赛德莱恩(sadelain)等人,2017；约翰(johnson)和朱恩(june),2017)，但其在实体癌中效果不佳，这可能是由于肿瘤微环境中的免疫抑制引起的。最近的研究示出免疫检查点阻断疗法的临床有效性依赖于肿瘤组织中肿瘤反应性t细胞的
存在，并且与肿瘤浸润性t细胞、pd
‑
l1表达和突变负荷相关(夏尔马(sharma)等人,2017)。肿瘤组织缺乏肿瘤浸润性抗原特异性t细胞的癌症患者通常未能对免疫检查点疗法产生应答。为了克服这些问题，癌症疫苗可以增加肿瘤特异性t细胞以控制肿瘤。替代策略是过继性地转移肿瘤特异性t细胞，所述肿瘤特异性t细胞来源于癌症患者或者被工程化为在t细胞上表达肿瘤抗原特异性tcr或car。
11.使用癌症疫苗的免疫疗法提供了高肿瘤特异性细胞毒性的潜力，并且因此是非常有吸引力的癌症治疗方法。事实上，第一种治疗性癌症疫苗(西普鲁塞
‑
t(sipuleu
‑
cel
‑
t)；普列威丹德里昂(dendreon))于2010年被fda批准用于治疗转移性前列腺癌(坎托夫等人,2010)。然而，癌症疫苗通常仅获得有限的临床成功。即使对于fda批准的西普鲁塞
‑
t疫苗，也没有明显的临床应答，但与对照组相比，患者的存活期延长到4.1个月。用抗原肽或经抗原肽冲激的树突状细胞(dc)进行的疫苗接种可以产生抗肿瘤免疫，但未能产生足够的免疫应答，无法在所测试的若干种类型的癌症中获得显著的临床益处(梅莱罗(melero)等人,2014；罗森伯格(rosenberg)等人,2004)。单独的dc/肽或蛋白质疫苗可能不足强大以产生强效、持久的抗肿瘤应答(罗森伯格等人,2004)。
12.先前的研究已经示出，通过细胞穿透肽(cpp)共价键将如酪氨酸酶相关蛋白2(trp
‑
2)等癌抗原肽细胞内递送到dc中增强了抗原特异性t细胞应答和对抗癌症的抗肿瘤免疫，这主要是由于dc到t细胞的抗原呈递时间延长引起的(王和王,2002；王(wang)等人,2002)。基于这些临床前研究，启动了使用tat
‑
ny
‑
eso
‑
1肽的临床研究，并且发现此类肽疫苗是安全的，并且可以在被评估的9名前列腺癌患者中的6名中诱导抗原特异性t细胞应答，这与疫苗接种患者增加的psa两倍时间相关(松帕德(sonpavde)等人,2014)。然而，整体免疫应答太弱并且短暂，无法诱导癌症消退。因此，迫切需要新的策略来开发对抗癌症和其它疾病的更强效疫苗。
13.toll样受体(tlr)最近已作为先天免疫系统的重要组成部分而被知晓，其中tlr检测微生物感染并且激活dc成熟程序以诱导适应性免疫应答(伊瓦萨基(iwasaki)和麦哲托夫(medzhitov),2004；亚基拉(akira)和武田(takeda),2016)。用dc中的先天免疫受体(如tlr、nod样受体(nlr)和rig样受体(rlr))的对应配体触发所述先天免疫受体激活了核因子
‑
κb(nfκb)、i型干扰素(ifn)和炎性应答。这些信号传导途径产生促炎细胞因子并且诱导强烈的先天性和适应性免疫应答。将抗原与tlr配体一起施用可以增加抗原的免疫原性并且增加dc引发t细胞应答的能力(布兰德(blander)和麦哲托夫,2006；布兰德和麦哲托夫,2006)。用抗原肽和tlr配体加载dc在使用肽和tlr配体产生强烈的t细胞应答中可以是有效的(帕鲁卡(palucka)和邦舍罗(banchereau),2013)。
14.使用如多阶段载体(msv)等纳米技术可以将更多抗原加载到纳米脂质体或纳米颗粒内，并且与传统的dc疫苗相比，可以产生对抗乳腺癌的更强的抗肿瘤免疫(夏(xia)等人,2015)。在黑色素瘤中，发现癌抗原肽trp
‑
2必须与tlr配体(cpg和mpla)共同加载到msv中，并且然后被与疫苗相同的dc摄取(朱(zhu)等人,2018)。接种msv/trp
‑
2加载的dc与msvtlr配体加载的dc的混合物疫苗不会产生强效抗肿瘤免疫，从而表明肽与tlr配体的共同递送至关重要(朱等人,2018)。然而，尽管msv技术取得了进步，但基于dc/msv的疫苗接种可以将小鼠存活期延长的时间有限(10天)，从而进一步表明基于dc/msv的疫苗接种仅延迟肿瘤生
长，但不能产生足够的抗肿瘤免疫来完全消除肿瘤细胞。
15.基于这些研究，推断当前的疫苗策略未能产生足够的免疫来完全消除癌细胞。可替代地，肿瘤微环境中的免疫抑制抑制了由肽疫苗诱导的抗肿瘤免疫。为了理解为什么加载有cpp连接的治疗性肽的dc未能引发抗肿瘤免疫来根除癌症，发现cpp连接的治疗性肽促进了抗原肽向dc内的细胞内递送。类似地，cpp已被用于将不同的负荷物(包含蛋白质、dna、sirna和mrna)递送到细胞内，到靶细胞内。然而，发现cpp tat
‑
ny
‑
eso
‑
1肽难以与疫苗佐剂montanide isa
‑
51产生稳定乳液。tat
‑
ny
‑
eso
‑
1和montanide isa
‑
51的乳液滴剂在水中不稳定并且在短时间内扩散，这可能会影响疫苗效力。tat
‑
ny
‑
eso
‑
1和montanide isa
‑
51的这种不稳定性质促使发明人进一步研究如何克服这个问题。一个潜在的问题是cpp(即，tat)的(亲水性)正电荷可能会破坏cpp
‑
ny
‑
eso
‑
1和montanide isa
‑
51的乳液。
16.强效疫苗必须含有先天免疫信号传导组分。发明人和其合作者最近的研究示出，将抗原肽和tlr配体共同递送到相同的dc中对于产生强效且有效的免疫应答是必不可少的(朱等人,2018)。尽管基于msv的方法改善了抗原肽和基于核酸的tlr配体向相同dc的共同递送，因此增强了抗肿瘤免疫。然而，这种方法并没有解决基本问题，即，由于肽和带负电荷的核酸的疏水性，抗原肽与基于核酸的tlr3和tlr9配体不会形成复合物。
17.鉴于上述内容，需要用于癌症治疗性分子的改善的递送方法，所述癌症治疗性分子包含t细胞表位、b细胞表位、治疗性核酸分子和佐剂。
18.2.基于肽的自组装纳米结构
19.分子自组装是有序结构的自发形成，并且其是在热力学和动力学条件下由于特定的和局部的分子相互作用而发生的。氢键合、疏水相互作用、静电相互作用和范德华力相组合，使分子维持在稳定的低能状态。在纳米尺度和/或微尺度两者上发生形成分级结构的自缔合以实现这些能量极小值(韩(han)等人,2010)。
20.自组装在自然界中在蛋白质折叠、dna双螺旋形成和细胞膜形成期间自发发生(科罗利科夫(korolkov)等人,2013)。由于自组装纳米结构的生物相容性和“自下而上”制造的简易性(严(yan)等人,2010)，由如氨基酸等天然生物分子构建块制成的自组装纳米结构对于其合成自组装单层(sam)替代品是高度优选的(塔耶比
·
佐拉比(tayebe zohrabi)等人,2015)。
21.3.细胞穿透肽
22.细胞穿透肽(cpp)通常被描述为8
‑
30个氨基酸的短肽，能够穿透生物膜以触发各种生物分子穿过细胞膜进入细胞质中的移动并且改善其细胞内路线，由此促进与靶标的相互作用(参见例如，美国专利第9,598,465号)。cpp源自蛋白质或者源自嵌合序列，通常是两亲性的并且具有净正电荷(莫里斯(morris)等人,2008；汉森(hansen)等人,2008；海茨(heitz)等人,2009)。已经从蛋白质中鉴定了若干种cpp，包含人免疫缺陷病毒(hiv)的tat蛋白(弗兰克尔(frankel)和帕博(pabo),1988)、单纯疱疹病毒的vp22蛋白(艾略特(elliott)和奥黑尔(o'hare),1997；费伦(phelan)等人,1998)和成纤维细胞生长因子(林(lin)等人,1995；罗哈斯(rojas)等人,1998)。tat肽和膜转位序列(mts)已经用于在体外和体内两者将蛋白质转导到细胞内(法韦尔(farwell)等人,1994；金姆(kim)等人,1997；施瓦茨(schwarz)等人,1999；林格伦(lindgren)等人,2000)。
23.cpp可以被细分为两个主要类，第一类需要与负荷物化学连接，并且第二类涉及形
成稳定的非共价复合物。cpp已经用于将大量负荷物(质粒dna、寡核苷酸、sirna、pna、蛋白质、肽、脂质体、纳米颗粒)递送到各种细胞类型和体内模型内(莫里斯等人,2008；贝格斯(beggars)和萨根(sagan),2013；黄(huang)等人,2015；马库斯(marcus)等人,2016；格尔(gungor)等人,2014)。在这些情况下，cpp主要通过其膜转位能力将负荷物运送到细胞内(图1)。在这些应用中，没有与cpp共价连接的治疗性t细胞表位。因此，cpp不具有两亲性性质并且与cpp
‑
t细胞肽不同，所述cpp
‑
t细胞肽具有两亲性性质以与带负电荷的分子自组装成纳米颗粒。


技术实现要素：

24.本发明通过提供具有靶向递送系统的新型疫苗克服了现有技术中固有的这些和其它限制。公开了自组装纳米颗粒，其包括连接到一或多种疏水性治疗性肽配体(包含tlr(toll样受体)和抗原肽)的阳离子细胞穿透肽(cpp)群。所得纳米颗粒的两亲性性质(即，具有亲水性部分和疏水性部分两者)另外地促进包含一或多种治疗性mrna、sirna和/或dna分子。所得颗粒在中性ph下自组装，并且可以被递送到如树突状细胞等抗原呈递细胞(apc)内以呈递到t细胞，从而激活免疫系统，或者所述颗粒可以作为疫苗直接递送。
25.在特定实施例中，发明人已经证明各自共价连接到某种治疗性肽(例如，抗原肽，其优选地是疏水性的)的阳离子cpp可以形成紧密且小尺寸(50
‑
100nm)的自组装纳米颗粒，并且可以用于实现治疗性肽的有效细胞内递送。如带负电荷的分子(dna、dsrna、sirna或mrna)等其它组分可以被包含在纳米颗粒中，用于促进纳米颗粒形成和纳米颗粒跨细胞膜递送(图2)。所述纳米颗粒包括：(i)包括具有带有正电荷的肽的cpp的冠，所述cpp共价连接到具有优选的疏水性性质的治疗性肽，以及(ii)带负电荷的分子(dna、dsrna、sirna或mrna)加上如mpla等疏水性分子。基于电荷和疏水性性质，设计并开发了一种具有tlr配体[cpg和mpla，简称cm；cpg和mpla和poly(i:c)，简称cmi]的自组装cpp
‑
t细胞肽纳米颗粒的新技术，如图2a和图2b中示意性所示。两憎性或两亲性cpp
‑
治疗性肽通过电相互作用与带负电荷的cpg和/或poly(i:c)形成纳米颗粒，而通过所述颗粒内的疏水性与mpla形成纳米颗粒，所述cpp
‑
治疗性肽由具有带正电荷的肽并且共价连接到如ny
‑
eso
‑
1[sllmwitqcflpv(seq id no:l)]和trp
‑
2[syvdffvwl(seq id no:2)]等治疗性肽(通常疏水性)的如tat等cpp组成。
附图说明
[0026]
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
[0027]
以下附图形成本说明书的一部分，并且包含在内以展示本发明的某些方面。为了促进对本发明原理的理解，现在将参考附图中所展示的实施例或实例，并且将使用特定语言来描述它们。然而，应当理解，并非旨在限制本发明的范围。如本发明所涉及的领域的普通技术人员通常会想到的那样设想了所描述的实施例中的任何改变和进一步修改以及如本文所描述的本发明的原理的任何进一步应用。
[0028]
结合附图参考以下描述可以更好地理解本发明，其中相似的附图标记标识相似的元件，并且在附图中：
[0029]
图1展示了cpp起载剂的作用以将负荷物递送到细胞中；
[0030]
图2a和图2b示出了阳离子cpp
‑
t细胞表位肽具有两亲性性质以形成纳米颗粒并且递送到核内体中。图2a：阳离子cpp(正电荷)与t细胞表位肽(疏水性)共价连接以具有两亲性性质。cpg和poly(i:c)带负电荷，而mpla是疏水性的。cpp
‑
t细胞肽通过电相互作用与cpg和/或poly(i:c)形成纳米颗粒，而在颗粒内部通过疏水相互作用与mpla形成纳米颗粒。图2b：cpp
‑
肽/tlr配体纳米颗粒被dc或巨噬细胞摄取并且递送到核内体中，其中cpp
‑
肽/tlr配体颗粒在ph 4.0下被破坏。cpp
‑
肽由mhc i类或ii类分子加工并且呈递到t细胞，而tlr配体与tlr3、tlr4和tlr9结合以触发先天免疫应答和细胞因子产生，因此提高t细胞应答的效率和质量；
[0031]
图3a
‑
1、图3a
‑
2、图3b
‑
1、图3b
‑
2、图3c
‑
1和图3c
‑
2示出了tat
‑
trp2与cpg和mpla(简称cm)的自组装纳米颗粒。trp2本身不能与cpg和mpla形成颗粒。afm分析指示纳米颗粒横截面的大小；
[0032]
图4示出了tat
‑
trp2与tlr配体在不同比率下的自组装纳米颗粒的大小分布的dls测量。表3中列出了tat
‑
trp2和tlr配体的组合(不同比率)。灰色条指示具有大pdi(pdi>0.5)的不稳定/多分散复合物；
[0033]
图5示出了由tat
‑
trp2、cpg和mpla构成的tat
‑
trp2
‑
cm复合物在各种氮(+)与磷酸盐(
‑
)(n/p)比率下的ζ电位；
[0034]
图6a和图6b示出了tat
‑
trp2
‑
cm复合物的表征。在h2o中的tat
‑
trp2
‑
cm复合物的大小的dls测量(图6a)。在h2o中的tat
‑
trp2(或trp2
tat
)、cpg、mpla和tat
‑
trp2
‑
cm复合物的ζ电位(图6b)。pdi，多分散性指数；
[0035]
图7a、图7b、图7c、图7d、图7e和图7f示出了tat
‑
trp2和tat
‑
eso
‑
1与cpg和mpla的纳米颗粒(tat
‑
trp2
‑
cm，tat
‑
eso
‑1‑
cm)以及tat
‑
trp2和tat
‑
eso
‑
1与cpg、mpla和poly(i:c)的纳米颗粒(tat
‑
trp2
‑
cmi和tat
‑
eso
‑1‑
cmi)。tat
‑
trp2和tat
‑
eso
‑
1纳米颗粒的示意性呈现(图7a)。tat
‑
trp2和tat
‑
eso
‑
1与cm(图7b)或cmi(图7c和图7d)的纳米颗粒大小。图7e和图7f：tat
‑
trp2
‑
cm、tat
‑
trp2
‑
cmi、tat
‑
eso
‑
l
‑
cm和tat
‑
eso
‑1‑
cmi的ζ电位；
[0036]
图8a、图8b和图8c示出了tat
‑
trp2
‑
cm复合物在不同ph值下的表征。(图8a和图8b)在ph 7.0(图8a)和ph 4.0(图8c)磷酸钾缓冲液中tat
‑
trp2
‑
cm复合物的大小的dls测量。(图8c)在ph 7.0和ph 4.0磷酸钾缓冲液中tat
‑
trp2(或trp2
tat
)、cpg、mpla和tat
‑
trp2
‑
cm复合物的ζ电位。pdi，多分散性指数；
[0037]
图9a、图9b、图9c和图9d示出了tat
‑
trp2/tlr和tat
‑
eso
‑
1/tlr的组装和纳米颗粒是ph依赖性的。图9a示出了在ph 4
‑
7磷酸钾缓冲液中tat
‑
trp2
‑
cm复合物大小变化的dls测量。图9b是dc中tat
‑
trp2或tat
‑
trp2
‑
cm复合物摄取和ph依赖性复合物分解过程的示意性图示。图9c和图9d示出了在ph 7和ph 4磷酸钾缓冲液中tat
‑
trp2
‑
cm(图9c)、tat
‑
eso
‑1‑
cm、tat
‑
trp2
‑
cmi(图9d)和tat
‑
eso
‑1‑
cmi复合物大小变化的dls测量；
[0038]
图10示出了用于刺激先天免疫应答和细胞因子产生的tlr配体的组合。将骨髓源性dc分离并且然后用不同的tlr配体(单独一种)、双重或三重组合进行处理。通过elisa测定细胞上清液中细胞因子(tnf
‑
α、il
‑
6、ifn
‑
α和ifn
‑
β)的产生。poly(i:c)/cpg、cpg/mpla双重组合和cpg/poly(i:c)/mpla三重组合在触发先天免疫细胞因子产生方面比其它组更强；
[0039]
图11示出了接种dc/tat
‑
trp2
‑
cm和dc/trp2
‑
cm疫苗的c57bl/6小鼠中b16肿瘤的肺转移模型。在第0天将b16肿瘤细胞(0.2
×
106个细胞/小鼠)注射(静脉内)到c57bl/c小鼠中，并且在第5天接种dc/tat
‑
trp2
‑
cm、dc/trp2
‑
cm或dc/β
‑
gal
‑
cm(5
×
106个细胞/小鼠)疫苗。在第18天处死小鼠。对肺转移数量进行计数；
[0040]
图12a、图12b和图12c示出了在各种疫苗接种后携带b16的c57bl/6小鼠的肺转移和存活率。图12a示出了肿瘤模型和疫苗计划。在图12b中，在第0天将b16肿瘤细胞(0.2
×
106个细胞/小鼠)注射(静脉内)到c57bl/c小鼠中，并且在第5天向所述小鼠注射5个不同疫苗组(5
×
106个细胞/小鼠)。在第18天处死所有小鼠。对肺转移数量进行计数。图12c示出了b16注射和疫苗与图12b中的相同。监测接种了不同组疫苗的携带b16的小鼠的存活率，持续55天。误差条表示标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
[0041]
图13a和图13b示出了dc/tat
‑
eso
‑
cm和tat
‑
eso
‑
cmi疫苗产生强大的抗肿瘤免疫。在第0天向hla
‑
a2 tg小鼠注射rm1/a2
‑
eso
‑
1肿瘤细胞。用疫苗(dc/对照、dc/tat
‑
eso
‑
cm或dc/tat
‑
eso
‑
cmi)处理携带肿瘤的小鼠。每两天监测肿瘤生长。图13a示出了第15天的肿瘤大小。图13b示出了肿瘤生长曲线。指示了不同组之间的p值；
[0042]
图14a和图14b示出了接种了dc/对照、dc/tat
‑
eso
‑
cm或dc/tat
‑
eso
‑
cmi疫苗的小鼠中的t细胞应答(图14a)。图14b示出了cd8
+
ct细胞中ifn
‑
γ％；
[0043]
图15示出了dc/tat
‑
eso
‑
cm疫苗接种后乳腺癌生长的显著抑制。在第0天向hla
‑
a2 tg小鼠注射e0771/a2
‑
eso
‑
1肿瘤细胞。用dc/对照或dc/tat
‑
eso
‑
cm处理携带肿瘤的小鼠。每两天监测肿瘤生长。接种dc/tat
‑
eso
‑
cm疫苗显著地抑制了乳腺癌生长；
[0044]
图16a、图16b和图16c示出了与dc/tat
‑
eso
‑
cmi疫苗接种相比，使用tat
‑
eso
‑
cmi的直接免疫产生了强效治疗性抗肿瘤免疫。在图16a中，在第0天向hla
‑
a2 tg小鼠注射rm1/a2
‑
eso肿瘤细胞，然后在第10天、第13天和第18天注射tat
‑
eso
‑
cmi三次或在第10天接种dc/tat
‑
eso
‑
cmi疫苗。每两天监测肿瘤生长。在图16b中，示出了每组的肿瘤大小。在图16c中，记录了疫苗接种后三个组的肿瘤生长。示出了各组之间显著性的p值；
[0045]
图17a、图17b、图17c和图17d示出了乳腺癌样品和细胞系中的ct83表达。图17a示出了ct83表达乳腺癌细胞系的rf
‑
pcr分析。图17b示出了使用rt
‑
pcr分析的乳腺癌样品中的ct83的表达。ny
‑
eso
‑
1用作阳性对照。图17c是使用抗ct83抗体对乳腺癌细胞系进行的蛋白质印迹分析。图17d中示出了针对ct83表达的正常组织和乳腺癌组织的抗体染色。
[0046]
图18a和图18b示出了肺癌样品和细胞系中的ct83表达。图18a示出了ct83表达肺癌细胞系和癌样品的rf
‑
pcr分析。图18b示出了使用抗ct83抗体对肺癌细胞系中的ct83表达进行的蛋白质印迹分析。mda
‑
468用作阳性对照；
[0047]
图19a、图19b、图19c和图19d示出了使用具有cmi的自组装tat
‑
ct83肽纳米颗粒产生cd83特异性t细胞。图19a示出了从经tat
‑
ct83
‑
cmi免疫的小鼠的脾细胞释放的ifn
‑
γ的细胞内染色。图19b示出了通过elisa的ifn
‑
γ释放测定。图19c示出了在一个培养周期后t细胞对ct83肽的应答。图19d示出了ct83
‑
a2限制性肽t细胞克隆的建立；
[0048]
图20a、图20b、图20c和图20d示出了tat
‑
ct83
‑
cmi疫苗对eo771
‑
a2
‑
ct83乳腺癌产生了强效抗肿瘤免疫。(图20a)hla
‑
a2转基因小鼠中e0771
‑
a2
‑
ct83乳腺癌模型建立方案以及疫苗接种方案。(图20b)在单独使用所指示疫苗调配物或连同抗pd1阻断疗法(10mg/kg bw，腹膜内)进行2次免疫后eo771
‑
a2
‑
ct83乳腺肿瘤的图像。(图20c)在第16天分离来自在
使用或不使用抗pd1抗体的情况下接种所指示调配物疫苗的小鼠的肿瘤并测量所述肿瘤的重量。(图20d)在有或没有tat
‑
ct83
‑
cmi疫苗接种的情况下肿瘤位点的cd3
+
t细胞浸润的免疫组织化学染色；
[0049]
图21a、图21b、图21c和图21d示出了接种tat
‑
eso
‑
cmi疫苗产生对抗乳腺癌的强效治疗性免疫。(图21a)疫苗实验设计的示意性呈现。(图21b)示出了每组中hla
‑
a2 tg小鼠的肿瘤生长。(图21c)小鼠和肿瘤大小的图像。(图21d)接种不含dc的tat
‑
eso
‑
cmi疫苗显著抑制了肿瘤生长。*p<0.05，**p<0.01；
[0050]
图22a、图22b和图22c示出了单独的或与抗pd
‑
1疗法组合的tat
‑
trp2
‑
cmi疫苗。(图22a和图22b)接受单独的或与抗pd
‑
1处理组合的tat
‑
trp
‑
2/cmi疫苗接种的小鼠的肺图像和肺转移数量。(图22c)单独的或与抗pd
‑
1疗法组合的tat
‑
trp
‑
2/cmi疫苗接种后的小鼠存活率；
[0051]
图23a和图23b示出了单独的或与抗pd
‑
1疗法组合的tat
‑
eso
‑
cmi疫苗。(图23a)与对照组相比，接受单独的或与抗pd
‑
1处理组合的tat
‑
eso
‑
cmi疫苗接种的hla
‑
a2
‑
tg小鼠中rm1/a2
‑
eso肿瘤细胞的肿瘤图像。(图23b)与对照组相比，单独的或与抗pd
‑
1疗法组合的tat
‑
eso
‑
cmi疫苗接种后的肿瘤生长曲线；
[0052]
图24a和图24b示出了tcr
‑
t细胞转移以及随后的sapnano疫苗扩增了肿瘤浸润性t细胞并且显著地抑制了肿瘤生长。(图24a)不同处理组中的肿瘤生长。*p值<0.05。(图24b)单独的或与tat
‑
eso
‑
cmi疫苗组合的a2
‑
eso tcr
‑
t细胞后，肿瘤浸润性a2
‑
eso tcr
‑
t细胞的百分比增加。使用在抗cd3阳性t细胞上进行年代测定的抗tcr人vβ13抗体检测a2
‑
eso tcr
‑
t细胞。使用抗tcr人vβ13抗体检测不到tat
‑
eso
‑
cmi疫苗诱导的内源性t细胞；并且
[0053]
图25a、图25b、图25c、图25d和图25e示出了ny
‑
eso tcr
‑
t疗法与tat
‑
eso
‑
cmi疫苗接种的组合在人源化nsg小鼠模型中产生了强烈的抗肿瘤应答。(图25a)动物实验的示意图。在肿瘤温育前3到4周，通过静脉内注射1
×
107人pbmc以重建人免疫系统来对3到4周龄nsg小鼠进行人源化。将hla
‑
a2和ny
‑
eso阳性人乳腺癌细胞(mda
‑
mb
‑
231
‑
a2
‑
eso)皮下注射到人源化的nsg小鼠的脂肪垫(100万/小鼠)。在第5天用ny
‑
eso tcr
‑
t细胞处理携带肿瘤的小鼠。三剂人il2(50000iu)和4剂tat
‑
eso
‑
cmi疫苗通过静脉内注射施用。在第30天处死小鼠。(图25b)通过facs在人源化3周后的nsg小鼠中检测到人淋巴细胞。(图25c)处理后监测肿瘤生长。数据表示为平均值
±
sem。pbs对照组(n＝4)，其它组(n＝5)，双因素anova测试用于统计分析。*p<0.05，**p<0.01。(图25d和图25e)在从小鼠分离后对肿瘤重量进行成像和称重。(平均值
±
sem，t测试用于统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)
[0054]
序列简要说明：
[0055]
seq id no:1是根据本公开的一个方面使用的示范性治疗性ny
‑
eso
‑
1特异性肽；
[0056]
seq id no:2是根据本公开的一个方面使用的示范性治疗性trp
‑
2特异性肽；
[0057]
seq id no:3是根据本公开的一个方面使用的示范性hiv tat 47
‑
57特异性细胞穿透肽序列；
[0058]
seq id no:4是根据本公开的一个方面使用的示范性tat
‑
ptd
‑
4特异性细胞穿透肽序列；
[0059]
seq id no:5是根据本公开的一个方面使用的示范性tat
‑
ptd
‑
5特异性细胞穿透肽序列；
[0060]
seq id no:6是根据本公开的一个方面使用的示范性dpv3特异性细胞穿透肽序列；
[0061]
seq id no:7是根据本公开的一个方面使用的示范性dpv6特异性细胞穿透肽序列；
[0062]
seq id no:8是根据本公开的一个方面使用的示范性dpv7特异性细胞穿透肽序列；
[0063]
seq id no:9是根据本公开的一个方面使用的示范性九残基聚精氨酸细胞穿透肽序列；
[0064]
seq id no:10是根据本公开的一个方面使用的示范性九残基聚赖氨酸细胞穿透肽序列；
[0065]
seq id no:11是根据本公开的一个方面使用的示范性fhv外壳特异性细胞穿透肽序列；
[0066]
seq id no:12是根据本公开的一个方面使用的示范性信号肽ii特异性细胞穿透肽序列；
[0067]
seq id no:13是根据本公开的一个方面使用的示范性两亲性模型肽特异性细胞穿透肽序列；
[0068]
seq id no:14是根据本公开的一个方面使用的示范性hsv vp22特异性细胞穿透肽序列；
[0069]
seq id no:15是根据本公开的一个方面使用的示范性肽载剂特异性细胞穿透肽序列；
[0070]
seq id no:16是根据本公开的一个方面使用的示范性cl22特异性细胞穿透肽序列；
[0071]
seq id no:17是根据本公开的一个方面使用的示范性trp
‑
2特异性细胞穿透肽序列；
[0072]
seq id no:18是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽；
[0073]
seq id no:19是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽；
[0074]
seq id no:20是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽；
[0075]
seq id no:21是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽；
[0076]
seq id no:22是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽；
[0077]
seq id no:23是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽；并且
[0078]
seq id no:24是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽。
[0079]
seq id no:25是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽；
[0080]
seq id no:26是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽；
[0081]
seq id no:27是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽；并且
[0082]
seq id no:28是根据本公开的一个方面使用的示范性tat连接的肽。
具体实施方式
[0083]
下面描述了本发明的说明性实施例。为清楚起见，在本说明书中未描述实际实施方案的所有特征。当然应当理解，在任何此类实际实施例的开发中，必须作出许多实施方案
特定的决策以实现开发者的具体目标，如遵守与系统相关的和与商业相关的约束，所述约束将因实施方案而不同。此外，应当理解，此类开发努力可能是复杂且耗时的，但是其对于受益于本公开的本领域普通技术人员来说将是例行工作。
[0084]
因此，在第一方面，本发明提供了包括各自共价连接到疏水性治疗性肽的多个阳离子cpp的纳米颗粒，所述纳米颗粒在中性条件下(例如，在ph 7.0下)自组装，并且在酸性条件下(例如，在ph 4.5下)解离(图2a和图2b)。
[0085]
在一些实施例中，阳离子cpp选自由以下组成的组：tat、tat
‑
ptd
‑
4、tat
‑
ptd
‑
5、dvp3、dvp6、dvp7、聚精氨酸(r9)、聚赖氨酸(k9)、fhv外壳、信号肽i、信号肽ii、pres、转运素(transportan)、两亲性模型肽、hsv vp22和cl22。在一些实施例中，阳离子cpp由8
‑
30个氨基酸组成。在一个实施例中，阳离子cpp是tat。
[0086]
在一些实施例中，治疗性肽是抗原肽或含有t细胞表位的非免疫原性肽。在一些实施例中，t细胞表位是肿瘤特异性表位或病原体特异性表位。在一些实施例中，治疗性肽由9
‑
25个氨基酸组成。抗原肽或含有t细胞表位的非免疫原性肽涉及如肿瘤等特定疾病和感染性疾病。
[0087]
本发明的纳米颗粒可以进一步包括至少一种非共价结合到cpp的带负电荷的分子，优选地带负电荷的tlr配体。在一些实施例中，带负电荷的分子是cpg寡脱氧核苷酸、poly(i:c)或其组合。在一些实施例中，cpg寡脱氧核苷酸的长度为20
‑
24bp。在一些实施例中，poly(i:c)的长度为0.2kb到1kb。
[0088]
本文公开的纳米颗粒还可以携带至少一种非共价结合到治疗性肽的疏水性分子，优选地疏水性tlr配体。在一些实施例中，疏水性分子是单磷酰脂质a(mpla)、r848或其组合。
[0089]
本文公开的纳米颗粒可以被细胞摄取。在一些实施例中，含有抗原肽或具有t细胞表位的非免疫原性肽的纳米颗粒可以被apc——尤其是dc或巨噬细胞——在体外和在体内摄取。在一些实施例中，tlr配体激活一或多个tlr信号传导途径。
[0090]
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括本发明的纳米颗粒和优选地约ph 7.0的药学上可接受的载剂。
[0091]
在第三方面，本公开还提供了用于产生上述纳米颗粒的组合物，所述组合物包括各自共价连接到疏水性治疗性肽的阳离子cpp以及任选的至少一种带负电荷的分子和/或至少一种疏水性分子。
[0092]
在纳米颗粒施用之前，组合物中的组分可以在约ph 7.0的介质中混合。纳米颗粒在介质中自组装，通过内吞作用在体外被apc摄取，并且然后用于疫苗。可替代地，可以制备自组装纳米颗粒，并且递送到动物内，自组装纳米颗粒在动物体内被dc或巨噬细胞摄取。无论dc或巨噬细胞在体外或在体内摄取纳米颗粒，自组装纳米颗粒都将进入核内体或溶酶体，在所述核内体或溶酶体处，纳米颗粒将在ph 4.5下被破坏；cpp连接的肽和tlr配体被释放。当核内体定位的tlr3、tlr7、tlr8和tlr9结合到tlr配体以触发先天免疫信号传导时，cpp连接的肽将结合到核内体中的mhc ii类分子以进行加载和呈递，或穿过核内体膜进入细胞质、er和高尔基体(golgi)中以用于抗原加工并由mhc i类分子将抗原呈递给t细胞。
[0093]
在一些实施例中，阳离子cpp选自由以下组成的组：tat、tat
‑
ptd
‑
4、tat
‑
ptd
‑
5、dvp3、dvp6、dvp7、聚精氨酸(r9)、聚赖氨酸(k9)、fhv外壳、信号肽i、信号肽ii、pres、转运
素、两亲性模型肽、hsv vp22和cl22。在一些实施例中，阳离子cpp由8
‑
30个氨基酸组成。在一个实施例中，阳离子cpp是tat。在一些实施例中，治疗性肽是抗原肽或含有t细胞表位的非免疫原性肽。在一些实施例中，t细胞表位是肿瘤特异性表位或病原体特异性表位。在一些实施例中，治疗性肽由mhc i类分子呈递的8个、9个、10个或11个氨基酸或mhc ii类分子呈递的9
‑
25个氨基酸组成。抗原肽或含有t细胞表位的非免疫原性肽涉及如肿瘤等特定疾病和感染性疾病。
[0094]
在一些实施例中，带负电荷的分子是带负电荷的tlr配体。在一些实施例中，带负电荷的分子是cpg寡脱氧核苷酸、poly(i:c)或其组合。在一些实施例中，cpg寡脱氧核苷酸的长度为15bp到24bp。在一些实施例中，poly(i:c)的长度为0.2kb到1kb。在一些实施例中，疏水性分子非共价地是疏水性tlr配体。在一些实施例中，疏水性分子是单磷酰脂质a(mpla)、r848或其组合。
[0095]
在第四方面，本公开提供了一种用于治疗、预防和/或改善癌症或感染性疾病的至少一种症状的方法。从总体和一般意义上讲，所述方法通常包括向有需要的受试者提供治疗有效量的包括本文所公开的纳米颗粒的药物调配物。
[0096]
在一些实施例中，癌症可以是危险的肿瘤，并且此类肿瘤在组成上可以是实体的或非实体的，这取决于特定疾病。在某些实施例中，要治疗的癌性肿瘤是原发性肿瘤或转移性肿瘤，如但不限于一或多种黑色素瘤或肺癌。
[0097]
在其它实施例中，可以设想治疗疾病，特别是例如治疗一或多种病毒、真菌和/或细菌感染。
[0098]
纳米颗粒中含有t细胞表位的抗原肽或非免疫原性肽被apc尤其dc或巨噬细胞加工并且通过新合成的mhc ii类分子长时间呈递到t细胞。纳米颗粒中含有的tlr配体刺激dc或免疫细胞产生先天免疫应答，如释放i型干扰素细胞因子，以增强dc将表位呈递到t细胞以及共刺激t细胞进行活化的能力，以及细胞因子对t细胞生长和扩增的刺激。
[0099]
本文所公开的纳米颗粒能够增强抗原肽或含有t细胞表位的非免疫原性肽与两个或两个以上tlr配体共同递送到相同的如dc或巨噬细胞等抗原呈递细胞内，从而产生强效且有效的免疫应答。所产生的如抗肿瘤作用或抗病原体作用等作用可以优于其它一些递送平台，例如，msv。
[0100]
本公开的其它目的、特征和优点将从以下详细描述中变得清楚。然而，应当理解尽管详细描述和具体实例表示本发明的优选实施例，然而它们仅以说明的方式给出，因为根据此详细描述，处于本发明的精神和范围内的不同变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见的。
[0101]
药物调配物
[0102]
在某些实施例中，本公开涉及以药学上可接受的调配物的形式制备的自组装纳米颗粒组合物，所述自组装纳米颗粒组合物用于单独地或与一或多种其它诊断、预防和/或疗法方式组合施用于动物的一或多种细胞或组织。药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的调配物是本领域的普通技术人员熟知的，开发在多种治疗、预防、诊断和预后方案中使用本文所描述的自组装纳米颗粒组合物的适合的剂量和治疗方案也是本领域普通技术人员熟知的。
[0103]
在某些情况下，期望通过一或多种标准递送装置向动物体的身体内或周围的一或多种细胞、组织或器官递送含所公开的自组装纳米颗粒组合物的适当调配的药物媒剂，所
述标准递送装置包含但不限于皮下、肠胃外、静脉内、肌肉内、鞘内、瘤内、腹膜内、经皮、局部、通过口服或经鼻吸入，或通过直接注射。
[0104]
施用方法还可以包含美国专利第5,543,158号、第5,641,515号和第5,399,363号中描述的那些方式，所述美国专利中的每个专利以全文明确引用的方式并入本文。呈游离碱或药学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液可以在无菌水中制备，并且可以适当地与一或多种表面活性剂如羟基丙基纤维素混合。还可以在甘油、液体聚乙二醇、油或其混合物中制备分散体。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有防止微生物生长的防腐剂。
[0105]
对于可注射水溶液的施用，不限于的是，如果需要，所述溶液可以被适合地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下(subcutaneous)、经皮、皮下(subdermal)和/或腹膜内施用。在这方面，本发明的组合物可以在一或多种药学上可接受的媒剂中调配，所述媒剂包含例如无菌水性介质、缓冲液、稀释剂等。例如，可以将给定剂量的活性成分溶解在特定体积的等渗溶液(例如，等渗的nacl基溶液)中，并且然后在建议的施用位点注射，或者进一步在适用于静脉内输注的媒剂中稀释(参见例如，“雷明顿药物科学(remington's pharmaceutical sciences)”第15版,第1035
‑
1038页和第1570
‑
1580页)。虽然剂量的某种变化必然会根据正在治疗的受试者的病状、治疗程度和施用位点而发生，负责施用的人员仍将能够使用医学和制药领域的普通知识确定适合于个体受试者的正确剂量方案。
[0106]
可以通过将所公开的自组装纳米颗粒组合物以所需的量根据需要与以上枚举的若干种其它成分一起掺入适当的溶剂中、然后进行过滤灭菌来制备无菌可注射组合物。通常，可以通过将所选的灭菌的活性成分掺入无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质和来自上文枚举的那些的所需其它成分。本文公开的自组装纳米颗粒组合物还可以以中性或盐形式调配。
[0107]
药学上可接受的盐包含酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且药学上可接受的盐与如不限于盐酸或磷酸等无机酸或如不限于乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸等形成。与游离羧基形成的盐还可以源自如不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等无机碱和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等有机碱。在调配后，溶液将以与剂量调配物相容的方式施用，并以对预期应用有效的量施用。本发明的化合物的调配物可以以各种剂型施用，如可注射溶液、局部制剂、口服调配物，包含缓释胶囊、水凝胶、胶体、粘性凝胶、经皮试剂、鼻内调配物和吸入调配物等。
[0108]
本文公开的自组装纳米颗粒组合物的量、剂量方案、调配物和施用将在受益于本教导的普通技术人员的能力范围内。然而，很可能可以通过单次施用来实现诊断有效(即，药学上有效)量的一或多种所公开的组合物的施用，如不限于单次注射足够量的所递送的药剂以向有需要的患者提供期望的益处。可替代地，在一些情况下，可能期望的是，在相对较短或甚至相对较长的时间段内提供所公开的自组装纳米颗粒组合物的多次或连续施用，这可以由监督向所选的接受此类程序、治疗、疗法或诊断的个体施用此类组合物的医疗从业者确定。
[0109]
通常，本文所描述的自组装纳米颗粒组合物中的一或多种自组装纳米颗粒组合物的调配物将含有至少有效量的第一活性剂。优选地，所述调配物可以含有至少约0.001％的每种活性成分，优选地至少约0.01％的活性成分，但是活性成分的百分比当然可以变化，并
且按总调配物计，可以方便地以约0.01到约90重量％或体积％，或约0.1到约80重量％或体积％，或更优选地约0.2到约60重量％或体积％的量存在。自然地，每种组合物中的活性成分的量可以是以这样的方式来制备，所述方式使得在化合物的任何给定的单位剂量中将获得适合的剂量。制备此类药物调配物的本领域的普通技术人员将设想如溶解度、生物利用度、生物t
1/2
、施用途径、产品保质期以及其它药理学考虑因素等因素，并且如此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。
[0110]
虽然设想了全身施用在本发明的许多实施例中是有效的，但也设想了本文公开的调配物适合直接注射到体内的一或多种器官、组织或细胞类型内。例如可以使用相关医学肿瘤学领域的普通技术人员已知的合适手段将所公开的纳米颗粒直接施用到体内特定的谨慎位置，或直接施用到肿瘤、肿瘤干细胞、癌性组织和/或癌干细胞。
[0111]
包括本文公开的自组装纳米颗粒组合物中的一或多种自组装纳米颗粒组合物的药物调配物可以进一步包括特别调配用于与哺乳动物细胞并且特别是人细胞接触和/或用于向如人类患者等哺乳动物受试者施用的一或多种赋形剂、缓冲液或稀释剂。组合物可以进一步任选地包括一或多种诊断剂或预后剂，和/或可以与另外的微球群、微颗粒群、纳米球群或纳米颗粒群一起调配，或者可以被调配成含有一或多种另外的治疗剂和/或诊断剂，可用于向哺乳动物患者(以及尤其是人类患者)的一或多种细胞、组织、器官或身体施用。
[0112]
药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的调配物是本领域的技术人员熟知的，开发以多种方式(包含例如不限于口服、肠胃外、静脉内、鼻内、瘤内和肌肉内施用途径)使用本文所描述的特定自组装纳米颗粒组合物的适合的剂量、诊断和/或治疗方案也是本领域的技术人员熟知的。
[0113]
所采用的自组装纳米颗粒组合物的特定量以及采用所公开的调配物的组合物的特定施用时间或剂量方案将在受益于本教导的本领域普通技术人员的能力范围内。然而，很可能可以通过在有效地为接受此类治疗的患者提供期望益处的时间期间施用一或多剂调配物来实现所公开的调配物的施用。此类剂量方案可以由监督化合物施用的医疗从业者确定，这取决于特定病状或患者、所施用疗法的程度或持续时间等。
[0114]
包括一或多种如本文公开的自组装纳米颗粒组合物的药物调配物不以任何方式限于仅用于人类，或甚至灵长类动物或哺乳动物。在某些实施例中，可以使用鸟、两栖动物、爬虫类或其它动物物种来采用本文公开的方法和组合物。然而，在优选实施例中，本公开的组合物优选地被调配成用于在用于诊断、改善和/或治疗患者体内的一或多种疾病并且特别是用于治疗一或多种类型的肿瘤或癌细胞或用于治疗一或多种感染的各种方案中向哺乳动物并且特别是向人类施用。如上所述，此类组合物不仅限于用于人类，还可以被调配成用于包含但不限于对所选的牲畜、外来种或家养动物、伴侣动物(包含宠物等)、非人灵长类动物以及动物标本或其它圈养标本等的兽用施用。
[0115]
用于制备药物的组合物
[0116]
本发明的另一个重要方面涉及用于在制备用于预防、诊断、治疗和/或改善动物(包含例如脊椎动物哺乳动物)的一或多种疾病、功能障碍、异常病状或病症的一或多种症状的药物中使用所公开的自组装纳米颗粒组合物(以及包含其的调配物)的方法。特别设想了使用所公开的自组装纳米颗粒组合物来用于癌症的诊断和/或预后、癌症转移的检测和/或预测，或用于监测其程度和/或用于治疗一或多种异常病状，如在体内、离体和/或原位治
疗一或多种癌细胞类型。
[0117]
这种使用通常涉及以足够的量向有需要的哺乳动物施用所公开的包括至少第一活性剂的自组装纳米颗粒组合物中的一或多种自组装纳米颗粒组合物并持续足够的时间，以诊断、治疗、减轻或改善受感染哺乳动物中肿瘤形成或癌生长和/或转移的一或多种症状。包含所公开的自组装纳米颗粒组合物中的一或多种自组装纳米颗粒组合物的药物调配物也形成本公开的一部分，并且特别是那些进一步包含至少第一药学上可接受的赋形剂的用于受感染哺乳动物的癌症的一或多种症状的疗法和/或改善的组合物。
[0118]
自组装纳米颗粒
[0119]
本公开描述了使用阳离子细胞穿透肽(各自共价连接到疏水性治疗性肽，以及任选地至少一种带负电荷的分子和/或至少一种疏水性分子)来形成纳米颗粒。所得纳米颗粒具有：(i)包括疏水性治疗性肽和任选的疏水性分子的核，和(ii)包括cpp和任选的带负电荷的分子的冠。
[0120]
带负电荷的分子可以是tlr配体，如cpg寡脱氧核苷酸、poly(i:c)、dna和rna(mrna或sirna)。疏水性分子可以优选地是疏水性tlr配体，其可以是单磷酰脂质a(mpla)或r848。
[0121]
虽然不希望受任何理论束缚，但据信由于治疗性肽(和任选的疏水性分子)的疏水性以及cpp的亲水性、通过带正电荷和带负电荷的分子的电键，自组装发生在约ph 7.0的水溶液中。
[0122]
用于形成本发明的纳米颗粒的组分的量可以由本领域技术人员确定。在较多带负电荷的分子的情况下，较多的cpp将参与纳米颗粒形成。并且由于不同的ζ电位，一些组分的量变化可以改变纳米颗粒的大小和形状以及体内生物分布。
[0123]
在一个实施例中，已经设计并合成了阳离子cpp(带正电荷)
‑
抗原肽或含有t细胞表位的弱免疫原性肽(通常疏水性)，并且将其在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中与cpg寡核苷酸(带负电荷)和单磷酰脂质a(mpla，疏水性)混合。虽然cpp
‑
抗原肽(10mm)和cpg(10mm)两者都可溶于pbs，但一旦混合(1:1)，就会观察到沉淀或聚集体。这些聚集体是圆的纳米颗粒，其中直径大小为100nm。自组装被认为通过带正电荷的cpp与带负电荷的分子的电相互作用以及肽本身与单磷酰脂质a(mpla)之间的疏水相互作用发生。使用不同比率(正:负电荷或摩尔浓度)的进一步研究发现，不同比率的cpp
‑
治疗性肽、cpg和mpla可以在ph 7下产生100nm大小的纳米颗粒，但ζ电位(表面电荷)和每种组分的组装效率不同。
[0124]
如以上所描述的，本发明的纳米颗粒在中性条件下(例如，在ph 7.0下)自组装，并且在酸性条件下(例如，在ph 4.5下)被破坏。因此，纳米颗粒以紧密且小尺寸的颗粒形式递送到树突状细胞或巨噬细胞，并且然后在ph变为4.5的核内体中被破坏，从而将cpp与治疗性肽，优选地抗原肽或含有t细胞表位的非免疫原性肽，以及其它分子，优选地tlr配体，释放到细胞质中。此后，抗原肽或含有t细胞表位的非免疫原性肽结合到mhc i类或ii类分子，并且将表位呈递到t细胞，而tlr配体结合到tlr以触发tlr介导的信号传导途径(nf
‑
κb和i型干扰素)，从而产生促炎细胞因子并诱导强烈的先天性和适应性免疫应答。
[0125]
化学治疗方法和用途
[0126]
本公开的重要方面涉及用于使用所公开的自组装纳米颗粒调配物来治疗或改善一或多种形式的癌症的症状的方法，所述癌症包含例如肿瘤或转移性癌症，如但不限于黑色素瘤转移到哺乳动物肺。此类方法通常涉及以足够的量向哺乳动物(以及特别是向有需
要的人类)施用所公开的包括至少第一抗癌治疗剂的自组装纳米颗粒组合物中的一或多种自组装纳米颗粒组合物并持续足够的时间以治疗(或可替代地改善)受感染哺乳动物的癌症(的一或多种症状)。
[0127]
在某些实施例中，根据治疗特定疾病、病症、功能障碍或异常病状的需要，可以以单一治疗方式(作为单一施用，或可替代地在从若干小时(hrs)到若干天(甚至若干周或若干月)的时间段内多次施用)向动物提供本文所描述的自组装纳米颗粒组合物。可替代地，在一些实施例中，可能期望继续治疗或将其与一或多种另外的疗法模式组合，持续若干个月或更长的时间段。在其它实施例中，可能期望将疗法与一或多种常规治疗方案组合提供。
[0128]
本公开还提供了所公开的自组装纳米颗粒组合物中的一或多种自组装纳米颗粒组合物在制造用于治疗和/或改善感染或癌症的一或多种症状的药物中的用途，并且特别是用于制造用于治疗和/或改善包含例如人类感染、癌性肿瘤和接头的哺乳动物感染或癌症的一或多种症状的药物。
[0129]
本发明还提供了所公开的自组装纳米颗粒组合物中的一或多种自组装纳米颗粒组合物在制造用于治疗哺乳动物的疾病或病症，并且具体地用于治疗如感染和/或细胞过度增殖(即，癌症)等一或多种人类疾病的药物中的用途。
[0130]
治疗性试剂盒
[0131]
包含所公开的自组装纳米颗粒组合物中的一或多种自组装纳米颗粒组合物和用于在特定治疗方式中使用试剂盒的说明书的治疗性试剂盒也表示本公开的优选方面。这些试剂盒可以进一步任选地包含一或多种另外的治疗性化合物、一或多种诊断试剂或其任何组合。
[0132]
本发明的试剂盒可以被包装用于商业分发，并且可以进一步任选地包含适于将自组装纳米颗粒组合物递送到动物的一或多种递送装置(例如，注射器、注射剂等)。此类试剂盒通常包含自组装纳米颗粒组合物可以放置于其中并且优选地适当地等分的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器。在还提供第二药物的情况下，试剂盒还可以含有其中可以放置第二组合物的第二不同容器。可替代地，可以将如本文所公开的多种自组装纳米颗粒制备成如悬浮液或溶液等单种混合物，并且可以将所述多种自组装纳米颗粒包装在单个容器中，如小瓶、烧瓶、注射器、导管、插管、瓶子或其它合适的单个容器。
[0133]
本发明的试剂盒通常还可以包含适于将小瓶或其它容器容纳或保持在密闭空间中以供商业销售的保持机构，例如，注射或吹塑成型的塑料容器，可以将期望的小瓶或其它容器保留在所述保持机构中以最小化或防止破损、暴露在阳光下或其它不期望的因素，或允许立即使用包含在试剂盒内的组合物。
[0134]
细胞穿透肽
[0135]
如基于hiv
‑
tat的肽和嵌合细胞穿透肽等细胞穿透两亲性肽也已经应用于将治疗性负荷物递送到其靶标(马祖布(magzoub)等人,2004)。
[0136]
cpp长期以来一直被用作药物递送媒剂，因为其能够将细胞膜转位(古普塔(gupta)等人,2005)。少于30个氨基酸的阳离子短肽cpp以及长度为8
‑
10个精氨酸残基的基于聚精氨酸的cpp示出了最有效的膜穿透(富克斯(fuchs)等人,2006)。
[0137]
根据经典机制(富克斯等人,2006)，cpp的膜穿透基于精氨酸残基的胍基与细胞表面上碳水化合物和磷脂的羧基、磷酰基或磺酰基之间的氢键相互作用。最初，cpp转位穿过
膜的途径是通过独立于受体和内吞作用的机制定义的，但现在，已经证明了新型cpp内化机制。
[0138]
已经从蛋白质中鉴定了若干种cpp，包含人免疫缺陷病毒(hiv)的tat蛋白、单纯疱疹病毒的vp22蛋白和成纤维细胞生长因子。
[0139]
细胞穿透肽的一些实例包含但不限于：
[0140]
1.ygrkkrrqrrr(hiv tat 47
‑
57)(seq id no:3)；
[0141]
2yaraaarqara(tat
‑
ptd
‑
4)(seq id no:4)；
[0142]
3.yaraarraarr(tat
‑
ptd
‑
5)(seq id no:5)；
[0143]
4.rkkrrresrkkrrres(dpv3)(seq id no:6)；
[0144]
5.grpresgkkrkrkrlkp(dpv6)(seq id no:7)；
[0145]
6.gkrkkkgklgkkrdp(dpv7)(seq id no:8)；
[0146]
7.rrrrrrrrr(聚精氨酸，r9)(seq id no:9)；
[0147]
8.kkkkkkkkk(聚赖氨酸，k9)(seq id no:10)；
[0148]
8.rrrrnrtrrnrrrvr(fhv外壳)(seq id no:11)；
[0149]
9.galflgwlgaagstmgawsqpkkkrkv(信号肽ii)(seq id no:12)；
[0150]
10.klalklalkalkaalkla(两亲性模型肽)(seq id no:13)；
[0151]
11.daatatrgrsaasrpterpraparsasrprrpve(hsv vp22)(seq id no:14)；
[0152]
12.ketwwetwwtewsqpkkkrkv(肽载剂)(seq id no:15)；以及
[0153]
13.kkkkkkggflgfwrgengrktrsayermcnilkgk(cl22)(seq id no:16)。
[0154]
可以在可公开获得的cppsite 2.0网站在线找到已知cpp的完整列表，所述网站是细胞穿透肽数据库(cppsite)的更新版本。
[0155]
在本公开中，阳离子cpp共价连接到t细胞表位肽，并且存在于纳米颗粒的冠部分处。带正电的或接近中性的冠使纳米颗粒附接到带负电的细胞表面，并且然后被如dc或巨噬细胞等细胞以改善的摄取效率摄取。
[0156]
cpp还帮助与其连接的抗原肽或含有t细胞表位的弱免疫原性肽直接结合到核内体中的mhc ii类分子以用于将抗原呈递在细胞表面上，或从核内体逃逸并且然后进入er和高尔基体，其中抗原肽或含有t细胞表位的非免疫原性肽结合到新合成的mhc i类分子，用于呈递在细胞表面上以激活t细胞。
[0157]
如以上所描述的，本发明需要阳离子cpp。然而，如本领域技术人员熟知的，可以通过在主链上添加或附接一些如lys、arg和his等氨基酸来修饰非阳离子的cpp。例如，聚lys肽或聚arg肽被合成为阳离子cpp。
[0158]
抗原肽
[0159]
在本公开的上下文中，术语“抗原肽”是指特定肿瘤或病原体共有的并且结合到mhc分子的肽抗原。
[0160]
本公开的肿瘤抗原优选地源自癌症，所述癌症包含但不限于原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤(non
‑
hodgkin's lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(hodgkin's lymphoma)、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。在一个实施例中，本公开的肿瘤抗原包括由源自哺乳动物癌性肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(til)免疫识别的一或多种癌抗原表位。
[0161]
恶性肿瘤表达可以充当免疫攻击的靶抗原的许多肽。这些分子包含但不限于组织特异性抗原，如黑色素瘤中的mart
‑
1、酪氨酸酶和gp 100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(pap)和前列腺特异性抗原(psa)4。其它靶分子属于转化相关分子组，如致癌基因her
‑
2/neu/erbb
‑
2。又另一组靶抗原是癌胚胎抗原，如癌胚抗原(cea)。
[0162]
如癌睾丸抗原和突变源性新抗原等肿瘤抗原的实例包含但不限于ny
‑
eso
‑
1、ct83、mage基因家族和新抗原4。
[0163]
同样，已鉴定出特定肿瘤类型共有的致癌基因产物肽抗原。这些多肽将在本发明的多肽复合物中用作试剂，所述试剂通常可以用于刺激t细胞应答，有效地与携带此类抗原的肿瘤反应，致癌基因产物肽抗原包含但不限于与人类乳腺癌和妇科癌症相关联的her
‑
2/neu、与胰腺癌相关联的癌胚抗原(cea)。
[0164]
可以从天然来源如从一级临床分离物、细胞系等中纯化和分离肿瘤抗原和其癌抗原表位。也可以通过化学合成或通过本领域已知的重组dna技术获得癌症肽和其抗原表位。斯图尔德(steward)等人,(1969)；博丹斯基(bodansky)等人,(1976)；迈恩霍费尔(meienhofer)(1983)；以及施罗德(schroder)等人,(1965)中描述了用于化学合成的技术。
[0165]
此外，如伦克维斯特(renkvist)等人,(2001)中描述的，存在许多本领域已知的抗原。pct国际专利申请公开第wo 02/064057号中列出了由肿瘤抗原编码并且被t细胞(细胞毒性cd8
+
或辅助性cd4
+
)识别的多种t细胞定义的表位，所述pct国际专利申请公开以全文明确引用的方式并入本文。
[0166]
尽管未列出类似物或人工修饰的表位，但技术人员知道如何通过本领域的标准手段获得或产生类似物或人工修饰的表位。在路德维希癌症研究所(ludwig institute for cancer research)的数据库中鉴定了由抗体鉴定并通过serex技术检测的其它抗原[参见萨因(sahin)等人,(1997)和陈(chen)等人,(2000)]，技术人员可以在万维网上轻松找到所述数据库。
[0167]
本发明的抗原肽需要是疏水性的，使得其被包裹在纳米颗粒中并且被递送到核内体。如本领域技术人员所熟知的，可以通过将一或多个如gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met和trp等氨基酸添加或附接到主链来修饰非疏水性的抗原肽以增加肽的抗原性。
[0168]
t细胞表位
[0169]
形成本发明的纳米颗粒的核部分的免疫原性肽包括t细胞表位。
[0170]
由于t细胞表位不需要显示在载剂表面来引起免疫，所以t细胞表位可以并入纳米颗粒的核中。
[0171]
t细胞表位可以选自不同来源。例如，可以通过实验方法确定t细胞表位。此类表位在文献中是已知的，并且也可以通过基于特定病原体或癌抗原的现有蛋白质序列的算法来预测，或者此类表位可以从头设计。
[0172]
可在科学文献中获得大量已知的t细胞表位。这些t细胞表位可以选自特定病原体、癌症特异性肽序列，或者所述t细胞表位可以是具有特定特征的从头设计的肽，例如，padre肽(参见例如，美国专利第5,736,142号，所述美国专利以全文明确引用的方式并入本文)，所述padre肽结合到许多不同mhc ii分子，这使其成为所谓的杂乱t细胞表位。存在含有数千种不同t细胞表位的通常可获得的数据库，例如mhc数据库“mhcbn 4.0版”或pdb数据库“蛋白质数据库(protein data bank)”等。
[0173]
众所周知并且有文件充分证实的是，将辅助性t细胞(htl)表位并入原本不具有免疫原性的肽序列或将其附接到非肽抗原可以使这些htl表位的免疫原性更强。pan
‑
dr结合肽htl表位padre已经被广泛用于疟疾、阿尔茨海默氏症(alzheimer's)和许多其它疫苗的疫苗设计。
[0174]
根据mhcbn数据库(同上)的定义，t细胞表位是对对应的mhc分子的结合亲和力(ic
50
值)小于50,000nm的肽。此类肽被认为是mhc结合剂。根据此定义，截至2006年8月，mhcbn数据库4.0版中以下数据可用：20717mhc结合剂和4022mhc非结合剂。
[0175]
也可以通过使用预测算法获得适合的t细胞表位。这些预测算法可以扫描来自病原体或癌抗原的现有蛋白质序列以寻找推定的t细胞表位，或者所述预测算法可以预测从头设计的肽是否结合到特定的mhc分子。许多此类预测算法通常是可在互联网上获得的。实例是svrmhcdb(万(wan)等人,2006)、syfpeithi、mhcpred、基序扫描仪或用于mhc ii结合分子的netmhciipan和用于mhc i结合表位的netmhcpan。
[0176]
如本文所描述且优选用于设计的htl表位是肽序列，所述肽序列通过生物物理方法测量或通过netmhciipan预测，以高于500nm的结合亲和力(ic
50
值)结合到任何mhc ii分子。这些被认为是弱结合剂。优选地，这些表位通过生物物理方法测量或通过netmhciipan预测，以高于50nm的ic
50
值结合到mhc ii分子。这些被认为是强结合剂。
[0177]
t细胞表位可以并入非免疫原性肽内的若干个地方。为了实现这一点，具有t细胞表位的特定序列必须遵守mhc结合规则。用于结合到mhc分子的规则被并入mhc结合预测程序，所述程序使用复杂的算法来预测mhc结合肽。
[0178]
存在许多不同的hla分子，所述hla分子中的每个hla分子在将与其最佳结合的其序列中具有氨基酸的限制。美国专利第8,546,337号的表3中总结了结合基序，所述美国专利以全文明确引用的方式并入本文。在所述表中，基序以x示出了可以具有任何氨基酸的位置，并且在方括号中示出了仅可以位于结合基序的特定位置的氨基酸(的列表)。
[0179]
通常，在本发明中，含有t细胞表位的非免疫原性肽需要是疏水性的，使得其被包裹在纳米颗粒中并且被递送到核内体。如本领域技术人员所熟知的，可以通过将一些如gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met和trp等氨基酸添加或附接到主链来修饰非疏水性的含有t细胞表位的非免疫原性肽。
[0180]
t
oll
样受体和tlr信号传导
[0181]
toll样受体(tlr)是进化上保守的受体，并且是果蝇toll蛋白的同源物，所述果蝇toll蛋白被发现对于防御微生物感染很重要。tlr识别被称为病原体相关微生物模式(pamp)或危险相关分子模式(damp)的高度保守的结构基序，所述pamp仅由微生物病原体表达，所述damp是从坏死或垂死细胞释放的内源性分子。
[0182]
tlr包含tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、tlr11、tlr12和tlr13，尽管后两个在人类中未发现。
[0183]
tlr在如树突状细胞(dc)和巨噬细胞等先天免疫细胞以及如成纤维细胞和上皮细胞等非免疫细胞中表达。tlr基于其定位而主要分类为两个亚家族，细胞表面tlr和细胞内tlr。细胞表面tlr包含tlr1、tlr2、tlr4、tlr5、tlr6和tlr10，而细胞内tlr位于核内体中并且包含tlr3、tlr7、tlr8、tlr9、tlr11、tlr12和tlr13。
[0184]
由对应的pamp或damp对tlr的刺激启动信号传导级联，从而引起如ap
‑
1、nf
‑
κb和
干扰素调节因子(irf)等转录因子的激活。tlr的信号传导引起多种细胞应答，包含产生指导适应性免疫应答的干扰素(ifn)、促炎细胞因子和效应细胞因子。
[0185]
tlr信号传导由至少两个不同的途径组成：使得产生炎性细胞因子的myd88依赖性途径，以及与ifn
‑
β的刺激和树突状细胞的成熟相关联的trif依赖性途径。
[0186]
tlr配体
[0187]
由于tlr(和其它先天免疫受体)的特异性，其在进化过程中不容易被改变；这些受体识别与威胁(例如，病原体或细胞应激)不断相关联的分子，并且对这些威胁具有高度特异性。
[0188]
满足这一要求的病原体相关分子被认为对病原体的功能至关重要，并且难以通过突变改变；据说所述病原体相关分子在进化上是保守的。病原体中有些保守的特征包含细菌细胞表面脂多糖(lps)、脂蛋白、脂肽和脂阿拉伯甘露聚糖；蛋白质，如来自细菌鞭毛的鞭毛蛋白；病毒的双链rna；或细菌dna和病毒dna的未甲基化cpg岛；以及在真核dna的启动子中发现的cpg岛；以及某些其它rna和dna分子。
[0189]
c
p
g
‑
a和c
p
g
‑
b
[0190]
表1列出了一些熟知的tlr和其常见的配体：
[0191]
表1
[0192]
通常已知的tlr和其配体
[0193]
biochemistry and molecular biology),(第2版)j.斯泰内什(j.stenesh)(编辑),威利交叉科学(wiley
‑
interscience)(1989)；微生物学与分子生物学词典(dictionary of microbiology and molecular biology)(第3版),p.辛格尔顿(p.singleton)和d.塞恩斯伯里(d.sainsbury)(编辑),威利交叉科学(2007)；钱伯斯科学与技术词典(chambers dictionary of science and technology)(第2版),p.沃克(p.walker)(编辑),钱伯斯(chambers)(2007)；遗传学词汇(glossary of genetics)(第5版),r.里格(r.rieger)等人(编辑),施普林格出版社(springer
‑
verlag)(1991)；以及哈珀柯林斯生物学词典(the harpercollins dictionary of biology),w.g.黑尔(w.g.hale)和j.p.马格姆(j.p.margham)(编辑),哈珀
·
柯林斯出版社(harpercollins)(1991)。
[0200]
虽然任何类似或等同于本文描述的那些方法和组合物的方法和组合物可以用于本发明的实践或测试，但本文描述了优选的方法和组合物。出于本发明的目的，为了清楚和便于参考，以下术语定义如下：
[0201]
根据存在已久的专利法惯例，贯穿本技术和权利要求中使用的词语“一个/一种(a/an)”表示“一或多个/种”。
[0202]
如本文所使用的，术语“约”和“大约”是可互换的，并且通常应理解为指围绕给定数字的数字范围，以及所列举数字范围内的所有数字(例如，除非另有说明，否则“约5到15”意指“约5到约15”)。此外，本文中的所有数值范围应理解为包含所述范围内的每个整数。
[0203]“生物相容”是指当暴露于活细胞时，将支持细胞的适当细胞活性而不在细胞内引起不良影响的材料，所述不良影响如细胞生命周期的变化、细胞增殖率的变化或细胞毒性作用。
[0204]
术语“生物功能等同物”是本领域熟知的，并且在本文中进一步详细定义。因此，与本文提供的核苷酸序列中的一或多种核苷酸序列具有约85％到约90％；或更优选地，约91％到约95％；或甚至更优选地，约96％到约99％的同一性或功能等同性的核苷酸序列被特别设想为在本技术中阐述的方法和组合物的实践中是有用的。
[0205]
如本文所使用的，“仿生”应意指合成材料与人体中天然存在的物质的相似性，并且不会被人体排斥(例如，不会在人体中引起不良反应)。
[0206]
如本文所使用的，术语“缓冲液”包含一或多种组合物或其水溶液，当将酸或碱添加到包含缓冲液的溶液或组合物中时，所述组合物或所述溶液抵抗ph的波动。这种对ph变化的抵抗是由于此类溶液的缓冲性质，并且可以是组合物中包含的一或多种特定化合物的功能。因此，表现出缓冲活性的溶液或其它组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液通常没有无限地维持溶液或组合物的ph的能力；相反，缓冲液通常能够将ph维持在某些范围内，例如约5到7的ph。
[0207]
如本文所使用的，术语“载剂”旨在包含对于施用于相关动物是药学上可接受的任何溶剂、分散介质、包被剂、稀释剂、缓冲液、等渗剂、溶液、悬浮液、胶体、惰性剂等或其组合。一般地用于化学化合物并且具体地用于化学治疗剂的一或多种递送媒剂的使用是制药领域的普通技术人员熟知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，否则设想了将其用于诊断性、预防性和治疗性组合物中。还可以将一或多种补充活性成分并入所公开的化疗组合物中的一或多种化疗组合物，或与所公开的化疗组合物中的一或多种化疗组合物联合施用。
[0208]
如本文所使用的，术语“dna区段”是指从特定物种的总基因组dna中分离出来的dna分子。因此，使用本文公开的组合物之一从生物样品中获得的dna区段是指已经从一或多个dna区段所获自的特定物种的总基因组dna中分离或纯化的一或多个dna区段。术语“dna区段”包含dna区段和此类区段的更小片段，以及重组载体，包含例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
[0209]
如本文所使用的，术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或病状或以其它方式能够产生预期治疗效果的量。
[0210]
如本文所使用的，术语“例如(for example)”或“例如，(e.g.,)”仅作为实例使用，并非意在限制，并且不应被解释为仅指在说明书中明确枚举的那些项。
[0211]
如本文所使用的，“异源”序列被定义为与预定的参考序列相关，如多核苷酸或多肽序列。例如，关于结构基因序列，异源启动子被定义为不天然存在于参考结构基因附近但通过实验室操纵定位的启动子。同样，异源基因或核酸区段被定义为不天然存在于参考启动子和/或增强子元件附近的基因或区段。
[0212]
如本文所使用的，当提及多核苷酸时，“同源”意指具有相同基本核苷酸序列的序列，尽管来自不同来源。通常，同源核酸序列源自具有一或多个基本上类似的基因组序列的密切相关的基因或生物体。相比之下，“类似”多核苷酸是与来自不同物种或生物体的多核苷酸具有相同功能的多核苷酸，但可能具有显著不同的对一或多种实现类似功能或具有类似生物活性的蛋白质或多肽进行编码的一级核苷酸序列。类似多核苷酸通常可以源自两种或两种以上(例如，基因上或系统发育上)不密切相关的生物体。
[0213]
如本文所使用的，术语“同源性”是指两个或两个以上多核苷酸或多肽序列之间的互补程度。当第一核酸或氨基酸序列与第二核酸或氨基酸序列具有完全相同的一级序列时，词语“同一性”可以代替词语“同源性”。可以通过使用本领域已知的算法和计算机程序分析两个或两个以上序列来确定序列同源性和序列同一性。此类方法可以用于评估给定序列是否与另一选择的序列同一或同源。
[0214]
在两个或两个以上核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一”或“同一性”百分比是指当针对最大对应性进行比较和比对时，如使用下述序列比较算法(或普通技术人员可获得的其它算法)之一或通过视觉检查测量的，相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或两个以上序列或子序列。
[0215]
如本文所使用的，短语“需要治疗”是指如医师或兽医等护理人员做出的患者需要(或将以一或多种方式受益于)治疗的判断。此类判断可以基于护理人员专业知识范围内的多种因素做出，并且可以包含以下认知：由于可通过如本文所阐述的一或多种化合物或药物组合物治疗的疾病状态，患者生病。
[0216]
短语“分离的”或“生物学上纯的”是指基本上(substantially)或基本上(essentially)不含如在其天然状态下发现的通常伴随材料的组分的材料。
[0217]
如本文所使用的，术语“试剂盒”可以用于描述便携式独立外壳的变型，其包含至少一组试剂、组分或药物调配的组合物以进行本发明的一或多种测定方法。任选地，此类试剂盒可以包含一或多套用于例如在实验室或临床应用中使用所附试剂的说明书。
[0218]“连接”或“接合”是指本领域已知的用于功能性连接一或多个蛋白质、肽、核酸或多核苷酸的任何方法，所述方法包含但不限于重组融合、共价键合、二硫键合、离子键合、氢
键合、静电键合等。
[0219]
如本文所使用的，术语“天然存在的”在应用于对象时是指可以在自然界中找到对象的事实。例如，存在于可以从自然界来源中分离并且没有被实验室中的人有意修饰的生物体(包含病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本文所使用的，根据经典遗传学可能已经选择性繁殖的实验室啮齿动物品系被认为是天然存在的动物。
[0220]
如本文所使用的，术语“核酸”包含以下中的一或多种类型：多脱氧核糖核苷酸(含有2
‑
脱氧
‑
d
‑
核糖)、多核糖核苷酸(含有d
‑
核糖)和任何其它类型的多核苷酸，所述多核苷酸为嘌呤或嘧啶碱基或经修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包含无碱基位点)的n
‑
糖苷。如本文所使用的，术语“核酸”还包含通常通过亚基之间的磷酸二酯键，但在一些情况下通过硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等共价键合的核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物。“核酸”包含单链和双链dna，以及单链和双链rna。示范性核酸包含但不限于gdna；hnrna；mrna；rrna、trna、微rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、小核仁rna(snora)、小核rna(snrna)和小时序rna(strna)等和其任何组合。
[0221]
如本文所使用的，术语“可操作地连接”和“操作性地连接”是指以这样的方式连接的核酸序列的结合，使得编码区域是连续的并且在正确的阅读框中。此类序列通常是连续的或基本上连续的。然而，由于增强子通常在与启动子分开若干个千碱基时起作用并且内含子序列可以具有可变长度，因此一些多核苷酸元件可以是可操作连接但不连续的。
[0222]
如本文所使用的，术语“患者”(也可互换地被称为“宿主”或“受试者”)是指可以接受本文所公开的药物组合物中的一或多种药物组合物的任何宿主。优选地，受试者是脊椎动物，其旨在表示任何动物物种(并且优选地，哺乳动物物种，如人类)。在某些实施例中，“患者”是指任何动物宿主，包含但不限于任何哺乳动物宿主。优选地，所述术语是指任何哺乳动物宿主，后者包含但不限于人和非人灵长类动物、牛、犬、山羊(caprine)、cavine、乌鸦(corvine)、epine、马、猫、山羊(hircine)、兔(lapine)、野兔、狼、鼠、绵羊、猪、蛙、racine、狐狸等，包含牲畜、动物标本、外来种以及伴侣动物、宠物和任何由兽医护理的动物。患者可以在患者能够通过产生免疫应答对接种本疫苗产生应答的任何年龄。在特定实施例中，哺乳动物患者优选地是人。
[0223]
短语“药学上可接受的”是指当向哺乳动物施用时，并且特别是当向人施用时优选地不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。
[0224]
如本文所使用的，“药学上可接受的盐”是指优选地保留母体化合物的所期望生物活性并且不赋予任何不期望的毒理效应的盐。此类盐的实例包含但不限于与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐；以及与有机酸形成的盐，所述有机酸包含但不限于乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、扑酸(pamoic acid)(亚甲基双羟萘酸(embonic acid))、海藻酸、萘甲酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸；具有多价金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等的盐；与由n,n'
‑
二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的盐；以及其组合。
[0225]
如本文所使用的，术语“质粒”或“载体”是指由基因材料(即，核酸)构成的基因构建体。通常，质粒或载体含有在细菌宿主细胞例如，大肠杆菌(escherichia coli)中起作用的复制起点和用于检测包含质粒的细菌宿主细胞的可选择标志物。本发明的质粒和载体可
以包含如本文所述的一或多种遗传元件，所述遗传元件被布置成使得插入的编码序列可以在适合的表达细胞中转录和翻译。另外，质粒或载体可以包含一或多个核酸区段、基因、启动子、增强子、激活子、多克隆区域或其任何组合，包含从一或多种从天然和/或人工来源获得或衍生的区段。
[0226]
如本文所使用的，“聚合物”意指通过聚合形成并且包含重复结构单元的化学化合物或化合物的混合物。聚合物可以以多种形式和组合物或组合物的组合构建。
[0227]
如本文所使用的，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且包含两个或两个以上氨基酸的任何一或多个链。因此，如本文所使用的，包含但不限于“肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白质”、“酶”、“氨基酸链”和“连续氨基酸序列”的术语均涵盖在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何术语使用，或与这些术语中的任何术语可互换地使用。所述术语进一步包含经过一或多种翻译后修饰的多肽，所述修饰包含例如但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、溶蛋白性裂解、翻译后加工或通过包含一或多种非天然存在的氨基酸进行的修饰。本领域中存在用于多核苷酸和多肽结构的常规命名法。
[0228]
例如，广泛采用一个字母和三个字母的缩写来描述氨基酸：丙氨酸(a；ala)、精氨酸(r；arg)、天冬酰胺(n；asn)、天冬氨酸(d；asp)、半胱氨酸(c；cys)、谷氨酰胺(q；gin)、谷氨酸(e；glu)、甘氨酸(g；gly)、组氨酸(h；his)、异亮氨酸(i；ile)、亮氨酸(l；leu)、甲硫氨酸(m；met)、苯丙氨酸(f；phe)、脯氨酸(p；pro)、丝氨酸(s；ser)、苏氨酸(t；thr)、色氨酸(w；trp)、酪氨酸(y；tyr)、缬氨酸(v；val)和赖氨酸(k；lys)。本文所描述的氨基酸残基优选为“l”异构形式。然而，“d”异构形式的残基可以代替任何l
‑
氨基酸残基，前提是保留了多肽的期望的特性。
[0229]
如本文所使用的，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“抑制(suppress)”、“抑制(suppressing)”和“抑制(suppression)”如本文所使用的是指在疾病状态的临床症状发作之前单独或以包含在药物组合物中的形式施用化合物以预防疾病状态的任何症状、方面或特性。此类预防和抑制不一定是被认为在医学上是绝对有用的。
[0230]“蛋白质”在本文中与“肽”和“多肽”可互换地使用，并且包含合成、重组或体外产生的肽和多肽，以及在将核酸序列施用于宿主动物或人受试者后体内表达的肽和多肽。术语“多肽”优选地旨在指任何氨基酸链长度，包含长度为约2到约20个氨基酸残基的短肽的长度，长度为约10到约100个氨基酸残基的寡肽，以及更长的多肽，包含长度为约100个氨基酸残基或更多。此外，所述术语还旨在包含酶，即，包含至少一种氨基酸聚合物的功能性生物分子。本发明的多肽和蛋白质还包含被或已经被翻译后修饰的多肽和蛋白质，并且包含添加到主链氨基酸链的任何糖或其它衍生物或缀合物。
[0231]
如本文所使用的，“纯化”意指与许多其它化合物或实体分离。化合物或实体可以是部分纯化的、基本上纯化的或纯的。当化合物或实体从基本上所有其它化合物或实体中去除时，所述化合物或实体被认为是纯的，即，是优选地至少约90％，更优选地至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％纯的。部分或基本上纯化的化合物或实体可以从其天然存在于的材料的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％中去除，所述材料例如细胞材料，如细胞蛋白质和/或核酸。
[0232]
术语“重组”指示材料(例如，多核苷酸或多肽)已经通过人为干预而被人工或合成地(即，非天然地)改变。可以在材料的天然环境或天然状态内对材料执行改变，或可以对从天然环境或天然状态取出的材料执行改变。具体地，例如，当启动子序列通过人工工程化的核酸区段的表达产生时，所述启动子序列是“重组的”。例如，“重组核酸”是通过例如在克隆、dna改组或其它程序期间或通过化学或其它诱变将核酸重组制得的；“重组多肽”或“重组蛋白”是通过重组核酸的表达产生的多肽或蛋白；并且“重组病毒”，例如，重组aav病毒，是通过重组核酸的表达产生的。
[0233]
如本文所使用的，术语“调节元件”是指调节转录的核酸序列的一或多个区域。示范性调控元件包含但不限于增强子、转录后元件、转录控制序列等。
[0234]
术语“rna区段”是指从特定物种的总细胞rna中分离出来的rna分子。因此，rna区段可以指已与其它rna分离或经纯化而不含其它rna的(天然来源或合成来源的)一或多个rna区段。包含在术语“rna区段”内的是rna区段和此类区段的更小片段。
[0235]
术语“基本上如seq id no:x中所示的序列”意指所述序列基本上对应于seq id no:x的一部分并且具有的与seq id no:x的核苷酸(或氨基酸)不同或不是所述核苷酸(或氨基酸)的生物功能等同物的核苷酸(或在多肽序列的情况下氨基酸)相对较少。术语“生物功能等同物”是本领域熟知的，并且在本文中进一步详细定义。因此，与本文提供的核苷酸序列中的一或多种核苷酸序列具有约85％到约90％；或更优选地，约91％到约95％；或甚至更优选地，约96％到约99％的同一性或功能等同性的核苷酸序列被特别设想为在本发明的实践中是有用的。
[0236]
用于本发明的核酸的适合的标准杂交条件包含例如在50％甲酰胺、5
×
邓哈特(denhardt's)溶液、5
×
ssc、25mm磷酸钠、0.1％sds和100μg/ml变性鲑鱼精子dna中在42℃下杂交16小时，然后在60℃下用0.1
×
ssc、0.1％sds溶液连续洗涤1小时以去除期望的背景信号量。用于本发明的较低严格杂交条件包含例如，在35％甲酰胺、5
×
邓哈特溶液、5
×
ssc、25mm磷酸钠、0.1％sds和100μg/ml变性鲑鱼精子dna或大肠杆菌dna中在42℃下杂交16小时，然后在55℃下用0.8
×
ssc、0.1％sds连续洗涤。本领域普通技术人员将认识到，可以容易地调整此类杂交条件以获得用于特定应用的期望的严格水平。
[0237]
如本文所使用的，术语“结构基因”旨在一般性地描述多核苷酸，如基因，其被表达以产生编码的肽、多肽、蛋白质、核酶、催化性rna分子或反义分子。
[0238]
如本文所使用的，术语“受试者”描述了生物体，包含可以向其提供用根据本发明的组合物的治疗的哺乳动物，如灵长类动物。可以受益于所公开的治疗方法的哺乳动物物种包含但不限于猿；黑猩猩；猩猩；人；猴；家养动物，如狗和猫；牲畜，如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和其它动物，如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
[0239]
当用于定义氨基酸或核酸序列时，术语“基本上互补”意指特定的主题序列，例如寡核苷酸序列，与选择的序列的全部或一部分基本上互补，并且因此将特异性地结合到对选择的序列进行编码的mrna的一部分。如此，序列通常将与mrna“靶”序列高度互补，并且在整个序列的互补部分将具有不超过约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个或约10个左右的碱基错配。在许多情况下，可能期望序列精确匹配，即，与寡核苷酸特异性结合的序列完全互补，并且因此沿互补段具有零错配。如此，高度互补序列通常将非常特异性地结合到mrna的靶序列区域，并且因此在减少和/或甚至抑制靶mrna序列向多
肽产物的翻译方面将非常有效。
[0240]
基本上互补的核酸序列与核酸特异性地结合到的对应核酸靶序列的互补性(或“精确匹配％”)将大于约80％，并且更优选地与核酸特异性地结合到的对应靶序列的互补性将大于约85％。在某些方面，如以上所描述的，期望具有甚至更多基本上互补的核酸序列用于本发明的实践，并且在此类情况下，核酸序列与核酸特异性地结合到的对应靶序列的互补性将大于约90％，并且在某些实施例中，可以与核酸特异性地结合到的对应靶序列的互补性大于约95％，并且甚至至多并且包含与设计的核酸特异性地结合到的靶序列的全部或一部分约96％、约97％、约98％、约99％和甚至约100％精确匹配互补。
[0241]
可以例如通过使用可从威斯康星大学遗传学计算机组(uwgcg)获得的gap计算机程序6.0版比较序列信息来确定任何公开的核酸序列的相似性百分比或互补性百分比。gap程序使用尼德曼(needleman)和翁施(wunsch)(1970)的比对方法。简而言之，gap程序将相似性定义为类似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以这两个序列中较短序列中的符号的总数。gap程序的优选默认参数包含：(1)核苷酸的一元比较矩阵(含有值1表示同一性，以及0表示非同一性)，以及哥博斯科夫(gribskov)和伯吉斯(burgess)(1986)的加权比较矩阵，(2)每个空位3.0的罚分，以及每个空位中每个符号额外0.10的罚分；以及(3)末端空位不罚分。
[0242]
如本文所使用的，与组分的量相关的术语“基本上不含(substantially free)”或“基本上不含(essentially free)”优选地是指含有小于约10重量％，优选地小于约5重量％，并且更优选地小于约1重量％的化合物的组合物。在优选实施例中，这些术语是指小于约0.5重量％、小于约0.1重量％或小于约0.01重量％。
[0243]
如本文所使用的，术语“结构基因”旨在一般性地描述多核苷酸，如基因，其被表达以产生编码的肽、多肽、蛋白质、核酶、催化性rna分子或反义分子。
[0244]
如本文所使用的，术语“受试者”描述了生物体，包含可以向其提供用根据本发明的组合物的治疗的哺乳动物，如灵长类动物。可以受益于所公开的治疗方法的哺乳动物物种包含但不限于人、非人灵长类动物，如猿；黑猩猩；猴子和猩猩，家养动物，包含狗和猫，以及牲畜，如马、牛、猪、绵羊和山羊，或其它哺乳动物物种，包含但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠等。
[0245]
如本文所使用的，术语“基本上对应于”、“基本上同源”或“基本上同一性”表示核酸或氨基酸序列的特性，其中与选择的参考核酸或氨基酸序列相比，选择的核酸序列或选择的氨基酸序列具有至少约70％或约75％的序列同一性。更典型地，选择的序列和参考序列将具有至少约76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％或甚至85％的序列同一性，并且更优选地，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性。仍更优选地，高度同源序列通常在选择的序列和与其进行比较的参考序列之间共享大于至少约96％、97％、98％或99％的序列同一性。
[0246]
如本文所使用的，“合成”应意指材料不是人或动物起源的。
[0247]“靶向部分”是可以促进颗粒靶向特定位点的任何因子。例如，靶向部分可以是化学靶向部分、物理靶向部分、几何靶向部分或其组合。化学靶向部分可以是颗粒表面上的化学基团或分子；物理靶向部分可以是颗粒的特定物理性质，如表面或疏水性；几何靶向部分包含颗粒的大小和形状。进一步地，化学靶向部分可以是树枝状聚合物、抗体、可为硫代适
体的适体、配体、抗体或结合靶位点上的特定受体的生物分子。物理靶向部分可以是表面电荷。可以在颗粒制造期间通过使用如特定洗涤等化学处理引入电荷。例如，将多孔二氧化硅或氧化硅表面浸入水中可以导致在表面上获得负电荷。
[0248]
表面电荷也可以由颗粒表面上的另外的层或化学链如聚合物链提供。例如，聚乙二醇链可以是表面上负电荷的来源。可以使用本领域普通技术人员已知的方法将聚乙二醇链涂覆或共价偶联到表面。
[0249]
术语“治疗实践期”意指一或多种活性剂是治疗有效的所必需的时间段。术语“治疗有效”是指降低一或多种症状的严重性和/或频率、消除一或多种症状和/或根本原因、预防症状和/或其根本原因的发生以及改善或修复损伤。
[0250]“治疗剂”可以是可以在受试者中的靶位点产生期望的生物学效应的任何生理学或药理学活性物质。治疗剂可以是化学治疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、溶核化合物、放射性同位素、受体和前药激活酶，所述治疗剂可以是天然存在的、通过合成或重组方法产生的或其组合。受经典多药耐药性影响的药物，如长春花生物碱(例如，长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine))、蒽环类(例如，多柔比星(doxorubicin)和柔红霉素(daunorubicin))、rna转录抑制剂(例如，放线菌素d(actinomycin
‑
d))和微管稳定药物(例如，紫杉醇(paclitaxel))，可以具有作为治疗剂的特定用途。细胞因子也可以用作治疗剂。此类细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。癌症化疗剂可以是优选的治疗剂。对于抗癌剂和其它治疗剂的更详细描述，本领域技术人员参考任何数量的指导手册，包含但不限于医师案头参考(physician's desk reference)和哈德曼(hardman)和林姆博德(limbird)(2001)。
[0251]
如本文所使用的，“转录因子识别位点”和“转录因子结合位点”是指多核苷酸序列或序列基序，其被鉴定为一或多种转录因子的序列特异性相互作用的位点，通常采取直接蛋白质
‑
dna结合的形式。通常，可以通过dna足迹、凝胶迁移率变动测定等鉴定转录因子结合位点，和/或可以基于已知的共有序列基序或通过本领域普通技术人员已知的其它方法预测转录因子结合位点。
[0252]“转录调节元件”是指单独或与一或多种其它核酸序列组合激活转录的多核苷酸序列。转录调节元件可以例如包括一或多种启动子、一或多种应答元件、一或多种负调节元件和/或一或多种增强子。
[0253]“转录单元”是指包括：至少第一结构基因的多核苷酸序列，所述基因可操作地连接到至少第一顺式作用启动子序列并且任选地可操作地连接到有效地转录结构基因序列所必需的一或多个其它顺式作用核酸序列；和至少第一远端调节元件，这可能是结构基因序列的适当组织特异性转录和发育转录所需的，所述结构基因序列可操作地位于启动子和/或增强子元件的控制下；以及有效转录和翻译所必需的任何另外的顺式序列(例如，聚腺苷酸化位点、mrna稳定性控制序列等)。
[0254]
如本文所使用的，术语“转化”旨在概括地描述将外源性多核苷酸序列(例如，病毒载体、质粒或重组dna或rna分子)引入宿主细胞或原生质体的过程，其中外源性多核苷酸并入至少第一染色体中或能够在转化的宿主细胞内自主复制。转染、电穿孔和“裸”核酸摄取都表示用于用一或多种多核苷酸转化宿主细胞的技术的实例。
[0255]
如本文所使用的，术语“经转化的细胞”旨在意指其核酸补体已通过将一或多种外
源性多核苷酸引入所述细胞内而改变的宿主细胞。
[0256]
如本文所使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment of)”是指向受试者提供任何类型的医学或外科管理。治疗可以包含但不限于向受试者施用包括治疗剂的组合物。“治疗”包含向受试者施用或应用将本发明的化合物或组合物，用于如治愈、逆转、减轻疾病、病症或病状或疾病、病症或病状的一或多种症状或表现、降低其严重性、抑制其进展，或减少其可能性的目的。在某些方面，本发明的组合物也可以在任何症状或病状表现出现之前预防性地施用，此时这种预防是必要的。通常，在此类情况下，受试者将是由于家族史、医疗记录或完成一或多项指示有随后罹患此类疾病或病症的倾向的诊断测试或预后测试而被诊断为“有风险”罹患此类疾病或病症的受试者。
[0257]
如本文所使用的，术语“载体”是指能够在宿主细胞中复制和/或可以与另一核酸区段操作性地连接以引起所连接区段的复制的核酸分子(通常包括dna)。质粒、粘粒或病毒是示范性载体。
[0258]
在某些实施例中，将本发明的一或多个核酸区段与适当的可检测标志物(即，“标记”)组合采用将是有利的，如在杂交测定中采用标记的多核苷酸探针来确定给定靶序列的存在的情况下。本领域已知用于标记寡核苷酸探针的多种适当的指示剂化合物和组合物，包含但不限于能够在适合的测定中被检测到的荧光配体、放射性配体、酶配体或其它配体，如抗生物素蛋白/生物素等。在特定实施例中，还可以采用如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶等一或多种荧光标记或酶标签，而不是放射性或其它环境上不太期望的试剂。在酶标签的情况下，已知比色、显色或荧光指示剂底物可以用于提供用于检测人眼可见的样品的方法，或通过如闪烁扫描术、荧光测定法、分光光度法等分析方法鉴定与含有一或多个互补的或基本上互补的核酸序列的样品的特异性杂交。在所谓的“多重化”测定的情况下，其中两个或两个以上经标记的探针同时地或顺序地检测，可能期望用具有第一检测性质或参数(例如，发射和/或激发光谱最大值)的第一标记来标记第一寡核苷酸探针，所述测定还用具有与第一标记不同的(即，离散的或可辨别的)第二检测性质或参数的第二标记来标记第二寡核苷酸探针。多重化测定的用途是分子遗传领域的普通技术人员熟知的，特别是在基因扩增/检测方案的背景下。
[0259]
生物功能等同物
[0260]
可以对核酸的结构或包括核酸的载体以及mrna、多肽或由其编码的治疗剂进行修饰和改变，并且仍然获得含有一或多种具有期望的特性的治疗剂的功能系统。如上所述，通常期望将一或多个突变引入特定多核苷酸序列。在某些情况下，所得的经编码多肽序列因此突变而改变，或者在其它情况下，多肽的序列未因编码多核苷酸中的一或多个突变而改变。
[0261]
当期望改变多肽的氨基酸序列以产生等效的或甚至改进的第二代分子时，可以通过根据表2更改编码dna序列的密码子中的一或多个密码子来实现氨基酸改变。
[0262]
例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而不会明显丧失与如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点等结构的相互作用结合能力。由于蛋白质的相互作用能力和性质定义了蛋白质的生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列取代，当然，也可以在其基础dna编码序列中进行，并且仍然可以获得具有类似性质的蛋白质。因此发明人设想可以在不明显丧失所公开组合物的肽序列或编码所述肽的对应
dna序列的生物效用或活性的情况下对所述肽序列或所述dna序列进行各种改变。
[0263]
表2
[0264][0265]
在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质交互性生物功能方面的重要性在本领域中是被普遍理解的(凯特(kyte)和杜立特(doolittle),1982，通过引用并入本文)。接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白的二级结构，所述二级结构进而定义蛋白与其它分子，例如酶、底物、受体、dna、抗体、抗原等的相互作用。已经基于氨基酸的亲水性和电荷特性为每个氨基酸分配了亲水指数(凯特和杜立特,1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(
‑
0.4)；苏氨酸(
–
0.7)；丝氨酸(
–
0.8)；色氨酸(
–
0.9)；酪氨酸(
–
1.3)；脯氨酸(
–
1.6)；组氨酸(
–
3.2)；谷氨酸盐(
–
3.5)；谷氨酰胺(
–
3.5)；天冬氨酸盐(
‑
3.5)；天冬酰胺(
–
3.5)；赖氨酸(
–
3.9)；以及精氨酸(
–
4.5)。
[0266]
本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸取代并且仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即，仍获得生物功能等同蛋白质。在进行此类改变时，优选亲水指数在
±
2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水指数在
±
1以内的氨基酸的取代，并且甚至更加特别优选亲水指数在
±
0.5以内的氨基酸的取代。在本领域中还应理解，可以基于亲水性来有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利第4,554,101号(具体地以全文明确引用的方式并入本文)指出，由蛋白质相邻氨基酸的亲水性支配的其最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。
[0267]
如美国专利第4,554,101号中所详述的，已经为氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0
±
1)；谷氨酸盐(+3.0
±
1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(
‑
0.4)；脯氨酸(
‑
0.5
±
1)；丙氨酸(
‑
0.5)；组氨酸(
‑
0.5)；半胱氨酸(
‑
1.0)；甲硫氨酸(
‑
1.3)；缬氨酸(
‑
1.5)；亮氨酸(
‑
1.8)；异
亮氨酸(
‑
1.8)；酪氨酸(
‑
2.3)；苯丙氨酸(
‑
2.5)；色氨酸(
‑
3.4)；应当理解的是，氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等同的，并且特别是免疫学上等同的蛋白质。在这种改变时，优选亲水性值在
±
2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在
±
1以内的氨基酸的取代，甚至更特别优选亲水性值在
±
0.5以内的氨基酸的取代。
[0268]
如上文所概述的，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到一或多种前述特性的示范性取代是本领域的普通技术人员熟知的，并且包含精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0269]
贯穿本文使用的章节标题仅出于组织目的，而不应被解释为对所描述的主题进行限制。在本技术中所引用的所有文件或文件的部分(包含但不限于专利、专利申请、论文、书籍和专著)都明确以全文明确引用的方式并入本文。如果一或多个并入的文献和类似材料以与本技术中术语的定义相矛盾的方式定义了术语，则以本技术为准。
[0270]
实例
[0271]
包含了以下实例以说明本发明的说明性实施例。本领域的普通技术人员应当理解，这些实例中所公开的技术表示发现的在本发明的实践中很好地起作用并且因此可以被认为构成本发明的优选实践模式的技术。然而，根据本公开内容，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并且仍然获得相同或相似的结果。
[0272]
实例1
[0273]
尽管已经报告了使用ny
‑
eso
‑
1肽与montanide isa
‑
51加cpg或poly(i:c)的许多临床试验，但是临床和免疫应答通常较弱或不太显著。许多合理的原因之一是ny
‑
eso
‑
1肽和tlr配体[cpg或poly(i:c)]不会彼此相互作用形成复合物或颗粒，从而导致弱免疫应答。之前已经证明dc/tat
‑
trp
‑
2疫苗可以产生强大的保护性而非治疗性免疫(王等人,2002)。在i期临床试验中，tat
‑
eso
‑
1肽与montanide isa
‑
51混合用于疫苗，所述疫苗仅产生弱t细胞应答。在此研究期间，发现了两个潜在的问题：1)tat
‑
eso
‑
1无法与montanide isa
‑
51形成稳定的复合物，可能是由于其n端带正电荷；2)tat
‑
eso
‑
1与cpg混合时形成沉淀。基于电荷和疏水性性质，设计并开发了一种具有tlr配体[cpg、mpla和poly(i:c)，简称cmi]的自组装cpp
‑
t细胞肽纳米颗粒(pep
‑
nano)的新技术，如图2a和图2b中示意性所示。两憎性或两亲性cpp
‑
治疗性肽通过电相互作用与带负电荷的cpg和/或poly(i:c)形成纳米颗粒，而通过所述颗粒内的疏水性与mpla形成纳米颗粒，所述cpp
‑
治疗性肽由具有带正电荷的肽并且共价连接到如ny
‑
eso
‑
1(sllmwitqcflpv)(seq id no:1)和trp
‑
2(syvdffvwl)(seq id no:2)等治疗性肽(通常疏水性)的如tat等cpp组成。
[0274]
实例2
[0275]
tat
‑
trp2肽与tlr配体或其组合的纳米颗粒的自组装和表征
[0276]
首先将tat
‑
trp2、tat
‑
eso
‑
1和cpg以10mg/ml的浓度完全溶解在无菌超纯水中作为储备溶液。将mpla和poly i:c以1mg/ml的浓度完全溶解在无菌超纯水中。为了制备tat
‑
肽疫苗纳米颗粒，将指示体积的cpg、mpla和poly i:c(如表3中所示)在超纯水或缓冲液中通过强烈涡旋彻底混合。
[0277]
表3
[0278]
tlr配体的浓度和组合
[0279][0280]
tat
‑
肽纳米颗粒的自组装是通过在1分钟内在冰水浴中用超声处理逐滴添加tat
‑
肽来触发的。tat
‑
trp2表现出亲水性/正电荷和疏水性，并且还促进其与cpg odn的静电相互作用。trp2肽的疏水性c端通过疏水相互作用与mpla一起形成疏水性核。静电和疏水性相互作用驱动tat
‑
trp2与两种或三种tlr激动剂自组装形成球形tat
‑
trp2
‑
cm纳米颗粒，如在代表性横截面(红色线)上的高度和dmt模量分布的afm分析所证明的。相比之下，未经tat修饰的trp2肽未能与cpg
‑
mpla形成复合物并形成长纤维。
[0281]
为了调配稳定且高效的肽疫苗纳米颗粒，使用不同比率的tat
‑
trp2肽:tlr配体优化了调配物，如表3所示，并且表征了tat
‑
trp2与不同tlr配体组合的每个纳米颗粒的大小(80
‑
150nm)(图4)。灰色条指示具有大pdi(pdi>0.5)的不稳定/多分散复合物。
[0282]
实例3
[0283]
cpp
‑
肽纳米颗粒的ζ电位
[0284]
为了确定纳米颗粒的表面电荷，测量了使用各种氮(+)与磷酸盐(
‑
)(n/p)比率(n＝来自氨基酸残基的氮；p＝cpg odn磷酸基团)构成的复合物的ζ电位。tat
‑
trp2
‑
cm纳米颗粒的ζ电位随n/p比率的不同而变化(图5)。tat
‑
trp2
‑
cm的条件#2和tat
‑
trp2
‑
cmi的条件#18(表3和图4)被应用于未来的研究。图6a和图6b示出了tat
‑
trp2
‑
cm的纳米颗粒大小，以及
tat
‑
trp2、cpg、mpla和tat
‑
trp2
‑
cm的ζ电位。使用tat
‑
eso
‑
1与cpg和mpla(cm)以及cpg、mpla和poly(i:c)(cmi)获得了类似的结果(图7a、图7b、图7c、图7d、图7e和图7f)。
[0285]
实例4
[0286]
cpp
‑
肽纳米颗粒的形成和大小均是
p
h依赖性的
[0287]
已证明tat
‑
trp2
‑
cm在ph 7.0时的纳米颗粒和ζ电位在ph 4.0时被破坏和改变(图8a、图8b和图8c)。
[0288]
为了进一步表征不同的ph 4
‑
7下的自组装和纳米颗粒大小，发现自组装和纳米颗粒在不同ph值下被破坏。在ph 7.0下，tat
‑
trp2
‑
cm的纳米颗粒紧密且大小为100nm，但在ph 6.0时大小增加，在ph 5.0时大小减小。tat
‑
trp2
‑
cm的纳米颗粒被完全破坏和分离(图9a)。基于这些结果，推断tat
‑
trp2
‑
cm纳米颗粒在吞噬作用时被apc摄取到核内体/溶酶体内，其中纳米颗粒在ph 4
‑
5中被破坏。内/溶酶体区室内的酸化增加了tat
‑
trp2的正电荷并且中和cpg odn。tat
‑
trp2肽随后被释放到细胞质中并且由er中的mhc i类或ii类分子呈递，而tlr配体结合到tlr以触发先天免疫应答并且产生细胞因子，因此增强抗原呈递和t细胞激活(图9b)。相比之下，单独的tat
‑
trp2通过细胞穿透性质进入apc，并且由apc呈递到t细胞，而没有先天免疫应答和细胞因子产生。进一步示出了ph依赖性性质适用于tat
‑
trp2
‑
cm、tat
‑
trp2
‑
cmi、tat
‑
eso
‑1‑
cm和tat
‑
eso
‑1‑
cmi(图9c)。
[0289]
实例5
[0290]
cpp
‑
肽纳米颗粒用不同tlr配体组合触发先天免疫应答和细胞因子产生
[0291]
为了鉴定刺激先天免疫应答的tlr配体的最佳组合，新鲜分离了骨髓源性dc，并且然后用不同tlr配体(单独一种)、双重或三重组合处理(图9a、图9b、图9c和图9d)。在不同tlr配体或其组合的处理后，通过elisa在细胞上清液中测定细胞因子(tnf
‑
α、il
‑
6、ifn
‑
α和ifn
‑
β)产生。发现poly(i:c)/cpg、cpg/mpla双重组合和cpg/poly(i:c)/mpla三重组合在触发先天免疫细胞因子产生方面比其它组更好。cpg/poly(i:c)/mpla三重组合是诱导细胞因子产生的最强激活剂(图10)。
[0292]
实例6
[0293]
cpp
‑
肽纳米颗粒的形成和大小是
p
h依赖性的
[0294]
尽管已经报告了使用ny
‑
eso
‑
1肽与montanide isa
‑
51加cpg或poly(i:c)的许多临床试验，但临床和免疫应答通常较弱或不太显著。许多合理的原因之一是ny
‑
eso
‑
1肽和tlr配体[cpg或poly(i:c)]不会彼此相互作用形成复合物或颗粒，从而导致弱免疫应答。之前已经证明dc/tat
‑
trp
‑
2疫苗可以产生强大的保护性而非治疗性免疫(王等人,2002)。在i期临床试验中，tat
‑
eso
‑
1肽与montanide isa
‑
51混合用于疫苗，所述疫苗仅产生弱t细胞应答。总体而言，鼠和人类临床研究示出，目前的疫苗方法未能获得强效免疫和临床应答。主要问题是癌抗原肽/蛋白质和tlr配体未共同递送到相同apc内。在大多数情况下，仅使用tlr配体之一，而不是共同递送两种或三种配体。在下面的实例中，展示了sapep
‑
nano技术可以在小鼠模型中产生强效抗肿瘤免疫，所述技术利用如tat
‑
trp2或tat
‑
eso
‑
1等两亲性cpp
‑
治疗性肽通过电相互作用与带负电荷的cpg和/或poly(i:c)形成纳米颗粒，并且通过疏水性与mpla形成纳米颗粒。
[0295]
实例7
[0296]
加载有tat
‑
trp2和tlr配体纳米颗粒的dc产生稳健抗肿瘤免疫
[0297]
为了增强抗肿瘤免疫，假设tat
‑
trp
‑
2肽可以通过物理性质(正/负电荷、亲水性和疏水性)与如cpg和mpla等tlr配体形成复合物并且诱导治疗性免疫。为了测试此预测，使用了b16小鼠模型和酪氨酸酶相关蛋白2(trp
‑
2)肽作为实验系统。tat
‑
trp
‑
2(ygrkkrrqrrrsyvdffvwl)(seq id no:17)肽与cpg/mpla形成紧密复合物(tat
‑
trp2
‑
cm)，而trp2肽未能与cpg/mpla形成复合物(trp2
‑
cm)(图3a
‑
1、图3a
‑
2、图3b
‑
1、图3b
‑
2、图3c
‑
1和图3c
‑
2)。制备加载有tat
‑
trp2
‑
cm或trp2
‑
cm的dc并且静脉内注射到携带b16肿瘤的小鼠内。16天后，检查这些经处理的小鼠的肺转移，发现与dc/β
‑
gal
‑
cm对照组相比，dc/tat
‑
trp2
‑
cm显著抑制肺转移的数量，而dc/trp2
‑
cm未能抑制肺转移的数量(图11)。
[0298]
最近示出，多阶段媒剂(msv)纳米技术可以将肽、cpg和mpla加载到硅颗粒中，并且诱导对抗b16肿瘤细胞的强烈免疫应答(朱(zhu)等人,2018)。为了比较dc/msv疫苗与dc/pep
‑
nano疫苗诱导抗肿瘤免疫和存活的能力，制备了dc/对照肽(组#1)、dc/trp2/cpg/mpla(#2)、dc/tat
‑
trp
‑
2/cpg/mpla(组#3)、dc/msv
‑
trp2/cpg/mpla(#4)和dc/msv
‑
tat
‑
trp
‑
2/cpg/mpla(#5)，并且然后注射到携带肿瘤的小鼠内(图12a)。明显地，与dc/trp
‑
2/cpg/mpla(#2)和dc/msv/trp
‑
2/cpg/mpla(#4)相比，dc/tat
‑
trp2/cpg/mpla组(#3)和dc/msv
‑
tat
‑
trp2/cpg/mpla组(#5)可以诱导更强的治疗性免疫并抑制b16肺转移而与msv无关(图12b)，这表明tat序列而非msv是产生最强免疫应答所严格必需的。更重要地，进一步示出，用dc/tat
‑
trp
‑
2/cpg/mpla免疫的小鼠比dc/msv
‑
tat
‑
trp
‑
2/cpg/mpla组中的小鼠存活时间更长，所述dc/msv
‑
tat
‑
trp
‑
2/cpg/mpla组中所有小鼠在b16肿瘤注射后35天内死亡(图12c)。其它疫苗组(dc/β
‑
gal/cpg/mpla、dc/trp2/cpg/mpla和dc/msv/trp
‑
2/cpg/mpla)在b16接种后25天内死亡。这些结果表明，tat
‑
trp
‑
2/cpg/mpla疫苗在测试的不同疫苗组中是最好的。
[0299]
实例8
[0300]
加载有tat
‑
eso
‑
1和tlr配体纳米颗粒的dc产生稳健抗肿瘤免疫
[0301]
为了研究加载有tat
‑
eso
‑1‑
cm或tat
‑
eso
‑
cmi纳米颗粒的dc是否可以诱导对抗rm1/a2
‑
eso
‑
1肿瘤细胞的强效抗肿瘤免疫，通过dc/对照肽、dc/tat
‑
eso
‑
cm或dc/tat
‑
eso
‑
cmi疫苗接种进行了实验。每两天监测肿瘤生长。发现与对照组相比，dc/tat
‑
eso
‑
cm疫苗接种显著抑制了rm1/hla
‑
a2
‑
ny
‑
eso
‑
1肿瘤生长(图13a和图13b)。重要地，dc/tat
‑
eso
‑
cmi显示出比dc/tat
‑
eso
‑
cm疫苗更强的免疫(图13a和图13b)。对免疫细胞应答的进一步分析证实，dc/tat
‑
eso
‑
cmi中的抗原特异性应答比dc/tat
‑
eso
‑
cm更好(图14a和图14b)。这些结果表明dc/tat
‑
eso
‑
cm疫苗和dc/tat
‑
eso
‑
cmi疫苗两者都产生了强效抗肿瘤免疫。
[0302]
为了进一步证明dc/tat
‑
eso
‑
cm是否可以在其它肿瘤模型中诱导治疗性抗肿瘤免疫，使用了乳腺癌e0771/a2
‑
eso肿瘤细胞作为肿瘤模型。示出了与对照相比，dc/tat
‑
eso
‑
cm疫苗接种完全抑制了肿瘤生长(图15)。
[0303]
实例9
[0304]
无dc的tat
‑
eso
‑
1/tlr纳米颗粒的直接免疫诱导强大的治疗性抗肿瘤免疫
[0305]
尽管大多数疫苗研究使用加载有抗原肽、msv颗粒或cpp
‑
肽和tlr纳米颗粒的组合的dc，但此类过程复杂且非常劳动密集，特别是对于临床试验。因此，发明人假设cpp
‑
肽/tlr纳米颗粒是否可以直接用于疫苗接种以产生强效抗肿瘤免疫。为了测试这种可能性，将携带肿瘤的小鼠用tat
‑
eso
‑
cmi免疫三次，并且与用dc/tat
‑
eso
‑
cmi免疫一次的小鼠进行
比较。结果在图16a中示出。直接接种tat
‑
eso
‑
cmi疫苗显著抑制了肿瘤生长，并且抑制程度远高于dc/tat
‑
eso
‑
cmi(图16b和图16c)。相比之下，并且如所预期的，在对照组中观察到肿瘤快速生长。
[0306]
实例10
[0307]
tat
‑
ct83肽疫苗
[0308]
已经示出ct83(也被称为cxorf61和kklc1)在人肺癌和乳腺癌中高度表达(图17a
‑
图17d、图18a和图18b)，与之前的报告一致(福山(fukuyama)等人，2006；帕雷特(paret)等人，2015)。因此，可能的是，ct83可以用作癌症疫苗和免疫疗法的免疫靶标。
[0309]
为了测试此可能性，合成了一系列含有潜在hla
‑
a2结合基序的tat连接的ct83肽(表4)。使用hla
‑
a2转基因小鼠的体内免疫，示出了具有cmi的自组装tat
‑
ct83肽纳米颗粒产生对抗ct83
‑
a2肽的强t细胞应答(图19a、图19b、图19c、图19d和图20a
‑
图20d)。hla
‑
dr13和hla
‑
dp4限制性t细胞在体外肽刺激后产生。
[0310]
为了确定tat
‑
ct83
‑
cmi是否可以产生强效抗肿瘤免疫，通过在超声下混合100μg tat
‑
ct83肽混合物(含有等量的tat
‑
ct83
‑
a2
‑
1、
‑
5、
‑
6和
‑
7，参见下表4，20μg cpg、4μg mpla和10μg poly(i:c))制备tat
‑
ct83肽疫苗用于每只小鼠。图20a中示出了使用hla
‑
a2转基因小鼠的实验设计。示出了tat
‑
ct83
‑
cmi疫苗可以强烈诱导对抗鼠乳腺癌e0771/a2/ct83细胞的强效抗肿瘤免疫(图20b和图20c)。此外，此类抗肿瘤免疫可以通过抗pd
‑
1阻断疗法进一步增强(图20b和图20c)。重要地，与未接种疫苗的小鼠相比，疫苗诱导的t细胞浸润到肿瘤组织内(图20d)。
[0311]
表4
[0312]
tat连接的ct83肽
[0313]
肽名称tat连接的肽tat
‑
ct83 a2
‑
1ygrkkrrqrrrklvelehtl(seq id no：18)tat
‑
ct83 a2
‑
2ygrkkrrqrrrllassilca(seq id no：19)tat
‑
ct83 a2
‑
3ygrkkrrqrrrylllassil(seq id no：20)tat
‑
ct83 a2
‑
4ygrkkrrqrrrrilvnlsmv(seq id no：21)ct83
‑
dp4
‑
tatsilcalivfwkyrrfqrnygrkk(seq id no：22)ct83
‑
lp1
10
‑
31
silcalivfwkyrrfqrntgem(seq id no：23)ct83
‑
lp2
66
‑
87
ilnnfphsiarqkrilvnlsmv(seq id no：24)tat
‑
ct
‑
83
‑
a2
‑
5ygrkkrrqrrrklvelehtllskg(seq id no：25)tat
‑
ct
‑
83
‑
a2
‑
6ygrkkrrqrrrklvelehtlls(seq id no：26)tat
‑
ct
‑
83
‑
a2
‑
7ygrkkrrqrrrklvelehtll(seq id no：27)tat
‑
ct
‑
83
‑
a2
‑
8ygrkkrrqrrrilnnfphsi(seq id no：28)
[0314]
1.tat
‑
eso
‑
cmi在乳腺癌中产生强抗肿瘤免疫
[0315]
类似地，在hla
‑
a2 tg小鼠中使用e0771/a2
‑
eso乳腺癌细胞进行了实验。与对照处理组相比，发现在注射肿瘤后第10天一次dc/tat
‑
eso
‑
cmi疫苗接种(1
×
106个细胞/小鼠)完全抑制了肿瘤生长(图21a、图21b和图21c)。此外，示出了在治疗模型中，接种不含dc的tat
‑
eso
‑
cmi疫苗也产生了强效抗肿瘤免疫并且抑制了肿瘤细胞生长(图21d)。
[0316]
2.tat
‑
trp2
‑
cmi或tat
‑
eso
‑
cmi疫苗与抗pd
‑
1阻断剂的组合疗法：
[0317]
为了测试sapnano疫苗是否可以与免疫检查点疗法组合，示出了与单独的tat
‑
trp
‑2‑
cmi sapnano相比，tat
‑
trp
‑2‑
cmi sapnano疫苗接种加抗pd
‑
1疗法可以进一步增强抗肿瘤免疫并延长小鼠的存活期(图22a、图22b和图22c)。具体地，tat
‑
trp2
‑
cmi加抗pd
‑
1显著延长了小鼠的存活期(图22c)。
[0318]
为了进一步测试此概念，单独用tat
‑
eso
‑
cmi疫苗接种或与抗pd
‑
1疗法组合处理携带rm1
‑
a2
‑
eso肿瘤的hla
‑
a2转基因小鼠(图23a和图23b)。示出了单独的sapnano疫苗显著抑制了肿瘤生长(图22a和图22b)。通过抗pd
‑
1阻断疗法可以进一步增强sapnano疫苗诱导的抗肿瘤免疫(图23a和图23b)。
[0319]
3.tat
‑
eso
‑
cmi疫苗与tcr
‑
t细胞免疫疗法的组合疗法
[0320]
为了测试新型sapnano疫苗是否可以增强a2
‑
eso tcr
‑
t细胞介导的抗乳腺癌免疫，使用e0771/a2
‑
eso肿瘤细胞进行了实验，并且发现过继性转移a2
‑
eso tcr
‑
t细胞后接种tat
‑
eso
‑
cmi疫苗比单独任何一种更好地抑制e0771/a2
‑
eso肿瘤生长(图24a)。值得注意的是，tat
‑
eso
‑
cmi疫苗比tcr
‑
t细胞的过继性转移诱导更强的抗肿瘤免疫(图24a)。一致地，与单独的a2
‑
eso tcr
‑
t细胞(5.5％)相比，tat
‑
eso
‑
cmi疫苗扩增了肿瘤浸润性a2
‑
eso tcr
‑
t细胞(25.9％)(图24b)。这些结果表明tat
‑
eso
‑
cmi疫苗可以在体内扩增a2
‑
eso tcr
‑
t细胞。
[0321]
为了在人源化小鼠中进一步测试此组合疗法，将人pbmc注射到nsg小鼠内以重建人免疫系统3
‑
4周。然后向这些人源化nsg小鼠注射mda
‑
mb
‑
231
‑
a2
‑
eso肿瘤细胞，然后sapnano疫苗、ny
‑
eso
‑
1tcr
‑
t细胞疗法或两者。尽管由于免疫重建后如t细胞和dc等免疫细胞有限，单独的tat
‑
eso
‑
cmi疫苗并没有显著抑制肿瘤生长，但在mda
‑
mb
‑
231
‑
a2
‑
eso乳腺癌模型中，tat
‑
eso
‑
cmi疫苗可以与eso特异性tcr工程化t细胞疗法组合，以与单独的tcr
‑
t细胞组相比产生比单独任何一个更强的抗肿瘤效应(图25a、图25b、图25c、图25d和图25e)。
[0322]
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本文关于一或多个元素使用如“包括”、“具有”、“包含”或“含有”等术语对本发明的任何方面或实施例的描述旨在提供对本发明的“由所述一或多个特定元素组成”、“基本上由所述一或多个特定元素组成”或“基本上包括所述一或多个特定元素”的类似方面或实施例的支持，除非另有说明或明确与上下文矛盾(例如，本文描述的包括特定元素的组合物应理解为还描述由所述元素组成的组合物，除非另有说明或明确与上下文矛盾)。
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根据本公开内容，无需过度实验即可制备和执行本文所公开和要求保护的所有组
合物和方法。虽然已经根据优选实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域的技术人员来说将显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以改变所述组合物和方法以及本文所描述的方法的步骤或步骤序列。更具体地说，将显而易见的是，化学和/生理学相关的某些药剂可以代替本文所描述的药剂，同时将实现相同或类似的结果。
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对于本领域的技术人员来说显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为处于由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。