用于治疗和预防微血栓形成的纤溶酶原的制作方法

用于治疗和预防微血栓形成的纤溶酶原
1.本发明涉及纤溶酶原(plg)，用于预防或治疗血栓形成症状，适用于有患微血栓风险的人群或已有微血栓症状的患者。本发明还涉及纤溶酶原(plg)，其用于一种溶解微血栓的方法，以及预防患有先天性或获得性纤溶酶原(plg)缺乏症的患者出现微血栓。
2.血栓形成事件，尤其是微血栓，会导致严重的健康问题。例如，在发达国家，冠状动脉梗塞、中风和肺栓塞是导致死亡的一些主要病因。因此，治疗和预防血栓形成事件的需求强烈。尤其是微血栓，即小尺寸的血栓形成，特别是发生在毛细血管系统中的，不太容易治疗。
3.有多种原因可能导致微血栓形成事件，例如外科手术如血管手术(例如冠状动脉搭桥手术)、内置假体的存在(即插入异物/植入物或移植物，例如，血管/血管内假体)，或狭窄的外伤。另外，还有多种其他的已知诱因。
4.治疗血栓形成的方法通常是药物治疗。为了防止血栓扩大，需要抗凝抑制(anticoagulation inhibition)，如使用肝素制剂或因子xa抑制剂。当凝块停止增大时，机体可以开始清理损伤。机体通常会分解凝块并试图再次疏通静脉(重新血管化)。这通常需要几天、几周甚至几个月的时间。静脉系统受到影响的区域越多，需要的时间就越长。在凝块分解和静脉再生过程中，会释放一些物质，其会增加血液的凝固性。
5.在此期间，再次/重复血栓形成事件的风险特别高。因此，通常避免使用另外的抗凝药物。4
‑
羟基香豆素，如苯丙香豆素、华法林或乙基香豆素，可使用约三至六个月。香豆素的使用通常需要定期进行血液检查以及特别的关注，因为这些药物可以防止血栓形成，但也会增加出血的倾向。最重要的是，抗凝治疗引起的出血风险在日常临床实践中仍然是一个未解决的问题。尽管需要进行抗血栓治疗，上述疾病中仍然需要残留一定量的凝血机制。首先，在所有手术之后，伤口愈合需要这样的机制来阻止伤口流血。凝块本身是组织修复所需的细胞(成纤维细胞)侵入的基础，其利用纤维蛋白网络来夹住伤口，构建新的胶原纤维，重建(构建)新组织。伤口的愈合通常有四个阶段：
6.阶段i
‑
止血阶段：是伤口通过凝血闭合的过程。当血液从体内泄漏时，止血就开始了。止血的第一步是血管收缩以限制血流。接下来，血小板粘在一起以封住血管壁的断裂处。最后，凝血发生并用纤维蛋白链加强血小板塞，纤维蛋白链起分子结合剂样的作用。伤口愈合的止血阶段发生得非常快。血小板在血管上皮壁破裂的几秒钟内粘附到内皮下表面。之后，纤维蛋白链在大约60秒内开始粘附。当纤维蛋白网开始形成时，血液通过促凝剂和凝血酶原的释放从液体转变为凝胶状。这样，血栓或凝块的形成使血小板和血细胞被困在伤口区域。血栓在伤口愈合阶段通常很重要，但如果它从血管壁脱离并流窜于循环系统，就可能会导致中风、肺栓塞或心脏病发作，这就会成为一个问题。众所周知，中枢性肺栓塞患者具低风险外周栓塞复发的特征是有较快的纤维蛋白凝块降解(参见kupis等，scientific reports,2019,9:72)。
7.第二阶段
‑
炎症阶段：炎症是伤口愈合的第二阶段，当受伤的血管出现渗出液(由水、盐和蛋白质组成)导致局部肿胀时，炎症就开始了。炎症既可以控制出血又可以防止感染。液体充血便于伤口愈合和修复细胞移至伤口部位。
8.在炎症阶段，受损的细胞、病原体和细菌从伤口区域清除。这些白细胞、生长因子、营养素和酶会造成伤口愈合阶段常见的肿胀、发热、疼痛和发红。炎症是伤口愈合过程的自然组成部分，只有时间过长或过度时才是问题。
9.第三阶段
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增殖期：伤口愈合的增殖期是用由胶原蛋白和细胞外基质组成的新组织重建伤口。在增殖阶段，伤口会随着新组织的形成而收缩。此外，必须构建新的血管网络，使肉芽组织保持健康并获得足够的氧气和营养。肌成纤维细胞通过抓住伤口边缘并使用类似于平滑肌细胞的机制将它们拉在一起来使伤口收缩。在伤口愈合的健康阶段，肉芽组织呈粉红色或红色，质地不均匀。此外，健康的肉芽组织不容易流血。深色肉芽组织则可能是感染、缺血或灌注不良的征兆。在伤口愈合增殖阶段的后期，上皮细胞重现损伤处。重要的是要记住，当伤口保持湿润和水分时，上皮化发生得更快。通常，在受伤后48小时内使用封闭或半封闭敷料，将会保持正确的组织湿度以优化上皮形成。
10.第四阶段
‑
成熟阶段：也称为伤口愈合的重塑阶段，成熟阶段是胶原蛋白从iii型重塑为i型并且伤口完全闭合。用于修复伤口但不再需要的细胞通过细胞凋亡或程序性细胞死亡被移除。当胶原蛋白在增殖期沉积时，它们会杂乱无章并且伤口很厚。在成熟阶段，胶原蛋白沿张力线排列，水被重新吸收，因此胶原蛋白纤维可以靠得更近并进行交联。胶原蛋白的交联减少了疤痕厚度，也使伤口的皮肤区域更强壮。通常，重塑在受伤后约21天开始，并可持续一年或更长时间。即使进行了交联，愈合的伤口区域仍然比未受伤的皮肤弱，通常只有未受伤皮肤的80％的拉伸强度。
11.伤口愈合的阶段是一个复杂而脆弱的过程。伤口愈合阶段未能取得应有的进展会导致慢性伤口。导致慢性伤口的因素是老年人的静脉疾病、感染、糖尿病和代谢缺陷。尽管有抗凝治疗，伤口愈合过程以及纤维蛋白溶解需要残留的凝血活性，其与伤口的增殖和成熟阶段并行。
12.本领域已知的大多数抗凝药物具有严重的缺点并且经常导致显着的健康风险。凝血问题可能由于例如未知的肝功能不全或抗凝药物过量引起。纤溶部位的问题目前没有得到关注。对两方面问题的关注可以帮助改善治疗的结果，因此，需要改进的治疗方案。
13.目前使用的tpa(组织纤溶酶原激活剂或upa(尿激酶))被用作间接疗法，至少需要正常的纤溶酶原(plg)水平。tpa通常将纤溶酶原(plg)激活为纤溶酶。这用于溶解可能导致连续额外组织损伤的已经形成的血栓。如果可用的纤溶酶原(plg)量不足，治疗可能会失败。在接受“溶解疗法”的所有患者中，约有三分之一发现了这一点(stubblefield wb、alves nj、rondina mt、kline ja：“可变抗纤溶酶原(plg)激活剂引发中危肺栓塞的纤维蛋白溶解”，plos one.2016 feb 11；11(2):e0148747.doi:10.1371/journal.pone.0148747.ecollection 2016；和cullis jo、chisholm m、ackery dm：“未解决的肺栓塞：纤溶的作用”，nucl med commun.1993jan；14(1):4
‑
7)。
14.不同类型纤溶酶原(plg)的混用在施用于患者时也有明显的缺点。
15.wo 2018/162754教导了可以从血浆和血浆级分，特别是低温贫血浆(cryo
‑
poor plasma)、通过一个或两个吸收步骤减少的低温贫血浆(fix/pcc或c1
‑
酯酶抑制剂)、糊剂i
‑
ii
‑
iii或辛酸糊剂，获得glu
‑
纤溶酶原，作为治疗患有器官梗塞或有发生器官梗塞风险的患者的有效药剂。
16.us 5,597,800教导了通过lys
‑
纤溶酶原治疗脑水肿。此外，还有使用纤溶酶原
(plg)作为一般性替代疗法的描述(参见shapiro等人，blood，2018，131：1301
‑
1310；schott等人，the new england journal of medicine，1998，339：1679
‑
1686)。
17.wo 2017/077380教导了纤溶酶(原)的补充性疗法。该文件没有教导预防或治疗直径小于1mm的微血栓。此外，wo 2017/077380似乎不涉及本发明的glu
‑
纤溶酶原，因为在wo 2017/077380使用的纤溶酶(原)具有显着的蛋白水解活性。在这方面，wo 2017/077380教导了其中使用的纤溶酶原降解纤维蛋白(参见wo 2017/077380，第25页，第24和25行，以及第30页，第24行)。相反，本发明的glu
‑
纤溶酶原，与纤溶酶和lys
‑
纤溶酶原不同，没有(或基本上没有)蛋白水解活性。
18.ep
‑
a 3395359教导了一种用于预防和/或去除受试者动脉和静脉血栓形成的方法。该文也没有教导预防或治疗直径小于1mm的微血栓的方法。此外，ep
‑
a 3395359未提及glu
‑
纤溶酶原。相反，ep
‑
a 3395359中教导的纤溶酶原(plg)具有蛋白水解活性，而本发明的glu
‑
纤溶酶原(基本上)没有蛋白水解活性。ep
‑
a 3395359专注于长度为810个氨基酸的蛋白质作为纤溶酶原(plg)，因此是一种不同于glu
‑
纤溶酶原的蛋白质。
19.然而，治疗和预防微血栓(即直径小于1毫米的小尺寸血栓事件)仍然特别具有挑战性。目前治疗血栓的手段主要集中在大尺寸血栓发生后的治疗。然而，预防血栓形成事件以及治疗和预防患者的微血栓形成也是需要的。
20.令人惊讶地，实验发现纤溶酶原(plg)，特别是glu
‑
纤溶酶原，可以非常有效地用作预防或治疗患者血栓形成事件，特别是微血栓的形成。
21.本发明涉及纤溶酶原(plg)，特别是glu
‑
纤溶酶原，其用于预防或治疗患者血栓形成事件的方法。更具体地，本发明涉及用于预防或治疗患者血栓形成事件的纤溶酶原(plg)，其中患者患有或有风险患有直径小于1mm的微血栓。
22.换言之，本发明涉及预防或治疗患者血栓形成事件的方法，其中向所述患者施用足量的纤溶酶原(plg)，特别是glu
‑
纤溶酶原。更具体地，本发明涉及一种用于预防或治疗患者血栓形成事件的方法，其中向所述患者施用足够量的纤溶酶原(plg)，并且其中患者处于发展或患有微血栓的风险中直径小于1毫米。
23.本发明的一个方面涉及纤溶酶原(plg)，其用于在患者中预防微血栓形成事件的方法中，其中患者处于发展直径小于1mm的微血栓的风险中。
24.本发明的另一方面涉及用于治疗患者微血栓形成事件的方法中使用的纤溶酶原(plg)，其中患者患有直径小于1mm的微血栓。
25.通常，患者患有或处于发展大量微血栓的风险中。在血栓形成事件中，患者患有或有发生至少10、至少50、至少100个微血栓的风险。
26.根据本发明，血栓形成事件是微血栓。如本文所用，术语“微血栓”(复数“微血栓”)可以从最广泛的意义上理解为在空间方向之一上具有一定微小直径的任何血栓，所述直径小于1mm(毫米)，优选小于0.9毫米，小于0.8毫米、小于0.7毫米、小于0.6毫米、小于0.5毫米、小于0.4毫米、小于0.3毫米、小于0.2毫米或小于0.1毫米。应该理解，另一空间方向的直径可以可选地彼此独立地更大或更小。一般应理解，最大直径是指，在理论上切穿微血栓时，理论上的切割长度(a theoretical cut length)，其中微血栓在该直径方向上具有最宽的空间延展。微血栓也可以是微凝血异常。
27.因此，在一个优选的实施方案中，本发明还涉及纤溶酶原(plg)，其可用于预防或
治疗患者微血栓形成的方法。
28.优选地，微血栓在三个空间方向中的两个方向上具有小于1mm、优选地小于0.9mm、小于0.8mm、小于0.7mm、小于0.6mm、小于0.5mm、小于0.4mm、小于0.3mm、小于0.2mm或小于0.1mm的最大直径。应该理解的是，其余空间方向的直径可以可选地更大或更小。
29.优选地，微血栓在所有三个空间方向上的最大直径小于3mm，优选小于2.5mm，小于2mm，小于1.5mm，小于1mm或小于0.5mm，特别是当在三个空间方向中的两个方向上同时具有小于1mm、优选小于0.9mm、小于0.8mm、小于0.7mm、小于0.6mm、小于0.5mm、小于0.4mm的最大直径时、小于0.3毫米、小于0.2毫米或小于0.1毫米。
30.优选地，微血栓的最大切片平面小于2mm2(平方毫米)、优选小于1.5mm2、小于1mm2、小于0.9mm2、小于0.8mm2、小于0.7mm2、小于0.6mm2、小于0.5mm2、小于0.4mm2、小于0.3mm2、小于0.2mm2或小于0.1mm2。通常会理解，当理论上切穿微血栓时，最大切片平面是理论切割表面积，微血栓呈现的最宽的空间范围。
31.综上所述，在一个优选实施例中，血栓事件为直径小于1mm的血管血栓。在优选的实施方案中，血栓形成事件是直径小于0.9mm、小于0.8mm、小于0.7mm、小于0.6mm、小于0.5mm、小于0.4mm、小于小于0.3mm、小于0.2mm或小于0.1mm。
32.在一个优选的实施方案中，血栓形成事件是毛细血管的血栓。在一个优选的实施方案中，微血栓是毛细血管的微血栓。
33.一般地，本发明涉及纤溶酶原(plg)及其衍生物或组合物(glu
‑
纤溶酶原、lys
‑
纤溶酶原和/或纤溶酶)。纤溶酶原(plg)/纤溶酶系统的结构和功能是众所周知的(参见aisina和mukhametova，russian journal of bioorganic chemistry，2014，40：590
‑
605)。
34.在一个特别优选的实施方案中，本发明使用的纤溶酶原(plg)是glu
‑
纤溶酶原。因此，贯穿本发明，纤溶酶原(plg)可以被指定为glu
‑
纤溶酶原。在替代的优选实施方案中，纤溶酶原(plg)是lys
‑
纤溶酶原。在另一个优选实施方案中，纤溶酶原(plg)是glu
‑
纤溶酶原和lys
‑
纤溶酶原的组合。在本文中，lys
‑
纤溶酶原和glu
‑
纤溶酶原可以以任何变化的形式组合。在另一个优选实施方案中，纤溶酶原(plg)是glu
‑
纤溶酶原和lys
‑
纤溶酶原以及一种或多种其他纤溶酶原(plg)衍生物的组合。在本文中，lys
‑
纤溶酶原和glu
‑
纤溶酶原以及一种或多种其他纤溶酶原(plg)衍生物可以以任何变化形式组合。
35.glu
‑
纤溶酶原是一种源自血浆的酶原。众所周知，glu
‑
纤溶酶原(基本上)没有蛋白水解活性。
36.优选地，给予患者的纤溶酶原组合物(优选含有glu
‑
纤溶酶原)其(基本上)没有蛋白水解活性。
37.如本领域技术人员一般理解的，可以从最广泛的意义上理解所述的(基本上)没有蛋白水解活性的涵义。优选地，给予患者的glu
‑
纤溶酶原和/或纤溶酶原组合物(优选含有glu
‑
纤溶酶原)，每1.0g/l总蛋白质含量的酶活性低于70单位(u，即μmol/min)，或低于10、低于9、低于8、低于7、低于6、低于5、低于2、低于1、低于0.5、低于0.1或低于0.01u。这里，蛋白水解活性可以通过任何方式确定。例如，它可能是由s
‑
2288(chromogenix)蛋白水解活性测定确定的活性。或者，也可以将其确定为纤维蛋白降解为d
‑
二聚体的活性。纤溶酶的比酶活性可以通过纤维蛋白降解为d
‑
二聚体来确定。优选地，给予患者的glu
‑
纤溶酶原和/或纤溶酶原组合物(优选含有glu
‑
纤溶酶原)，其蛋白水解活性低于测定的检测限。
38.在一个优选的实施方案中，给予患者的纤溶酶原组合物含有纯度为至少90％(w/w)、至少95％(w/w)、至少97％(w/w)、至少98％(w/w)、至少99％(w/w)、至少99.5％(w/w)、至少99.7％(w/w)、至少99.8％(w/w)、或至少99.9％(w/w)，基于总蛋白质含量。
39.在一个优选的实施方案中，给予患者的纤溶酶原组合物(优选含有glu
‑
纤溶酶原)不含或仅含有低于1eu/ml、低于0.5eu/ml、低于0.1eu/ml、低于0.05eu/ml，或低于0.01eu/ml的非常低的内毒素含量(根据欧洲药典(5.0版)第2.6.14章在鲎变形细胞裂解物(lal)内安全内色素测定法测定)。
40.在一个优选的实施方案中，给予患者的纤溶酶原组合物(优选含有glu
‑
纤溶酶原)不含或仅含有低于5g/l、低于2g/l、低于1g/l、低于0.5g/l，或低于0.1g/l的非常低的免疫球蛋白含量(通过比浊法测定)。
41.在一个优选的实施方案中，给予患者的纤溶酶原组合物(优选含有glu
‑
纤溶酶原)不含或仅含有极低的lys
‑
纤溶酶原含量。在一个优选的实施方案中，给予患者的纤溶酶原组合物(优选含有glu
‑
纤溶酶原)不含或仅含有非常低的白蛋白含量。
42.在一个优选的实施方案中，患者患有由纤溶酶原(plg)消耗增加、glu
‑
纤溶酶原生物合成减少或两者兼有所引起的获得性纤溶酶原(plg)缺乏症。在一个优选的实施方案中，患者患有由glu
‑
纤溶酶原消耗增加、glu
‑
纤溶酶原生物合成减少或两者兼有所引起的获得性glu
‑
纤溶酶原缺乏症。
43.在一个优选的实施方案中，患者患有获得性纤溶酶原(plg)缺乏症。在一个优选的实施方案中，患者患有由纤溶酶原(plg)消耗增加(消耗低纤维蛋白溶解)引起的获得性纤溶酶原(plg)缺乏症。纤溶酶原(plg)消耗可能是由于纤溶酶原(plg)转化为纤溶酶。这可能有多种原因，例如，由于纤维蛋白溶解系统的长期激活，例如由于凝块形成和/或一条或多条血管内部、内膜的损伤。
44.在一个优选的实施方案中，纤溶酶原(plg)是glu
‑
纤溶酶原并且患者患有获得性glu
‑
纤溶酶原缺乏症。在一个优选的实施方案中，纤溶酶原(plg)是glu
‑
纤溶酶原，且患者患有由glu
‑
纤溶酶原消耗增加引起的获得性glu
‑
纤溶酶原缺乏症。
45.在一个优选的实施方案中，患者的纤溶酶原(plg)生物合成减少。在一个优选的实施方案中，患者的glu
‑
纤溶酶原生物合成减少。例如，这种生物合成减少可能是由于编码纤溶酶原(plg)，特别是glu
‑
纤溶酶原的信使核糖核酸(mrna)的表达减少、此类mrna的错误剪接、mrna向相应多肽的翻译减少、细胞内加速mrna和/或其相应多肽的降解，或其中两种或多种情况的组合。
46.如本文所用，术语“增加”和“减少”是指与健康人群的平均值进行比较。优选地，“增加”可以是比健康人群的平均值高至少5％、至少10％、至少25％、至少50％或至少2倍的值。优选地，“降低”可以是比健康人群的平均值低至少5％、至少10％、至少25％或至少50％的值。
47.如本文所用，获得性(glu
‑
)纤溶酶原缺乏可以从最广泛的意义上理解为(glu
‑
)纤溶酶原缺乏，例如，在病人的生存期间获得。因此，这种(glu
‑
)纤溶酶原缺乏症不同于先天性(glu
‑
)纤溶酶原缺乏症。优选地，获得性(glu
‑
)纤溶酶原缺乏是由纤溶酶原(plg)消耗增加引起的。这种纤溶酶原(plg)消耗可能由本文所述的患者体内的事件引起。
48.在一个优选的实施方案中，本发明使用的纤溶酶原(plg)具有比纤溶酶低的蛋白
水解活性。在一个优选的实施方案中，本发明使用的纤溶酶原(plg)具有低蛋白水解活性或没有蛋白水解活性。在一个优选的实施方案中，本发明使用的纤溶酶原(plg)基本上没有蛋白水解活性。高蛋白水解活性可以由活性酶如tpa、纤溶酶或其他活性蛋白酶触发，这些酶优选在纯化过程中被去除。换句话说，本发明使用的纤溶酶原(plg)优选(基本上)不含蛋白水解成分。本发明使用的纤溶酶原(plg)优选基本上不含tpa、纤溶酶或其他活性蛋白酶。
49.在本发明的上下文中选择性使用glu
‑
纤溶酶原是特别有益的。血液凝固是两种抑制剂之间的平衡，即抗凝血酶iii和肝素辅因子ii。形成的纤维蛋白凝块只能通过纤溶系统的激活去除。纤溶系统的激活取决于纤溶酶的激活。人血浆含有多种激活形式的纤溶酶原(plg)，首先是glu
‑
纤溶酶原(天然)、lys
‑
纤溶酶原(轻度激活)和激活形式的纤溶酶。在健康个体中，天然glu
‑
纤溶酶原通过upa、tpa激活为glu
‑
纤溶酶是一个关键机制(sricker，rb；wong，“组织纤溶酶原(plg)激活剂对正常和凝血功能障碍血小板的纤溶酶原(plg)的激活：对表面蛋白和血小板聚集的影响”，《血液》1986，s.275
‑
280)。
50.链激酶或尿激酶在用于治疗各种血栓形成事件中有溶栓作用(kunamneni,a.；durvasula,r.“用于溶栓治疗的链激酶
‑
a药物：专利文件综述”，《心血管药物发现的最新进展》2014，106
–
121页；takada,akikazu；takada,yumiko，“通过尿激酶将glu
‑
纤溶酶原激活为lys
‑
纤溶酶的途径”，《血栓形成研究》1982，671
‑
677页)。由于纤溶酶原(plg)的激活导致纤溶酶原(plg)裂解为纤溶酶[wohl,r.c.，“不同激活剂在ph 7.4和37摄氏度下激活人纤溶酶原(plg)的动力学”，《生物化学杂志》1980，2005
–
2013页]。因此已知三种不同的激活机制[fredenburgh,j.c.；nesheim,m.e.，“lys
‑
纤溶酶原是体外纤溶过程中glu
‑
纤溶酶原激活的重要中间体”，《生物化学杂志》1992,26150
–
26156页]。纤溶酶原(plg)对内皮细胞和纤维蛋白凝块具有高结合亲和力。组织纤溶酶原(plg)激活剂(tpa)的额外结合导致激活和纤溶酶形成。通过纤溶酶原(plg)在细胞表面的结合，而被tpa激活为纤溶酶，是最后一种激活机制[sricker,r.b.；wong，“组织纤溶酶原(plg)激活剂对正常和凝血功能障碍血小板的纤溶酶原(plg)的激活：对表面蛋白和血小板聚集的影响”，《血液》1986，275
‑
280页]。但只有当药物靶标纤溶酶原(plg)在血液循环和血栓部位有足够的存在量时，这种疗法才能成功。
[0051]
纤溶酶原(plg)是一种酶原，在被纤溶酶原(plg)激活剂如组织型纤溶酶原(plg)激活剂[tpa]或尿激酶纤溶酶原(plg)激活剂[upa]部分裂解后，转化为具有蛋白水解活性的形式,即纤溶酶[pm]。pm是纤溶系统的关键蛋白质，因为它可以将纤维蛋白凝块中存在的纤维蛋白(凝血产物)降解为可溶性纤维蛋白降解产物/片段，从而导致凝块溶解。纤溶酶的产生优先地发生在纤维蛋白表面，为纤溶酶原(plg)和tpa提供结合位点。这种结合刺激纤溶酶原(plg)的激活，同时也将纤溶酶的作用定位于纤维蛋白形成的位点，从而促进有效的凝块溶解。活化的纤溶酶是纤溶系统中的关键酶。因此，只要纤溶酶与纤维蛋白凝块基质结合，它就不会被与之抗衡的抑制剂α
‑2‑
抗纤溶酶(a2ap)抑制，但游离出来的纤溶酶则会立即被其抑制。游离纤溶酶在血浆中的半衰期非常短，为0.1秒。glu
‑
纤溶酶原和α
‑2‑
抗纤溶酶(a2ap)的半衰期为50小时。相比之下，lys78
‑
纤溶酶原(plg)的半衰期仅为20小时[fredenburgh,j.c.；nesheim,m.e.；“lys
‑
纤溶酶原是体外纤溶过程中glu
‑
纤溶酶原激活的重要中间体”，《生物化学杂志》1992,26150
–
26156页]。优先裂解的选择性在纤溶酶的赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧，其选择性高于胰蛋白酶。它将聚合的纤维蛋白转化为可溶性产物[castellino,francis j.；ploplis,victoria a.“纤溶酶原(plg)/纤溶酶系统的结构
和功能”，《血栓形成和止血》2005，647
‑
654页]。
[0052]
如在本发明的上下文中使用的，术语“患者”可以从最广泛的意义上理解为任何生物，其优选地是任何动物，更优选地是包括人在内的哺乳动物，特别是人。应当理解，纤溶酶原(plg)通常与待治疗的患者属于同一物种，以避免不良的免疫原性副反应。任选地，患者还可能患有或有风险患有选自器官衰竭(例如，肾的器官衰竭如急性肾损伤/衰竭(aki)、心脏、肺、脑和静脉疾病)、动脉阻塞性疾病、微循环障碍、弥散性血管内凝血(dic)以及其中两种或多种的组合(其为特定器官衰竭的最终后果)。
[0053]
本发明通篇使用的术语弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，dic)可以是微循环。那么，它也可以被称为弥散性血管内微凝血(disseminated intravascular microcoagulation)。
[0054]
患者可能患有也可能没有患有全身性疾病。贯穿本发明，本文所用的术语“患有”可以从最广泛的意义上理解为患者已经产生与血栓形成事件相关的病症相关的病理状况。所述患者优选用纤溶酶原(plg)治疗。任选地，患者可能患有器官衰竭、血栓形成事件、动脉阻塞性疾病、微循环、弥散性血管内凝血(dic)，或其中两种或更多种病症的组合，特别是器官衰竭，即，这种病症已存在于患者中。在一个优选的实施方案中，本文所用的术语“患有”可以从最广泛的意义上理解为患者已经产生与血栓形成事件相关的病理状况。患者不一定患有疾病，但可能存在医学症状，例如酸碱紊乱(例如呼吸性碱中毒或乳酸性酸中毒)、少尿(甚至无尿)、高血糖、胰岛素需求增加、呼吸急促、低碳酸血症、低氧血症、肝功能障碍、血液学异常、氮质血症、凝血异常和缺血性结肠炎，或其中的一种或多种的并发症状。
[0055]
如上所述，本发明还涉及血栓形成事件的预防。优选地，用纤溶酶原(plg)降低此类患者发生(微)血栓形成的风险。术语“有风险”是指与整个相同物种种群的平均概率相比，患者发生血栓形成事件的概率增加。更优选地，风险增加至少5倍，甚至更优选地增加至少10倍，甚至更优选地增加至少100倍，甚至更优选地增加至少1000倍。
[0056]
在一个优选的实施方案中，本发明涉及纤溶酶原(plg)，其用于预防或治疗患者血栓形成事件的方法，其中所述患者患有器官衰竭、血栓形成事件、动脉阻塞性疾病、微循环、弥散性血管内凝血(dic)及其两种或多种的组合，尤其是器官衰竭。
[0057]
如本文所用，血栓形成事件可以是血管内形成的任何血凝块。这种血栓形成事件可能会阻碍血液在循环系统的流通。这可能导致由该血管供给的组织坏死(也称为梗塞)。在一个优选的实施方案中，血栓形成事件可以选自下组：深静脉血栓形成(dvt，例如腿部、盆腔静脉血栓形成)、栓塞中的血栓形成(例如慢性或急性器官栓塞如呼吸器官/肺栓塞)、梗塞中的血栓形成(例如心肌梗塞、肾、中风、视网膜静脉阻塞)、弥散性血管内凝血(dic)中的血栓形成和血栓性血小板减少性紫癜(ttp)。
[0058]
在优选的实施方案中，血栓形成事件是获得性血栓形成事件。在优选的实施方案中，血栓形成事件与纤溶酶原(plg)缺乏症(例如，获得性纤溶酶原(plg)缺乏症、暂时性纤溶酶原(plg)缺乏症或慢性纤溶酶原(plg)缺乏症)相关。这种纤溶酶原(plg)缺乏可以任选地由于血流中纤溶酶原(plg)的永久消耗而引起，所述血流因动脉粥样硬化斑块或动脉或其他血管的狭窄而(部分地)闭合。这种纤溶酶原(plg)缺乏可以通过测量纤溶酶的活性(用例如尿激酶激活后)或通过纤溶酶原(plg)的免疫检测很简单地观察到。
[0059]
纤溶酶原(plg)可用作直接疗法。目前使用的tpa(组织纤溶酶原(plg)激活剂或
upa(尿激酶))用作间接疗法，至少需要正常的纤溶酶原(plg)水平。tpa可将纤溶酶原(plg)激活为纤溶酶。这可用于溶解可能导致连续额外组织损伤的已经形成的血栓。这些情况下的低纤溶酶原(plg)水平可能是由体内消耗纤溶酶原(plg)蛋白，特别是glu
‑
纤溶酶原蛋白引起的。发现有微血栓形成事件的患者在(微)血栓形成事件发生后的最初48小时内，血浆中的纤溶酶原(plg)浓度通常较低。注射纤溶酶原(plg)后，在小鼠实验场景中，纤溶酶原(plg)的总水平在一段时间内增加。可以合理地推测，在其他哺乳动物(包括人类)中的纤溶酶原(plg)总水平增加也类似。此外，不仅纤溶酶原(plg)的测量值可能具有决定性意义，而且α
‑2‑
抗纤溶酶的量也具有决定性意义。增加的α
‑2‑
抗纤溶酶可能会抑制可用的纤溶酶原(plg)分子。此外，在这种情况下，注射纤溶酶原(plg)可以抗衡高浓度的α
‑2‑
抗纤溶酶，进而可能导致在关键的前48小时内的情况有所改善。
[0060]
在一个优选的实施方案中，血栓形成事件是直径小于1mm的肾血管血栓。在一个优选的实施方案中，血栓形成事件是直径小于1mm的肾毛细血管的血栓。因此，在一个优选的实施方案中，本发明还涉及纤溶酶原(plg)，其用于预防或治疗患者肾脏中微血栓形成的方法。
[0061]
在一个优选的实施方案中，患者有风险发生微血栓。在一个优选的实施方案中，患者有风险发生可以导致血栓(thrombosis)形成的微血栓。在一个优选的实施方案中，患者有风险发生可以导致大血管血栓形成的微血栓。在一个优选的实施方案中，患者有风险发生可以导致栓塞(embolization)形成的微血栓。在一个优选的实施方案中，患者有风险发生可以导致大血管栓塞形成的微血栓。在一个优选的实施方案中患者有风险发生可以导致大血管的血栓形成或栓塞形成的微血栓。
[0062]
在一个优选的实施方案中，患者患有或有风险患有动脉、静脉、小动脉、小静脉、或毛细血管的狭窄病状，或患有或有风险患有动脉、静脉、小动脉、小静脉、或毛细血管的痉挛病状，这种病状可以导致诸如脂蛋白(a)
‑
贫血、铁缺乏症、维生素d缺乏症、维生素k缺乏症、维生素h缺乏症、贫血、同型半胱氨酸血症、蛋白质z缺乏症、栓塞、中风、心肌梗塞、鼻衄、月经过多、冯维勒布兰德综合征、莫布伦格拉赫特等疾病中、肝功能障碍、抗磷脂综合征、偏头痛、甲状腺功能障碍、流产、使用纤溶酶原(plg)激活剂的裂解疗法的失败，及其两种或多种情况的组合。
[0063]
在一个优选的实施方案中，患者的血纤维蛋白溶酶原(plg)、特别是glu
‑
纤溶酶原水平低于在同一物种整体的血纤维蛋白溶酶原(plg)、特别是glu
‑
纤溶酶原的水平。
[0064]
血纤溶酶原(plg)，特别是glu
‑
纤溶酶原的这种较低的血液水平可能由多种原因引起。在一个优选的实施方案中，纤溶酶原(plg)，特别是glu
‑
纤溶酶原的较低血液水平是由一个或多个以下情况引起：纤溶酶原(plg)，特别是glu
‑
纤溶酶原，的生理性或病理性高消耗、纤溶酶原(plg)的高消除率、纤溶酶原(plg)的低表达率以及高水平的一种或多种纤溶酶原(plg)，特别是glu
‑
纤溶酶原，的抑制剂的存在。
[0065]
任选地，微血栓的形成可能是由于高凝状态存在一段时间，导致纤溶酶原(plg)(特别是纤溶酶原(plg))的消耗，或可能由低纤维蛋白溶解状态引起的微和/或大血栓的持续发展，或者两种情况均存在，可选地导致纤溶酶原(plg)的消耗。
[0066]
纤溶酶(原)抑制剂可以是抑制纤溶酶(原)活性和/或降低血纤溶酶原(plg)水平的任何化学物质。例如，纤溶酶原(plg)抑制剂可以是α
‑2‑
抗纤溶酶，其在wo2018/162754有
进一步的描述。在一个优选的实施方案中，患者的特征在于：
[0067]
(a)在患者血液中发现的α
‑2‑
抗纤溶酶与纤溶酶原(plg)(优选纤溶酶原(plg))的比率与相同种群的平均比率相比至少高1.1倍；和/或
[0068]
(b)患者血液中的纤溶酶原(plg)(优选纤溶酶原(plg))水平与相同种群的平均水平相比至少低1％(mol/mol)。
[0069]
优选地，与在同一物种的整个种群中发现的平均比率相比，在患者血液中发现的α
‑2‑
抗纤溶酶与纤溶酶原(plg)(优选纤溶酶原(plg))的比率至少高1.15倍，更优选高至少1.2倍，尤其是高至少1.25倍。
[0070]
优选地，与在同一物种的整个种群中发现的平均比率相比，患者血液中的纤溶酶原(plg)(优选纤溶酶原(plg))水平低至少2％(mol/mol)，更优选低至少5％(mol/mol)，至少10％(mol/mol)、至少20％(mol/mol)、至少30％(mol/mol)、至少40％(mol/mol)或至少50％(mol/mol)。
[0071]
在一个优选的实施方案中，对患者血液中纤溶酶原(plg)的水平进行测定，且所测定到的纤溶酶原(plg)水平，与在同一物种的整个种群中发现的平均值相比，低至少10％(mol/mol)，至少20％(mol/mol))、至少30％(mol/mol)、至少40％(mol/mol)或至少50％(mol/mol)，在这种情况下，给予患者足量的纤溶酶原(plg)以预防或治疗血栓形成事件。
[0072]
患者可能有也可能没有任何临床症状。患者可能有也可能没有任何缺血区域。在一个优选的实施方案中，患者患有至少一个局部缺血区域。在一个优选的实施方案中，患者患有至少一个局部缺血区域，如果没有向所述患者施用纤溶酶原(plg)，所述局部缺血区域则可能导致至少部分组织的坏死。
[0073]
在一个优选的实施方案中，纤溶酶原(plg)是glu
‑
纤溶酶原，且患者患有至少一个局部缺血区域，如果没有向所述患者施用glu
‑
纤溶酶原，所述局部缺血区域则可能导致至少部分组织的坏死。
[0074]
在这种情况下，优选地，施用本发明的纤溶酶原(plg)的可以至少部分地防止或溶解血栓凝块。在这种情况下，优选地，施用本发明的纤溶酶原(plg)可以至少部分地防止坏死。由于局部区域的血液供应不足而导致的这种坏死也可以被称为梗塞(infarction)。
[0075]
梗塞可以从广义上理解为由于局部区域的血液供应不足而导致的组织死亡(坏死)。
[0076]
血栓形成事件可由任何原因引起。在优选的实施方案中，血栓形成事件由梗塞、高胆固醇血症或两者引起。
[0077]
此外，血栓对动脉通路的堵塞会导致在依赖性器官(脑、心脏、肾脏、胃肠道等)中的血流路径发生梗塞。在一个优选的实施方案中，血栓形成事件是由梗塞引起的(由梗塞发病机理中的任何典型原因引起)，或由含有由高胆固醇血症引起的胆固醇晶体的动脉粥样硬化斑块破裂引起，或两者兼有。
[0078]
梗塞可以从最广泛的意义上理解为由于血液不足导致局部区域的氧气供应不足引起组织死亡(坏死)。梗塞可以是任何梗塞，例如心肌梗塞、肾梗塞、中风等。
[0079]
在替代的优选实施方案中，血栓形成事件由以下至少一种原因引起：外科手术，例如血管手术(例如，冠状动脉搭桥手术)，通过内置假体(即，插入异物，例如血管/血管内假体)、动脉瘤和狭窄外伤。在另一个替代优选的实施方案中，血栓形成事件与癌症、外伤、缺
乏运动、肥胖、吸烟、激素避孕、怀孕和产后时期、抗磷脂综合征和某些遗传状况有关。遗传风险因素可能包括抗凝血酶、蛋白c和蛋白s的缺陷，以及因子v leiden突变，还有全身性避孕药的使用，特别是与吸烟、缺乏身体活动、尤其是长期卧病不起、肥胖、脱水(exsiccosis)、癌症、既往血栓形成、或怀孕兼有时。
[0080]
患者可能遭受单个血栓形成事件或多个血栓形成事件。在优选的实施方案中，患者患有不止一个血栓形成事件。在替代的优选实施方案中，患者患有单个血栓形成事件。
[0081]
纤溶酶原(plg)可以从任何来源获得。它可以从商业来源获得或可以通过任何方式制备。例如，它可以用如wo 2018/162754中所述的方法制备。它可以从血浆和血浆组分中分离，特别是低温贫血浆、通过一或两个吸收步骤(fix/pcc或c1
‑
酯酶抑制剂)还原的低温贫血浆、糊剂i
‑
ii
‑
iii或辛酸其糊剂，如wo 2018/162754中所述。
[0082]
纤溶酶原(plg)可以通过任何方式施用于患者。在优选的实施方案中，将纤溶酶原(plg)全身性地施用于患者。在一个优选的实施方案中，纤溶酶原(plg)施用方式为静脉内(iv)、动脉内(ia)、颅内(ic)、腹膜内(ip)、肌内(im)和皮下(sc)注射，特别是通过静脉内(iv)、肌肉内(im)和皮下(sc)注射的给药途径。或者或另外地，药物组合物还可适用于其他给药途径，例如经鼻或皮肤给药。
[0083]
对于施用方式，纤溶酶原(plg)可以包含在药物组合物中，即与至少一种药学上可接受的载体组合。术语“药物组合物”和“药物制剂”可以互换理解。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“载体”和“赋形剂”在最广泛的意义上可互换地理解为可支持纤溶酶原(plg)的药理学可接受性的任何物质。这样的药物组合物可以是即用型的，且可以优选地是液体制剂，特别是注射制剂。储存形式也可以是液体，但也可以是干燥形式(例如粉末，例如包含干燥或冷冻干燥的纤溶酶原(plg)的粉末)或可以是糊剂或糖浆等。任选地，干燥形式、糊剂或糖浆可以在施用于患者之前溶解或乳化。
[0084]
药学上可接受的载体可以示例性地选自水性缓冲液、盐水、水、二甲亚砜(dmso)、乙醇、植物油、石蜡油或其两种或更多种的组合。此外，药学上可接受的载体可任选地包含一种或多种去污剂、一种或多种起泡剂(例如，十二烷基硫酸钠(sls)、二十二烷基硫酸钠(sds))、一种或多种着色剂(例如食用色素)、一种或多种维生素、一种或多种盐(例如钠盐、钾盐、钙盐、锌盐)、一种或多种保湿剂(例如山梨糖醇、甘油、甘露醇、丙二醇、聚葡萄糖)、一种或多种酶、一种或多种防腐剂(例如苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯)、一种或多种抗氧化剂、一种或多种草药和植物提取物，一种或多种稳定剂、一种或多种螯合剂(例如乙二胺四乙酸(edta)和/或一种或多种摄取介质(例如聚乙烯亚胺(pei)、细胞穿透肽(cpp))、蛋白质转导结构域(ptd)、抗菌肽等)。
[0085]
本发明还涉及可用于本发明的治疗或预防的药物组合物的剂量单位。示例性地，所述剂量单位指单剂量容器或多剂型形式。
[0086]
剂量范围可根据预期用途进行调整。在优选的实施方案中，向患者施用至少一次纤溶酶原，剂量在0.01至100mg/kg体重范围内，
[0087]
在优选的实施方案中，以0.01至1mg/kg体重的剂量向患者施用纤溶酶原(plg)至少一次。
[0088]
在一个优选的实施方案中，向患者施用至少一次纤溶酶原(plg)，剂量为0.01至0.1mg/kg体重、0.05至0.5mg/kg体重、0.1至1mg/kg体重，0.5至5mg/kg体重，1至10mg/kg体
重，或1至100mg/kg体重。
[0089]
在优选的实施方案中，采用静脉内施用单个剂量，剂量在0.01至1mg/kg的范围内。优选地，静脉内施用的单剂量在0.02至0.9mg/kg、0.03至0.8mg/kg、0.04至0.7mg/kg、0.05至0.5mg/kg、0.1至0.4mg/kg或0.25至0.35mg/kg的范围内。
[0090]
在一个优选的实施方案中，采用肌内施用单个剂量，剂量范围为0.05至10mg/kg。优选地，肌内施用的单剂量在0.1至9mg/kg、0.2至8mg/kg、0.3至7mg/kg或0.5至5mg/kg的范围内。
[0091]
在一个优选的实施方案中，采用皮下施用单个剂量，剂量范围为0.1至100mg/kg。优选地，皮下施用的单剂量在0.5至90mg/kg、1至80mg/kg、2至70mg/kg或5至50mg/kg的范围内。
[0092]
在一个优选的实施方案中，在血栓形成事件发生后的24小时内给患者至少一次纤溶酶原(plg)。在优选的实施方案中，在血栓形成事件发生后的12小时内，或至少在6、5、或4小时内，给患者至少一次纤溶酶原(plg)。
[0093]
在替代的优选实施方案中，患者在将要经历发生血栓形成事件的高风险事件之前的一周内给药。
[0094]
在另一个可选的优选实施方案中，当处于发生血栓形成事件的风险时，定期向患者给药。
[0095]
如本文所用，术语“定期”可以从最广泛的意义上理解为持续至少一周、至少一个月、至少六个月或至少一年的时间段。
[0096]
这种发生血栓形成事件的高风险事件可以是增加患者产生血栓形成风险的任何事件。在优选实施例中，这种事件是外科手术。
[0097]
这里，外科手术可以是任何手术介入，优选血管手术。如本文所用，血管手术可以从最广泛的意义上理解为选自搭桥手术(例如冠状动脉搭桥手术)、内假体(即插入异物，例如血管/血管内假体)、动脉瘤、狭窄外伤损伤的手术，以及其他血管外科干预。在这些情况下，还可能存在由血管内的伤口表面、内置假体等引起的次生血栓形成的风险。这些可能会激活凝血级联反应，导致血栓形成。对于防范凝血级联激活后这些风险，纤溶酶原(plg)的预防性给药获得令人惊讶的成功。
[0098]
发生血栓形成事件的其他额外或替代风险因素可能包括：癌症、外伤、缺乏运动、肥胖、吸烟、激素避孕、怀孕和产后时期、抗磷脂综合征和某些遗传缺陷。遗传风险因素可能包括抗凝血酶、蛋白c和蛋白s的缺陷，以及因子v leiden突变。潜在的机制可能涉及血流速度降低、凝结趋势增加和血管壁损伤的某种组合。
[0099]
发生血栓形成事件的其他额外或替代风险因素可能还包括口服避孕药(特别是雌激素减少的或不含雌激素的)，尤其是兼有吸烟、缺乏身体活动、长期卧病不起、肥胖，脱水(exsiccosis)，癌症，血栓形成史，怀孕。受深静脉血栓影响最常见的部位是腿部。有人提及大腿或小腿静脉血栓形成。如果小腿、腘窝和大腿都受到影响，则称为多节段血栓形成。盆腔静脉血栓形成不太常见，但由于其血管的尺寸和更高的肺栓塞风险，因此更危险。孕妇担心盆腔静脉血栓形成，在生产后由于子宫去除了压力，血块可能溶解，而导致肺栓塞，这可能是致命的。血栓形成和dvt的另一个并发症是弥散性血管内凝血(dic)。
[0100]
可以根据任何给药方案向患者施用纤溶酶原(plg)。
[0101]
在一个优选的实施方案中，在三天或更多天的时间段内每天一次向患者施用纤溶酶原(plg)。优选地，在至少一周、至少两周、至少四周、至少两个月或至少一年的时间段内每天一次向患者施用纤溶酶原(plg)。在一个优选的实施方案中，患者每天一次静脉内给予纤溶酶原(plg)，持续三天或更多天、至少一周、至少两周、至少四个星期、至少两个月、或至少一年。在这种情况下，单剂量可以是任何剂量范围内的单剂量。在一个优选的实施方案中，单剂量的给药可以各自在0.01至1mg/kg体重的范围内。进一步优选的剂量范围在本文中描述。
[0102]
在一个优选的实施方案中，每天一次向患者施用纤溶酶原(plg)，持续三天或更长时间，其中施用是静脉内施用，其中单剂量的静脉内施用可以各自在0.01至1的范围内毫克/公斤体重。进一步优选的剂量范围在本文中描述。
[0103]
在一个优选的实施方案中，每天一次向患者施用纤溶酶原(plg)，持续三天或更多天，其中优选施用是动脉内施用，特别是动脉内施用各自在0.01至1毫克/公斤体重范围内的单剂量。在一个优选的实施方案中，每天一次向患者施用纤溶酶原(plg)，持续三天或更长时间，其中优选施用是颅内施用，特别是颅内施用各自在0.01至1毫克/公斤体重范围内的单剂量。
[0104]
在优选的实施方案中，每两天向患者施用纤溶酶原(plg)一次，持续三天或更长时间。优选地，每两天向患者施用纤溶酶原(plg)，持续至少一周、至少两周、至少四个星期、至少两个月或至少一年的时间。在一个优选的实施方案中，患者每天一次肌肉内或静脉内，特别是肌肉内，施用纤溶酶原(plg)，持续三天或更多天、或持续至少一周、至少两周、至少四个星期，至少两个月，或至少一年。在这种情况下，单剂量可以是任何剂量范围内的单剂量。在一个优选的实施方案中，单次给药的剂量可以分别在0.05至10mg/kg体重的范围内。进一步优选的剂量范围在本文中描述。在一个优选的实施方案中，每天一次向患者施用纤溶酶原(plg)，持续三天或更长时间，其中施用是肌内施用，其中单剂量的静脉内施用可以各自在0.05至10毫克/公斤体重的范围内。进一步优选的剂量范围在本文中描述。
[0105]
在一个优选的实施方案中，每周一次对患者施用纤溶酶原(plg)，持续三周或更长时间。优选地，每周向患者施用纤溶酶原(plg)一次，持续至少两周、至少四周、至少两个月或至少一年的时间段。在一个优选的实施方案中，每周一次对患者皮下施用纤溶酶原(plg)，持续三周或更多周，优选地，持续至少两周、至少四周、至少两个月或至少一年的时间。在这种情况下，单剂量可以是任何剂量范围内的单剂量。在一个优选的实施方案中，单剂量的给药可以各自在0.1至100mg/kg体重的范围内。进一步优选的剂量范围在本文中描述。在一个优选的实施方案中，每周一次向患者施用纤溶酶原(plg)，持续三周或更长时间，其中施用是皮下施用0.1至100mg/kg体重范围内的单次剂量。进一步优选的剂量范围在本文中描述。在一个优选的实施方案中，给予患者的剂量相当于不超过血浆中正常纤溶酶原(plg)量的15％。进一步优选的剂量范围在本文中描述。在一个优选的实施方案中，给予患者的剂量相当于不超过血浆中正常纤溶酶原(plg)量的10％。进一步优选的剂量范围在本文中描述。在一个优选的实施方案中，给予患者的剂量相当于不超过血浆中正常纤溶酶原(plg)量的5％。进一步优选的剂量范围在本文中描述。
[0106]
在一个优选的实施方案中，患者每天给药一次，持续三至七天，随后每两天给药一次，持续三天或更长时间。在另一个优选实施方案中，患者每天给药一次，持续三至七天，随
后每周给药一次，持续三周或更多周的时间。在替代的优选实施方案中，患者每天给药一次，持续三至七天，随后每两天给药一次，持续三天或更多天，随后每周给药一次，持续三周或更多周的时间段。
[0107]
在给药之前，可以测试患者血液中的纤溶酶原(plg)水平。如果确定的纤溶酶原(plg)水平与同一物种的整个种群的平均水平相比至少低10％(mol/mol)，则可以向患者施用足量的纤溶酶原(plg)以达到预防或治疗血栓事件。
[0108]
因此，在一个优选实施方案中，患者是：
[0109]
(a)在治疗期间以0.01至100mg/kg体重范围内的纤溶酶原(plg)剂量至少施用一次纤溶酶原(plg)；随后
[0110]
(b)步骤(i)是确定患者血液中的纤溶酶原(plg)水平；如果所确定的纤溶酶原(plg)水平与同一物种的整个种群的平均值相比至少低10％(mol/mol)，进行步骤(ii)，即向患者施用足量的纤溶酶原(plg)以预防或治疗血栓形成事件，并且任选地
[0111]
(c)只要步骤(i)中测定的纤溶酶原(plg)水平，与同一物种的整个种群的平均值相比，至少低10％(mol/mol)，就重复进行步骤(i)和(ii)。
[0112]
本文将描述进一步优选的剂量范围和治疗间隔。
[0113]
一个治疗期是指相应治疗(例如(微)手术干预)的持续时间以及之后的短暂时间，这个短暂时间例如是相应治疗后的最多一天、最多两天、最多一周，或长达一个月。
[0114]
患者可能患有或可能不患有疾病。在一个优选的实施方案中，患者患有深静脉血栓形成、盆腔静脉血栓形成、肺栓塞、任何器官的梗塞、视网膜静脉阻塞、弥散性血管内凝血(dic)、血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、与血栓形成事件同时发生的在毛细血管流动路径中的血管病(特别是糖尿病性血管病)、血栓性静脉炎，或其两种或多种的组合。
[0115]
在优选的实施方案中，患者患有弥散性血管内凝血(dic)、急性肾/肾组织损伤(aki)、败血症或其两种或更多种的组合。
[0116]
在一个优选的实施方案中，患者患有弥散性血管内凝血(dic)。在一个优选的实施方案中，患者患有急性肾/肾组织损伤(aki)。在一个优选的实施方案中，患者患有败血症。
[0117]
在一个优选的实施方案中，患者处于发生血栓形成事件的风险中，因为所述患者患有动脉粥样硬化或动脉狭窄，已经接受或正在接受手术，特别是血管手术(包括血管重建和/或搭桥手术)，和/或具有内置假体(例如，血管/血管内置假体)。搭桥手术还可能包括血管移植(vascular grafting)。在一个优选的实施方案中，患有血栓形成事件的患者同时患有或曾经患有动脉粥样硬化或动脉狭窄，已经接受或正在接受手术，特别是血管手术(包括血管重建和/或搭桥手术)，和/或具有内置假体(例如，血管/血管内置假体)。
[0118]
以下实施例和附图旨在提供本发明的说明性实施例。这些实施例并不旨在对本发明主题的范围提供任何限制。以下的附图、实施例和权利要求将进一步说明本发明。
[0119]
附图简述
[0120]
图1显示给予10mg/kg胆固醇的小鼠的肾小球滤过率(gfr)的降低，表达为相对于未治疗小鼠的百分比变化(cc组)；给予小鼠10mg/kg胆固醇，随后在给予胆固醇后4小时后，给予132μl包含65μg/ml glu
‑
纤溶酶原的组合物(cc+glu
‑
p组)；和小鼠给予了132μl的组合物，该组合物包含65μg/ml的glu
‑
纤溶酶原(pbs+glu
‑
p组)，均为24小时后的结果。
[0121]
图2显示了未治疗小鼠的肾小球滤过率(gfr)的降低，以微升/分钟的流速表示(基
线组)；小鼠给予了10mg/kg胆固醇(cc组)；小鼠给予了10mg/kg胆固醇，随后在给予胆固醇后4小时给予132μl包含65μg/ml glu
‑
纤溶酶原的组合物(cc+glu
‑
p组)；和小鼠给药了132μl包含65μg/ml glu
‑
纤溶酶原(pbs+glu
‑
p)的组合物，均为24小时后的结果。
[0122]
图3显示了用10mg/kg胆固醇给药的小鼠的梗塞面积(cc组)，以整个肾脏的百分比表示；小鼠给予了10mg/kg胆固醇，随后在给予胆固醇后4小时给予132μl包含65μg/ml glu
‑
纤溶酶原的组合物(cc+glu
‑
p组)；和小鼠给予了132μl包含65μg/ml glu
‑
纤溶酶原(pbs+glu
‑
p组)的组合物，均为24小时后的结果。
[0123]
图4显示了纤溶酶原(plg)水平降低患者(n＝600)的诊断频率百分比，纤溶酶原(plg)缺乏症(黑色)和非纤溶酶原(plg)缺乏症(灰色)。
[0124]
图5显示了不同患者组的α
‑2‑
抗纤溶酶(a2ap)活性，无疾病/对照人群(norm)、脂蛋白(a)(lpa)、缺铁(iron)、维生素d缺乏(vitd)、维生素k缺乏(vitk)、维生素h缺乏症(vith)、贫血症(anaem)、同型半胱氨酸水平(hcys)、蛋白z缺乏症(pz)、血栓形成(thromb)、栓塞(emb)、中风(stroke)、心肌梗塞(mi)、外延(epist)、月经过多(hm)、von willebrand综合征(vws)、morbus meulengracht(meul)、肝病(li)、抗磷脂病(apl)、偏头痛(migr)、甲状腺疾病(tyr)、流产(abort)。
[0125]
图6显示了不同患者组中的纤溶酶原(plg)活性(缩写与图5中使用的缩写相同)。
[0126]
图7显示了不同患者组中α
‑2‑
抗纤溶酶与纤溶酶原(plg)(a2ap/plg)的活性比率(缩写与图5中使用的相同)。
[0127]
图8显示了与一组急性肾损伤/衰竭患者(aki)相比，对照组(cp)的纤溶酶原(plg)活性。
[0128]
图9显示了与一组急性肾损伤/衰竭患者(aki)相比，对照组(cp)的α
‑2‑
抗纤溶酶(a2ap)活性。
[0129]
图10显示了与一组急性肾损伤/衰竭患者(aki)相比，对照组(cp)的α
‑2‑
抗纤溶酶:纤溶酶原(plg)(a2ap/plg)的活性比率。
[0130]
图11显示了与一组弥散性血管内凝血患者(dic)相比，对照群体(cp)的纤溶酶原(plg)活性。
[0131]
图12显示了与一组弥散性血管内凝血患者(dic)相比，对照群体(cp)的α
‑2‑
抗纤溶酶(a2ap)活性。
[0132]
图13显示了与一组弥散性血管内凝血患者(dic)相比，对照群体(cp)的α
‑2‑
抗纤溶酶:纤溶酶原(plg)(a2ap/plg)的活性比率。
[0133]
图14显示了与一组败血症患者(sepsis)相比，对照组(cp)的纤溶酶原(plg)活性。
[0134]
图15显示了与一组败血症患者(sepsis)相比，对照组(cp)的α
‑2‑
抗纤溶酶(a2ap)活性。
[0135]
图16显示了与一组败血症患者(sepsis)相比，对照组(cp)的α
‑2‑
抗纤溶酶:纤溶酶原(plg)(a2ap/plg)的活性比率。
[0136]
图17为获得性纤溶酶原(plg)缺乏症的诊断研究总结。在此，对纤溶酶原(plg)活性百分比进行了测量。发现与对照人群(cp)相比，40％的急性肾/肾损伤(aki)患者和62％的弥散性血管内凝血(dic)患者呈现统计学上显着的纤溶酶原(plg)缺乏。
实施例
[0137]
glu
‑
纤溶酶原制剂的制备
[0138]
glu
‑
纤溶酶原按照wo 2018/162754实施例1中的描述制备，基于总蛋白质含量，纯度大于95％(w/w)。人glu
‑
纤溶酶原制剂含有1256μg/ml glu
‑
纤溶酶原(通过酶联免疫吸附试验，elisa测定)。
[0139]
所述制剂的总蛋白质含量为1259μg/ml(由bradford蛋白质测定法测定)。因此，基于总蛋白质含量，glu
‑
纤溶酶原的纯度>99.7％(重量)。十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)的结果也证实了其高纯度。
[0140]
glu
‑
纤溶酶原的蛋白水解活性低于检测限，采用标准化s
‑
2288(chromogenix)蛋白水解活性测定法测定，以总蛋白含量为标准，单位为1.0g/l总蛋白含量。
[0141]
人glu
‑
纤溶酶原制剂仅包含可忽略不计的内毒素水平低于1eu/ml(根据欧洲药典(5.0版)第2.6.14章在鲎变形细胞裂解物(lal)内安全内色素测定法测定)，以及<0.35g/l igg、<0.05g/l iga和<0.35g/l igm(均以比浊法测定法确定)。检测不到白蛋白(通过多色终点法测定)和赖氨酸
‑
纤溶酶原(通过蛋白质印迹法法测定)。
[0142]
在进一步的生物活性测试中，人glu
‑
纤溶酶原的浓度设置为200μg/ml，然后激活为纤溶酶。这对应于血液中天然存在的纤溶酶浓度范围。获得的纤溶酶溶液的蛋白水解活性通过纤溶酶对硝基苯酚标记(pnp
‑
标记)肽底物测定。结果发现，与天然存在于血浆的纤溶酶蛋白水解活性(视为为100％)相比，该制剂的蛋白水解纤溶酶活性在109％的范围内。因此，说明人glu
‑
纤溶酶原具有完全的生物活性，并且可以转化为完全活性的纤溶酶。
[0143]
示例1
[0144]
动物模型(胆固醇晶体诱导小鼠微血栓)
[0145]
触发肾脏中微血栓的形成
[0146]
在每个小鼠通向肾脏的血管中注射100微升的10毫克/千克胆固醇(cc)。注射的时间点视为是时间点零(0小时)。结果发现胆固醇会导致肾脏较小血管中血块的形成，特别是在肾毛细血管中。
[0147]
纤溶酶原(plg)治疗
[0148]
glu
‑
纤溶酶原如wo 2018/162754实施例1所述方法制备，纯度>95％(w/w)，性能如上所述。保留一些仍未接受治疗的小鼠。在给予胆固醇后4小时，每只治疗的小鼠静脉内(i.v.)注射132μl的65μg/ml glu
‑
纤溶酶原的组合物(在磷酸盐缓冲盐水中)。同时在胆固醇给药4小时后注射磷酸盐缓冲盐水作为未治疗的对照组。作为额外的对照组，注射pbs代替cc，并在4小时后注射132μl的65μg/ml glu
‑
纤溶酶原的组合物(在磷酸盐缓冲盐水中)。
[0149]
测量数据
[0150]
胆固醇给药后24小时，测定肾小球滤过率(gfr)。此外，通过用肾组织的氯化三苯基四唑鎓(ttc)染色来确定肾中的梗塞大小。此外，对处死的小鼠进行组织学检查，例如，通过确定肾小管损伤(pas)、内皮损伤(cd31)和中性粒细胞免疫细胞过滤的评分。
[0151]
结果和讨论
[0152]
定量结果如图1至3所示。发现给予胆固醇会引起微血栓。这些也在24小时后小鼠肾脏的组织学观察中证实。发现这些微血栓对肾小球滤过率(gfr)具有显着影响(参见图1和图2，其为包括胆固醇(cc)的样本)并导致超过一半(50％)的肾组织坏死(参见图3，其为
仅包含胆固醇(cc)的样品)。单独使用(glu
‑
)纤溶酶原对肾小球滤过率(gfr)没有有显着影响(参见图1和图2，右侧)。它也不会恢复受胆固醇给药引起的微血栓对肾小球滤过率(gfr)的影响(参见图1和图2，样本包括胆固醇(cc)和(glu
‑
)纤溶酶原(glu
‑
p))。
[0153]
然而，施用(glu
‑
)纤溶酶原有效地防止了组织坏死(参见图3，样本包括胆固醇(cc)和(glu
‑
)纤溶酶原(glu
‑
p))。与仅给予胆固醇时出现的坏死相比，坏死减少了一半。因此，(glu
‑
)纤溶酶原有效地减少了梗塞面积。
[0154]
这些结果表明，施用(glu
‑
)纤溶酶原可有效治疗和预防患有(微)血栓的患者。
[0155]
根据本发明生产的(glu
‑
)纤溶酶原，在(微)血栓形成事件中，令人惊讶地具有高且优异的纤维蛋白溶解活性。可能的假设是(但不受此理论的束缚)，(glu
‑
)纤溶酶原可溶解已存在的微血栓，可用于预防微血栓和/或大血栓事件的出现。这种(微)血栓形成事件通常是梗塞的原因，例如心肌梗塞、中风以及肾梗塞、视网膜静脉阻塞、血栓性血小板减少性紫癜等。
[0156]
示例2
[0157]
由纤溶酶原(plg)消耗引起的获得性纤溶酶原(plg)缺乏症的临床表现。
[0158]
一般而言，当纤溶酶原(plg)，特别是glu
‑
纤溶酶原消耗量增加时，可能会出现获得性纤溶酶原(plg)缺乏症。这可能出现在任何类型的具有较长发病史的血栓形成事件，例如在动脉粥样硬化中。血管内部，内膜的损伤可能会持续更长的时间。这将首先导致凝血系统持续但轻微的激活，持续地将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。只要没有形成能够阻塞整个血管直径的凝块，血流仍然可以进行。这种凝块可能会持续地激活纤溶系统。这样，纤溶酶原(plg)(例如，glu
‑
纤溶酶原)将转化为纤溶酶，因此，纤溶酶原(plg)(例如，glu
‑
纤溶酶原)将被消耗。目前，有两种治疗方法：首先，在没有形成闭塞凝块之前，抑制凝血(例如通过维生素k拮抗剂)就足够了。当凝块形成后(这可能导致，例如，心肌梗塞、中风等)，到目前为止，唯一的选择是溶栓治疗。这通常是通过tpa、upa或链激酶激活纤溶酶原(plg)来实现。
[0159]
使用上述三种药物中的一种均需要存在靶向酶纤溶酶原(plg)。然而，在上述获得性纤溶酶原(plg)缺乏症的情况下，溶栓疗法的目标不再存在。令人惊讶地发现，在这种情况下以及在任何其他获得性纤溶酶原(plg)(例如，glu
‑
纤溶酶原)缺陷中，这种蛋白质的替代性治疗有助于挽救这些患者的生命。
[0160]
当血栓形成时，血浆中的纤溶酶原(plg)(例如，glu
‑
纤溶酶原)将由于局部活化而被消耗。在单个大血栓或许多个微血栓中纤维蛋白量越高，尤其是在较长时间的情况恶化时，纤溶酶原(plg)的消耗量通常越高。这可能会导致暂时性获得性纤溶酶原(plg)缺乏，将平衡倾斜到低纤维蛋白溶解状态，从而导致准血栓状态(参见图4)。纤溶酶原(plg)水平降低已在多种情况下显示出来，包括败血症肝病心肌梗塞、阿根廷出血热，以及l
‑
天冬酰胺酶治疗、溶栓治疗和手术后。由于蛋白质在纤维蛋白溶解中的重要作用，纤溶酶原(plg)水平降低可能会损害身体降解纤维蛋白的能力，从而使其易患血栓形成/血栓性疾病。
[0161]
因此，血栓形成疾病的原因既可能是高凝状态，也可能是低纤维蛋白的溶解。目前的治疗仅是通过使用肝素、华法林或f.x拮抗剂来针对(高)凝血。
[0162]
令人惊讶地发现，纤溶酶原(plg)的消耗导致纤维蛋白溶解的减退，这也可以称之为暂时性获得性纤溶酶原(plg)(例如，glu
‑
纤溶酶原)缺乏症。因此，本发明发现对暂时性获得性纤溶酶原(plg)(例如，glu
‑
纤溶酶原)缺乏症的治疗能够解决血栓性疾病。对高患病
率和危及生命状态的疾病的诊断性研究为这一发现提供了证据。
[0163]
示例2.1
[0164]
急性肾损伤/衰竭(aki)
[0165]
多器官衰竭，也称为“多器官功能障碍综合征”(mods)，肾脏是其所涉及的器官之一。这种疾病的定义是患者出现器官功能改变，且在没有干预的情况下无法维持体内平衡的急性疾病。mods可能最终导致多器官衰竭综合征(mofs)和死亡。急性肺损伤(ali)和急性呼吸窘迫综合征(ards)是mods或mofs的常见表现。然而，除败血症以外的其他情况也会导致mods，包括外伤、烧伤和严重的失血性休克。多器官功能障碍，是极端的状态，是逐渐严重的个体器官生理紊乱(即一系列过程而不是单个事件)。器官功能改变的程度大不相同，从轻度器官功能障碍到明显的器官功能衰竭(如败血症的多器官功能衰竭、全身炎症反应综合征(sirs)、中毒性休克综合征和败血性血栓性静脉炎)。
[0166]
在急性肾功能衰竭中，肾脏中的微循环减少，不再产生尿液。因而对肾功能及其恢复可能进行客观评估。
[0167]
在患有急性肾损伤/衰竭(aki)且发病时间较长的患者中，与没有血管疾病的患者相比，纤溶酶原(plg)水平相当低。与曼海姆大学医院临床化学系(ikc)合作开展了一项针对这个课题的研究。到2018年3月，收集了77名患者的柠檬酸血浆样本，并储存在
‑
40℃以下。在din en iso 15189认证实验室中，用bcs xp分析仪(siemens healthcare)按批测量所有样品的纤溶酶原(plg)和α
‑2‑
抗纤溶酶。在相同条件下，使用一组53名健康者血浆作为对照。根据mann
‑
whitney，使用u
‑
test评估结果。
[0168]
在曼海姆临床化学系(ikc)的第一项验证性研究中，选择急性肾内肾衰竭患者，随后选择急性肾损伤网络(akin)患者。关键参数：肌酐升高至标准值的1.5倍，同时尿量减少。
[0169]
研究纲要：急性肾损伤/衰竭(aki)
[0170]
·
参数：alpha
‑2‑
抗纤溶酶(a2
‑
ap)、纤溶酶原(plg)、活性比率r＝血液样本中的a2
‑
ap/纤溶酶原(plg)，这也用于标准诊断
[0171]
·
77名急性肾损伤/衰竭(aki)患者
[0172]
·
53个对照人群(健康献血者)(cp)
[0173]
结果通过mann
‑
whitney检验分析并显示：
[0174]
·
aki患者呈现显着(**)获得性纤溶酶原(plg)缺乏
[0175]
·
aki患者呈现显着(**)获得性α
‑2‑
抗纤溶酶缺乏症
[0176]
·
(a2ap/plg)的活性比没有显着差异
[0177]
表1.aki患者与对照组的纤溶酶原(plg)活性结果总结
[0178]
表分析数据栏acp
‑
纤溶酶原(plg)(对照组)栏baki
‑
纤溶酶原(plg)(aki患者组)曼惠特尼检验： p值(高斯近似)0.0031p值汇总**中位数是否有显着差异？(p<0.05)是单尾或双尾p值？双尾
栏a、b的评分总和4096,4420曼惠特尼u1417
[0179]
急性肾损伤/衰竭(aki)的曼惠特尼检验(mann
‑
whitney test)表明纤溶酶原(plg)活性存在显着差异。在患者(ptx
‑
77)和对照组(cp
‑
53)中，p＝0.0031。结果如图8所示。
[0180]
表2.aki患者与对照组的α
‑2‑
抗纤溶酶活性结果总结
[0181][0182][0183]
急性肾功能衰竭的mann
‑
whitney试验显示α
‑2‑
抗纤溶酶活性存在显着差异。在患者(ptx
‑
77)和对照组(cp
‑
53)中，p＝0.0011。结果如图9所示。
[0184]
表3.aki患者与对照组的α
‑2‑
抗纤溶酶与纤溶酶原(plg)比率结果总结
[0185]
表分析数据栏acp比率(对照组)栏baki比率(aki患者组)曼惠特尼检验 p值(高斯近似)0.1241p值汇总**中位数是否有显着差异？(p<0.05)没有单尾或双尾p值？双尾栏a、b的评分总和3147,5369曼惠特尼u1716
[0186]
急性肾衰竭的mann
‑
whitney检验显示患者(ptx
‑
77)和对照组(cp
‑
53)的活性比率(a2ap/plg；p＝0.1241)无显着差异。结果如图10所示。
[0187]
示例2.2
[0188]
弥散性血管内凝血(dic)
[0189]
弥散性血管内(微)凝血(dic)患者的验证研究由曼海姆临床化学系(ikc)进行。
[0190]
dic患者通过d
‑
二聚体水平和内部标准确定。
[0191]
研究大纲
‑
dic：
[0192]
·
参数：α
‑2‑
抗纤溶酶(a2
‑
ap)、纤溶酶原(plg)活性。d
‑
二聚体，比率r＝血样中的
a2
‑
ap/纤溶酶原(plg)，其也用于标准诊断
[0193]
·
13名dic患者(dic)
[0194]
·
53个对照群体(cp)
[0195]
结果通过mann
‑
whitney检验分析，显示：
[0196]
·
dic患者出现显着(**)的获得性纤溶酶原(plg)缺乏
[0197]
·
dic患者没有获得性α
‑2‑
抗纤溶酶缺乏症
[0198]
·
a2ap/plg基于活性的比率存在显着(***)差异
‑‑
>纤维蛋白溶解抑制增加
[0199]
表4.dic患者与对照组的纤溶酶原(plg)活性结果总结
[0200]
表分析plg栏acp
‑
纤溶酶原(plg)(对照组)栏bdic
‑
纤溶酶原(plg)(dic患者组)曼惠特尼检验 p值(高斯近似)0.0013p值汇总**中位数是否有显着差异？(p<0.05)是单尾或双尾p值？双尾栏a、b的评分总和2256,519曼惠特尼u288.0
[0201]
dic的mann
‑
whitney检验显示纤溶酶原(plg)活性存在显着差异。在患者(ptx
‑
13)和对照组(cp
‑
53)中，p＝0.0013。结果如图11所示。
[0202]
表5.dic患者与对照组的α
‑2‑
抗纤溶酶活性结果总结
[0203][0204][0205]
dic的mann
‑
whitney检验显示α
‑2‑
抗纤溶酶活性没有显着差异。在患者(ptx
‑
13)和对照组(cp
‑
53)中，p＝0.073。结果如图12所示。
[0206]
表6.dic患者与对照组中α
‑2‑
抗纤溶酶与纤溶酶原(plg)的比率结果总结
[0207]
表分析比率
‑
dic栏acp比率(对照组)栏bdic比率(dic患者组)
曼惠特尼检验 p值(高斯近似)<0.0001p值汇总***中位数是否有显着差异？(p<0.05)是单尾或双尾p值？双尾栏a、b的评分总和1634,1141曼惠特尼u203.0
[0208]
dic的mann
‑
whitney检验显示患者(ptx
‑
13)的a2ap/plg活性比率较对照组(cp
‑
53)显着增加(p<0.0001)。结果如图13所示。
[0209]
总之，在一项有53名健康人对照人群(cp)，77名急性肾/肾损伤(aki)患者，和21名弥散性血管内凝血(dic)患者的研究中，40％的aki患者和62％的dic)患者，与对照人群(cp)相比，显示出统计学上显着的纤溶酶原(plg)缺乏症。这里，mann
‑
whitney检验显示cp与aki的中位数四分位间距p>0.003，而cp与dic的中位数四分位间距p>0.001。结果如图17所示。
[0210]
示例2.3
[0211]
败血症
[0212]
败血症患者的验证研究在曼海姆临床化学系(ikc)进行，根据d
‑
二聚体和内部标准进行鉴定。
[0213]
研究大纲
‑
败血症：
[0214]
·
参数：α
‑2‑
抗纤溶酶(a2ap)、纤溶酶原(plg)活性、
[0215]
比率r＝血液样本中的a2
‑
ap/纤溶酶原(plg)、pctp、dd，其也用于标准诊断。
[0216]
·
9名败血症患者(sepsis)
[0217]
·
53个对照群体(cp)
[0218]
结果通过mann
‑
whitney检验分析，显示：
[0219]
·
败血症患者呈现显着(*)获得性纤溶酶原(plg)缺乏症
[0220]
·
败血症患者无获得性α
‑2‑
抗纤溶酶缺乏症
[0221]
·
a2ap/plg活性比率也没有显着差异
[0222]
表7.败血症患者与对照组的纤溶酶原(plg)活性结果总结
[0223]
表分析
[0224]
表分析败血症
‑
plg栏acp
‑
纤溶酶原(plg)(对照组)栏b败血症
‑
纤溶酶原(plg)(脓毒症患者组)曼惠特尼检验 p值(高斯近似)0.0377p值汇总*中位数是否有显着差异？(p<0.05)是单尾或双尾p值？双尾栏a、b的评分总和1774,179曼惠特尼u134.0
[0225]
mann
‑
whitney检验显示纤溶酶原(plg)活性存在显着差异：患者(ptx
‑
9)和对照组(cp
‑
53)的p＝0.0377。结果如图14所示。
[0226]
表8.败血症患者与对照组的α
‑2‑
抗纤溶酶活性结果总结
[0227][0228][0229]
mann
‑
whitney检验显示α
‑2‑
抗纤溶酶活性无显着差异：患者(ptx
‑
9)和对照组(cp
‑
53)的p＝0.0704。结果如图15所示。
[0230]
表9.败血症患者与对照组中α
‑2‑
抗纤溶酶与纤溶酶原(plg)的比率结果总结
[0231]
表分析sepsis
‑
ratio栏acp比率(对照组)栏b脓毒症比率(脓毒症患者组)曼惠特尼检验 p值(高斯近似)0.2182p值汇总无显着差异(ns)中位数是否有显着差异？(p<0.05)没有单尾或双尾p值？双尾栏a、b的评分总和1608,345.5曼惠特尼u176.5
[0232]
mann
‑
whitney检验显示，与对照组(cp
‑
53)相比，患者(ptx
‑
13)的a2ap/plg活性比值有增加但不不显着(p＝0.2182)。结果如图16所示。
[0233]
示例2.4
[0234]
对照人群
[0235]
原始数据：来自血浆库中心的健康血浆供体对照人群(cp)中纤溶酶原(plg)和a2ap的测量值。
[0236]
对照人群plg参考范围：90％至144％；a2ap参考范围：97％到119％；二者的比率：0.80至1.25。
[0237]
表10.对照人群的纤溶酶原(plg)和a2ap的标准化活性(平均活性标准化为100％)
[0238]
[0239][0240]
[0241]
示例2.5
[0242]
因纤溶酶原(plg)消耗而导致获得性纤溶酶原(plg)缺乏症患者的诊断在波恩的凝血障碍与输血医学中心(f
ü
rund transfusionsmedizin,cbt)，对总共6000名(来自全科医院/家庭诊所)的非急性状态的病人测量纤溶酶原(plg)水平，选择其中所有纤溶酶原(plg)水平降低的病人，对其进行分析(n＝700，11.6％)。对纤溶酶原(plg)水平降低的患者的确诊频率进行的分析表明许多是在纤溶酶原(plg)缺乏不可预期的情况下确诊的。结果显示在图4和表11中。在cbt进行了一项前瞻性研究用以证明这些发现。同时，还对具有相同诊断的急性患者进行了平行前瞻性研究。
[0243][0244]
表11描述了线性回归r2＝r的相关系数。这是在计算机程序microsoft excel(使用德语版本中的“korrel”函数)中通过将每两个参数相互关联来计算的。计算值为相关率，
表明两个参数之间是否存在统计学上的相关性。如相关率r为
‑
0.5>r<0.5则表示没有相关性或相关性较弱。
‑
1.0至
‑
0.5或0.5至1.0的相关率r，则表示显着相关。因此可见，仅plg与ratio和quick与pro c act存在显着相关性。
[0245]
在表11中，符号代表的参数为：plg＝纤溶酶原[iu/ml]；quick＝快速[秒]；thrombin time＝凝血酶时间[秒]；aptt＝活化部分凝血活酶时间[秒]；prot c act＝蛋白c激活[iu/ml]；apc ratio＝活化蛋白c抗性[％]；atiii＝抗凝血酶iii[％]；a2ap＝α
‑2‑
抗纤溶酶[％]；ratio＝a2ap/plg比例，pai
‑
1＝纤溶酶原激活物抑制剂
‑
1[ng/ml]，pap complex＝纤溶酶原
‑
抗纤溶酶复合物；d
‑
dimer＝d
‑
二聚体；plt＝血小板[x106/μl]；crp＝c
‑
反应蛋白[μg/ml]
[0246]
表12.不同患者组的p值结果
[0247][0248][0249]
在这项研究中，纤溶酶原(plg)被确定为一个独立的参数。除了在存在纤溶酶原
(plg)情况下与(基于活性的)比值(a2ap/plg)有较弱的相关性之外，其与凝血或纤溶系统的任何其他参数均无相关性。因为所有样本均来自非急性患者，本研究中仅存在少数急性心肌梗死患者，所选患者群体(其纤溶酶原(plg)水平低)显示a2ap水平正常。