优化的疫苗组合物及其制备方法与流程

优化的疫苗组合物及其制备方法
1.交叉引用
2.本技术要求2019年2月21日提交的美国临时申请号62/808,760和2019年3月13日提交的美国临时申请号62/817,902的权益，其各自通过引用以其全文并入本文。


背景技术：

3.病原体，例如感染性细菌、寄生虫、真菌、病毒和癌症，已经进化出各种策略以逃逸宿主免疫应答的检测和中和。此类策略通常可破坏针对这些病原体的疫苗的成功开发并使之复杂化。快速突变可使疫苗设计复杂化。接种疫苗能够使宿主在感染前产生保护性抗体。这可以通过使宿主的免疫系统暴露于一种或多种病原体的一种或多种抗原来实现。当对相对缓慢突变的疫苗如此处理时，可以获得单一疫苗匹配和提供保护的多年窗口期，并且疫苗可以获得成功。
4.针对快速突变病原体的疫苗接种可提供有限的保护，例如，因为针对疫苗的免疫系统应答可能变得过时。在一些情况下，因抗原随时间变化，疫苗可能变得过时。这可能导致需要定期或半定期(例如每年)使用新疫苗。在一些情况下，此类疫苗提供的保护可能有所不同，并且一些疫苗可能在某些时期或几年内提供的保护较差。这可能是由于对下一季节可能流行的病毒株的错误预测。在一些情况下，例如对于普通感冒，这种快速突变可阻止疫苗的有效性。


技术实现要素：

5.本公开内容提供了疫苗，所述疫苗包含代表微生物的第五级进化枝的至少60％的一组抗原。
6.本公开内容还提供了疫苗，所述疫苗包含微生物的一组抗原，其中所述抗原中的两种之间的最小配对编辑距离为所述抗原的平均大小的至少10％，并且所述抗原中的两种之间的最大配对编辑距离不超过所述抗原的平均大小的98％。
7.本公开内容还提供了疫苗，所述疫苗包含代表微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原。
8.在一些实施方案中，在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的其他成员具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多40％。在一些实施方案中，在以下条件下抗原代表进化枝：如果编辑距离为所代表的进化枝的另一株系(strain)大小的至多5％。在一些实施方案中，在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、96％、97％、98％或99％具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多20％。在一些实施方案中，在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、96％、97％、98％或99％具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多10％。在一些实施方案中，在以下条件下所述抗原代表进化枝：如果所述编辑距离为所代表的进化枝的所有株系的95％、96％、97％、98％或99％的大小的至多5％。在一些实施方案中，在以下条件下抗原代
表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的编辑距离为至多25。在一些实施方案中，在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的编辑距离为至多100。在一些实施方案中，在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列存在于所述进化枝中。
9.本公开内容还提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含一组抗原，其中所述抗原衍生自微生物变体文库，其中：a)所述组中具有最大编辑距离的两种抗原的编辑距离为s；b)所述文库中具有最大编辑距离的两种抗原的编辑距离为l；和c)s为l的至少60％。
10.本公开内容还提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种流感病毒血凝素抗原多肽，其各自由与其他流感病毒血凝素抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，其中每种多肽包含在所述4种流感病毒血凝素抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
11.本公开内容还提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种流感病毒神经氨酸酶抗原多肽，其各自由与其他流感病毒神经氨酸酶抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，其中每种多肽包含在所述4种流感病毒神经氨酸酶抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
12.本公开内容还提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种hiv gp160抗原多肽，其各自由与其他hiv gp160抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，其中每种多肽包含在所述4种hiv gp160抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
13.本公开内容还提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种hiv gp120抗原多肽，其各自由与其他hiv gp120抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，其中每种多肽包含在所述4种hiv gp120抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
14.本公开内容还提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种hiv gp41抗原多肽，其各自由与其他hiv gp41抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，其中每种多肽包含在所述4种hiv gp41抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
15.本公开内容还提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含激活受试者对表1中鉴定的至少6种株系产生免疫应答的一组抗原。
16.在一些实施方案中，在血凝素抑制测定中使用头部特异性抗体可检测免疫应答。在一些实施方案中，当使用所述血凝素抑制测定进行检验时，使用所述抗原产生的免疫应答是使用h1n1+h3n2+hab产生的免疫应答的至少2倍。在一些实施方案中，当使用所述血凝素抑制测定进行检验时，使用所述抗原产生的免疫应答是使用h1n1+h3n2+hab产生的免疫应答的至少10倍。在一些实施方案中，当使用所述血凝素抑制测定进行检验时，使用所述抗原产生的免疫应答是使用h1n1+h3n2+hab产生的免疫应答的至少100倍。
17.在一些实施方案中，所述微生物是细菌。在一些实施方案中，所述微生物是病毒。在一些实施方案中，所述病毒是流感。在一些实施方案中，所述流感为甲型(type a)。在一些实施方案中，所述流感为乙型(type b)。在一些实施方案中，所述甲型流感是h1n1、h1n2、h3n1、h3n2或h2n3。在一些实施方案中，所述甲型流感是h1n1。在一些实施方案中，所述甲型流感是h3n2。在一些实施方案中，所述病毒是人类免疫缺陷病毒(hiv)。在一些实施方案中，所述hiv是hiv
‑
1。在一些实施方案中，所述hiv
‑
1属于亚进化枝a、亚进化枝b或亚进化枝c。
18.在一些实施方案中，所述抗原是在三级空间中邻近的表面暴露残基的广谱中和性
抗原。在一些实施方案中，所述广谱中和性抗原在血凝素的茎(stem)中。在一些实施方案中，所述广谱中和性抗原在血凝素的头部中。在一些实施方案中，所述广谱中和性抗原在神经氨酸酶中。在一些实施方案中，所述广谱中和性抗原在gp160中。在一些实施方案中，所述广谱中和性抗原在gp120中。在一些实施方案中，所述广谱中和性抗原在gp41中。
19.在一些实施方案中，所述抗原是血凝素的广谱保守性片段。在一些实施方案中，所述抗原是血凝素头部的广谱保守性片段。在一些实施方案中，所述抗原是血凝素茎的广谱保守性片段。在一些实施方案中，所述抗原是神经氨酸酶的广谱保守性片段。在一些实施方案中，所述抗原是gp160的广谱保守性片段。
20.在一些实施方案中，所述疫苗包含选自seq id no:1
‑
87的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:1
‑
87中的任一种具有至少60％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:1
‑
87中的任一种具有至少70％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:1
‑
87中的任一种具有至少80％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:1
‑
87中的任一种具有至少90％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含选自seq id no:88
‑
127的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:88
‑
127中的任一种具有至少60％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:88
‑
127中的任一种具有至少70％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:88
‑
127中的任一种具有至少80％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:88
‑
127中的任一种具有至少90％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含选自seq id no:128
‑
171的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:128
‑
171中的任一种具有至少60％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:128
‑
171中的任一种具有至少70％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:128
‑
171中的任一种具有至少80％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:128
‑
171中的任一种具有至少90％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含选自seq id no:172
‑
267的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:172
‑
267中的任一种具有至少60％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:172
‑
267中的任一种具有至少70％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:172
‑
267中的任一种具有至少80％同一性的至少一种抗原。在一些实施方案中，所述疫苗包含与seq id no:172
‑
267中的任一种具有至少90％同一性的至少一种抗原。
21.在一些实施方案中，所述一组抗原包含至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000种不同的抗原。在一些实施方案中，所述一组抗原包含至少30种抗原。在一些实施方案中，所述一组抗原包含至少50种抗原。在一些实施方案中，所述抗原与其他抗原中的每一种的平均编辑距离为所述进化枝中抗原的平均大小的至少5％。
22.在一些实施方案中，所述组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离不超过1，并且最大配对编辑距离为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100。在一些实施方案中，所述组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离不超过所述抗原的大小的5％，并
且最大配对编辑距离为所述抗原的大小的至少75％。
23.在一些实施方案中，所述进化枝是系统发育树的进化枝，所述系统发育树是邻接聚类树或最大简约树。在一些实施方案中，第一级进化枝是未全部或部分归入另一更高级进化枝中的进化枝。在一些实施方案中，在所述微生物的系统发育树中，每个第x级进化枝在系统发育上在x
‑
1个分支节点之下。在一些实施方案中，所述疫苗进一步包含代表所述微生物的第三级、第四级、第五级、第六级、第七级、第八级、第九级、第十级、第十一级、第十二级、第十三级、第十四级或第十五级进化枝中每一个的至少60％的抗原。在一些实施方案中，所代表的进化枝是归入进化枝y
‑
1的进化枝y。在一些实施方案中，代表性进化枝是基于节点的进化枝。在一些实施方案中，代表性进化枝是基于茎的进化枝。在一些实施方案中，代表性进化枝是基于衍征的进化枝(apomorphy
‑
based clade)。在一些实施方案中，所述组中的每种抗原之间的平均分支数为至少1、3、5或10个。在一些实施方案中，所述组中任何两种抗原之间的最小分支数不超过1个，并且所述组中任何两种抗原之间的最大分支数为至少5、10或15个。
24.在一些实施方案中，每个otu包含彼此至少95％同源的序列。在一些实施方案中，每个otu包含至少3个差异序列。
25.在一些实施方案中，所述组中的每种抗原与所述组中的至少一种其他抗原具有至少90％、95％或99％序列同一性。在一些实施方案中，在至少100个氨基酸的长度范围内，所述组中的每种抗原与所述组中的至少一种其他抗原具有至少90％、95％或99％序列同一性。在一些实施方案中，所述组中的每种抗原与所述组中的每种其他抗原差异至少5％序列同一性。在一些实施方案中，所述组中的每种抗原与所述组中的每种其他抗原差异不超过75％序列同一性。
26.在一些实施方案中，每种抗原是包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、85、100、110或120个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述抗原选自表2、表3、表4、表5，或其片段或同源物。在一些实施方案中，所述疫苗组合物包含来自表2、表3、表4、表5的2种或更多种抗原，或其片段或同源物。在一些实施方案中，所述疫苗组合物包含来自表2、表3、表4、表5的3种或更多种抗原，或其片段或同源物。在一些实施方案中，所述疫苗组合物包含表2、表3、表4、表5中的5种或更多种抗原，或其片段或同源物。在一些实施方案中，所述疫苗组合物包含来自表2、表3、表4、表5的10种或更多种抗原，或其片段或同源物。在一些实施方案中，所述片段包含至多10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110或120个氨基酸。在一些实施方案中，所述片段包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110或120个氨基酸。在一些实施方案中，所述同源物包含与表1的抗原具有至少90％序列同一性的序列。
27.在一些实施方案中，所述文库包含所述微生物的至少1
×
104、1
×
105、1
×
106种不同变体。在一些实施方案中，所述文库包含所述微生物的所有已知序列的至少90％。
28.本公开内容还提供了药物组合物，所述药物组合物包含前述权利要求中任一项的疫苗组合物和药学上可接受的稀释剂、佐剂、辅料或其任何组合。
29.在一些实施方案中，所述疫苗为气雾剂制剂的形式。在一些实施方案中，所述疫苗为气雾剂制剂的形式。
30.在一些实施方案中，所述抗原中每种的浓度单独不能提供对受试者中的广谱中和
性抗原产生显著预防性免疫应答；并且共同地，所述抗原具有提供对所述受试者中的广谱中和性抗原产生免疫应答的组合浓度。在一些实施方案中，所述受试者是鸟。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是猪。
31.本公开内容还提供了病毒样颗粒(vlp)，所述病毒样颗粒包含前述权利要求中任一项的疫苗组合物。
32.本公开内容还提供了重组表达载体，所述重组表达载体包含编码以下项的核酸分子：a)代表微生物的第一级进化枝和第二级进化枝中的每一个的至少60％的一组抗原；b)一组抗原，其中所述抗原中的两种之间的最小配对编辑距离不超过25，并且所述抗原中的两种之间的最大配对编辑距离为至少300；c)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原；或d)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原。
33.本公开内容还提供了重组表达载体，所述重组表达载体包含编码以下项的核酸分子：a)代表微生物的第一级进化枝和第二级进化枝中的每一个的至少60％的一组抗原；b)一组抗原，其中所述抗原中的两种之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的5％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少75％；c)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原；或d)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原。
34.本公开内容还提供了在受试者中治疗感染或降低感染可能性的方法，所述方法包括向所述受试者施用前述权利要求中任一项的疫苗组合物。
35.本公开内容还提供了在受试者中治疗流感感染或降低流感感染可能性的方法，所述方法包括向所述受试者施用疫苗组合物，所述疫苗组合物导致免疫激活对季节性流感有效至少3、4、5、6、7、8、9或10年。
36.在一些方法中，所述受试者是人。在一些方法中，所述受试者是驯养动物(domesticated animal)。
37.本公开内容还提供了制备疫苗组合物的方法，所述方法包括：选择一组抗原，所述一组抗原是(a)代表微生物的第一级进化枝和第二级进化枝中的每一个的至少60％；(b)一组抗原，其中所述抗原中的两种之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的5％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少75％；(c)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％；或(d)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％。
38.在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述微生物的株系文库中获得多种抗原序列；和比对所述多种抗原序列以创建所述抗原的系统发育树。
39.通过引用并入
40.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示为通过引用并入一样。
附图说明
41.本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下利用本发明原理阐述说明性实施方案的具体实施方式及其中的附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理
解：
42.图1示出了是否是系统发育树上的进化枝的实例。
43.图2示出了三种类型的进化枝的实例：基于节点的进化枝、基于分支的进化枝和基于衍征的进化枝。
44.图3示出了系统发育树中的进化枝分级，其中第三级进化枝被归入第二级进化枝，第二级进化枝被归入第一级进化枝。
45.图4示出了流感抗原
‑
抗体相互作用空间模型。
46.图5描绘了按类别(即，通用、90％株系、所有h1株系、所有h3株系、所有h1株系的90％和所有h3株系的90％)的保守性表位的概率。
47.图6示出了可以转变表位保守分布的浓度保守偶联疫苗接种策略
48.图7示出了表明猪接种本文所述的疫苗时观察到的群体效应的elisa信号。
49.图8示出了一队列猪接种本文所述的疫苗三次后每个ha分类的elisa信号。
50.图9示出了一队列猪接种本文所述的疫苗三次后的elisa信号和倍数变化。
51.图10示出了显示针对每个队列的每个成员的基于一套抗原变体的疫苗组合物的第二次加强后的血清滴度的热图。
52.图11示出了按同种型分开的靠前克隆型占据的外周b细胞库。
53.图12示出了通过噬菌体展示分离的广谱中和性猪单克隆抗体9c5的序列比对。
54.图13示出了足以体外中和一组5种甲型流感株系的三种广谱中和性人抗体(cr9114、f10和c05)和一种广谱中和性猪抗体(9c5)的最低抗体浓度。
55.图14示出了数据，所述数据显示与二价对照相比，保守浓度偶联方法可以产生具有改进的株系覆盖度和中和广度的血清。
具体实施方式
56.快速进化的病原体可能对疫苗设计构成根本性挑战，因为此类病原体的突变可致使先前的疫苗应答过时。例如，每年重新设计流感疫苗可以尝试预测可能在下一年普遍流行的进化流感变体。此类尝试可能通常失败。大多数疫苗接受者产生的抗体可能遗漏流感外壳蛋白上已鉴定的保守性表位。
57.本文提供了可以引发对一种或多种病原体产生应答的免疫产生组合物(例如，疫苗)。在一些情况下，本文提供的疫苗包含可引发可产生广谱中和性抗体的免疫应答的抗原。本公开内容还提供了使用和制备本文提供的疫苗的方法。
58.广谱中和性抗体可以提供“通用”或更长期的疫苗。这种广谱中和性抗体可以抗广谱保守残基，例如抗原的残基。广谱保守抗原可以在微生物的多个株系中具有保守性。微生物，即使是快速突变的病原体，也可以包含广谱保守抗原。可以识别和/或结合这些保守抗原或多组抗原的抗体可以对给定病毒的许多株系提供保护。
59.因为非保守残基可以是免疫显性的，因为它们可以具有比广谱保守残基更高的丰度(例如，极高丰度)，本公开内容提供了可以转变抗原残基丰度分布的方法，以支持对更保守抗原的应答。通过将代表微生物的一系列变异(例如，突变体、不同株系或不同进化枝)的广谱保守抗原掺入疫苗，可以赋予受试者对微生物的许多或基本上所有变异产生免疫力。
60.i.微生物
61.如本文所述的疫苗组合物可引发对微生物或对微生物株系或株系亚群的免疫应答。在一些情况下，此类疫苗可以提供对微生物的多种株系产生广谱免疫力(免疫力不限于特定株系)。此类疫苗可以包含一组抗原，其可以包含来自微生物的数个或许多个不同株系的数种或许多种不同抗原。
62.微生物可以是对受试者进行疫苗接种的试剂。在一些情况下，微生物可以具有致病性，或者可以导致疾病、病症或死亡。微生物可以是细菌、病毒、真菌、寄生虫或其衍生物，例如由微生物分泌的或从微生物分离的核酸、蛋白质、毒素或肽。
63.细菌可以是单细胞原核微生物。细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌可以具有感染性。
64.真菌可以是产生孢子的生物。真菌可以引起受试者的皮肤、肺、血液或者其他器官、组织或生物体液发生疾病。在一些情况下，真菌可以来自曲霉属、芽生菌属、念珠菌属、球孢子菌属或隐球菌属(例如，新型隐球菌(c.neoformans)和格特隐球菌(c.gattii))。其他合适的真菌也在本公开内容的范围内。
65.寄生虫可以是原生动物、蠕虫、体外寄生虫或任何其他合适的寄生虫。在一些情况下，寄生虫可以是疟原虫寄生虫。在一些情况下，寄生虫可以是疟原虫寄生虫或锥虫寄生虫。在疟原虫寄生虫的情况下，疫苗可以是针对疟疾寄生虫的。在锥虫寄生虫的情况下，疫苗可以是针对chagas病寄生虫、昏睡病寄生虫或leishmaniasis病寄生虫的。
66.原生动物可以是单细胞生物，它可以在受试者的血液或组织中生存和/或繁殖。原生动物的实例可以包括但不限于，肉足纲(例如，内阿米巴属(entamoeba))、鞭毛纲(例如，贾第鞭毛虫(giardia)和利什曼原虫(leishmania))、纤毛虫纲(例如，肠袋虫属(balantidium))和孢子虫纲(例如，疟原虫、隐孢子虫等)。
67.蠕虫可以是多细胞生物。蠕虫可以分为三类：扁形动物、棘头动物和线虫。蠕虫的实例可包括但不限于，寄生扁虫、吸虫、绦虫、刺头蠕虫、蛔虫和蛲虫。蠕虫可以在胃肠道、血液、淋巴系统或其他组织中存活。
68.外寄生物可以是可以在受试者体表上存活的生物体，并且在一些情况下，可以附着或钻入受试者的皮肤中。体外寄生虫的实例可以包括蜱、跳蚤、虱子和螨虫。
69.在一些实例中，病毒可以是慢病毒、黄病毒、丝状病毒、冠状病毒或副粘病毒。在慢病毒的情况下，疫苗可能是针对人类免疫缺陷(hiv)病毒的。在黄病毒的情况下，疫苗可能是针对登革热病毒(dengue virus)、寨卡病毒(zika virus)或西尼罗病毒(west nile virus)的。在丝状病毒的情况下，疫苗可能是针对埃博拉病毒(ebola virus)、马尔堡病毒(marburg virus)或拉夫病毒(ravn virus)的。在冠状病毒的情况下，疫苗可能是针对中东呼吸综合征(mers)病毒、严重急性呼吸综合征(sars)病毒或新型冠状病毒(例如，2019
‑
ncov)的。在副粘病毒的情况下，疫苗可能是针对呼吸道合胞病毒(rsv)或尼帕病毒(nipah virus)的。
70.疫苗可以针对任何类型的流感病毒，例如但不限于本文所述的任何一种或多种流感病毒。流感病毒可以是甲型流感、乙型流感、丙型流感或丁型流感。基于病毒表面的两种蛋白，甲型流感病毒可以分为亚型：血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)。不同的流感株系可以有不同的血凝素亚型、神经氨酸酶亚型，或两者。可以有至少198种预测的甲型流感亚型组合。乙型流感病毒可以可进一步分为谱系，其可以包括，例如，b/山形县(yamagata)和b/维多利
亚(victoria)。
71.如果病毒是甲型流感病毒，则它可以是任何亚型，包括但不限于，h1n1、h1n2、h1n3、h2n2、h3n2、h3n8、h4n2、h4n4、h4n6、h4n8、h5n1、h5n2、h5n3、h5n8、h6n1、h6n4、h6n5、h6n6、h6n8、h7n1、h7n2、h7n3、h7n7、h7n8、h7n9、h8n4、h9n2、h9n5、h9n8、h10n3、h10n4、h10n7、h10n8、h10n9、h11n2、h11n6、h11n9、h12n1、h12n3、h12n5、h13n6、h13n8、h14n5、h15n2、h15n8、h16n3、h17n、h18n11或其变体。如果病毒是乙型流感病毒，则它可以是乙型流感病毒的任何株系或其变体。流感病毒的非限制性列表包括在表1中。
72.流感病毒可以是表1中列出的株系。一些疫苗可以包含一组抗原，其可以激活受试者对表1中至少80％的株系的免疫应答。在一些情况下，疫苗可以包含一组抗原，其可以激活受试者对表1中至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或100％的株系的免疫应答。
73.表1：流感病毒株系
74.75.76.77.78.79.[0080][0081]
流感疫苗可以包含每个血凝素抗原分类(即h1、h2、h3等)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种抗原。
[0082]
疫苗可以针对任何物种的hiv病毒，例如hiv
‑
1和hiv
‑
2。hiv
‑
1可以属于m组(主要)、o组(离群值)或n组(非m或o)。hiv
‑
1m组可以是a、b、c、d、f、g、h、j亚型或其他亚型。hiv
‑
2可以是a亚型或b亚型。在一些情况下，针对hiv的疫苗可以针对hiv
‑
1或hiv
‑
2中的一种。在一些情况下，针对hiv的疫苗可以针对hiv
‑
1和hiv
‑
2。
[0083]
疫苗可以针对hiv的变体，或在一些情况下针对猿猴免疫缺陷病毒(siv)。在一些情况下，针对hiv的疫苗也可以针对siv。在一些情况下，针对hiv的疫苗还可以提供针对siv变体的保护。
[0084]
hiv病毒可以是图26
‑
34中所列的株系。一些疫苗可以包含一组抗原，其可以激活受试者对图26
‑
34中至少80％的株系的免疫应答。在一些情况下，疫苗可以包含一组抗原，其可以激活受试者对图26
‑
34中至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或100％的株系的免疫应答。
[0085]
微生物可以有变体。微生物的变体可以包含基因组发生变异的微生物、翻译后修饰发生变异的微生物、表观基因组发生变异的微生物、蛋白质表达发生变异的微生物、rna表达发生变异的微生物、抗原含量发生变化的微生物或其组合。在一些情况下，抗原含量发生变化的微生物可能特别令人关注。
[0086]
微生物可以具有多个变体，这些变体可以使用系统发育树代表。系统发育树可以是模型或工具，其可用于探索关系。在一些情况下，在最小连接图的意义上，系统发育树可以是系统发育或进化历史的图解表示。系统发育树可以包含多个进化枝，其中进化枝可以是嵌套分支的分群。进化枝可以是包括共同的祖先和该祖先的所有后代(现存的和已灭绝的)的分群。图1中提供了系统发育树中进化枝的实例。不包含进化枝的系统发育树中的分群的实例也在图1中提供。疫苗可以包含代表微生物进化枝的抗原。
[0087]
微生物的群组可以分为进化枝，或系统发育树中的群组。在一些情况下，系统发育树可以是微生物的组织，所述组织可以表明个体微生物彼此之间的关联程度。
[0088]
可以基于微生物抗原的一个或多个序列的相似性来排列进化枝。进化树上的进化枝和亚进化枝可以显示为具有相似遗传变化(例如核苷酸或氨基酸的变化)并且有一个共同祖先(例如，一个共同节点或分支)的群组。
[0089]
基因上具有差异的进化枝可以具有抗原性差异。抗原性差异的进化枝可以指其成员具有可影响受试者免疫力的差异的进化枝。
[0090]
进化枝可以是系统发育树(可以是邻接聚类树或最大简约树)的进化枝。在一些情况下，系统发育树可以通过贝叶斯模型、最大似然模型、加权对群算术平均法(wpgma)或非加权对群算术平均(upgma)进行建模。本文提供的系统发育树还可以通过其他合适的统计模型建模。可以使用凝聚聚类方法创建邻接聚类树。可以创建最大简约树以最小化特征状态更改的总数。
[0091]
进化枝可以包括节点和分支。节点可以是系统发育树上的点或顶点，可以代表微生物的一个谱系分成两个或更多个谱系(例如，系统发育树中的内部节点)或当前的谱系(例如，末端节点)。分支可以是系统发育树上的线，可用于表示谱系，无论是祖先还是末端。
[0092]
进化枝可以是基于节点的进化枝、基于分支的进化枝或基于衍征的进化枝。基于节点的进化枝可以是源自系统发育树上特定节点的进化枝，并且可以涵盖该节点以及从该节点往下的分支和节点。基于节点的进化枝的实例在图2的上图中示出。基于分支的进化枝可以是源自系统发育树上特定分支的进化枝，并且可以涵盖该分支以及从该分支往下的分支和节点。基于分支的进化枝的实例在图2的中间图中示出。在一些情况下，进化枝可以是基于衍征的进化枝。基于衍征的进化枝可以是源自祖先的进化枝，其中特定的特征状态，例如，序列或结构特征起源。基于衍征的进化枝的实例在图2的下图中示出。图2所示的基于衍征的进化枝中的水平线指示特定特征状态发生的位置。
[0093]
在一些情况下，进化枝可以是系统发育树的进化枝，其可以是有根树、无根树或分支树。如果任何唯一节点可以对应树上所有实体的最近共同祖先，则系统发育树可以是有根树。如果系统发育树可以在没有对祖先做任何实质性假设的情况下创建，则它可以是无根树。系统发育树可以是每个节点正好有两个后代的分支树。
[0094]
进化枝可以通过其分级进行描述。进化枝的分级可以是归入它的进化枝个数的描述。可以把第x+1级进化枝归入第x级进化枝。例如，可以把第2、3、4级等归入第1级进化枝，并且可以把第3、4、5级等归入第2级进化枝。图3中提供了同一系统发育树中的第一级进化枝、第二级进化枝和第三级进化枝的图示。此处，把第二级进化枝归入第一级进化枝，并且把第三级进化枝归入第二级进化枝。
[0095]
同样，第y级进化枝可以被归入第y
‑
1级进化枝中。例如，第5级进化枝可以被归入第4级进化枝，第6级进化枝可以被归入第5级进化枝，以及第7级进化枝可以被归入第6级进化枝等。
[0096]
如果进化枝是第x级进化枝，那么第x级进化枝可以在系统发育上在微生物的系统发育树中的x
‑
1个分支节点之下。例如，第5级进化枝可以在系统发育上在4个分支节点之下，第6级进化枝在系统发育上可以在5个分支节点之下，以及第7级进化枝在系统发育上可以在6个分支节点之下。
[0097]
微生物的进化枝可以是第一级、第二级、第三级、第四级、第五级、第六级、第七级、第八级、第九级、第十级、第十一级、第十二级、第十三级、第十四级、第十五级或任何其他合适的分级。如果进化枝是第一级进化枝，则该进化枝不能全部或部分归入在另一个更高级别的进化枝中。
[0098]
例如，流感亚型(例如，甲型流感)可以分为不同的遗传进化枝和亚进化枝。流感进
化枝可以是基于流感病毒基因序列(例如，血凝素序列)的相似性的流感病毒的细分。
[0099]
作为另一实例，hiv亚型(例如，hiv
‑
1和/或hiv
‑
2)可以分为不同的遗传进化枝和亚进化枝。hiv进化枝可以是基于hiv病毒基因序列(例如，编码gp160蛋白的env基因)的相似性的hiv病毒的细分。
[0100]
ii.抗原
[0101]
本文所述的疫苗组合物可以包含抗原。疫苗组合物中的抗原可以是疫苗组合物可以属于引发针对其的免疫应答的微生物或微生物株系。
[0102]
抗原可以是可以被免疫系统识别的分子，其可以包括抗体、b细胞和/或t细胞。例如，抗原可以是可以诱导免疫应答的外来物质。在一些情况下，诱导的免疫应答可以包括抗体的产生。在一些情况下，抗体可以识别、附着或结合抗原。
[0103]
抗原可以是免疫原上的任何抗原决定簇，例如，抗体通过抗原结合位点结合的任何初级免疫原。抗原上的决定簇或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
[0104]
抗原可以是新抗原、自身抗原、内源性抗原、外源性抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、毒素或肿瘤抗原。一些疫苗可以包含来自一种来源的抗原，而一些疫苗可以包含来自两种、三种、四种或更多种来源的抗原。
[0105]
疫苗可以包含表1中株系的抗原。一些疫苗可以包含表1中株系的一种或多种抗原的一种或多种同源物。在一些情况下，此类同源物可以包含与表1中的抗原具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。
[0106]
抗原可以是流感抗原。在一些情况下，流感抗原可以是血凝素或神经氨酸酶。在一些情况下，流感抗原可以是血凝素或神经氨酸酶的片段、衍生物或经修饰的血凝素或神经氨酸酶。在一些情况下，疫苗可以包含血凝素和神经氨酸酶、或其片段、衍生物或经修饰形式的组合。在各种情况下，抗原可以是血凝素
‑
神经氨酸酶组合蛋白，或其片段、衍生物或经修饰形式。
[0107]
血凝素可以是可以在流感病毒表面发现的同三聚体糖蛋白。血凝素可以是1类融合蛋白，并且可以具有作为附着因子和/或膜融合蛋白的多功能活性。在一些情况下，血凝素可以在流感病毒与靶细胞或宿主细胞表面的唾液酸结合方面发挥作用。在这种结合后，流感病毒可以被内化。在一些情况下，血凝素可以在低ph(例如，5.0
‑
5.5)环境中流感病毒的病毒包膜与晚期内体膜的融合中发挥作用。
[0108]
血凝素可以是甲型或乙型流感病毒。血凝素可以具有包含头部和茎的结构，并且可以包含三个相同的单体。单体可以包含具有可通过两个二硫键连接的ha1和ha2区的完整ha0单多肽链。ha2区可以具有α螺旋卷曲结构，并且可以位于ha1区的顶部。ha1区可以是小球状结构域，可以包含α/β结构的混合。
[0109]
疫苗组合物可以包含血凝素头部、血凝素茎，或其组合或片段。在一些情况下，疫苗组合物可以包含广谱保守性血凝素片段、广谱保守性血凝素头部片段、广谱保守性血凝素茎片段或其组合。广谱保守性序列可以是氨基酸序列或核酸序列，其在微生物的物种或株系之间可以相同或相似。
[0110]
疫苗组合物可以包含ha0区、ha1、ha2区，或其组合或片段。血凝素抗原可以是血凝素的亚型。例如，甲型流感病毒血凝素抗原中的血凝素可以属于18个或更多个亚型。血凝素
的亚型可以是h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、h17或h18。
[0111]
一些疫苗组合物可以包含至少5种、至少10种、至少20种或至少30种流感病毒血凝素抗原多肽。此类血凝素抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表，其中每种多肽包含在流感病毒血凝素抗原多肽之间具有至少90％同一性的靶区段。在一些情况下，此类血凝素抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在某些情况下，此类血凝素抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在各种情况下，此类血凝素抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在一些情况下，此类血凝素抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。
[0112]
神经氨酸酶可以是在流感病毒表面发现的蛋白质。神经氨酸酶能够使流感病毒从宿主细胞中释放。神经氨酸酶可以是糖苷水解酶家族34的成员。神经氨酸酶可以是蘑菇形蛋白质。神经氨酸酶可以包含头部，其可以包含四个共面且大致呈球形的亚基和疏水区。在一些情况下，疏水区可以嵌入病毒膜的内部。神经氨酸酶可以包含单条多肽链。神经氨酸酶多肽可以是六个保守极性氨基酸的单链，其后可以是可变氨基酸。
[0113]
疫苗可以包含神经氨酸酶的球形亚基、神经氨酸酶的疏水区或其组合。在一些情况下，疫苗组合物可以包含神经氨酸酶的广谱保守性片段、神经氨酸酶球形亚基的广谱保守性片段、神经氨酸酶疏水区的广谱保守性片段或其组合。
[0114]
在一些情况下，神经氨酸酶抗原可以是神经氨酸酶的亚型。流感病毒神经氨酸酶抗原可以有11种或更多种亚型。神经氨酸酶的亚型可以是n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、n10或n11。在一些情况下，神经氨酸酶抗原可以是非流感病毒的病毒。在一些情况下，神经氨酸酶可以属于细菌。例如，神经氨酸酶可以属于脆弱拟杆菌或铜绿假单胞菌或另一种细菌。
[0115]
一些疫苗组合物可以包含至少5种、至少10种、至少20种或至少30种流感病毒神经氨酸酶抗原多肽。此类神经氨酸酶抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表，其中每种多肽包含在流感病毒神经氨酸酶抗原多肽之间具有至少90％同一性的靶区段。在一些情况下，此类神经氨酸酶抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在某些情况下，此类神经氨酸酶抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在各种情况下，此类神经氨酸酶抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在一些情况下，此类神经氨酸酶抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。
[0116]
抗原可以是hiv抗原。在一些情况下，hiv抗原可以是糖蛋白gp160。在一些情况下，hiv抗原可以是gp160的片段、衍生物或修饰的gp160。在一些情况下，疫苗可以包含gp160或其片段、衍生物或经修饰形式的组合。
[0117]
gp160可以是由hiv病毒中的env基因编码的蛋白质，其可以形成同三聚体并且可
以在hiv病毒的表面上发现。gp160可以被受试者体内的蛋白酶(例如弗林蛋白酶)切割成gp120和gp41。gp120和gp41可以被转运到受试者宿主细胞的质膜上，其中gp41可以将gp120锚定在被感染细胞的膜上。在一些情况下，gp120可以是抗原。在一些情况下，gp41可以是抗原。
[0118]
gp160可以属于hiv
‑
1或hiv
‑
2。gp160可以包含三个亚基，其可以具有附着至膜相关部分的面向外的糖蛋白部分。gp160亚基之间的界面可以是极性的。
[0119]
疫苗组合物可以包含gp160的糖蛋白区段、gp160的膜相关部分、gp160的广谱保守性片段、gp160糖蛋白区段的广谱保守性片段、gp160的膜相关部分的广谱保守性片段或其组合。
[0120]
一些疫苗组合物可以包含至少5种、至少10种、至少20种或至少30种hiv gp160抗原多肽。此类gp160抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表，其中每种多肽包含在gp160抗原多肽之间具有至少90％同一性的靶区段。在某些情况下，此类gp160抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在各种情况下，此类gp160抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在一些情况下，此类gp160抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在一些情况下，此类gp160抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。
[0121]
gp120可以属于hiv
‑
1或hiv
‑
2。gp120可以包含三个亚基，其可以具有附着至膜相关部分的面向外的糖蛋白部分。gp120亚基之间的界面可以是极性的。
[0122]
疫苗组合物可以包含gp120的糖蛋白区段、gp120的膜相关部分、gp120的广谱保守性片段、gp120糖蛋白区段的广谱保守性片段、gp120的膜相关部分的广谱保守性片段或其组合。
[0123]
一些疫苗组合物可以包含至少5种、至少10种、至少20或至少30种hiv gp120抗原多肽。此类gp120抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表，其中每种多肽包含在gp120抗原多肽之间具有至少90％同一性的靶区段。在某些情况下，此类gp120抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在各种情况下，此类gp120抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在一些情况下，此类gp120抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在一些情况下，此类gp120抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。
[0124]
gp41可以属于hiv
‑
1或hiv
‑
2。gp41可以包含三个亚基，其可以具有附着至膜相关部分的面向外的糖蛋白部分。gp41亚基之间的界面可以是极性的。
[0125]
疫苗组合物可以包含gp41的糖蛋白区段、gp41的膜相关部分、gp41的广谱保守性片段、gp41糖蛋白区段的广谱保守性片段、gp41的膜相关部分的广谱保守性片段或其组合。
[0126]
一些疫苗组合物可以包含至少5种、至少10种、至少20种或至少30种hiv gp41抗原
多肽。此类gp41抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表，其中每种多肽包含在gp41抗原多肽之间具有至少90％同一性的靶区段。在某些情况下，此类gp41抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在各种情况下，此类gp41抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过95％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在一些情况下，此类gp41抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少20％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。在一些情况下，此类gp41抗原多肽可以由与疫苗中的其他多肽具有至少10％同一性，但不超过98％同一性的序列(例如，氨基酸序列)代表。
[0127]
抗原可以广谱地中和。广谱中和性抗原可以被广谱中和性抗体识别。广谱中和性抗体可以是可以影响多种病毒株的抗体。一些广谱中和性抗原可以属于至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的株系。
[0128]
广谱中和性抗原可以包含在三级空间中相邻的表面暴露残基。即，广谱中和性抗原可以基于其表面特性进行中和。在一些情况下，广谱中和性抗原可以包含抗原的非表面区上的中和性残基，例如在袋(pocket)中、活性位点中或抗原内部。
[0129]
抗原，例如广谱中和性抗原，可以属于流感病毒。此类广谱中和性抗原可以位于血凝素上。此类广谱中和性抗原可以在血凝素的茎中、在血凝素的头部中或其部分中。在一些情况下，广谱中和性抗原可以与血凝素的茎、血凝素的头部或其部分相似。在一些情况下，此类部分可以是广谱中和性的。例如，广谱中和性抗原可以与血凝素的头部或血凝素的茎至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在一些情况下，广谱中和性抗原可以与血凝素头部的部分或血凝素茎的部分至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在一些情况下，广谱中和性抗原可以与血凝素的广谱保守性片段、血凝素头部的广谱保守性片段或血凝素茎的广谱保守性片段至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。
[0130]
在一些情况下，广谱中和性抗原可以位于神经氨酸酶或其部分上。在一些情况下，广谱中和性抗原可以与神经氨酸酶相似。例如，广谱中和性抗原可以与神经氨酸酶或其部分至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在一些情况下，此类部分可以是广谱中和性的。例如，广谱中和性抗原可以与神经氨酸酶的部分至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在一些情况下，广谱中和性抗原可以与神经氨酸酶的广谱保守性片段至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。
[0131]
广谱中和性抗原可以属于hiv病毒。在一些情况下，广谱中和性抗原可以位于gp160或其部分上。在一些情况下，广谱中和性抗原可以与gp160相似。例如，广谱中和性抗原可以是与gp160或其部分至少约30％相似、至少约40％相似、至少约50％相似、至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在某些情况下，此类部分可以是广谱中和性的。在各种情况下，广谱中和性抗原可以与gp160的部分至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在一些情况下，广谱中和性抗原可以与gp160的广谱保守的片段至少约60％相似、至少
约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。
[0132]
广谱中和性抗原可以属于hiv病毒。在一些情况下，广谱中和性抗原可以位于gp120或其部分上。在一些情况下，广谱中和性抗原可以与gp120相似。例如，广谱中和性抗原可以与gp120或其部分至少约30％相似、至少约40％相似、至少约50％相似、至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在一些情况下，此类部分可以是广谱中和性的。在各种情况下，广谱中和性抗原可以与与gp120的部分至少约30％相似、至少40％相似、至少50％相似、至少60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在一些情况下，此类部分可以是广谱保守性片段。
[0133]
广谱中和性抗原可以属于hiv病毒。在一些情况下，广谱中和性抗原可以位于gp41或其部分上。在一些情况下，广谱中和性抗原可以与gp41相似。例如，广谱中和性抗原可以与gp41或其部分至少约30％相似、至少约40％相似、至少约50％相似、至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在一些情况下，此类部分可以是广谱中和性的。在各种情况下，广谱中和性抗原可以与gp41的部分至少约60％相似、至少约70％相似、至少约80％相似、至少约85％相似、或至少约90％相似。在一些情况下，此类部分可以是广谱保守性片段。
[0134]
在一些情况下，疫苗可以包含对应于超过一种微生物的抗原。一些疫苗可以包含针对两种、三种、四种、五种、六种或更多种微生物的抗原。抗原可以各自以低于在目前可用疫苗中的剂量存在于疫苗中。不同抗原的组合可以允许b细胞和/或t细胞广谱识别微生物的许多株系，即使疫苗中未出现的株系。在一些情况下，这可以称为群体效应(swarm effect)。群体效应可以减少每种抗原的剂量以及减少引发免疫应答所需的总抗原剂量。例如，代表微生物进化枝的给定分级的特定数量的进化枝的抗原可以包括在疫苗中。包括不同进化枝的代表可使疫苗对进化上不同的株系有效。作为另一实例，代表特定数量的微生物操作分类单元(otu)的抗原可以包括在疫苗中。otu可用于对密切相关的实体(例如抗原)群组进行分类。
[0135]
otu可以是微生物群组。out综述可见于sokal等人(principles of numerical taxonomy.w.h.freeman and co.,san francisco and london(1963))和schloss等人(applied and environmental microbiology,2006年10月,第6773
‑
6779页,第72卷,第10期)。
[0136]
otu通常可以指按序列相似性分群的抗原聚类(cluster)，并且有时可以作为不同分类级别“物种”的实用代表。向受试者施用包含代表多种otu进化枝的抗原的疫苗可以赋予对遗传多样性抗原组的免疫力。
[0137]
在一些情况下，otu可以基于微生物的特定核酸或氨基酸序列。例如，otu可以基于16s rrna序列或编码16s rrna的基因序列。此类otu可以称为16s out。在各种情况下，otu可以基于18s rrna序列或编码18s rrna的基因序列。
[0138]
otu可以是具有相似性阈值的微生物群组。例如，out可以是具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相似性的微生物群组。在一些情况下，不同微生物的相似度可以高于阈值。此类微生物可以在合并的otu中，其可以含有多个物种。在某些情况下，微生物的单一物种可以具有比阈值相似度更低的旁系同源物。此类旁系同源物可以跨
两个或更多个out拆分。
[0139]
分配otu的方法可以包括稀疏曲线。此类方法可以评估物种丰富度以及α和β多样性估计量，暗含假设otu是对误差可以忽略不计的生物体观察，和/或观察的数量与物种或单系群组的总数密切相关。
[0140]
在一些情况下，聚类可以是假聚类，例如，由于伪影，例如读取错误和/或嵌合体。在某些情况下，otu可以基于otu内微生物序列之间的遗传距离。在各种情况下，otu可以提供对微生物种群丰富度和/或多样性的估计。在一些实例中，属于给定otu的微生物可以具有结构相似性。在某些实例中，属于不同otu的微生物可以具有不同的结构。
[0141]
可以使用软件或工具将微生物序列分配至otu。此类工具的实例包括但不限于，基于距离的otu和丰富度(dotur)工具、共享otu和相似性(sons)工具、libshuff/∫
‑
libshuff工具、treeclimber工具、unifrac工具或分子方差分析(amova)工具。
[0142]
工具可以基于包含多个微生物序列的信息的输入将微生物序列分配至otu。此类输入的实例可以包括距离矩阵、系统发育树和/或距离矩阵。dotur工具可以通过对一个、几个或每个距离级别使用最远、平均或最近邻算法将序列分配至otu。dotur工具可以基于距离矩阵输入分配otu。sons工具可以计算收集器曲线，以估计群落之间共享的otu的比例和丰富度。sons算法可以基于otu指定输入分配otu。
[0143]
libshuff/∫
‑
libshuff工具可以使用cramer
‑
von mises统计量检验两个群落的结构是否相同、不同或彼此的子集。libshuff/∫
‑
libshuff工具可以基于距离矩阵输入分配otu。treeclimber工具可以实施基于简约的检验，以确定两个或更多个群落的群落结构是否具有显著差异。treeclimber工具可以基于系统发育树输入分配otu。
[0144]
unifrac工具可以比较群落对之间的系统发育距离，以描述它们结构的相似性。unifrac工具可以基于系统发育树输入来分配otu。amova工具可以使用方差类型公式的分析来确定两个或更多个群落结构的遗传多样性是否具有显著差异。amova工具可以基于距离矩阵输入分配otu。
[0145]
otu通常可以指按序列相似性分群的抗原聚类，并且有时可以作为不同分类级别“物种”的实用代表。包括各种otu的代表性进化枝可以导致跨基因多样性的抗原组。每个otu可以包含相似的微生物序列。在一些情况下，每个otu可以包含彼此至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％同源的微生物序列。在一些情况下，每个otu可以包含彼此至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的微生物序列。
[0146]
在更进一步的实例中，可以包括衍生自变体文库的一组抗原，使得该组抗原广谱地代表变体文库。在一些情况下，可以包括衍生自变体文库的一组抗原，使得该组抗原广谱地代表变体文库的至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％。在一些情况下，此类一组抗原可以另外代表一种或多种未包括在变体文库中的变体。
[0147]
抗原可以是单一目标肽或蛋白质，或两种、三种、四种、五种、六种或更多种肽和/或蛋白质的复合物。在一些情况下，抗原可以指抗原结构域，或较大蛋白质或蛋白质复合物的区域或部分。在一些情况下，抗原可以指两个或更多个抗原结构域，或更大蛋白质或蛋白质复合物的两个或更多个区域或部分。在一些情况下，抗原可以是整体蛋白质、整体蛋白质的片段、整体蛋白质的功能片段、肽、多聚体多肽、多肽序列或其组合。在一些情况下，抗原
可以经修饰(例如，人工修饰)。此类修饰可以稳定或提高抗原性。修饰的实例包括多肽序列的改变(例如，截断、延长或突变)。在一些情况下，抗原可以包含两种或更多种整体蛋白质、整体蛋白质的片段、整体蛋白质的功能片段、肽或多聚体多肽。有时，抗原可以包含脂质、核酸、多糖或其组合。
[0148]
抗原可以是完整的(即，完全的或整体的)抗原，或抗原的功能部分。抗原可以是抗原的肽功能部分。如本文所用，“完整的”通常是指全长抗原，因为该抗原多肽在自然界中存在。完整的抗原可以采用自然界中所见的天然蛋白质折叠，呈现一级序列表位以及三级序列构象表位。这可以与抗原的仅一小部分或肽的递送形成直接对比。向细胞递送完整抗原可引发广谱免疫应答，而不是仅针对单个或少数几个表位的免疫应答。在一些情况下，在开发疫苗或文库时，抗原上的一个、几个或所有表位可以是未知的。
[0149]
可替代地，根据初始抗原的大小，可以将抗原分成几部分。通常，当整体抗原是多聚体多肽时，整体蛋白质可分为亚单位和/或结构域，其中抗原的每个单独亚单位或结构域可以根据本文公开的方法与聚合物相关联。在一些情况下，抗原的部分可以是功能片段或部分。
[0150]
疫苗可以包含抗原的同源物(例如，血凝素同源物、神经氨酸酶同源物、gp160同源物、gp120同源物或gp41同源物)。同源物可以是与抗原具有共同祖先的分子。在一些情况下，抗原的同源物可以是抗原。
[0151]
在一些情况下，抗原可以经修饰。修饰可以包括截短、标签、氨基酸的添加、糖基化、甲基化、泛素化、插入、缺失、突变或其他修饰。例如，hiv env
‑
糖蛋白复合物(三聚体)通常可以经人工突变，例如，通过二硫键可以保持抗原稳定和/或防止或延迟hiv env衍生蛋白质的解离。这可以包括但不限于人工切割位点、整个功能区域的去除(例如，跨膜区的切割)
[0152]
在一些情况下，抗原可以以低于在目前可用疫苗中的浓度存在。在一些情况下，如果单独施用抗原，抗原可以以不足以诱导免疫应答的浓度存在。在一些情况下，疫苗中的每种抗原可以以不足以使任何抗原在单独施用抗原时诱导免疫应答的浓度存在。在这种情况下，总抗原浓度，而不是单独抗原的浓度，可以成为是否诱导免疫应答的决定因素。当抗原的总浓度是决定因素时，所需的单独抗原浓度可以是总浓度的函数或抗原数量的函数。
[0153]
在一些情况下，一种或多种抗原可以提供受试者中对多种微生物变体的免疫力。例如，抗原可以提供对微生物变体的免疫力，这些变体是基于起源年份、起源物种、特定突变的变体，或任何其他合适变体。
[0154]
一组抗原中的两种抗原可以具有编辑距离(例如，配对编辑距离)。编辑距离可以描述两种抗原的差异。编辑距离可以是levenshtein距离。第一抗原和第二抗原之间的levenshtein距离可以是将第一抗原改变为第二抗原所需的最少编辑次数。在计算编辑距离时，允许的编辑可以包括插入、缺失和/或置换。如果第一抗原和第二抗原相同，则莱文斯坦距离可以为零。如果第一抗原和第二抗原大小相同，则levenshtein距离至多可以是第一抗原的大小。如果第一抗原和第二抗原的大小不同，则levenshtein距离可以至少是第一抗原和第二抗原之间的大小差异。
[0155]
另一种计算编辑距离的方法可以是最长公共子序列方法，其中插入和缺失可以是仅有的两个允许的计算编辑。另一种计算编辑距离的方法可以是hamming距离，其中仅可以
使用相同大小的抗原。
[0156]
可以确定两种或更多种抗原之间的最小编辑距离。在一些情况下，最小编辑距离可以是两种或更多种抗原中的任何两种抗原之间的最小编辑距离。最小编辑距离可以是一组中两种或更多种最相似抗原的相似性的度量。
[0157]
可以确定两种或更多种抗原之间的最大编辑距离。在一些情况下，最大编辑距离可以是两种或更多种抗原中的任何两种抗原之间的最大编辑距离。最大编辑距离可以是一组中两种或更多种差异最大抗原的相似性的度量。
[0158]
可以测量或描述一组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离和一组中两种或更多种抗原之间的最大配对编辑距离。两种编辑距离的组合可以描述一组中相似度最高和最低的抗原，并且在一些情况下，可以是一组中各种抗原范围的度量。
[0159]
编辑距离可以以抗原大小的百分比进行测量。在本文中，抗原的大小可以是抗原的平均大小、抗原大小的最大值、抗原大小的最小值、或抗原大小的另一种度量。例如，对于大小各自为100个氨基酸且具有5个编辑差异的两种抗原，配对编辑距离可以表示为5％。
[0160]
疫苗可以包含微生物的一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离小于特定阈值。疫苗可以包含一组抗原，其中两种抗原之间的最大配对编辑距离至少是不同的特定阈值。在一些情况下，要求包括的抗原的最小和最大差异有助于确保以最小偏倚赋予跨各种抗原的免疫力。
[0161]
文库或疫苗可以通过最大编辑距离和最小编辑距离之间的差异进行描述。组中具有最大编辑距离的两种抗原可以具有称为“s”的编辑距离。文库中编辑距离最大的两种抗原可以具有称为“l”的编辑距离。“s”和“l”之间的差异可以表明疫苗中存在的抗原具有一系列差异。较大的差异可以指示抗原的较大范围的差异性或更多种类的抗原。在一些情况下，“s”可以是“l”的至少60％、“l”的70％、“l”的80％或“l”的90％。换言之，疫苗组合物中编辑距离差异最大的抗原可以位于文库中编辑距离具有差异的抗原的前10％、20％、30％或40％。
[0162]
可以计算给定疫苗的抗原之间的平均节点数。在一些情况下，疫苗中一组抗原中每种抗原之间节点的平均节点可以为至少1个、至少3个、至少5个、至少10个、至少15个或至少20个。在一些情况下，每种抗原之间的平均节点数可以为一组中抗原数的函数。有时，如果该组中的抗原数量较多，则每种抗原之间的平均节点数可能较低。
[0163]
可以使用系统发育树上将其分开的节点数来比较疫苗中的抗原。例如，密切相关的抗原可以由比较低密切相关的抗原更少的节点分开。在描述分开两种抗原的节点数量时，由较少节点分开的抗原可以在结构或序列上更密切相关或更相似，而被更多节点分开的抗原在结构或序列上可能较低密切相关或较少相似。在一些情况下，例如，疫苗中的两种抗原可以由至少1个、至少3个、至少5个、至少10个、至少15个或至少20个节点分开。
[0164]
在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以为1个。任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少5个、至少10个、至少15个或至少20个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以为1个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少5个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以为1个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少10个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以为1个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少15个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以
为1个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少20个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以少于5个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少5个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以少于5个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少10个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以少于5个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少15个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以少于5个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少20个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以少于10个并且任何两种抗原之间的最大节点数可能为至少10个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以少于10个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少15个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小节点数可以少于10个并且任何两种抗原之间的最大节点数可以为至少20个。
[0165]
可以计算给定疫苗的抗原之间的平均分支数。在一些情况下，疫苗中一组抗原中每种抗原之间的平均分支数可以为至少1个、至少3个、至少5个、至少10个、至少15个或至少20个。在一些情况下，每种抗原之间的平均分支数可以为一组中抗原数的函数。有时，如果该组中的抗原数量较多，则每种抗原之间的平均分支数量可能较低。
[0166]
可以使用系统发育树上将其分开的分支数量来比较疫苗中的抗原。例如，与较低密切相关的抗原相比，密切相关的抗原可以由较少的分支分开。在描述分开两种抗原的分支数量时，由较少分支分开的抗原可以在结构或序列上更密切相关或更相似，而被更多分支分开的抗原在结构或序列上可能较低密切相关或较少相似。在一些情况下，例如，疫苗中的两种抗原可以由至少1个、至少3个、至少5个、至少10个、至少15个或至少20个分支分开。
[0167]
在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个。任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少5个、至少10个、至少15个或至少20个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少5个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少10个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少15个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少20个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于5个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少5个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于5个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少10个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于5个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少15个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于5个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少20个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于10个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少10个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于10个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少15个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于10个并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少20个。
[0168]
疫苗可以通过其序列同一性进行描述。如本文所用，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”，通常是指两个或更多个相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的序列或子序列。
[0169]
可替代地，两个核酸序列或多肽相同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第
二核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫交叉反应，如下所述。因此，在以下情况下一个多肽通常与第二多肽相同：例如，其中两个肽的差异仅在于保守置换。两个核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补物在严格条件下彼此杂交，如本文所述。
[0170]
可替代地，两个核酸序列或多肽相同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫交叉反应，如下所述。因此，在以下情况下一个多肽通常与第二多肽相同：例如，其中两个肽的差异仅在于保守置换。两个核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补物在严格条件下彼此杂交，如本文所述。
[0171]
可替代地，两个核酸序列或多肽相同的指示是第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫交叉反应，如下所述。因此，在以下情况下一个多肽通常与第二多肽相同：例如，其中两个肽的差异仅在于保守置换。两个核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补物在严格条件下彼此杂交，如本文所述。在一些情况下，一组中的每种抗原可以与该组中的至少一种抗原具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。在一些情况下，序列同一性可以衡量疫苗内抗原序列的相似或差异程度。
[0172]
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且通常指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖经天然修饰或通过干预的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及其他合适修饰的多肽。应当理解，因为本公开内容的多肽基于抗体，所以多肽可以以单链或缔合链出现。
[0173]“多核苷酸”或“核酸”，如本文可互换使用的，通常指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过dna或rna聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸成分打断。聚合后可进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”、用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，例如，带有不带电荷的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和带有电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有侧基，例如，蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply
‑
l
‑
赖氨酸等)的那些，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些，含有烷基化剂的那些，具有经修饰的连接(例如，α异头核酸等)的那些，以及未修饰形式的(一种或多种)多核苷酸。
[0174]
此外，糖中通常存在的任何羟基基团可以被取代(例如，通过膦酸酯基团、磷酸酯基团)，由标准保护基团保护，或被激活以制备与另外核苷酸的另外连接，或可以与固体支持物缀合。5'和3'末端oh可以被磷酸化或者被胺或具有1至20个碳原子的有机封端基团部分置换。其他羟基也可以被衍生化为标准保护基团。多核苷酸还可以含有核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'
‑
o
‑
甲基
‑
、2'
‑
o
‑
烯丙基、2'
‑
氟
‑
或2'
‑
叠氮基
‑
核糖、碳环糖类似物、α
‑
异头糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物(例如甲基核苷)。一个或多个磷酸二酯连接可以被另外的连接基团取代。这些可选的连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯被p(o)s(“硫代
酸酯”)、p(s)s(“二硫代酸酯”)、(o)nr2(“酰胺化物”)、p(o)r、p(o)or'、co或ch2(“甲缩醛”)取代，其中r或r'各自独立地为h或者经取代的或未取代的烷基(1
‑
20c)(其任选地含有醚(
‑‑
o
‑‑
)连接)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有连接均需要相同。前述描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括rna和dna。
[0175]“同源性”、“同一性”或“相似性”可以指两种肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性、相似性和同一性均可以通过比较在每个序列中的位置来确定，这些位置可以为了比较的目的而进行比对。当比较序列中的同等位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置处是相同的；当同等位点被相同或相似的氨基酸残基(例如，空间和/或电子性质相似)占据时，则该分子可被称为在该位置处同源(相似)。表示为同源性/相似性或同一性百分比是指由比较的序列共有的位置上相同或相似氨基酸数量的函数。“无关”或“非同源”的序列可以与本公开内容的序列具有小于40％同一性或小于25％同一性。在比较两个序列时，不存在残基(氨基酸或核酸)或存在额外残基也可降低同一性和同源性/相似性。
[0176]
术语“同源性”描述了基于数学的序列相似性比较，其用于鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白质。本公开内容的核酸(核苷酸或寡核苷酸)和氨基酸(蛋白质)序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如鉴定其他家族成员、相关序列或同源物。可以使用altschul等人，(1990)j.mol.biol.215:403
‑
10的nblast和xblast程序(2.0版)进行此类搜索。blast核苷酸搜索可以用nblast程序进行，评分＝100，字长＝12，以获得与本公开内容的核酸分子同源的核苷酸序列。blast氨基酸搜索可以用xblast程序进行，评分＝50，字长＝3，以获得与本公开内容的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以利用如altschul等人，nucleic acids res.25(17):3389
‑
3402中所述的缺口blast。当使用blast和缺口blast程序时，可以使用相应程序(例如，xblast和blast)的默认参数(参见，www.ncbi.nlm.nih.gov)。
[0177]
如本文所用，“同一性”可以指当序列比对以最大化序列匹配时，即，考虑缺口和插入，两个或更多个序列中相应位置处相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。可以通过已知方法容易地计算同一性，包括但不限于在computational molecular biology,lesk,a.m.，编辑，oxford university press,new york,1988；biocomputing:informatics and genome projects,smith,d.w.，编辑，academic press,new york,1993；computer analysis of sequence data,part i,griffin,a.m.和griffin,h.g.，编辑，humana press,new jersey,1994；sequence analysis in molecular biology,von heinje,g.,academic press,1987；和sequence analysis primer,gribskov,m.和devereux,j.，编辑，m stockton press,new york,1991；以及carillo,h.和lipman,d.,siam j.applied math.,48:1073(1988)中描述的那些。确定同一性的方法旨在提供检验的序列之间的最大匹配。此外，确定同一性的方法已编入公开可用的计算机程序中。确定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括但不限于gcg程序包(devereux,j.等人，nucleic acids research 12(1):387(1984))、blastp、blastn和fasta(altschul,s.f.等人，j.molec.biol.215:403
‑
410(1990)和altschul等人nuc.acids res.25:3389
‑
3402(1997))。blast x程序可以从ncbi和其他来源公开获得(blast manual,altschul,s.等人，ncbi nlm nih bethesda,md.20894；altschul,s.等人，j.mol.biol.215:403
‑
410(1990))。熟知的smith waterman算法也可用于确定同一性。
[0178]
期望的序列同一性程度的范围为约80％至约100％以及其间的整数值。通常，本公开内容涵盖与本文提供的任何序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的序列。
[0179]
本文中氨基酸序列中使用的字母“x”旨在表示二十个标准氨基酸中的任一个可置于该位置，除非另有特别说明。
[0180]
iii.疫苗
[0181]
疫苗可以是可以刺激免疫系统的组合物。这可以涉及刺激抗体的产生，并且可以提供针对一种或多种微生物的免疫力。疫苗可以由微生物制备，微生物可以是疾病的病原体、其产物或其合成替代物。以上提供了微生物的实例。
[0182]
疫苗可以被制备为药物组合物。药物组合物可以是疫苗的制剂，包括抗原，其形式可以施用于受试者。在一些情况下，药物组合物可以随时使用。可以优化药物组合物以使其易于使用、不良反应最小化、易于储存、储存温度范围、易于给药、易于生产或任何其他合适的因素。
[0183]
药物组合物可以包含如本文所述的疫苗组合物和药学上可接受的稀释剂、佐剂、辅料或其任何组合。在一些情况下，药物组合物可以包含稀释剂。稀释剂可以是稀释试剂。稀释剂可用于降低疫苗的粘性或密度，以提高其例如通过针头流动能力。在一些情况下，稀释剂可以与疫苗预混。在一些情况下，稀释剂可以与疫苗分开提供并在施用前混合。
[0184]
在一些情况下，药物组合物可以包含佐剂。佐剂可以提供增加的免疫原性。佐剂可以提供抗原缓释(例如，佐剂可以是脂质体)或者它可以是本身具有免疫原性的佐剂，从而与抗原起协同作用。例如，佐剂可以是已知的佐剂或者促进核酸摄取、将免疫系统细胞募集至施用部位或促进应答淋巴细胞的免疫激活的其他物质。佐剂包括但不限于免疫调节分子(例如，细胞因子)、油和水乳剂、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、海藻酸钠、bacto
‑
adjuvant、合成聚合物(例如聚氨基酸和氨基酸共聚物)、皂苷、石蜡油、ps
‑
gamp以及胞壁酰二肽。
[0185]
在一些情况下，佐剂可以是免疫调节分子。例如，免疫调节分子可以是重组蛋白细胞因子、趋化因子或免疫刺激剂，或者编码细胞因子、趋化因子或免疫刺激剂的核酸，其旨在用于增强免疫应答。
[0186]
本文提供的药物组合物可以包装在病毒样颗粒(vlp)中。在一些情况下，病毒样颗粒可以包含疫苗。
[0187]
在某些情况下，药物组合物可以包含辅料。在各种情况下，辅料可以是可用作疫苗的溶媒或介质的无活性物质。辅料可包括粘合剂、包衣、色素、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂、溶媒或其任何组合。
[0188]
本文的疫苗组合物或药物组合物可以被配制为多种制剂中的一种。在一些情况下，疫苗可以是气雾剂制剂、注射制剂、口服制剂或任何其他合适的制剂的形式。
[0189]
本文提供的疫苗组合物可以被配制成单位剂量。单位剂量可以是适用于一名受试者的疫苗剂量。在一些实例中，疫苗可以包装为单一单位剂量。在一些其他实例中，疫苗可以包装为多个单位剂量。
[0190]
对疫苗产生的免疫应答可以取决于抗原的总量，而不是存在的每种抗原的量。在
一些情况下，每种抗原可以处于单独使用时未提供对受试者中的广谱中和性抗原产生显著免疫应答的浓度。这种免疫应答可以包括募集和/或激活免疫细胞，例如b细胞或t细胞。在一些情况下，这种免疫应答可以是预防性免疫应答。在一些情况下，抗原可以具有提供对受试者中广谱中和性抗原产生免疫应答的组合浓度。
[0191]
iv.使用方法
[0192]
本文提供用于治疗或减少因感染和/或暴露于微生物或毒素引起的不良事件的方法。本文还提供了用于抑制或降低受试者中由微生物或毒素引起的疾病或病症的可能性的方法。所述方法可以包括向受试者施用本文所述的疫苗组合物。在一些情况下，本文提供的方法可以赋予受试者对由微生物引起的疾病或病症的免疫力。
[0193]
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”在本文中可互换使用。如本文所用，这些术语通常是指获得益处或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处可以表示根除或改善所治疗的潜在病症。此外，可以通过根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理症状来实现治疗益处，从而在受试者中观察到改善，尽管受试者可能仍患有潜在病症。预防效应包括延迟、预防或消除疾病或病症的出现，延迟或消除疾病或病症的症状发作，减缓、停止或逆转疾病或病症的进展，或其任何组合。为了预防益处，具有发展特定疾病的风险的受试者或报告一种或多种疾病生理症状的受试者可以接受治疗，即使可能尚未做出该疾病的诊断。
[0194]
施用本文疫苗的受试者可以是哺乳动物、鸟或任何其他合适的受试者。在一些情况下，受试者可以是人。在一些情况下，受试者可以是猪或其他驯养动物，例如，牛、山羊、绵羊、马、鸡、公鸡、火鸡、鹦鹉、猴、仓鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、犬或猫。
[0195]
此类受试者可以口服、以气雾剂、以注射剂或其组合接受疫苗。在一些情况下，可以接种多于一剂的疫苗。在一些情况下，受试者可以接受一剂、二剂、三剂、四剂、五剂、六剂、七剂、八剂、九剂、十剂或更多剂疫苗。可以在同一天重复给药，也可以间隔至少1天、至少1周、至少1个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年或至少10年。在一些情况下，重复剂量可以作为加强剂量给予，并且可以是与先前剂量相同的剂量、更大的剂量或更少的剂量。加强剂量可以是初免加强。
[0196]
具有重复剂量的疫苗的单个剂量可以包含相同的抗原或不同的抗原。如果单个剂量包含不同的抗原，则它们可以具有至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种抗原差异。在一些情况下，如果单个剂量包含不同的抗原，差异可以是最大限度地暴露于尽可能多的不同抗原。在一些情况下，如果单个剂量包含不同的抗原，另外的剂量可以是“更新”剂量，这可以赋予对新进化、适应或耐药株系的免疫力。
[0197]
在某些实施方案中，待注射的疫苗可以被配制成皮下注射。在一些情况下，待注射的疫苗可以被配制为用于肌内、腹腔、静脉内、皮内或任何其他合适类型的注射。可以向健康的受试者、非健康的受试者或健康状况未知的受试者施用疫苗。在一些情况下，如果受试者健康，疫苗可能更有效。疫苗可以包含重组表达载体。在一些情况下，疫苗可以由重组表达载体制备。在各种情况下，疫苗可以以重组表达载体储存。
[0198]
在一些情况下，重组表达载体可以包含编码代表微生物的第一级进化枝和第二级进化枝中的每一个的至少60％的一组抗原的核酸分子；一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过25并且两种抗原之间的最大配对编辑距离为至少300；代表微生物
所有otu的至少60％的一组抗原；或代表微生物所有otu的至少60％的一组抗原。
[0199]
在某些实例中，重组表达载体可以包含编码重组表达载体的核酸分子，该重组表达载体包含编码以下的核酸分子：代表微生物的第一级进化枝和第二级进化枝中的每一个的至少60％的一组抗原；一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的5％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少75％，代表微生物所有otu的至少60％的一组抗原；或代表微生物所有otu的至少60％的一组抗原。
[0200]
在各种实例中，重组表达载体可以包含编码代表微生物的第一级进化枝中的每一个的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的一组抗原的核酸分子。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码代表微生物的第二级进化枝中的每一个的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的一组抗原的核酸分子。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码代表微生物的第三级进化枝中的每一个的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的一组抗原的核酸分子。
[0201]
在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的1％、不超过5％、不超过10％、不超过15％或不超过20％。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的1％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的5％，并且最大配对编辑距离为至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。在各种情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的10％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的15％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的20％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。
[0202]
在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离为抗原大小的至少1％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中最大配对编辑距离不超过抗原大小的60％、不超过70％、不超过80％、不超过90％、不超过95％或不超过98％。在各种情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离为抗原大小的至少1％，并且最大配对编辑距离不超过抗原大小的60％、不超过70％、不超过80％、不超过90％、不超过95％或不超过98％。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离为抗原大小的至少5％，并且最大配对编辑距离不超过抗原大小的60％、不超过70％、不超过80％、不超过90％、不超过95％或不超过98％。在各种情况下，重组表达载体可以包含编码
一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离为抗原大小的至少10％，并且最大配对编辑距离不超过抗原大小的60％、不超过70％、不超过80％、不超过90％、不超过95％或不超过98％。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离为抗原大小的至少15％，并且最大配对编辑距离不超过抗原大小的60％、不超过70％、不超过80％、不超过90％、不超过95％或不超过98％。在一些情况下，重组表达载体可以包含编码一组抗原的核酸分子，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离为抗原大小的至少20％，并且最大配对编辑距离不超过抗原大小的60％、不超过70％、不超过80％、不超过90％、不超过95％或不超过98％。
[0203]
制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，所述一组抗原代表微生物的第一级进化枝和第二级进化枝中的每一个的至少60％，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的5％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少75％，代表微生物的所有otu的至少60％，或代表微生物的所有otu的至少90％。
[0204]
在一些情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，所述一组抗原代表微生物的第一级进化枝中的每一个的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，所述一组抗原代表微生物的第二级进化枝中的每一个的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在各种情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，所述一组抗原代表微生物的第三级进化枝中的每一个的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
[0205]
在一些情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的1％、不超过5％、不超过10％、不超过15％或不超过20％。在一些情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，其中最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在各种情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的1％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的5％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的10％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在各种情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的15％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些情况下，制备疫苗组合物的方法可以包括选择一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离不超过抗原大小的20％，并且最大配对编辑距离为抗原大小的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0206]
v.实施例
[0207]
开发的疫苗可以，例如，在以下几种方式中的至少一种上与典型市售疫苗有差异(和/或提供相对于其的优势)：(1)包含大量(例如，六种或更多种)抗原，例如，30种抗原，(2)每种抗原的含量相对较低，例如，每种抗原0.05μg，这可以允许相对较低的总抗原含量，
以及(3)疫苗针对在抗原上的共有位点引发的免疫原性应答的广度，例如，30种抗原中的每一种均是0.05μg，但共有位点的有效剂量是1.5μg的30
×
。
[0208]
对于以下实施例，向猪施用流感疫苗组合物。使用数种流感疫苗组合物。对于所有组合物，溶媒包含角鲨烯和磷酸盐缓冲盐水。溶媒对照组合物包含角鲨烯和磷酸盐缓冲盐水。旨在模拟市售流感疫苗的二价对照流感疫苗包含两种流感抗原变体：h1n1_2007(a/布里斯班/2007)(5μg)以及h3n2_1997(a/悉尼/5/1997)或h3n2_2007(a/布里斯班/2007)(5μg)。第一种单一抗原流感疫苗组合物包含50ng第一种血凝素变体(h1n1_2007；a/布里斯班/2007)。第二种单一抗原流感疫苗组合物包含50ng第二种血凝素变体(h3n2_2007；a/布里斯班/2007)。30种抗原流感疫苗组合物包含30种流感抗原(30种血凝素变体)，代表1918年至2015年之间的流感抗原，如实施例4中所述进行选择。27种抗原流感疫苗组合物包含27种流感抗原(27种血凝素变体)，代表1918年至2008年之间的流感抗原。30种抗原流感疫苗组合物也用于一般疫苗组合物检验。使用27种抗原流感疫苗来检验疫苗预防“未来”病毒株的能力，这可能被描述为疫苗提供针对尚不存在但将来可能存在的抗原变体的保护的能力。
[0209]
以下说明性实施例是本文描述的组合物和方法的实施方案的代表，并不表示以任何方式进行限制。
[0210]
实施例1：对接种疫苗后引发的独特抗体的数量进行定量
[0211]
成人可以包含约1亿个独特bcr的b细胞受体(bcr)库。接种流感疫苗后，可以引发约1,000个独特bcr以开始亲和成熟。血清学分析表明，其中约10％可以有效转化为生产性浆细胞。这可能导致注射流感疫苗，该疫苗可以提供约100种独特抗体的血清学保护。该概念在图4中示出。
[0212]
实施例2：对血凝素上独特型b细胞表位的数量进行估计
[0213]
人抗体可以接触它们识别的抗原表面上约20至30个残基。在一些情况下，约12至16个此类残基可以形成表位，该表位可以称为“潜在的关键表位”。在一些情况下，此类表位对于维持抗体对抗原的识别可能是重要的。
[0214]
鉴于由疫苗接种引起的来自约1000个b细胞谱系的约100种独特抗体，问及：(1)流感血凝素蛋白(ha)表面存在多少独特型表位，(2)鉴于这些表位的保守性，单个抗体发生广谱交叉反应的概率是多少，以及(3)在约100种独特抗体中，受试者的疫苗应答包含广谱保护性抗体的概率和百分比。
[0215]
为了在流感血凝素蛋白(ha)表面生成独特的潜在关键表位数据库，使用zdock进行559个结晶的人抗体结构对代表性ha结构(pdb id:3fku)进行深度计算蛋白质
‑
蛋白质对接。这产生3,718,346个独特的接触残基组，每个组包含25+/
‑
12个ha接触残基。然后对来自ha上独特接触残基组的14个接触残基(其可以形成潜在的关键表位)进行重复随机子采样，从而产生263,022,674个独特的14个残基潜在关键表位的数据库，其可以定义单个抗体的结合决定因素。虽未详尽，但该数据库为模拟人抗体结合ha的表位保守概率提供了基础。该概念在图4中示出。
[0216]
实施例3：对所有血凝素表位的氨基酸保守性进行定量
[0217]
对1918
‑
2018年间株系的82个ha蛋白序列中2.63亿个潜在关键表位的保守性进行分析。该分析鉴定低于百万分之一的在所有ha之间普遍保守的潜在关键表位。观察到约300,000个潜在关键表位中的一个在所有株系中具有90％的保守性，而在给定的ha抗原组
中观察到1％和3％是普遍保守的，如图5所示。在h1或h3抗原组中90％保守的潜在关键表位不太常见(h1和h3分别为6.9％和5.8％)。这可能表明，在一些情况下，非广谱保守性表位可能具有免疫显性，因为其数量远远超过了广谱保守性表位。
[0218]
该模型表明，真正普遍保守的表位结合抗体可能太罕见而无法在大多数免疫系统中出现，并且识别株系内保守性表位的广谱抗体可能出现，但可能代表少数应答，并且不太可能以足以在随后几年介导足够保护的浓度存在。例如，给定100种应答抗体，预期大多数受试者未引发针对广谱保守性表位的抗体。对于能够或可能能够在给定100种应答抗体的情况下引发针对广谱保守性表位的抗体的受试者，在大多数情况下，该抗体可以构成其血清应答的约1％。在这种情况下，季节之间的抗原漂移足以使受试者的剩余99％的抗体效价过时或接近过时。结合随时间发生的自然滴度下降，这些受试者最终可能得不到保护。
[0219]
该模型与以下观察结果一致：约10％
–
15％的氨基酸位置的季节性变化足以破坏大多数针对血凝素的表位，并可能导致需要通过当前方法进行持续接种。
[0220]
此外，仅用血凝素茎进行免疫可以提供一些益处，但茎内的季节性变化可继续使大多数表位过时。免疫原的变异，包括共有血凝素变异，可以提供有限益处。增强性佐剂可能无法解决广度激发，因为它们可以增加应答抗体的总数，并且可能能够改变基本的关键表位保守概率分布。
[0221]
虽然保守性表位存在于血凝素的茎和头部中，但它们的比例可能太低而无法引起大多数受试者(包括大多数人或大多数猪)的主要免疫应答比例，并且这可以通过优化免疫原序列或增强佐剂来解决的可能性很小。
[0222]
实施例4：流感疫苗组合物的产生
[0223]
目前，市售疫苗通常提供约10
–
50μg总抗原。此类市售疫苗通常仅包含两种抗原(二价疫苗)、三种抗原(三价疫苗)或四种抗原(四价疫苗)。
[0224]
为了鉴定最佳分散的血凝素变体群体，开发了将靶抗原的同源变体的大型数据库作为输入，并基于氨基酸百分比同一性输出随机生成的最佳分散代表的子集的方法。在本文中，输入是用于流感的血凝素抗原的同源变体的大型数据库，并且输出是代表如本文所述的输入组抗原的抗原子集。在本实施例中，设计了两种不同的疫苗组合物用于施用于受试者。
[0225]
该方法重复应用于1918年至2015年的时间段内的8600种血凝素变体的1000次随机迭代，以输出一组30种代表性流感抗原变体。这些变体包含30种抗原疫苗组合物，详见表2。抗原购自sino biological,inc.(中国北京)。
[0226]
表2：30种抗原疫苗组合物
[0227][0228][0229]
在一些实施例中，使用27种抗原疫苗组合物，旨在代表从1918年至2008年的时间
段的抗原变体。这种27种抗原疫苗组合物的大部分抗原也包含在30种抗原疫苗组合物中。该疫苗组合物可用于确定具有代表微生物表位的抗原的此类组合物针对“未来抗原”的疗效并且包括表3中的抗原。抗原购自sino biological,inc.(中国北京)。
[0230]
表3:27种抗原疫苗组合物
[0231][0232]
[0233]
在一些实施例中，使用包含从1918年至2018年来自人、猪和未知宿主的73种流感血凝素抗原的疫苗组合物。该组合物中的抗原在表4中提供。抗原购自sino biological,inc.(中国北京)。这些抗原的氨基酸序列是seq id no:1
‑
87，如表6中所列。
[0234]
表4：流感血凝素抗原疫苗组合物
[0235]
[0236]
[0237]
[0238][0239]
在一些实施例中，使用包含从1930年至2019年来自人、猪和未知宿主的28种流感神经氨酸酶抗原的疫苗组合物。该组合物中的抗原在表5中提供。抗原购自sino biological,inc.(中国北京)。这些抗原的氨基酸序列是seq id no:88
‑
127，如表7中所列。
[0240]
表5：流感神经氨酸酶抗原疫苗组合物
[0241]
[0242][0243]
可以包含在疫苗中的抗原的另外氨基酸序列以seq id no:128
‑
171提供，如表8中所列。
[0244]
实施例5：血凝素抑制测定
[0245]
血凝素抑制测定可用于测量疫苗赋予的免疫应答。用于血凝素抑制测定的样品方案可以从病毒的系列稀释液的制备开始，并且可以包括制备至少一种阴性对照或阳性对照样品，或者阴性对照样品和阳性对照样品两者。可能针对病毒的抗体，例如，在血清样品中，可以与病毒一起孵育。然后可以将红细胞添加到每个样品中并进行孵育，然后可以观察到血凝素。在一些情况下，不存在扣状体(button)可被视为阳性应答。在一些情况下，可以计算和报告效价。
[0246]
实施例6：流感中和测定
[0247]
流感中和测定的样品方案可以从制备抗体或包含抗体的溶液(例如，血清)的系列
稀释液开始。接下来提供的是用于产生这种连续稀释的样品方法。可以使用病毒稀释剂制备抗体稀释液。可以将病毒稀释剂添加到微量滴定板(例如96孔板)的孔中。在一些情况下，可以在每个孔中添加50μl病毒稀释剂。然后，可以将50μl的抗体或包含抗体的溶液添加到第一孔中。在一些情况下，这可以是1mg/ml的储备溶液。在一些情况下，这可以是血清。在一些情况下，这可以是稀释的血清。通过将50μl从第一个孔转移至每个连续孔中，可以实现2倍连续稀释，以实现1:1至1:128(抗体溶液：稀释剂)的稀释。此外，可以制备包含病毒稀释剂但没有抗体或包含抗体的溶液的阴性对照孔。最后50μl可能会被丢弃。在一些情况下，这可以重复进行，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
[0248]
将板盖上盖并放置在培养箱中。在一些情况下，条件可以是约37℃，约5％co2。在一些情况下，条件可以正好是37℃，约5％co2。在一些情况下，条件可以是约37℃，正好5％co2。在一些情况下，条件可以正好是37℃，正好5％co2。在稀释病毒的制备过程中，该板可以保持在培养箱中。在一些情况下，应保持ph以避免在添加病毒时对病毒产生有害的ph影响。
[0249]
病毒可以在病毒稀释剂中稀释到工作稀释度，可以是100tcid
50
/50μl。tcid
50
可以是50％组织培养感染剂量，100tcid50可以等于tcid
50
值的100倍。
[0250]
可以将50μl稀释的病毒添加到含有抗体的孔中和不含抗体的对照孔中。在一些情况下，可以制备具有抗体或含有抗体但不含病毒的溶液的另外对照孔。在一些情况下，可以保留一排孔用于病毒反滴定。轻轻混匀板，在所有孔中加入病毒稀释剂，使每个孔体积相等。可以使用标准方案进行反滴定。
[0251]
可以将板盖上盖并再次如上所述放置在培养箱中1小时。1小时后，可将100μl稀释的mdck细胞(应为70％
‑
95％单层且传代数较低<30)添加到微量滴定板的每个孔中。每个孔可以包含1.5
×
104个细胞。
[0252]
可以将板盖上盖并再次如上所述放入培养箱中18
‑
20小时。孵育后，可以从孔中除去液体，可以洗涤孔，例如，使用200μl磷酸盐缓冲盐水(pbs)。每孔可以添加100μl 80％冷丙酮，室温下孵育10
‑
12分钟固定。然后可以从孔中除去丙酮，并且可以干燥板，例如通过风干约10分钟或直到干燥。
[0253]
然后可以使用标准elisa方案进行流感酶联免疫吸附测定(elisa)以确定已被中和的病毒的量。在一些情况下，流感中和测定可以用受试者的血清进行，所述受试者已经接种了根据本公开内容开发的疫苗组合物。在一些情况下，可以使用猪血清、人血清或任何哺乳动物的血清进行这种流感中和测定。在一些情况下，血清可以包含抗体，这些抗体是头部特异性抗体、茎特异性抗体、广谱中和性抗体、通用抗体、90％通用抗体、广谱株系特异性抗体和/或90％株系特异性抗体
[0254]
在流感中和测定中，可以包括来自接种对照疫苗的受试者的对照样品。在这种情况下，对照疫苗可以是单价疫苗、二价疫苗、三价疫苗或四价疫苗。当对照疫苗是三价疫苗时，它可以包含来自h1n1株系、h3n2株系和hab株系的抗原。在一些情况下，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照疫苗时大至少2倍。在一些情况下，当使用血凝素进行抑制测定或流感中和检验时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用包含h1n1、h3n2和hab抗原的对照疫苗时大至少2倍。在一些情况下，当使用血凝素进行抑制测定或流感中和检验时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照四价疫苗时大至少2倍。在一些情况下，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照疫苗时大至少10倍。在一些
情况下，当使用血凝素进行抑制测定或流感中和检验时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用包含h1n1、h3n2和hab抗原的对照疫苗时大至少10倍。在一些情况下，当使用血凝素进行抑制测定或流感中和检验时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照四价疫苗时大至少10倍。在一些情况下，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照疫苗时大至少100倍。在一些情况下，当使用血凝素进行抑制测定或流感中和检验时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用包含h1n1、h3n2和hab抗原的对照疫苗时大至少100倍。在一些情况下，当使用血凝素进行抑制测定或流感中和检验时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照四价疫苗时大至少100倍。在一些情况下，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照疫苗时大至少1,000倍。在各种情况下，当使用血凝素进行抑制测定或流感中和检验时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用包含h1n1、h3n2和hab抗原的对照疫苗时大至少1,000倍。在一些情况下，当使用血凝素抑制测定或流感中和进行检测时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照四价疫苗时大至少1,000倍。在一些情况下，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照疫苗时大至少10,000倍。在各种情况下，当使用血凝素进行抑制测定或流感中和检验时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用包含h1n1、h3n2和hab抗原的对照疫苗时大至少10,000倍。在一些情况下，当使用血凝素进行抑制测定或流感中和检验时，使用开发的疫苗的最小中和稀释度可以比使用对照四价疫苗时大至少10,000倍。在一些情况下，最小中和稀释度的改进可以针对一种抗原、超过一种抗原或针对所有检验的抗原。在各种情况下，最小中和稀释度的改进可以针对一种抗原、超过一种抗原或针对所有检验的抗原。
[0255]
在一些情况下，开发的疫苗可以比对照疫苗中和更多的株系。例如，开发的疫苗可以比对照疫苗中和多至少一种株系。在一些情况下，开发的疫苗可以比对照疫苗中和多至少2种、至少5种、至少10种、至少25种、至少50种或至少100种株系。在各种情况下，开发的疫苗可以比对照疫苗中和多至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1,000倍、至少5,000倍或至少10,000倍的株系。
[0256]
实施例7：elisa测定
[0257]
elisa可用于检测血清中存在的针对抗原(例如，流感抗原)的抗体。在一些实施方案中，研究了多种不同的抗原(例如，来自不同株系的血凝素变体)。简言之，可以将血凝素抗原变体固定在96孔板的孔中。在一些情况下，可以制备稀释系列。可以制备不含抗原的阴性对照孔。
[0258]
可以在包含血凝素抗原变体的孔或对照孔中孵育包含怀疑含有血凝素的血清的溶液。孵育期后，可以洗掉包含血清的溶液。在一些情况下，如果血清中存在可与血凝素反应的一种或多种抗体，则抗体将保持与板结合。
[0259]
针对产生血清的动物的抗体产生的二抗可以施加到孔中。孵育期后，可以洗掉二抗。如果血凝素和血清中的抗体之间存在相互作用，二抗可以标记血凝素
‑
抗体复合物。
[0260]
二抗可以通过任何可接受的方式标记，并且可以在存在二抗的孔中检测信号。在一些情况下，信号可以对应于存在的二抗的量。在一些情况下，信号可以对应于存在的血清来源抗体的量。在一些情况下，信号可以对应于孔中血凝素
‑
抗体相互作用的量。
[0261]
实施例8：通过保守
‑
浓度偶联增加平均表位广度
[0262]
检验是否可以设计转变体内表位保守性的概率分布，以将疫苗引发的抗体富集到
保守性表位的疫苗接种策略。
[0263]
不受任何特定理论的约束，假设有可能选择性地回应能够识别的b细胞，并且可以通过将这些表位的保守性与其在疫苗制剂中的浓度偶联，从而针对广谱保守性表位进行亲和成熟，称为保守
‑
浓度偶联或c3。通过施用30种不同ha变体的混合物，每种单独地以不足以引发有效株系特异性免疫应答的剂量，可以有效地从分布中去除单一变体表位的优势群体。因此，这将选择性地有利于识别组分之间共有表位的b细胞，其中广谱反应性b细胞接受的剂量比株系特异性b细胞高多达30倍。
[0264]
图6示意性地示出了c3的工作方式。携带靶向保守性表位的受体的b细胞接受更高的相对抗原负荷，因此需要刺激以分化为可产生抗体的浆细胞。具有可识别株系特异性表位的受体的其他b细胞可以接受较低的相对抗原负荷，这可能低于启动免疫应答所需的阈值。实施例9：研究设计
‑
使用保守
‑
浓度偶联(c3)的保守性表位聚焦
[0265]
使用家养远交猪(sus scrofa)(这是一种模式生物以及用于甲型流感感染和疫苗接种的兽医靶标生物)设计三项体内实验。在第一项体内研究中，35头猪被分成5个队列，每个队列7头猪。每种疫苗(c3)制剂均包含一组不同的30种ha变体(h1、h2、h3、h5和h7，1918
‑
2014年期间)。猪队列接种二价制剂(biv，2种ha抗原h1n1 2007和h3n2 1997，5,000ng/抗原)、c3
‑
500(30种ha抗原和500ng/抗原)、c3
‑
100(30种ha抗原和100ng/抗原)、c3
‑
50(30种ha抗原和50ng/抗原)或溶媒对照品(pbs+角鲨烯)。动物接种3次，间隔3周，每次接种后3
‑
4周(第29、50和71天)收集血清。从第三次接种疫苗(第50天)后7天收集的pbmc中分离rna。
[0266]
在第二项和第三项体内研究中，2008年后的所有ha代表均被移除，以创建“2009年前”的c3制剂，用于检查对事实上的未来病毒株系和ha的血清学应答，包括h1n1大流行的2009年至h3n2 2018年。使用h1n1 2007和h3n2 2007类似地配制2008年季节性二价对照品。
[0267]
对于第二项体内研究，将20头猪分成5个队列，每个队列4头猪。队列各自接受包含5,000ng/抗原(biv)的2种ha抗原、50ng/抗原(c3
‑
50)的27种ha抗原、50ng(单一低剂量h1)的h1n1 2007、50ng(单一低剂量h3)的h3n2 2007、或pbs+角鲨烯(溶媒对照品)的制剂接种。包括以低剂量(50ng)施用单一ha的队列，以验证猪的工作l
thresh
(化学计量限度，低于其则给定抗原未诱导免疫应答)。每头动物接种六次，间隔21天。此外，3个队列(biv、c3
‑
50和溶媒对照品)在第六次接种后9周接受第七次接种。对于c3
‑
50，第七次接种包括高剂量加强(27ha，500ng/抗原)。在同一天的每次接种之前立即收集血清。在第六次接种后4周(第135天)和第七次接种后4周(第195天)收集另外的血清。从第六次接种后7天(第112天)收集的外周血单核细胞中分离rna。
[0268]
在第三项体内研究中，将25头猪分成五个队列，每个队列5头猪。队列各自接受包含5,000ng/抗原+角鲨烯(biv)、c3
‑
50+角鲨烯、c3
‑
50+明矾、c3
‑
50+tlr或溶媒对照品(pbs+角鲨烯+明矾+mpla+咪喹莫特)的制剂接种。动物接受3次接种，每次间隔21天，在同一天每次接种前立即收集血清。在第三次接种后4周(第70天)收集另外的血清。对于前两次接种，所有3个c3
‑
50队列均以50ng/抗原接受28种ha抗原，在第三次接种时接受500ng/抗原。
[0269]
实施例10：群体效应
[0270]
为了支持浓度保守偶联理论，体内测定l
thresh
。首先，通过以50ng的剂量施用单一抗原(h1n1 2007或h3n2 2007)，确定50ng剂量的ha低于免疫激活阈值。间隔21天向猪施用六剂总剂量(对应于前面实施例中的第二项研究)。在这两种情况下，在第六次接种后28天，
通过elisa未检测到针对任一抗原的血清应答，如图7所示。
[0271]
然而，当这两种抗原与1918
‑
2008年期间的25种其他ha联合施用时，每种ha的剂量也是50ng(c3
‑
50)，检测到对两种抗原的血清应答。此外，c3
‑
50接种导致对c3中其他ha以及2009
‑
2013年期间未包含在制剂中的一组“未来”2008年后毒株，包括h1n1、h3n2、h5n1和h7n9的血清应答。因此，即使单个组分可能低于其阈值剂量，低剂量组合也可以引发免疫应答。
[0272]
在这种情况下，在单独亚生理剂量的27种抗原的池中，共有表位的剂量可以高出至多27倍，因此可以成功靶向并优先导致广谱应答，这些应答在异源株系中交叉。
[0273]
图7示出了跨免疫队列(各n＝4)c3
‑
50(27种ha，50ng/ha)、单一低剂量(50ng)h1n1 2007抗原、单一低剂量(50ng)h3n2 2007抗原和溶媒对照品(pbs+角鲨烯)，单独猪血清对10种ha抗原(1934
‑
2013年期间的h1、h3、h5和h7)的elisa信号(％最大od
450nm
)。箱线图显示中位值和iqr；线显示下四分位数和上四分位数的1.5
×
iqr。点代表离群值。虚线框中显示的抗原表示1918
‑
2008 c3疫苗制剂中存在的ha。
[0274]
实施例11：保守
‑
浓度偶联应答主要是亚型特异性的并需要最小总亚型抗原剂量
[0275]
c3引发的结合应答的分析由ha亚型分开。实施例9中描述的第一项研究的c3
‑
50制剂包含10种h1、7种h3、5种h5、3种h7和2种h2，其各自单独为50ng。血清应答与总亚型剂量相关，h1和h3提供最强应答，h5提供较弱应答，并且h2和h7似乎对c3
‑
50应答不佳。这些结果支持一种亚型的应答不一定会提高对其他亚型的应答的预测。因此，在一些情况下，广谱亚型内应答可能比完全通用的抗体更常见。数据表明潜在的最小进化枝剂量为7
‑
10个成员(即350
‑
500ng最保守的表位)以获得最佳效应。
[0276]
说明本实验的数据在图8中示出。来自c3
‑
50队列(研究#1)猪的elisa信号(％最大od
450nm
)显示为分为c3
‑
50制剂中存在的不同ha抗原类别(h1、h2、h3、h5和h7)。x轴显示每类的ha数量。在第三次接种疫苗后28天(第71天)收集血清。ha抗原数量与elisa信号的pearson相关系数显示为具有相应p值的r2。箱线图显示中位值和iqr；线显示下四分位数和上四分位数的1.5
×
iqr。p值使用kruskal
‑
wallis秩和检验结合dunn校正计算，以进行多重比较。选定的p值报告为经校正并表示为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。
[0277]
实施例12：具有反向剂量应答的保守
‑
浓度偶联广谱反应性
[0278]
在一些情况下，降低每个单独组分的剂量可能能够增加压力以仅靶向保守性表位，从而提供更大的血清学应答广度。为了评价c3的剂量与应答之间关系，与biv和溶媒对照组一起检验c3的三个剂量组。来自实施例9中描述的第一项研究的每队列7头猪中的每头对一组36种抗原的血清应答表明最低剂量的c3(50ng/ha)提供了对大多数抗原(跨越h1n1、h1n3、h1n3、h2n2、h3n2、h5n1、h6n2和h17n10，从1918年至2014年期间)的最高血清应答。这种反向剂量应答符合模型预测，并且是这种疫苗接种策略的特有属性。如通过elisa所测量，与我们的二价制剂相比，所有三种c3制剂产生改善的中位血清应答，如图9的小图b所示。此外，观察到反向剂量应答，其中最低剂量的c3产生最高中位血清应答，如图9的小图a所示，以及在第三次接种后7天至28天的血清效价随时间的最高倍数变化，如图9的小图b所示。这与模型对保守
‑
浓度偶联的预测一致，通过稀释竞争性表位导致向广度的转变。
[0279]
图9，小图a示出了每头猪(研究#1)跨所有检验株系(n＝36，跨越h1、h2、h3、h5、h7和h17，从1918
‑
2014年期间)的平均elisa信号(％最大od
450nm
)。在第三次接种疫苗后28天
(第71天)收集血清。图9，小图b示出了在第三次接种后7天和28天之间来自c)的每头猪的平均elisa信号(％最大od
450nm
)的倍数变化。箱线图显示中位值和iqr；线显示下四分位数和上四分位数的1.5
×
iqr。p值使用kruskal
‑
wallis秩和检验结合dunn校正计算，以进行多重比较。选定的p值报告为经校正并表示为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。
[0280]
在分析每个队列、每个动物的应答时，观察到更多动物的应答更广谱，作为反向剂量应答的函数，其中最低剂量(c3
‑
50 ng/抗原)表现出最大的广度，如图10的热图所示。
[0281]
图10提供了来自5个免疫队列的单独猪血清结合针对36种ha(跨越h1、h2、h3、h5、h6、h7和h17，1918
‑
2014年期间)以及广谱中和性人抗体(c05、f10和cr9114)的elisa信号(％最大od
450nm
)热图。免疫队列是以500ng/ha、100ng/ha和50ng/ha的30种ha的三种不同的c3制剂，biv队列(h1n1 2007和h3n2 1997，各5,000ng)和溶媒对照队列(pbs+角鲨烯)。在第三次接种后28天(第71天，研究#1)收集血清。使用分位数间隔调整热图阴影以调整elisa数据分布。阳性株系覆盖率被确定为高于溶媒对照平均值的百分比值+每个株系的3
×
sd。
[0282]
总体上，数据显示应答的广度与保守性表位的浓度相关，并且最低剂量50ng/抗原的c3制剂在大多数猪中提供了最广谱的平均结合株系/猪血清。
[0283]
实施例13：保守
‑
浓度偶联诱导一致的b细胞扩增
[0284]
接下来，在第六次接种后7天，分析第二项研究中描述的猪(如实施例9中所述)的猪外周血单核细胞(pbmc)的igm和igg b细胞受体(bcr)库。与在接受二价或溶媒免疫程序的猪中观察到的克隆扩增的高度可变性相反，在接受c3
‑
50制剂的猪中观察到明显更一致的bcr库克隆型扩增。因此，c3似乎产生了更一致并因此可能更好预测的免疫应答。
[0285]
说明这些观察结果的数据在图11中提供，作为按同种型分开的靠前克隆型占据的外周bcr库。黑线显示了对于每个免疫组猪的前n个克隆型而言作为总序列百分比(％)的平均占据的库。灰色区域表示95％置信区间。免疫队列来自实施例9中描述的第二项体内研究；27种ha的c3制剂，50ng/ha(n＝4)，二价队列(h1n1 2007和h3n2 2007，各为5,000ng，n＝3)和溶媒对照(pbs+角鲨烯，n＝4)。在第六次接种后7天(第112天)收集淋巴细胞。在文库制备过程中通过c区特异性引发确定同种型。克隆型被定义为具有相同cdrh3氨基酸序列的序列。
[0286]
实施例14：保守
‑
浓度偶联引发广谱中和性抗体
[0287]
为了分离在接种c3的动物中产生的单克隆猪抗ha抗体，产生来自实施例9中描述的第一项体内研究的c3动物的m13噬菌体展示的猪抗体的文库。从这些文库中，我们从接受低剂量c3(50ng/抗原)的猪身上分离了猪抗ha抗体，包括bnab 9c5。
[0288]
表示该实验结果的数据在图12中提供。通过噬菌体展示分离的广谱中和性猪单克隆抗体9c5的序列比对。使用imgt v quest针对猪(sus scrofa)种系基因比对重链和轻链核苷酸序列。与检测的种系基因相比的突变用下划线表示，cdrh3用粗体标记。cdrh3由imgt报告，其中以imgt编号方案中添加7个氨基酸位置111.1
‑
111.3和112.4
‑
112.1。在第三次接种疫苗后7天(第50天，研究#1)，从每个免疫队列的b细胞库构建噬菌体文库，并针对h3n2 2007和h1n1 2007进行4轮筛选。单克隆9c5来自一头猪(c3
‑
50队列，30种ha，50ng/ha)。
[0289]
数据表明，c3抗原制剂可以诱导广谱中和性抗体，与已知的人bnab相比，这些抗体表现出更好的性能。这表明本文提供的方法有效地克服了这些极罕见的表位的随机障碍，并且靶向这些的抗体能够广谱地中和一系列流感株系，即使它们不是原始抗原制剂的一部
分。
[0290]
此外，还进行了一项实验，以确定足以在体外中和一组5种甲型流感病毒株(h1n1/加利福尼亚/2009、h1n1/michigan/2015、h1n1/michigan/2017、h3n2/布里斯班/2007和h3n2/维多利亚/2011)的最低抗体浓度。结果在图13中提供。使用噬菌体展示文库从一头猪(c3
‑
50，体内研究#1)中分离出的猪单克隆9c5作为scfv
‑
hufc融合嵌合体构建体在2
‑
ml hek293上清液中进行检验，通过蛋白质a标准曲线用octet qk定量为32μg/ml。以与以下的比较进行显示：作为纯化的人igg1针对中和能力进行检验的对照bnab cr9114、f10和c05。
[0291]
实施例15：中和“未来”流感株系
[0292]
此处通过对接种c3的猪的血清进行微量中和测定，确定c3制剂是否引发中和性抗体。对于来自实施例9中描述的第二项体内研究的血清，从c3
‑
50疫苗接种队列的血清和接种株系(其是二价对照队列(2007年的h1n1和h3n2)的一部分)的二价对照品的猪血清中观察到相似中和能力。此外，对于检验的各个未来株系，c3
‑
50猪能够中和5/5(h1n1 2009、h3n2 2009、h3n2 2011、h3n2 2014和h1n1 2015)，而二价对照组仅显示对2/5(h3n2 2009和2011)的中和效价。
[0293]
对于来自实施例9中描述的第三项体内研究的血清，来自二价对照组的猪中和用一种“未来”病毒h3n2 2009(其不是制剂的一部分)检验的2/6株系。c3
‑
50队列明矾和角鲨烯表现出改善的中和作用，对检验的4/6和5/6株系的具有中和作用。中和不属于c3
‑
50制剂的3种和4种未来病毒。接受c3
‑
50+tlr激动剂作为佐剂的猪无法中和任何“未来”株系，仅能中和h3n2 2007。总体上，数据表明，以50ng施用的c3制剂产生的血清具有与二价制剂相似水平的广谱中和能力，同时还可以中和更广谱的不是抗原制剂的一部分的“未来”病毒。因此，保守
‑
浓度偶联方法可以将免疫应答集中在ha外壳蛋白上的高度保守性表位上。此外，这些表位可以引发与正常二价制剂相似水平的中和血清应答，并且还涵盖了随后十年病毒进化后出现的病毒株系。
[0294]
说明这些结果的数据在图14中提供。图14中的小图a提供了跨免疫队列(各n＝7头猪)c3
‑
50(30种ha，50ng/ha)、biv队列(h1n1 2007和h3n2 1997，各5,000ng)和溶媒对照(pbs+角鲨烯)，来自第一项体内研究的猪血清对30种ha抗原(h1、h2、h3、h5、h6、h7和h17，1918
‑
2014年期间)的elisa信号(％最大od
450nm
)。在第三次接种疫苗后28天(第71天)收集血清。柱代表队列中所有猪的平均值，误差条表示正标准偏差。箭头表示c3疫苗制剂中不存在ha(体内研究#1)。星号表示c3
‑
50和二价制剂之间的统计学显著差异，校正的p值<0.05或更低。p值使用株系方式wilcoxon秩和检验确定，其中替代性地假设biv信号小于c3
‑
50信号。应用benjamini hochberg校正来调整多重检验。
[0295]
图14中的小图b提供了中和广度，显示为按队列每头猪中和的平均株系数，以及显示为散点图的每个队列的阳性检验数。在第七次接种疫苗后28天(第195天，研究#2)收集血清。检验的病毒包括h1n1/puertorico/1934、h1n1/布里斯班/2007、h1n1/加利福尼亚/2009、h1n1/michigan/2015、h3n2/布里斯班/2007、h3n2/珀斯/2009、h3n2/维多利亚/2011和h3n2/香港/2014。未合并血清。队列为溶媒对照(pbs+角鲨烯)、季节性biv(h1n1 2007和h3n2 2007，各5,000ng)、单一低剂量h1抗原(h1n1 2007，50ng)、单一低剂量h3抗原(h3n2 2007，50ng)和c3
‑
50(27种ha，以50ng/ha)，体内研究#2。误差条表示标准偏差。
[0296]
图14中的小图c提供了研究#2的中和强度，报告为使用柱形图跨队列每个株系的
倒数中和稀释度。柱表示队列中所有猪(n＝4)的平均值，误差条表示标准偏差。检验的不属于2008c3制剂的“未来”株系用箭头表示。在第7次接种后28天(第195天)收集血清。
[0297]
图14中的小图d提供了研究#3的中和强度，报告为使用柱形图跨队列每个株系的倒数中和稀释度。柱表示队列中所有猪(n＝5)的平均值，误差条表示标准偏差。点显示每头猪的单独值。检验的不属于2008c3制剂的“未来”株系用箭头表示。在第三次接种疫苗后28天(第70天)收集血清。队列是溶媒对照(pbs+角鲨烯+tlr激动剂+明矾)、季节性biv(h1n1 2007和h3n2 2007，各5,000ng+角鲨烯)和3个c3
‑
50队列(28种ha，以50ng/ha)，分别含角鲨烯、tlr激动剂和明矾佐剂。
[0298]
实施例16：分别为hiv进化枝a、b和c选择32个最多样化的hiv gp160序列。
[0299]
hiv序列从www.hiv.lanl.gov/下载并分成进化枝。序列按长度过滤以排除短于800个氨基酸的序列并且选择来自进化枝a、b或c(hiv
‑
1m群)的序列用于进一步处理。
[0300]
使用hmmalign(hmmer v.3.0,hmmer.org/)与定制的hiv gp160蛋白hmm配置文件比对序列。接下来，使用定制的python(v.3.7.2)脚本生成配对汉明距离矩阵。随后使用在r(v.3.6.1)基本统计包的hclust函数中实现的upgma聚类(upgma：具有算术平均值的未加权对组方法)基于汉明距离矩阵对序列进行聚类。使用r(v 3.6.1)基础统计包的cuttree函数将聚类序列分为32个子聚类。
[0301]
使用gdatools(v.1.4)的medoids函数为每个聚类提取代表性序列作为它们的medoids。该分析的输出是96个氨基酸序列，每个hiv进化枝a、b和c各有32个氨基酸序列。这些序列是seq id no:172
‑
267，如表9中所列。
[0302]
vi.组合物
[0303]
组合物可以是疫苗或从中选择疫苗抗原的抗原文库。抗原文库可以包含多种抗原。这种组合物可以包含最少数量的微生物变体。在一些情况下，此类文库可以包含微生物的至少1
×
101种、至少1
×
102种、至少1
×
103种、至少1
×
104种、至少1
×
105种、至少1
×
106种、至少1
×
107种、至少1
×
108种、至少1
×
109种、或至少1
×
10
10
种变体。
[0304]
抗原文库可以包含微生物的所有已知序列的子集。包含更多序列的文库可以被认为更完整，并且在一些实施方案中，可以被认为更符合期望。在一些情况下，文库可以包含微生物的所有已知序列的至少80％、85％、90％或95％。
[0305]
疫苗中的抗原可以包含特定数目的氨基酸。在一些情况下，疫苗中的抗原可以包含不超过10个、不超过15个、不超过20个、不超过25个、不超过30个、不超过35个、不超过40个、不超过45个、不超过50个、不超过55个、不超过60个、不超过65个、不超过70个、不超过75个、不超过80个、不超过85个、不超过90个、不超过95个、不超过100个、不超过110个、或不超过120个氨基酸。在一些情况下，疫苗中的抗原可以包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个、或至少120个氨基酸。在一些情况下，疫苗中的抗原可以包含10至120个氨基酸、10至100个氨基酸、10至90个氨基酸、10至80个氨基酸、10至70个氨基酸、10至60个氨基酸、10至50个氨基酸、10至40个氨基酸、10至30个氨基酸、20至120个氨基酸、20至110个氨基酸、20至100个氨基酸、20至90个氨基酸、20至80个氨基酸、20至70个氨基酸、20至60个氨基酸、20至50个氨基酸、20至40个氨基酸、20至30个氨基酸、30至120个氨基酸、30至110个氨基酸、30至100个
氨基酸、30至90个氨基酸、30至80个氨基酸、30至70个氨基酸、30至60个氨基酸、30至50个氨基酸、30至40个氨基酸、40至120个氨基酸、40至110个氨基酸、40至100个氨基酸、40至90个氨基酸、40至80个氨基酸、40至70个氨基酸、40至60个氨基酸、40至50个氨基酸、50至120个氨基酸、60至110个氨基酸、50至100个氨基酸、50至90个氨基酸、50至80个氨基酸、50至70个氨基酸、50至60个氨基酸、60至120个氨基酸、60至110个氨基酸、60至100个氨基酸、60至90个氨基酸、60至80个氨基酸、60至70个氨基酸、70至120个氨基酸、70至110个氨基酸、70至100个氨基酸、70至90个氨基酸、70至80个氨基酸、80至120个氨基酸、80至110个氨基酸、80至100个氨基酸、80至90个氨基酸、90至120个氨基酸、90至110个氨基酸、90至100个氨基酸、100至120个氨基酸、100至110个氨基酸、或110至120个氨基酸。
[0306]
在一些情况下，疫苗中的抗原可以包含至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、或至少1000个氨基酸。在一些情况下，疫苗中的抗原可以包含不超过200个、不超过300个、不超过400个、不超过500个、不超过600个、不超过700个、或不超过800个氨基酸。在一些情况下，疫苗中的抗原可以包含10至1000个氨基酸、10至900个氨基酸、10至800个氨基酸、10至700个氨基酸、10至600个氨基酸、10至500个氨基酸、10至400个氨基酸、10至300个氨基酸、10至200个氨基酸、100至1000个氨基酸、100至800个氨基酸、100至700个氨基酸、100至600个氨基酸、100至500个氨基酸、100至400个氨基酸、100至300个氨基酸、100至200个氨基酸、200至1000个氨基酸、200至900个氨基酸、200至800个氨基酸、200至700个氨基酸、200至600个氨基酸、200至500个氨基酸、200至400个氨基酸、200至300个氨基酸、300至1000个氨基酸、300至900个氨基酸、300至800个氨基酸、300至700个氨基酸、300至600个氨基酸、300至500个氨基酸、300至400个氨基酸、400至1000个氨基酸、400至900个氨基酸、400至800个氨基酸、400至700个氨基酸、400至600个氨基酸、400至500个氨基酸、500至1000个氨基酸、500至900个氨基酸、500至800个氨基酸、500至700个氨基酸、500至600个氨基酸、600至1000个氨基酸、600至900个氨基酸、600至800个氨基酸、600至700个氨基酸、700至1000个氨基酸、700至900个氨基酸、700至800个氨基酸、800至1000个氨基酸、800至900个氨基酸、或900至1000个氨基酸。
[0307]
疫苗可以包含特定数量的抗原。可以基于可用抗原的总数、与致病株系的相似性、与其他包括的抗原的相似性、或与其他包括的抗原的差异来选择疫苗中的抗原。本文的疫苗可以包含一组抗原，其可以包含至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少200种、至少300种、至少400种、至少500种、至少600种、至少700种、至少800种、至少900种、或至少1000种不同的抗原。在选定的情况下，疫苗可以包含至少30种抗原。在一些情况下，疫苗可以包含一组抗原，其可以包含不超过5种、不超过6种、不超过7种、不超过8种、不超过9种、不超过10种、不超过15种、不超过20种、不超过30种、不超过40种、不超过50种、不超过60种、不超过70种、不超过80种、不超过90种、不超过100种、不超过200种、不超过300种、不超过400种、不超过500种、不超过600种、不超过700种、不超过800种、不超过900种、或不超过1000种不同的抗原。在选定的情况下，疫苗可以包含不超过30种抗原。在一些情况下，疫苗可以包含5至1000种、5至900种、5至800种、5至700种、5至600种、5至500种、5至400种、5至300种、5至200种、5至100种、5至90种、5至80种、5至70种、5至60种、5至50种、5至40种、5至30种、5至20种、5至10种、10至1000种、10至900种、10至800种、10至700
种、10至600种、10至500种、10至400种、10至300种、10至200种、10至100种、10至90种、10至80种、10至70种、10至60种、10至50种、10至40种、10至30种、10至20种、20至1000种、20至900种、20至800种、20至700种、20至600种、20至500种、20至400种、20至300种、20至200种、20至100种、20至90种、20至80种、20至70种、20至60种、20至50种、20至40种、20至30种、30至1000种、30至900种、30至800种、30至700种、30至600种、30至500种、30至400种、30至300种、30至200种、30至100种、30至90种、30至80种、30至70种、30至60种、30至50种、30至40种、40至1000种、40至900种、40至800种、40至700种、40至600种、40至500种、40至400种、40至300种、40至200种、40至100种、40至90种、40至80种、40至70种、40至60种、40至50种、50至1000种、50至900种、50至800种、50至700种、50至600种、50至500种、50至400种、50至300种、50至200种、50至100种、50至90种、50至80种、50至70种、50至60种、100至1000种、100至900种、100至800种、100至700种、100至600种、100至500种、100至400种、100至300种、100至200种、200至1000种、200至900种、200至800种、200至700种、200至600种、200至500种、200至400种、200至300种、300至1000种、300至900种、300至800种、300至700种、300至600种、300至500种、300至400种、400至1000种、400至900种、400至800种、400至700种、400至600种、400至500种、500至1000种、500至900种、500至800种、500至700种、500至600种、600至1000种、600至900种、600至800种、600至700种、700至1000种、700至900种、700至800种、800至1000种、800至900种、或800至1000种不同的抗原。
[0308]
在一些情况下，完整的抗原可以分成整体抗原的功能片段或部分，例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个部分(例如，段(piece)或片段(fragment))(含)，并且其中抗原的每个单独的功能片段可以与根据本文公开的方法制备聚合物缔合。在一些情况下，抗原可以分为至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45、至多50、至多55、至多60、至多65、至多70、至多75、至多80、至多85、至多90、至多95、或至多100个部分(例如，段或片段)(含)。
[0309]
在一些情况下，广谱保守性序列在微生物的跨一组株系(例如，微生物的至少10％的株系、至少25％的株系、至少50％的株系、至少75％的株系、至少90％的株系、至少95％的株系或所有株系)可以是至少40％保守的。在一些情况下，广谱保守性序列可以是跨微生物的物种或株系具有有限变异的序列。跨多种微生物保守的序列可以在多种微生物中相同或基本相同。例如，40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％保守的序列跨一组微生物可以具有40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的结构或序列同一性。
[0310]
在某些情况下，广谱保守性序列跨微生物的一组株系(例如，微生物的至少10％的株系、至少25％的株系、至少50％的株系、至少75％的株系、至少90％的株系、至少95％的株系或所有株系)可以是至少50％保守的。在各种情况下，广谱保守性序列跨微生物的一组株系(例如，微生物的至少10％的株系、至少25％的株系、至少50％的株系、至少75％的株系、至少90％的株系、至少95％的株系或所有株系)可以是至少60％保守的。在一些情况下，广谱保守性序列跨微生物的一组株系(例如，微生物的至少10％的株系、至少25％的株系、至
少50％的株系、至少75％的株系、至少90％的株系、至少95％的株系或所有株系)可以是至少70％保守的。在一些情况下，广谱保守性序列跨微生物的一组株系(例如，微生物的至少10％的株系、至少25％的株系、至少50％的株系、至少75％的株系、至少90％的株系、至少95％的株系或所有株系)可以是至少80％保守的。在各种情况下，广谱保守性序列跨微生物的一组株系(例如，微生物的至少10％的株系、至少25％的株系、至少50％的株系、至少75％的株系、至少90％的株系、至少95％的株系或所有株系)可以是至少90％保守的。
[0311]
如果抗原的序列与所代表进化枝的其他成员具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多10％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表进化枝的其他成员具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多15％、至多20％、至多25％或至多30％，则该抗原可以代表该进化枝。
[0312]
如果抗原的序列与所代表进化枝的其他成员具有的差异不超过所代表的进化枝的抗原平均大小的75％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些进化枝中，如果抗原的序列与所代表进化枝的其他成员具有的差异不超过50％、不超过55％、不超过60％、不超过65％、不超过70％、不超过75％、不超过80％、不超过85％、不超过90％或不超过95％，，则该抗原可以代表该进化枝。
[0313]
如果抗原的序列与所代表的进化枝的株系子集差异至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多55个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多150个、至多200个、至多250个、或至多300个氨基酸，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的至少50％株系差异至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多55个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多150个、至多200个、至多250个、或至多300个氨基酸，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的至少60％株系差异至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多55个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多150个、至多200个、至多250个、或至多300个氨基酸，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的至少70％株系差异至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多55个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多150个、至多200个、至多250个、或至多300个氨基酸，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的至少80％株系差异至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多55个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多150个、至多200个、至多250个、或至多300个氨基酸，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的至少90％株系差异至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多55个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、至多100个、至多150个、至多200个、至多250个、或至多300个氨基酸，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系差异至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多55个、至多60个、至多70
个、至多80个、至多90个、至多100个、至多150个、至多200个、至多250个、或至多300个氨基酸，则该抗原可以代表该进化枝。
[0314]
如果抗原的编辑距离为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多5％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的编辑距离为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多10％、至多15％或至多20％，则该抗原可以代表该进化枝。如果抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多10％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多15％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多20％，则该抗原可以代表该进化枝。
[0315]
如果抗原的编辑距离不超过所代表的进化枝的抗原平均大小的75％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的编辑距离不超过所代表的进化枝的抗原平均大小的70％、不超过80％、不超过90％、不超过95％或不超过99％，则该抗原可以代表该进化枝。
[0316]
如果抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％具有的差异不超过所代表的进化枝的抗原平均大小的90％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％具有的差异不超过所代表的进化枝的抗原平均大小的80％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％具有的差异不超过所代表的进化枝的抗原平均大小的70％，则该抗原可以代表该进化枝。
[0317]
如果抗原的编辑距离为所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的平均大小的至多5％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的编辑距离为所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的平均大小的至多10％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的编辑距离为所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的平均大小的至多15％，则该抗原可以代表该进化枝。
[0318]
如果抗原的编辑距离至多不超过所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的平均大小的90％，则该抗原可以代表该进化枝。如果抗原的编辑距离至多不超过所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的平均大小的80％，则该抗原可以代表该进化枝。在一些情况下，如果抗原的编辑距离至多不超过所代表的进化枝的所有株系的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的平均大小的70％，则该抗原可以代表该进化枝。
[0319]
一些疫苗可以包含与其他抗原中的每一个的平均编辑距离为进化枝中的抗原平均大小的至少5％的抗原。一些疫苗可以包含与至少一种其他抗原的平均编辑距离为进化枝中的抗原平均大小的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％或至少25％的抗原。在此类疫苗中，一些
疫苗可以包含与其他抗原中的每一个的平均编辑距离为进化枝中的抗原平均大小的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％或至少25％的抗原。在此类疫苗中，实际编辑距离可以变化，也可以相似。在一些情况下，没有抗原的实际编辑距离恰好为至少进化枝中抗原平均大小的5％。
[0320]
在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过1。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过2、不超过3、不超过4、不超过5、不超过6、不超过7、不超过8、不超过9、不超过10、不超过20、不超过30、不超过40、或不超过50。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少1。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40或至少50。
[0321]
在一些情况下，最小配对编辑距离可以不超过抗原大小的约1％、不超过约2％、不超过约3％、不超过约4％、不超过约5％、不超过约6％，不超过约7％、不超过约8％、不超过约9％、不超过约10％、不超过约15％、不超过约20％或不超过约25％。在一些情况下，最小配对编辑距离可以是抗原大小的至少约5％。在一些情况下，最小配对编辑距离可以是抗原大小的至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％或至少约25％。
[0322]
在一些情况下，最大配对编辑距离可以是至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少700、或至少800。在一些情况下，最大配对编辑距离可以不超过5、不超过10、不超过20、不超过30、不超过40、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90、不超过100、不超过150、不超过200、不超过250、不超过300、不超过350、不超过400、不超过450、不超过500、不超过550、不超过600、不超过700、或不超过800。
[0323]
在一些情况下，最大配对编辑距离可以不超过抗原大小的约75％。在一些情况下，最大配对编辑距离可以不超过抗原大小的约50％、不超过约55％、不超过约60％、不超过约65％、不超过约70％、不超过约75％、不超过约80％、不超过约85％、不超过约90％或不超过约95％。在一些情况下，最大配对编辑距离可以是抗原大小的至少约75％。在一些情况下，最大配对编辑距离可以是抗原大小的至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
[0324]
在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过1，并且最大配对编辑距离可以为至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700或至少800。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少1，并且最大配对编辑距离可以为至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、或至少800。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少1，并且最大配对编辑距离可以不超过5、不超过10、不超过20、不超过30、不超过40、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90、不超过100、不超过200、不超过300、不超过400、
不超过500、不超过600、不超过700、或不超过800。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过1，并且最大配对编辑距离可以不超过5、不超过10、不超过20、不超过30、不超过40、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90、不超过100、不超过200、不超过300、不超过400、不超过500、不超过600、不超过700、或不超过800。
[0325]
在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约1％，并且最大配对编辑距离可以是至少约75％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以是至少约1％，并且最大配对编辑距离可以是至少约75％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约1％，并且最大配对编辑距离可以不超过75％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约1％，并且最大配对编辑距离可以不超过约75％。
[0326]
在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约5％，并且最大配对编辑距离可以为至少约75％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约5％，并且最大配对编辑距离可以为至少约75％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约5％，并且最大配对编辑距离可以不超过75％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约5％，并且最大配对编辑距离可以不超过约75％。
[0327]
在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约20％，并且最大配对编辑距离可以为至少约75％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约20％，并且最大配对编辑距离可以为至少约75％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约20％，并且最大配对编辑距离可以不超过75％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约20％，并且最大配对编辑距离可以不超过约75％。
[0328]
在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约1％，并且最大配对编辑距离可以为至少约90％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约1％，并且最大配对编辑距离可以为至少约90％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约1％，并且最大配对编辑距离可以不超过90％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约1％，并且最大配对编辑距离可以不超过约90％。
[0329]
在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约5％，并且最大配对编辑距离可以为至少约90％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约5％，并且最大配对编辑距离可以为至少约90％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约5％，并且最大配对编辑距离可以不超过90％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约5％，并且最大配对编辑距离可以不超过约90％。
[0330]
在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过约20％，并且最大配对编辑距离可以为至少约90％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约20％，并且最大配对编辑距离可以为至少约90％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少约20％，并且最大配对编辑距离可以不超过90％。在一些情况下，该组中两种或更多种抗原之间的最
小配对编辑距离可以不超过约20％，并且最大配对编辑距离可以不超过约90％。
[0331]
疫苗可以包含一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离可以不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过6％、不超过7％、不超过8％、不超过9％、不超过10％、不超过11％、不超过12％、不超过13％、不超过14％、不超过15％、不超过16％、不超过17％、不超过18％、不超过19％、或不超过10％(含)。疫苗可以包含一组抗原，其中两种抗原之间的最小配对编辑距离可以为至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、或至少10％(含)。疫苗可以包含一组抗原，其中两种抗原之间的最大配对编辑距离可以为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％(含)。疫苗可以包含一组抗原，其中两种抗原之间的最大配对编辑距离可以不超过50％、不超过55％、不超过60％、不超过65％、不超过70％、不超过75％、不超过80％、不超过85％、不超过90％或不超过95％(含)。
[0332]
在一些情况下，一组中的每种抗原在至少100个氨基酸的长度上可以与该组中的至少一种抗原具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。在一些情况下，一组中的每种抗原在至少300个氨基酸的长度上可以与该组中的至少一种抗原具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。在一些情况下，一组中的每种抗原在至少500个氨基酸的长度上可以与该组中的至少一种抗原具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。
[0333]
疫苗可以包含一组中的抗原，该组中的抗原与该组中的其他抗原差异至少1％、至少5％或至少10％序列同一性。在一些情况下，疫苗可以包含一组中的抗原，该组中的抗原与该组中所有其他抗原差异至少1％、至少5％或至少10％序列同一性。
[0334]
疫苗可以包含一组中的抗原，该组中的抗原与该组中的至少一种其他抗原差异不超过75％序列同一性。在一些情况下，疫苗可以包含一组中的抗原，该组中的抗原与该组中的所有其他抗原差异不超过75％序列同一性。
[0335]
疫苗可以包含代表微生物的第五级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第六级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在其他情况下，疫苗可以包含代表微生物的第七级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第八级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第九级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第十级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第十一级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以
包含代表微生物的第十二级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第十三级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第十四级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第十五级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第二十级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第二十五级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第三十级进化枝的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的一组抗原。
[0336]
疫苗可以包含代表微生物的第三级、第四级、第五级、第六级、第七级、第八级、第九级、第十级、第十一级、第十二级、第十三级、第十四级、第十五级或其他合适分级进化枝中的每一个的至少60％的抗原。在一些情况下，疫苗可以包含代表微生物的第三级、第四级、第五级、第六级、第七级、第八级、第九级、第十级、第十一级、第十二级、第十三级、第十四级、第十五级或其他合适分级进化枝中的每一个的至少70％的抗原。在又其他情况下，疫苗可以包含代表微生物的第三级、第四级、第五级、第六级、第七级、第八级、第九级、第十级、第十一级、第十二级、第十三级、第十四级、第十五级或其他合适分级进化枝中的每一个的至少80％的抗原。在又其他情况下，疫苗可以包含代表微生物的第三级、第四级、第五级、第六级、第七级、第八级、第九级、第十级、第十一级、第十二级、第十三级、第十四级、第十五级或其他合适分级进化枝中的每一个的至少90％的抗原。
[0337]
在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个。任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少5个、至少10个、至少15个或至少20个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少5个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少10个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少15个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以为1个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少20个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于5个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少5个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于5个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少10个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于5个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少15个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于5个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少20个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于10个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少10个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于10个，并且任何
两种抗原之间的最大分支数可以为至少15个。在一些疫苗中，任何2种抗原之间的最小分支数可以少于10个，并且任何两种抗原之间的最大分支数可以为至少20个。
[0338]
作为流感疫苗的疫苗可以包含选自表2的抗原，或其片段或同源物。如果疫苗包含抗原的片段或同源物，则该片段或同源物可以具有至少特定大小。在一些情况下，片段或同源物可以是至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个、至少120个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、或至少1000个氨基酸。在一些情况下，片段或同源物可以是至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、至多50个、至多55个、至多60个、至多65个、至多70个、至多75个、至多80个、至多85个、至多90个、至多95个、至多100个、至多110个、或至多120个氨基酸、至多150个氨基酸、至多200个氨基酸、至多300个氨基酸、至多400个氨基酸、至多500个氨基酸、至多600个氨基酸、至多700个氨基酸、至多800个氨基酸、至多900个氨基酸、或至多1000个氨基酸。
[0339]
在一些情况下，疫苗中的抗原可以选自seq id no:1
‑
87。在一些情况下，疫苗中的抗原可以与选自seq id no:1
‑
87的序列具有至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％或至少约95％同一性。
[0340]
在一些情况下，疫苗中的抗原可以选自seq id no:88
‑
127。在一些情况下，疫苗中的抗原可以与选自seq id no:88
‑
127的序列具有至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％或至少约95％同一性。
[0341]
在一些情况下，疫苗中的抗原可以选自seq id no:128
‑
171。在一些情况下，疫苗中的抗原可以与选自seq id no:128
‑
171的序列具有至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％或至少约95％同一性。
[0342]
在一些情况下，疫苗中的抗原可以选自seq id no:172
‑
267。在一些情况下，疫苗中的抗原可以与选自seq id no:172
‑
267的序列具有至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％或至少约95％同一性。
[0343]
表6：可包括在流感疫苗中的血凝素抗原的氨基酸序列
[0344]
[0345]
[0346]
[0347]
[0348]
[0349]
[0350]
[0351]
[0352]
[0353]
[0354]
[0355]
[0356]
[0357]
[0358]
[0359]
[0360][0361][0362]
表7:可包括在流感疫苗中的神经氨酸酶抗原的氨基酸序列
[0363]
[0364]
[0365]
[0366]
[0367]
[0368]
[0369][0370]
表8：sino biologicals的血凝素抗原的氨基酸序列
[0371]
[0372]
[0373]
[0374]
[0375]
[0376]
[0377]
[0378]
[0379]
[0380]
[0381][0382]
表9：可以包括在hiv疫苗中的gp160抗原序列
[0383]
[0384]
[0385]
[0386]
[0387]
[0388]
[0389]
[0390]
[0391]
[0392]
[0393]
[0394]
[0395]
[0396]
[0397]
[0398]
[0399]
[0400]
[0401]
[0402]
[0403]
[0404]
[0405]
[0406]
[0407]
[0408]
[0409]
[0410]
[0411]
[0412]
[0413]
[0414]
[0415]
[0416]
[0417]
[0418]
[0419]
[0420]
[0421]
[0422][0423]
除了所附权利要求，本文中阐述的公开内容还由以下条款定义：
[0424]
1.一种疫苗，所述疫苗包含代表微生物的第五级进化枝的至少60％的一组抗原。
[0425]
2.一种疫苗，所述疫苗包含微生物的一组抗原，其中所述抗原中的两种之间的最小配对编辑距离为所述抗原的平均大小的至少10％，并且所述抗原中的两种之间的最大配对编辑距离不超过所述抗原的平均大小的98％。
[0426]
3.一种疫苗，所述疫苗包含代表微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原。
[0427]
4.条款1或条款3的疫苗，其中在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的其他成员具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多40％。
[0428]
5.条款1或条款3的疫苗，其中在以下条件下抗原代表进化枝：如果编辑距离为所代表的进化枝的另一株系大小的至多5％。
[0429]
6.条款1或条款3的疫苗，其中在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、96％、97％、98％或99％具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多20％。
[0430]
7.条款1或条款3的疫苗，其中在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的至少95％、96％、97％、98％或99％具有的差异为所代表的进化枝的抗原平均大小的至多10％。
[0431]
8.条款1或条款3的疫苗，其中在以下条件下所述抗原代表进化枝：如果所述编辑距离为所代表的进化枝的所有株系的95％、96％、97％、98％或99％的大小的至多5％。
[0432]
9.条款1或条款3的疫苗，其中在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的编辑距离为至多25。
[0433]
10.条款1或条款3的疫苗，其中在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列与所代表的进化枝的所有株系的编辑距离为至多100。
[0434]
11.条款1或条款3的疫苗，其中在以下条件下抗原代表进化枝：如果所述抗原的序列存在于所述进化枝中。
[0435]
12.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含一组抗原，其中所述抗原衍生自微生物的变体文库，其中：
[0436]
a.所述组中具有最大编辑距离的两种抗原的编辑距离为s；
[0437]
b.所述文库中具有最大编辑距离的两种抗原的编辑距离为l；和
[0438]
c.s为l的至少60％。
[0439]
13.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种流感病毒血凝素抗原多肽，其各自由与其他流感病毒血凝素抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，
[0440]
其中每种多肽包含在所述4种流感病毒血凝素抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
[0441]
14.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种流感病毒神经氨酸酶抗原多肽，其各自由与其他流感病毒神经氨酸酶抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，
[0442]
其中每种多肽包含在所述4种流感病毒神经氨酸酶抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
[0443]
15.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种hiv gp160抗原多肽，其各自由与其他hiv gp160抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，其中每种多肽包含在所述4种hiv gp160抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
[0444]
16.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种hiv gp120抗原多肽，其各自由与其他hiv gp120抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，其中每种多肽包含在所述4种hiv gp120抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
[0445]
17.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少4种hiv gp41抗原多肽，其各自由与其他hiv gp41抗原多肽具有至少20％同一性，但不超过95％同一性的序列表示，其中每种多肽包含在所述4种hiv gp41抗原多肽之间具有至少90％同一性的抗原。
[0446]
18.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含激活受试者对表1中鉴定的至少6种株系产生免疫应答的一组抗原。
[0447]
19.条款13或条款18的疫苗组合物，其中在血凝素抑制测定中使用头部特异性抗体可检测免疫应答。
[0448]
20.条款19的疫苗组合物，其中当使用所述血凝素抑制测定进行检验时，使用所述抗原产生的免疫应答是使用h1n1+h3n2+hab产生的免疫应答的至少2倍。
[0449]
21.条款14的疫苗组合物，其中当使用所述血凝素抑制测定进行检验时，使用所述抗原产生的免疫应答是使用h1n1+h3n2+hab产生的免疫应答的至少10倍。
[0450]
22.条款19的疫苗组合物，其中当使用所述血凝素抑制测定进行检验时，使用所述抗原产生的免疫应答是使用h1n1+h3n2+hab产生的免疫应答的至少100倍。
[0451]
23.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，其中所述微生物是细菌。
[0452]
24.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，其中所述微生物是病毒。
[0453]
25.条款24的疫苗组合物，其中所述病毒是流感。
[0454]
26.条款25的疫苗组合物，其中所述流感是甲型。
[0455]
27.条款25的疫苗组合物，其中流感是乙型。
[0456]
28.条款26的疫苗，其中所述甲型流感是h1n1、h1n2、h3n1、h3n2或h2n3。
[0457]
29.条款28的疫苗，其中所述甲型流感是h1n1。
[0458]
30.条款28的疫苗，其中所述甲型流感是h3n2。
[0459]
31.条款24的疫苗组合物，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(hiv)。
[0460]
32.条款31的疫苗组合物，其中所述hiv是hiv
‑
1。
[0461]
33.条款32的疫苗组合物，其中所述hiv
‑
1属于亚进化枝a、亚进化枝b或亚进化枝c。
[0462]
34.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，其中所述抗原是在三级空间中邻近的表面暴露残基的广谱中和性抗原。
[0463]
35.条款34的疫苗组合物，其中所述广谱中和性抗原在血凝素的茎中。
[0464]
36.条款34的疫苗组合物，其中所述广谱中和性抗原在血凝素的头部中。
[0465]
37.条款34的疫苗组合物，其中所述广谱中和性抗原在神经氨酸酶中。
[0466]
38.条款34的疫苗组合物，其中所述广谱中和性抗原在gp160中。
[0467]
39.条款34的疫苗组合物，其中所述广谱中和性抗原在gp120中。
[0468]
40.条款34的疫苗组合物，其中所述广谱中和性抗原在gp41中。
[0469]
41.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，其中所述抗原是血凝素的广谱保守性片段。
[0470]
42.条款41的疫苗，其中所述抗原是血凝素头部的广谱保守性片段。
[0471]
43.条款41的疫苗，其中所述抗原是血凝素茎的广谱保守性片段。
[0472]
44.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，其中所述抗原是神经氨酸酶的广谱保守性片段。
[0473]
45.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，其中所述抗原是gp160的广谱保守性片段。
[0474]
46.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含选自seq id no:1
‑
87的至少一种抗原。
[0475]
47.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:1
‑
87中的任一种具有至少60％同一性的至少一种抗原。
[0476]
48.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:1
‑
87中的任一种具有至少70％同一性的至少一种抗原。
[0477]
49.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:1
‑
87中的任一种具有至少80％同一性的至少一种抗原。
[0478]
50.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:1
‑
87中的任一种具有至少90％同一性的至少一种抗原。
[0479]
51.条款1、条款2、条款3、条款12的疫苗，所述疫苗包含选自seq id no:88
‑
127的至少一种抗原。
[0480]
52.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:88
‑
127中的任一种具有至少60％同一性的至少一种抗原。
[0481]
53.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:88
‑
127中的任一种具有至少70％同一性的至少一种抗原。
[0482]
54.条款1、条款2、条款3、条款12所述的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:88
‑
127中的任一种具有至少80％同一性的至少一种抗原。
[0483]
55.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:88
‑
127中的任一种具有至少90％同一性的至少一种抗原。
[0484]
56.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含选自seq id no:128
‑
171的至少一种抗原。
[0485]
57.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:128
‑
171中的任一种具有至少60％同一性的至少一种抗原。
[0486]
58.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:128
‑
171中的任一种具有至少70％同一性的至少一种抗原。
[0487]
59.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:128
‑
171中的任一种具有至少80％同一性的至少一种抗原。
[0488]
60.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:128
‑
171中的任一种具有至少90％同一性的至少一种抗原。
[0489]
61.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含选自seq id no:172
‑
267的至少一种抗原。
[0490]
62.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:172
‑
267中的任一种具有至少60％同一性的至少一种抗原。
[0491]
63.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:172
‑
267中的任一种具有至少70％同一性的至少一种抗原。
[0492]
64.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:172
‑
267中的任一种具有至少80％同一性的至少一种抗原。
[0493]
65.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，所述疫苗包含与seq id no:172
‑
267中的任一种具有至少90％同一性的至少一种抗原。
[0494]
66.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗，其中所述一组抗原包含至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000种不同的抗原。
[0495]
67.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗组合物，其中所述一组抗原包含至少30种抗原。
[0496]
68.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗组合物，其中所述一组抗原包含至少50种抗原。
[0497]
69.条款1、条款2、条款3、条款12的疫苗，其中所述抗原与其他抗原中的每一种的平均编辑距离为所述进化枝中抗原的平均大小的至少5％。
[0498]
70.条款1、条款3或条款12的疫苗，其中所述组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离不超过1，并且最大配对编辑距离为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100。
[0499]
71.条款1、条款3或条款4的疫苗，其中所述组中两种或更多种抗原之间的最小配对编辑距离不超过所述抗原的大小的5％，并且最大配对编辑距离为所述抗原的大小的至少75％。
[0500]
72.条款1的疫苗，其中所述进化枝是系统发育树的进化枝，所述系统发育树是邻接聚类树或最大简约树。
[0501]
73.条款1的疫苗，其中第一级进化枝是未全部或部分归入另一更高级进化枝中的进化枝。
[0502]
74.条款1的疫苗，其中在所述微生物的系统发育树中，每个第x级进化枝在系统发育上在x
‑
1个分支节点之下。
[0503]
75.条款1的疫苗，所述疫苗进一步包含代表所述微生物的第三级、第四级、第五级、第六级、第七级、第八级、第九级、第十级、第十一级、第十二级、第十三级、第十四级或第十五级进化枝中每一个的至少60％的抗原。
[0504]
76.条款75的疫苗，其中所代表的进化枝是归入进化枝y
‑
1的进化枝y。
[0505]
77.条款1的疫苗，其中代表性进化枝是基于节点的进化枝。
[0506]
78.条款1的疫苗，其中代表性进化枝是基于茎的进化枝。
[0507]
79.条款1的疫苗，其中代表性进化枝是基于衍征的进化枝。
[0508]
80.条款1的疫苗，其中所述组中的每种抗原之间的平均分支数为至少1、3、5或10个。
[0509]
81.条款1的疫苗，其中所述组中任何两种抗原之间的最小分支数不超过1个，并且所述组中任何两种抗原之间的最大分支数为至少5、10或15个。
[0510]
82.条款3的疫苗，其中每个otu包含彼此至少95％同源的序列。
[0511]
83.条款3的疫苗，其中每个otu包含至少3个差异序列。
[0512]
84.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗组合物，其中所述组中的每种抗原与所述组中的至少一种其他抗原具有至少90％、95％或99％序列同一性。
[0513]
85.条款1、条款2、条款3、条款12的疫苗组合物，其中在至少100个氨基酸的长度范围内，所述组中的每种抗原与所述组中的至少一种其他抗原具有至少90％、95％或99％序列同一性。
[0514]
86.条款1、条款2、条款3或条款12的疫苗组合物，其中所述组中的每种抗原与所述组中的每种其他抗原差异至少5％序列同一性。
[0515]
87.条款1、条款2、条款3、条款12的疫苗组合物，其中所述组中的每种抗原与所述组中的每种其他抗原差异不超过75％序列同一性。
[0516]
88.条款1、条款2、条款3或条款12的微生物疫苗组合物，其中每种抗原是包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、85、100、110或120个氨基酸的肽。
[0517]
89.条款1、条款2或条款3的疫苗组合物，其中所述抗原选自表2、表3、表4、表5，或其片段或同源物。
[0518]
90.条款89的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含来自表2、表3、表4、表5的2种或更多种抗原，或其片段或同源物。
[0519]
91.条款90的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含来自表2、表3、表4、表5的3种或更多种抗原，或其片段或同源物。
[0520]
92.条款91的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含表2、表3、表4、表5中的5种或更多种抗原，或其片段或同源物。
[0521]
93.条款92的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含来自表2、表3、表4、表5的10种或更多种抗原，或其片段或同源物。
[0522]
94.条款89的疫苗组合物，其中所述片段包含至多10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110或120个氨基酸。
[0523]
95.条款89的疫苗组合物，其中所述片段包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110或120个氨基酸。
[0524]
96.条款89的疫苗组合物，其中所述同源物包含与表1的抗原具有至少90％序列同一性的序列。
[0525]
97.条款12的疫苗组合物，其中所述文库包含所述微生物的至少1
×
104、1
×
105、1
×
106种不同变体。
[0526]
98.条款12的疫苗组合物，其中所述文库包含所述微生物的所有已知序列的至少90％。
[0527]
99.一种药物组合物，所述药物组合物包含前述条款中任一项的疫苗组合物和药学上可接受的稀释剂、佐剂、辅料或其任何组合。
[0528]
100.条款99的疫苗组合物，其中其中所述疫苗为气雾剂制剂的形式。
[0529]
101.条款99的疫苗组合物，其中所述疫苗为注射制剂的形式。
[0530]
102.前述条款中任一项的疫苗组合物，其中所述抗原中每种的浓度单独不能提供对受试者中的所述广谱中和性抗原的显著预防性免疫应答；并且共同地，所述抗原具有提供对所述受试者中的所述广谱中和性抗原的免疫应答的组合浓度。
[0531]
103.条款102的疫苗组合物，其中所述受试者是鸟。
[0532]
104.条款102的疫苗组合物，其中所述受试者是哺乳动物。
[0533]
105.条款103的疫苗组合物，其中所述受试者是人。
[0534]
106.条款103的疫苗组合物，其中所述受试者是猪。
[0535]
107.一种病毒样颗粒(vlp)，所述病毒样颗粒包含前述条款中任一项的疫苗组合物。
[0536]
108.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码以下项的核酸分子：
[0537]
(a)代表微生物的第一级进化枝和第二级进化枝中的每一个的至少60％的一组抗原；
[0538]
(b)一组抗原，其中所述抗原中的两种之间的最小配对编辑距离不超过25，并且所述抗原中的两种之间的最大配对编辑距离为至少300；
[0539]
(c)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原；或
[0540]
(d)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原。
[0541]
109.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码以下项的核酸分子：
[0542]
(a)代表微生物的第一级进化枝和第二级进化枝中的每一个的至少60％的一组抗原；
[0543]
(b)一组抗原，其中所述抗原中的两种之间的最小配对编辑距离不超过所述抗原的大小的5％，并且最大配对编辑距离为所述抗原的大小的至少75％；
[0544]
(c)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原；或
[0545]
(d)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％的一组抗原。
[0546]
110.一种在受试者中治疗感染或降低感染可能性的方法，所述方法包括向所述受试者施用前述条款求中任一项的疫苗组合物。
[0547]
111.一种在受试者中治疗流感感染或降低流感感染可能性的方法，所述方法包括向所述受试者施用疫苗组合物，所述疫苗组合物导致免疫激活对季节性流感有效至少3、4、5、6、7、8、9或10年。
[0548]
112.条款110或条款111的方法，其中所述受试者是人。
[0549]
113.条款110或条款111的方法，其中所述受试者是驯养动物。
[0550]
114.一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包括：选择一组抗原，所述一组抗原是(a)代表微生物的第一级进化枝和第二级进化枝中的每一个的至少60％；
[0551]
(b)一组抗原，其中所述抗原中的两种之间的最小配对编辑距离不超过所述抗原的大小的5％，并且最大配对编辑距离为所述抗原的大小的至少75％；
[0552]
(c)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％；或
[0553]
(d)代表所述微生物的所有操作分类单元(otu)的至少60％。
[0554]
115.条款114的方法，所述方法进一步包括：
[0555]
从所述微生物的株系文库中获得多种抗原序列；和
[0556]
比对所述多种抗原序列以创建所述抗原的系统发育树。
[0557]
如本文所用，术语“约”通常是指比特定用法上下文中规定的数值大或小(
±
)2％、5％、10％或15％。例如，“约10”将包括8.5至11.5的范围。如本文所用，术语“约”和“近似地”在用于限定数值或数值范围时表示高于或低于保持在所述值或范围的预期含义内的值或范围至多约0.2％、约0.5％、约1％、约2％、约5％、约7.5％或约10％(或约1％和10％之间的任何整数)的偏差。
[0558]
如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一种(a或an)”和“该(the)”包括复数引用内容，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“一种方法”的引用包括本文描述的类型和/或本领域技术人员在阅读本公开内容后将变得显而易见的一种或多种方法和/或步骤。虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅作为示例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到多种变化、改变和替换。应当理解，在实践本发明时可以采用对本文描述的本发明的实施方案的各种替代。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖在这些权利要求及其同等内容范围内的方法和结构。