作为有效的癌症疗法的合胞溶瘤性单纯疱疹突变体1.相关申请的交叉引用本技术根据35u.s.c.ꢀ§119(e)要求分别于2019年3月14日和2019年11月8日提交的美国临时申请第62/818,577号和第62/932,725号的优先权，其每个的内容通过引用整体并入本技术。2.政府支持声明本发明是在国家卫生研究所和国家癌症研究所（nih/nci）授予的ca223104号政府资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。3.序列表本技术包含序列表，该序列表已以ascii格式以电子方式提交，其内容通过引用整体并入本技术。该ascii副本创建于2020年3月13日，命名为106887‑7660_st25.txt，大小为245014字节。
背景技术：
：：4.溶瘤性单纯疱疹病毒（ohsv）（如最近fda批准用于治疗黑色素瘤的imlygictm）的抗肿瘤功效非常有前景。这些载体有两种主要作用机制：（1）裂解期，由直接感染和细胞裂解决定；和（2）免疫期，由抗肿瘤免疫的刺激驱动。然而，并非所有的癌症都有相似的反应，因为在某些癌症中的病毒传播本质上是缓慢的。在培养过程中，细胞对病毒的耐受程度不同。在动物中，肿瘤基质和免疫细胞成分的变化导致病毒传播和免疫反应能力的变化。因此，仍需要提高裂解期的效力以达到最佳治疗效果的策略。本发明满足了这些需求并提供了相关的优点。技术实现要素：5.本发明提供了一种非天然的单纯疱疹病毒（“hsv”），其中该病毒包含以下中的一个或多个中的突变，或基本上由其组成，或由其组成：（a）糖蛋白e（“ge”）编码基因，（b）受感染的细胞蛋白0（“icp0”）编码基因，（c）dna包装末端酶亚基1编码基因，（d）icp8编码基因，或（e）icp34.5编码基因。6.另一方面，本发明提供了一种组合物或药物组合物，其包含本发明的非天然hsv，或基本上由其组成，或由其组成。另一方面，本发明提供了一种感染细胞的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：将细胞与非天然hsv或含有非天然hsv的组合物或药物组合物接触。7.一方面，本发明提供了一种制备本发明的非天然hsv的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：使非天然hsv病毒颗粒中的基因突变或将转基因导入非天然hsv。另一方面，产生非天然hsv载体的方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：（a）将17termahsv载体和rrp450hsv载体引入宿主细胞；（b）使宿主细胞生长至少3代；和（c）分离由宿主细胞产生的hsv颗粒。8.还提供了一种抑制癌细胞或转移癌细胞的生长或转移的方法，包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：如本文所述，将细胞与有效量的非天然hsv载体或含有非天然hsv载体的组合物或药物组合物接触。所述接触是体外或体内的。一方面，所述接触是通过向对象施用非天然hsv或组合物或药物组合物在体内进行的。在体外，通过将非天然hsv与细胞接触来实施所述方法。所述体外方法可用于测试新疗法，或作为个性化分析以确定该疗法是否适合待治疗的癌症。额外的癌症疗法可与可以与本发明所公开方法同时或按顺序进行的治疗相结合。9.待治疗的癌细胞可以是实体瘤或血癌，例如癌或肉瘤，并且其非限制性示例包括胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经母细胞瘤、神经癌、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌或黑色素瘤。所述细胞属于任何物种，例如哺乳动物和人类，并且当在体外进行时，它可以来自培养的细胞系或原代细胞，例如来自组织活检。所述细胞可以是成体或幼年细胞或癌症干细胞（即，具有与正常干细胞相关的特征的癌细胞，特别是产生在特定癌症样本中发现的所有细胞类型的能力）或不具有与正常干细胞相关的特征的癌细胞。在一个实施例中，细胞表达n‑myc原癌基因蛋白（mycn），和/或以高于非癌细胞的水平表达mycn。10.另一方面，本发明还提供了一种用于在有需要的对象中治疗癌症或转移性癌症，或抑制癌细胞的生长或转移的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：向对象施用有效量的本发明的非天然hsv、组合物或药物组合物。待治疗的对象可以是任何物种，例如哺乳动物和人类，例如犬、马、牛、猫、猿猴、大鼠或小鼠。给药可作为一线疗法、二线疗法、三线疗法、四线疗法或五线疗法。额外的癌症疗法可与可以与本发明所公开方法同时或按顺序进行的治疗相结合。待治疗的癌细胞可以是实体瘤或血癌，例如癌或肉瘤，并且其非限制性示例包括胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经母细胞瘤、神经癌、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌或黑色素瘤。11.本发明所述方法可与适当的诊断相结合，以监测疾病的缓解或进展。本领域已知用于此类监测的几种方法。12.一方面，本发明提供了一种诱导细胞裂解的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：将细胞与有效量的本发明的非天然hsv、组合物或药物组合物接触。所述接触是体外或体内的。一方面，所述接触是通过向对象施用非天然hsv或组合物或药物组合物在体内进行的。在体外，通过将非天然hsv与细胞接触来实施所述方法。所述体外方法可用于测试新疗法，或作为个性化分析以确定该疗法是否适合待治疗的对象。额外的细胞溶解疗法可与可以与本发明所公开方法同时或按顺序进行的治疗相结合。13.待治疗的癌细胞可以是实体瘤或血癌，例如癌或肉瘤，并且其非限制性示例包括胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经母细胞瘤、神经癌、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌或黑色素瘤。所述细胞属于任何物种，例如哺乳动物和人类，并且当在体外进行时，它可以来自培养的细胞系或原代细胞，例如来自组织活检。所述细胞可以是成体或幼年细胞，或癌症干细胞，或不具有与正常干细胞相关的特征的癌细胞。该疗法可与适当的分析相结合，以测验该疗法的有效性，例如癌症缓解或进展。14.另一方面，本发明还提供一种试剂盒，其包含本发明的非天然hsv、组合物和/或药物组合物，或基本上由其组成，或由其组成。15.附图说明。16.图1a‑1b显示了生成mut‑3和mut‑3δ34.5（图1a）和mut‑3snp（图1b）的示意图。hsvmut‑3是从在非允许（non‑permissive）系（“定向进化”）中混合17terma和rrp450的连续传代中分离出来的；并且通过基因编辑（标记为“crispr/cas9”步骤）构建了减毒突变体mut‑3δ34.5（图1a）。图1b显示了mut‑3与其亲本病毒的序列比对。与mut‑3中任一亲本不同的非同义突变用反斜杠遮盖，包括ul15、ul29、us8、rl1和rl2。与17terma相同的基因组序列在底部小图中显示为空白框；与rrp450相同的那些标有正斜杠。17.图2a‑2c显示了mut‑3、mut‑3δ34.5、rrp450和17terma的菌斑大小和受体使用。申请人同时对四种病毒进行了菌斑分析，并在3天后通过keyencehs多功能荧光显微镜bz‑ii分析仪扫描和分析菌斑图像。（图2a）四种病毒的原始（顶部）图像和遮罩（底部，编号菌斑）图像。（图2b）计算了四种病毒的平均菌斑大小（左）和菌斑数量（右）。mut‑3和mut‑3δ34.5的菌斑大小明显大于亲本病毒rrp450和17terma。（图2c）cho细胞集的体外细胞毒性/mts检测。申请人使用四种病毒以不同感染复数（moi）感染cho‑k1（如标记）、cho‑nectin‑1（如标记）、cho‑nectin‑2（如标记）和cho‑hvem（如标记）。相对于未经处理的对照，申请人在病毒感染后（pvi）3天通过比色法细胞增殖/mts测定测量了细胞存活率。只有cho‑nectin‑1和cho‑hvem而不是cho‑k1或cho‑nectin‑2（主要用于hsv‑2进入）对四种病毒的处理敏感，这表明mut‑3和mut‑3δ34.5没有绕过受体屏障，仍然可以依赖典型的hsv进入受体以感染细胞。18.图3a‑3c：mut‑3δ34.5在杀死人和小鼠神经母细胞瘤细胞方面比17terma（γ134.5‑null）更有效，这不是由于体外感染性病毒颗粒产量增加所致。（图3a）神经母细胞瘤细胞系的体外细胞毒性/mts检测。申请人使用mut‑3（如标记）、mut‑3δ34.5（如标记）或17terma（如标记）以不同的moi感染人（sk‑n‑as）和小鼠（975a2）神经母细胞瘤细胞。相对于未经处理的对照组，申请人在病毒感染后（pvi）4天通过mts测定测量了细胞存活率。n=6，误差条表示sem。****p<0.0001，双因素方差分析。（图3b）体外病毒复制试验。申请人以moi=0.1（上部小图，人系sk‑n‑as）或moi=0.5（下部小图，鼠系975a2）用17terma（如标记）或mut‑3δ34.5（如标记）感染神经母细胞瘤细胞系，并在病毒感染后（pvi）2小时用pbs洗涤细胞。申请人在病毒感染后（pvi）2、24、48和72小时获取细胞裂解液，并通过菌斑分析测定病毒产量。n=3。误差条表示sd。*p<0.05，**p<0.001，****p<0.0001，双因素方差分析。（图3c）比较mut‑3δ34.5相比于17terma感染的神经母细胞瘤培养物中相对游离释放的病毒粒子。申请人进行了与（图3b）中所述类似的分析，通过收集上清液和颗粒，在一段时间内对两个分离的部分进行菌斑分析，而不是如图3b中作为一个整体进行分析。申请人计算了相对游离的病毒粒子作为整个培养物（上清液+颗粒）与上清液中感染性颗粒的比例。mut‑3δ34.5在48小时时显示出比17terma明显更多的相对释放病毒粒子。n=3。误差条表示sd。*p<0.05。19.图4a‑4h:神经母细胞瘤细胞中的mut‑3δ34.5和17terma摄取的tem分析。以50的moi用mut‑3δ34.5和17terma在37℃下感染神经母细胞瘤细胞sk‑n‑as和975a220分钟。（图4a、4b、4e和4f）插图显示mut‑3δ34.5病毒粒子主要存在于内吞囊泡中（除图4b中右侧箭头外的箭头），很少发现与质膜融合（图4b中右侧箭头）。（图4c、4d、4g和4h）插图显示17terma病毒粒子主要存在于内吞囊泡中（除图4g中底部箭头外的箭头），很少与质膜融合（图4g中底部箭头）。tem分析通过hitachih‑7650tem完成。n：细胞核。比例尺：500nm。20.图5a‑5c：在神经母细胞瘤细胞中减毒17δ34.5病毒粒子显示出与17terma相当的效力。申请人通过crispr‑cas9基因编辑技术生成17δ34.5，以用egfp表达盒替换野生型菌株17+中的g134.5基因。（图5a）vero细胞上17δ34.5克隆的菌斑图像。经过3轮菌斑纯化后，b4和g1克隆均产生100%gfp阳性（左侧小图）非合胞体（右侧小图，相衬）菌斑。在病毒感染后（pvi）两天，通过evos®fl成像系统拍摄图像。比例尺：400μm。（图5b）神经母细胞瘤细胞系的体外细胞毒性/mts检测。申请人使用野生型菌株17+（如标记）、17terma（如标记）、17d34.5克隆b4（如标记）或17d34.5克隆g1（如标记）以不同的moi感染神经母细胞瘤细胞系sk‑n‑as和975a2。相对于未经处理的对照组，申请人通过mts检测测量了病毒感染后（pvi）3天的细胞存活率。两个17d34.5克隆的效力显著低于其野生型对应物菌株17+，但与17terma相当。egfp表达盒和egfp的dna序列如图5c所示（seqidno:11）。21.图6a‑6c:与17δ34.5相比，mut‑3δ34.5显示出更快的病毒基因转移和细胞杀伤。申请人以不同的moi用模拟ctl、mut‑3δ34.5或17δ34.5处理（图6a）vero（图6b）sk‑n‑as（图6c）975a2细胞，并使用incucytezoom活细胞成像来随时间监测gfp阳性区域（顶部小图）和细胞融合（底部小图）。n=每个条件下6个孔，并且n=每个时间点每孔测量2次。病毒感染后（pvi）。mann‑whitneyu检验用于比较（图6a）的病毒之间达到最大gfp区域的时间。误差条表示sd。22.图7:mut‑3δ34.5比17terma更有效地控制人神经母细胞瘤体内生长。向患有sub‑qsk‑n‑as肿瘤的无胸腺裸鼠瘤内注射磷酸盐缓冲盐溶液（pbs）对照（如标记，n=8）、三剂1e7pfu的17terma（如标记，n=8）或mut‑3δ34.5（如标记，n=9）。绘制kaplan–meier生存曲线。使用对数秩检验对17terma和mut‑3δ34.5之间的统计显著性进行评分。*p<0.05。23.图8a‑8c:mut‑3δicp6（mut‑3的减毒版本）与溶瘤性疱疹病毒rrp450相比，在人神经母细胞瘤细胞系chp‑134中诱导更高的细胞毒性。（图8a）通过crispr‑cas9基因编辑策略构建的mut‑3δicp6图谱，其中编码icp‑6的ul39基因被cmv驱动的gfp报告基因盒替换。mts细胞活性检测比较了人神经母细胞瘤细胞系中mut‑3、rrp450和mut3‑δicp6/d7‑1的细胞毒性信息。将细胞以4000个细胞/孔接种在96孔培养皿中，在37℃下培养过夜，然后以每个细胞0.001、0.01、0.1和1个感染性病毒颗粒的感染复数（moi）感染每种列出的病毒。按照制造商的说明，在感染后第3天或第4天，使用celltiter96aquesous非放射性细胞增殖实验/mts（promega,madison,wi）进行检测。每个样本一式四份运行，结果显示为相对于未经感染的对照的细胞存活百分比。误差条表示标准偏差。使用t检验评估统计显著性。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。图8bsk‑n‑as和图8cchp‑134以图片方式显示了结果。24.图9a‑9b:与rrp450相比，mut‑3δicp6在小鼠神经母细胞瘤细胞系neuro‑2a和975a2中诱导更高的细胞毒性。图9a‑9b显示了mts细胞活性检测的结果，比较了小鼠神经母细胞瘤细胞系中mut‑3、rrp450和mut3‑δicp6/d7‑1的细胞毒性信息。将细胞以4000个细胞/孔接种在96孔培养皿中，在37℃下培养过夜，然后以每个细胞0.001、0.01、0.1和1个感染性病毒颗粒的感染复数（moi）感染每种列出的病毒。按照制造商的说明，在感染后第3天或第4天，使用celltiter96aquesous非放射性细胞增殖实验/mts（promega,madison,wi）进行检测。每个样本一式四份运行，结果显示为相对于未经感染的对照组的细胞存活百分比。使用t检验评估统计显著性。**p≤0.01，***p≤0.001。图9a：neuro‑2a和图9b：975a2。25.图10a‑10b:在48和72小时感染时段内，mut‑3δicp6在小鼠神经母细胞瘤细胞系975a2中产生的病毒产量显著高于rrp450。将小鼠975a2（图10a）和人sk‑n‑as（图10b）神经母细胞瘤细胞以每孔2x105个细胞接种于12孔培养皿中，在37℃下培养过夜，并在200ꢀµl无血清培养基中以moi0.01感染sk‑n‑as细胞（图10b）或以moi0.5感染975a2细胞（图10a）2小时，每20分钟轻轻摇晃一次。用pbs洗涤细胞一次，并用1毫升完全培养基覆盖。然后在感染后2、24、48和72小时收集细胞和上清液，冻融三次，并在vero细胞上连续稀释和滴定，以通过标准菌斑分析确定感染性病毒产量。每个样本一式三份运行。误差条表示标准偏差。使用t检验评估统计显著性。*p≤0.05，**p≤0.01。26.图11a‑11b:mut‑3δ34.5和mut‑3δicp6对分化的人角质形成细胞的作用明显低于mut‑3病毒。根据制造商的说明，人角质形成细胞（hfk）在补充有人角质形成细胞生长补充剂的epilife培养基（cascadebiologics）中生长。将未分化的hfk（图11a）以每孔2000个细胞的密度接种到96孔培养板中并培养过夜。然后用mut‑3、mut‑3δ34.5/c8g5或mut‑3δicp6d7‑1以0.0004、0.004、0.04、0.4和4的moi感染培养物。病毒感染3天后，通过mts检测测定细胞存活率。在接种后24小时，通过向培养基中添加10%的fbs和1mmol/l的cacl2产生分化的hfk，并允许它们在感染前再培养48小时。病毒感染4天后通过mts测定确定分化细胞存活率（图11b）。每个样本一式四份运行。误差条表示标准偏差。使用t检验评估统计显著性。*p≤0.05，**p≤0.01。27.图12：静脉注射1e6pfu野生型kos病毒株对幼稚型（naïve）blab/c小鼠是致命的。mut‑3δ34.5和mut‑3δicp6的安全研究的说明。申请人启动了一项病毒生物分布研究，通过尾静脉向幼稚型非荷瘤balb/c小鼠（20只雄性，20只雌性）注射1e8菌斑形成单位（pfu）的每种病毒。然后，申请人在第1、14、28、56和85天处死这些动物（每个时间点n=4），并采集其外周血、睾丸（雄性）、卵巢（雌性）、脾脏、肺、肾脏、心脏、肺和大脑进行分析。在病毒给药后的前两周内，申请人每天观察每只小鼠，然后每周观察两次，直到预定的处死日期。记录每只小鼠感染病毒前的体重，此后每周记录一次。同时，将野生型kos病毒作为阳性（非安全）对照给予[剂量范围：每只小鼠1e5至1e7pfu（n=3）]各组小鼠。申请人还对获得的器官进行了病理分析，比较了从接种突变病毒的小鼠和接种野生型kos病毒的小鼠获得的样本。申请人还利用菌斑分析来检测这些病毒的复制潜力。结果显示了接受单剂量1e5、1e6或1e7pfu野生型kos病毒的小鼠的存活曲线。[0028]图13a–13b：幼稚型balb/c小鼠可以耐受静脉注射高达1e8pfu的mut‑3∆34.5（c8g5）或mut‑3∆icp6（d7‑1）。申请人完成了安全性和生物分布研究，并通过体检发现接受高达1e8pfu的mut‑3∆34.5（c8g5）或mut‑3∆icp6（d7‑1）的小鼠保持健康直至指定的处死日期（最多85天）。在雌性小鼠中，菌斑分析显示，仅在感染后24小时，心脏、肾脏、肝脏、卵巢和脾脏中存在感染性病毒。图13a和图13b分别以图片方式显示了雌性和雄性小鼠的结果。[0029]图14可在接受1e6pfu或更多野生型kos病毒的小鼠的大脑、肾脏和卵巢中检测到复制的hsv。图14是总结了注射1e6或1e7pfu野生型kos病毒的小鼠的组织中菌斑分析结果的表格。在病毒注射后（pvi）5‑6天，在开始出现发病症状（脊柱后凸、嗜睡后肢麻痹等）后，处死小鼠。“+”表示可检测菌斑，“‑”ꢀ表示其不存在。灰色阴影框表示这些数据不可用。[0030]图15显示了在病毒感染后（pvi）24小时接受1e8pfu的c8g5或d7‑1的小鼠的几乎所有获得的组织（除了肺之外）中都可以检测到复制的hsv。该表总结了在病毒感染后24小时注射mut∆34.5或mut3∆icp6的小鼠组织的菌斑分析结果。“+”表示可检测菌斑，“‑”表示其不存在。灰色阴影框表示这些数据不可用。[0031]图16显示了在病毒感染后（pvi）14天接受1e8pfu的c8g5或d7‑1的小鼠的任何获得的组织中均未检测到复制的hsv。该表总结了在病毒感染后14天注射mut∆34.5或mut3∆icp6的小鼠组织的菌斑分析结果。“‑”表示无可检测菌斑。[0032]图17显示了在病毒感染后（pvi）28天接受1e8pfu的c8g5或d7‑1的小鼠的任何获得的组织中均未检测到复制的hsv。该表总结了在病毒感染后28天注射mut∆34.5或mut3∆icp6的小鼠组织的菌斑分析结果。“‑”表示无可检测菌斑。灰色阴影框表示这些数据不可用。[0033]图18是总结了在病毒感染后（pvi）56天接受1e8pfu的c8g5或d7‑1的小鼠的任何获得的组织中均未检测到复制的hsv的表格。该表总结了在病毒感染后56天注射mut∆34.5或mut3∆icp6的小鼠组织的菌斑分析结果。“‑”表示无可检测菌斑。[0034]图19显示了在病毒感染后（pvi）85天接受1e8pfu的c8g5或d7‑1的小鼠的任何获得的组织中均未检测到复制的hsv。该表总结了在病毒感染后85天注射mut∆34.5或mut3∆icp6的小鼠组织的菌斑分析结果。“‑”表示无可检测菌斑。[0035]图20a–20d显示的研究结果显示mut‑3δge的菌斑大小比mut‑3或mut‑3d34.5（c8g5）小得多。图20a：mut‑3∆ge是通过crispr‑cas9基因编辑策略构建的，其中编码糖蛋白ge的us8基因被cmv驱动的gfp报告基因盒替换。图20b：mut‑3∆ge克隆的28d5‑b4和28d5‑h1的非合胞体gfp阳性菌斑表型——用连续稀释的28d5‑b4或28d5‑h1感染vero细胞2小时，并覆盖在培养基中。在病毒感染后（pvi）3天拍摄菌斑的照片。图20c：mut‑3∆ge克隆28d5‑b4和28d5‑h1的qpcr分析显示了us8/ge缺失。用mut‑3∆ge克隆28d5‑b4或28d5‑h1感染幼仓鼠肾（bhk）细胞，并在观察到≥50%的细胞病变效应时收集其裂解物。从病毒感染的bhk细胞裂解物中分离的50‑100ng基因组dna用于qpcr反应。结果显示为相对于us8a对照hsv基因的ge/us8或gfp倍数。图20d：mut‑3∆ge克隆28d5‑b4和28d5‑h1与mut‑3或mut‑3∆34.5/c8g5之间菌斑大小的比较，取自在vero细胞中进行的标准菌斑分析。mut‑3、mut‑3∆34.5、mut‑3∆ge克隆28d5‑b4和克隆28d5‑h1的菌斑照片在病毒感染后（pvi）3天拍摄。[0036]图21a–21d提供的研究结果显示17δge的菌斑大小比17syn+或17δ34.5小得多。图21a：17δge是通过crispr‑cas9基因编辑策略构建的，其中编码糖蛋白ge的us8基因被cmv驱动的gfp报告基因盒替换。图21b：17δge克隆12g5的非合胞体和小gfp阳性菌斑表型——用连续稀释的17δge12g5感染vero细胞2小时，并覆盖在覆盖培养基中。在病毒感染后（pvi）3天拍摄菌斑的照片。图21c：17δge克隆12g5的qpcr分析显示了us8/ge缺失。用17δge克隆12g5感染幼仓鼠肾（bhk）细胞，并在观察到≥50%的细胞病变效应时收集其裂解物。从病毒感染的bhk细胞裂解物中分离的50‑100ng基因组dna用于qpcr反应。结果显示为相对于icp6对照组hsv基因的ge/us8或gfp倍数。图21d：17δge克隆12g517syn+或17δ34.5克隆b4之间菌斑大小的比较，取自在vero细胞中进行的标准菌斑分析。在病毒感染后（pvi）3天拍摄菌斑照片。[0037]详细说明下文将更全面地描述根据本发明的实施例。然而，本发明的各个方面可以以不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文所述的实施例。相反，提供这些实施例是为了使本发明彻底和完整，并且将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。本文描述中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制。[0038]除非另有定义，否则本文中使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。将进一步理解，诸如在常用词典中定义的术语，应当被解释为具有与其在本技术和相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且除非在此明确定义，否则不应当以理想化或过于正式的意义来解释。虽然下文未明确定义，但此类术语应根据其共同含义进行解释。[0039]本文描述中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献全部通过引用整体并入。[0040]除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术，这些技术属于本领域技术。[0041]除非上下文另有说明，否则本文描述的本发明的各种特征可以任何组合使用。此外，本发明还设想在一些实施例中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。为了说明，如果说明书规定复合物包括组分a、b和c，则具体意图是a、b或c中的任何一个或其组合可以单独地或在任何组合中被省略和放弃。[0042]除非另有明确指示，否则所有指定的实施例、特征和术语旨在包括所述实施例、特征或术语及其生物学等效物。[0043]所有数字名称，例如ph、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其变化（+）或（‑）的增量为1.0或0.1，视情况而定，或者变化+/‑15%，或者变化10%，或者变化5%，或者变化2%。应理解的是，尽管并非总是明确说明，但所有数字名称之前都有术语“约”。还应理解的是，尽管并非总是明确说明，但本文所述试剂仅为示例性试剂，且本领域已知此类试剂的等效物。[0044]如本文所用，术语“可比较的”指的是具有与参考水平相同的水平，或与参考水平相比在+/‑50%、或者45%、或者40%、或者35%、或者20%、或者25%、或者20%、或者15%、或者10%、或者5%、或者2%的变化范围内。[0045]在本发明的整个过程中，各种出版物、专利和已公开的专利说明书均通过识别引用或阿拉伯数字引用。由阿拉伯数字标识的出版物的完整引用可在权利要求之前找到。在此通过整体引用将这些出版物、专利和已公开的专利说明书的公开内容并入本发明，以更全面地描述本发明所属领域的状态。[0046]定义除非另有说明，否则本技术的实施将采用本领域技术范围内的有机化学、药理学、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术。例如，见sambrook,fritschandmaniatis,molecularcloning:alaboratorymanual,2ndedition(1989)；currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel,etal.eds.,(1987))；theseriesmethodsinenzymology(academicpress,inc.):pcr2:apracticalapproach(m.j.macpherson,b.d.hamesandg.r.tayloreds.(1995)),harlowandlane,eds.(1988)antibodies,alaboratorymanual,andanimalcellculture(r.i.freshney,ed.(1987))。[0047]如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个/一种”和“所述”也包括复数形式。[0048]如本文所用，术语“包括”旨在表示组合物和方法包括所述元件，但不排除其他元件。如本文所使用的，基本上由……组成（和语法变体）的过渡短语将被解释为包含所述材料或步骤，以及那些不会实质性地影响所述实施例的基本和新颖特征的材料或步骤。在方法实施例中叙述了这些特征。因此，本文中使用的术语“基本上由……组成”不应解释为等同于“包括”。“由……组成”应意味着排除多于其他成分的微量元素以及用于施用本文所公开的组合物的基本方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的方面在本发明的范围内。[0049]如本文所使用的术语“大约”，在提及可测量值（例如量或浓度等）时意指包含规定量的20%、10%、5%、1%、0.5%甚至0.1%的变化。[0050]当用于描述本文所公开的任何成分、范围、剂型等的选择时，术语或“可接受的”、“有效的”或“充分的”意指所述成分、范围、剂型等适用于所公开的目的。[0051]也如本文所使用的，“和/或”是指并包含一个或多个相关列出项目的任何和所有可能组合，以及在备选方案（“或”）中解释时缺少组合。[0052]本文中使用的术语“细胞”可指原核生物或真核生物细胞，任选地从受试者或市售来源获得。[0053]“真核细胞”指除原核生物以外的所有生命界。它们可以通过附膜细胞核轻松区分。动物、植物、真菌和原生生物是真核生物或有机体，它们的细胞通过内膜和细胞骨架组成复杂的结构。最典型的附膜结构是细胞核。除非特别说明，否则术语“宿主”包括真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性示例包括猿猴、牛、猪、小鼠、大鼠、鸟类、爬行动物和人，例如hek293细胞和293t细胞。[0054]“原核细胞”通常没有细胞核或任何其他附膜细胞器并且分为两个域，细菌和古细菌。除了染色体dna外，这些细胞还可以在称为附加体的循环中包含遗传信息。细菌细胞非常小，大致相当于动物线粒体（直径约1‑2μm，长10μm）的大小。原核细胞有三种主要形状：杆状、球形和螺旋形。细菌细胞不是像真核生物那样经历复杂的复制过程，而是通过二分裂进行分裂。示例包括但不限于芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌。[0055]应用于核酸序列的术语“编码”是指被叙述来“编码”多肽的多核苷酸，在其天然状态下或通过本领域技术人员熟知的方法操作时，可被转录和/或翻译以产生该多肽和/或其片段的mrna。反义链是这种核酸的互补序列，可以从中推导出编码序列。[0056]术语“等效物”或“生物等效物”在提及特定分子、生物或细胞材料时可互换使用，并意指在保持所需结构或功能的同时具有最小同源性的材料。等效多肽的非限制性示例包括与其或多肽序列具有至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%同一性的多肽，或由在高度严格的条件下与编码该多肽序列的多核苷酸杂交的多核苷酸或其互补序列编码的多肽。本文描述了高度严格的条件，并通过引用将其并入本文。或者，其等效物是由具有与参考多核苷酸（例如野生型多核苷酸）至少70%、或至少75%、或80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%同一性、或至少97%序列同一性、或至少99%同一性的多核苷酸或其互补序列编码的多肽。一方面，等效多肽或多核苷酸分别具有与参考多肽或多核苷酸相同或基本相似的生物功能，例如，细胞溶解功能、抗肿瘤、抗转移或抗癌功能，通过如本文所述的适当的细胞试验或动物模型确定。[0057]等效多肽的非限制性示例包括与参考多核苷酸具有至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%的同一性的多核苷酸。等效物还包括在高度严格的条件下与参考多核苷酸杂交的多核苷酸或其互补序列。[0058]多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一序列具有一定百分比（例如，80%、85%、90%或95%）的“序列同一性”意味着，当对齐时，该百分比的碱基（或氨基酸）在比较两个序列时是相同的。可使用本领域已知的软件程序，例如currentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.,eds.1987)supplement30,section7.7.18,table7.7.1.中描述的软件程序，确定比对和同源性百分比或序列同一性。在某些实施例中，默认参数用于对齐。使用默认参数，可以使用blast执行非限制性示例性对齐程序。具体而言，示例性程序包括使用以下默认参数的blastn和blastp：遗传代码=标准；过滤器=无；股=两股；截止值=60；期望值=10；矩阵=blosum62；描述=50个序列；排序方式=高分；数据库=非冗余，genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcdstranslations+swissprotein+spupdate+pir。有关这些程序的详细信息，可以访问以下网址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi‑bin/blast。序列同一性和百分比同一性可以通过将它们合并到clustalw中来确定（可在网址：genome.jp/tools/clustalw/上获得，最后一次访问日期为2017年1月13日）。[0059]“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的一个位置来确定，该位置可能是为了比较而对齐的。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源度是序列共享的匹配或同源位置数量的函数。“不相关”或“非同源”序列是与本发明的其中一个序列具有小于40%的同一性，或者小于25%的同一性。[0060]“同源性”或“同一性”或“相似性”也可以指在严格条件下杂交的两个核酸分子。[0061]“杂交”指一个或多个多核苷酸反应形成复合物的反应，该复合物通过核苷酸残基碱基之间的氢键来稳定。氢键可以通过watson‑crick碱基配对、hoogstein结合或任何其他序列特异性方式发生。该复合物包含以下组分，或基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：形成双链结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，例如pcr反应的启动，或核酶对多核苷酸的酶切。[0062]严格杂交条件的示例包括：约25℃至约37℃的培养温度；杂交缓冲液浓度约为6×ssc至约10×ssc；甲酰胺浓度约为0%至25%；和约4×ssc到约8×ssc的洗涤溶液。中等严格杂交条件的示例包括：约40℃至约50℃的培养温度；缓冲液浓度约为9×ssc至2×ssc；甲酰胺浓度约为30%至50%；以及约5×ssc至约2×ssc的洗涤溶液。高度严格杂交是指寡核苷酸与靶序列的杂交不存在错配（或完全互补）。高严格条件的示例包括：约55℃至约68℃的培养温度；缓冲液浓度约为1×ssc至0.1×ssc；甲酰胺浓度约为55%至75%；以及约1×ssc、0.1×ssc或去离子水的洗涤溶液。通常，杂交培养时间为5分钟至24小时，具有1、2或更多洗涤步骤，洗涤培养时间约为1、2或15分钟。ssc为0.15mnacl和15mm柠檬酸钠缓冲液。应当理解的是，可以使用使用其他缓冲系统的ssc等效物。[0063]如本文所用，“表达”是指多核苷酸转录成mrna的过程和/或转录的mrna随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组dna，则表达可包括真核细胞中mrna的剪接。[0064]“基因”是指至少含有一个开放阅读框（orf）的多核苷酸，在转录和翻译后能够编码特定的多肽或蛋白质。“基因产物”或任选地“基因表达产物”是指当基因被转录和翻译时产生的氨基酸（例如，肽或多肽）。[0065]“处于转录控制下”是本领域中熟知的术语，表示多核苷酸序列（通常为dna序列）的转录取决于其与有助于启动或促进转录的元件的可操作连接。“可操作连接”意味着多核苷酸以允许它们在细胞中发挥功能的方式排列。在一方面，本发明提供与下游序列（例如hsv毒力基因或其突变体）可操作连接的启动子。[0066]应用于核酸序列的术语“编码”是指被叙述来“编码”多肽的多核苷酸，在其天然状态下或通过本领域技术人员熟知的方法操作时，可被转录和/或翻译以产生该多肽和/或其片段的mrna。反义链是这种核酸的互补序列，可以从中推导出编码序列。[0067]本文使用的术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子、生物制品或细胞材料。[0068]如本文所用，术语“功能性/有功能的”可用于修饰任何分子、生物制品或细胞材料，以实现特定的具体效果。[0069]如本文所用，术语“核酸序列”和“多核苷酸”互换使用以指任意长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna‑rna杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰的、非天然或衍生核苷酸碱基的聚合物。[0070]术语“野生型”是指当从天然来源分离时具有该基因或基因产物特征的基因或基因产物。在一些实施例中，野生型基因或基因产物，即使对于一种病毒株，也包含略微不同的序列。[0071]术语“突变体”是指与野生型基因或基因产物或来自其他突变体菌株的基因或基因产物相比，在序列和/或功能特性上表现出改变（即，改变的特征）的基因或基因产物。在一个实施例中，其他突变菌株包含17terma或rr450菌株。[0072]术语“突变”是指来自野生型或其他突变菌株的dna序列变异。突变在生物体内产生或不产生功能特性。存在多种类型的突变，包括但不限于插入、缺失、截断、移码、置换或点突变。[0073]术语“点突变”是指具有单核苷酸碱基改变、插入或缺失遗传物质、dna或rna的突变。[0074]“缺失”是指染色体的一部分或dna序列缺失的突变。[0075]“移码”是指dna序列中不能被三整除的多个核苷酸的插入或缺失引起的突变。[0076]“置换”是指基因的一个或几个核苷酸被置换的突变。[0077]“截断”是指通过蛋白质水解或操纵结构基因而消除蛋白质n端或c端部分的突变，或由于无义突变导致结构基因中存在终止密码子而使蛋白质延伸提前终止。[0078]在一些实施例中，突变是非同义突变。术语“非同义突变”指改变蛋白质氨基酸序列的突变，与不改变氨基酸序列的同义突变形成对比。[0079]如本文所用，术语“启动子”是指调节编码序列（例如基因）的表达的任意序列。例如，启动子可以是组成型、诱导型、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是控制序列，它是多核苷酸序列的区域，该区域控制转录的起始和速率。它可以包含调节蛋白质和分子可以结合的遗传元件，如rna聚合酶和其他转录因子。非限制性示例性启动子包括ros肉瘤病毒（rsv）ltr启动子（任选地具有rsv增强子）、巨细胞病毒（cmv）启动子、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β‑肌动蛋白启动子、磷酸甘油酸激酶（pgk）启动子、u6启动子或ef1启动子。在一些实施例中，启动子是鸡β‑肌动蛋白（“cba”）启动子。[0080]下文提供了具有特定靶特异性的其他非限制性示例性启动子，包括但不限于cmv、ef1a、sv40、pgk1（人或小鼠）、p5、ubc、人β‑肌动蛋白、cag、tre、uas、ac5、多角体蛋白、camkiia、gal1、tef1、gds、adh1、camv35s、ubi、h1、u6、α‑1‑抗胰蛋白酶。合成衍生的启动子可用于普遍存在的或组织特异性表达。此外，病毒衍生的启动子，其中一些如上所述，可用于本文公开的方法中，例如cmv、hiv、腺病毒和aav启动子。在一些实施例中，启动子与增强子偶联以提高转录效率。[0081]增强子是一种可增加靶序列表达的调节元件。“启动子/增强子”是包含能够同时提供启动子和增强子功能的序列的多核苷酸。例如，逆转录病毒的长末端重复序列包含启动子和增强子功能。增强子/启动子可以是“内源性”或“外源性”或“异源性”的。“内源性”增强子/启动子是与基因组中给定基因自然连接的增强子/启动子。“外源性”或“异源性”增强子/启动子是通过遗传操作（即分子生物学技术）与基因并置的增强子/启动子，使得该基因的转录由连接的增强子/启动子控制。[0082]如本文所用，术语“肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子”是指允许基因表达的启动子，该基因受启动子控制，特别是在所需肿瘤细胞或组织中。可用于本发明的组织特异性启动子的非限制性示例包括前列腺特异性抗原（psa）启动子、前列腺特异性膜抗原（psma）启动子、酪蛋白启动子、igg启动子、绒毛膜胚胎抗原启动子、弹性蛋白酶启动子、胆色素原脱氨酶启动子、胰岛素启动子、生长激素因子启动子、乙酰胆碱受体启动子、乙醇脱氢酶启动子和α或β珠蛋白启动子。[0083]本发明中使用的肿瘤特异性启动子的非限制性实例包括端粒酶逆转录酶启动子、胶质纤维酸性蛋白启动子、e2f启动子、存活蛋白启动子、cox‑2启动子、egd‑2启动子、elf‑1启动子、缺氧特异性启动子、癌胚抗原启动子和基质溶素3启动子。[0084]术语“冷冻保护剂”是指能够保护一个或多个组织、病毒或其他生物制剂免受损坏或损害的化合物或材料。冷冻保护剂的示例包括但不限于硫酸软骨素、糖胺聚糖二甲基亚砜、细胞渗透性有机溶质、多糖、甘油、dulbecco最低基本培养基（dmem）、谷氨酰胺、d‑葡萄糖、丙酮酸钠、胎牛血清、罂粟碱、dmso、甘油、海藻糖、kh2po4、k2hpo4、kcl、甘露醇、nahco3、抗坏血酸钠、1,2‑丙二醇、甲酰胺、2,3‑丁二醇、丙丁酚、姜黄素及其混合物。[0085]术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并在其最广泛的意义上，指由氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的两个或多个亚基组成的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面，亚基可通过其他键连接，例如酯、醚等。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且不限制蛋白质的或肽的序列可能包含、或基本上由其组成、或由其组成、或基本上由其组成、或由其组成的氨基酸的最大数量。如本文所用，术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和d和l旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。[0086]如本文所用，术语“载体”是指包含完整复制子、或基本上由其组成、或由其组成的非染色体核酸，使得当载体放置在细胞内时可被复制，例如通过转化过程。载体可以是病毒载体或非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒（“hsv”）、杆状病毒、经修饰的杆状病毒、巴氏病毒或其他经修饰的天然病毒。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括：裸dna；与阳离子脂质体复合的dna，单独或与阳离子聚合物结合；阴离子和阳离子脂质体；dna‑蛋白质复合物和颗粒，包括与阳离子聚合物（如异构聚赖氨酸、限定长度寡肽和聚乙烯亚胺）缩合的dna，在某些情况下包含在脂质体中，或基本上由其组成，或由其组成；以及包含病毒和多聚赖氨酸dna、或基本上由其组成、或由其组成的三元复合物的用途。[0087]“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，该病毒或病毒颗粒包含将在体内、离体或体外递送至宿主细胞的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、aav载体、慢病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体等。甲病毒载体，如基于semlikiforest病毒的载体和基于sindbis病毒的载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见，schlesingeranddubensky(1999)curr.opin.biotechnol.5:434‑439andying,etal.(1999)nat.med.5(7):823‑827。[0088]在另一实施例中，hsv毒力蛋白（例如野生型或突变型）的表达由作为诱导型启动子的启动子调节。在具体的相关实施例中，启动子为诱导型四环素启动子。tet‑off和tet‑on基因表达系统使研究人员能够随时访问被描述为tet‑off和tet‑on的受调控的高水平基因表达系统。在tet‑off系统中，当从培养基中去除四环素（tc）或强力霉素（dox；一种tc衍生物）时，基因表达就会开启。相反，在tet‑on系统中，表达是通过添加dox打开的。这两种系统都允许基因表达受到不同浓度的tc或dox的严格调控。tet系统中的最大表达水平非常高，与强组成型哺乳动物启动子（例如cmv）获得的最大表达水平相比，表现良好。与其他诱导型哺乳动物表达系统不同，tet系统中的基因调控具有高度特异性，因此结果解释不会因多效性效应或非特异性诱导变得复杂。在大肠杆菌中，tet阻遏蛋白（tetr）对tn10转座因子上的四环素抗性操纵子的基因进行负调控。在没有tc的情况下，tetr通过结合到tet操作序列（teto）来阻断这些基因的转录。tetr和teto为在哺乳动物实验系统的调节和诱导提供了基础。在tet‑on系统中，调节蛋白基于“反向”tet阻遏物（rtetr），该阻遏物是由tetr中的四种氨基酸变化产生的（hillen&berens,mechanismsunderlyingexpressionoftn10encodedtetracyclineresistance.annurevmicrobiol.1994;48:345‑69;gossenetal.,transcriptionalactivationbytetracyclinesinmammaliancells.science.1995jun23;268(5218):1766‑9）。产生的蛋白质rtta（反向tta也被称为四环素激活蛋白）由ptet‑on调节质粒编码。[0089]在一相关实施例中，载体进一步包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：编码四环素激活蛋白的核酸；以及调节四环素激活蛋白表达的启动子。[0090]其他可用于载体、分离细胞、病毒包装系统和本文所述方法的诱导型系统包括蜕皮激素、雌激素、孕酮、二聚化化学诱导剂和异丙基‑β‑d1‑硫代半乳糖吡喃糖苷（iptg）的调节。[0091]如本文所用，术语“重组表达系统”或“重组载体”指用于表达通过重组形成的用于表达某些遗传物质的一种或多种遗传构建体。[0092]“基因递送载体”被定义为任何能携带多核苷酸插入宿主细胞的分子。基因递送载体的实例是：脂质体、胶束、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；以及细菌或病毒，例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和本领域常用的其他重组载体，其已被描述用于在各种真核和原核宿主中表达，并且可用于基因治疗以及简单蛋白质表达。[0093]本文公开的多核苷酸可使用基因递送载体递送至细胞或组织。如本文所使用的“基因递送”、“基因转移”、“转导”等是指将外源性多核苷酸（有时称为“转基因”）引入宿主细胞的术语，与用于引入的方法无关。此类方法包括多种众所周知的技术，例如载体介导的基因转移（如通过病毒感染/转染或各种其他基于蛋白质或脂质的基因传递复合物）以及促进“裸”多核苷酸递送的技术（例如电穿孔，“基因枪”递送和用于引入多核苷酸的各种其他技术）。所引入的多核苷酸可以稳定地或暂时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常要求引入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点，或整合到宿主细胞的复制子中，例如染色体外复制子（如质粒）或核染色体或线粒体染色体。已知许多载体能够介导基因转移到哺乳动物细胞，如本领域所知和本文所述。[0094]“质粒”是与染色体dna中分离的染色体外dna分子，能够独立于染色体dna进行复制。在许多情况下，它是圆形和双链的。质粒为微生物群体内的水平基因转移提供了一种机制，并且通常在给定的环境状态下提供选择性优势。质粒可能携带在竞争性环境生态位中对天然抗生素产生耐药性的基因，或者产生的蛋白质也可能在类似情况下充当毒素。[0095]基因工程中使用的“质粒”被称为“质粒载体”。许多商业上的质粒可用于此类用途。将要复制的基因插入质粒的副本中，该副本包含使细胞对特定抗生素产生耐药性的基因和多克隆位点（mcs或polylinker），该多克隆位点是一个包含几个常用的限制性位点的短区域，允许在该位置轻松插入dna片段。质粒的另一个主要用途是制造大量蛋白质。在这种情况下，研究人员培育出含有携带感兴趣的基因的质粒的细菌。正如细菌产生蛋白质以赋予其抗生素耐药性一样，它也可以被诱导从插入的基因中产生大量蛋白质。[0096]本文使用的术语“单纯疱疹病毒”或“hsv”是指产生本发明效果的单纯疱疹病毒，包括野生型或突变型单纯疱疹病毒。在一个实施例中，通过突变或修饰野生型hsv的任何基因或通过插入任何外源基因获得突变非天然hsv。血清型hsv包括1型hsv（或hsv‑1）或2型hsv（或hsv‑2），或者基本上由其组成，或者由其组成。hsv‑1是一种包膜双链dna病毒。在一个实施例中，hsv‑1可感染人类细胞。在另一实施例中，可将序列、基因或多个基因并入hsv‑1。合并序列的大小可以约为1个碱基、5个碱基、10个碱基、100个碱基、1kb、10kb、100kb或150kb。hsv‑1可在相对较低的感染复数（moi）下诱导细胞裂解，并且其增殖可被抗病毒药物抑制。在一个实施例中，hsv病毒dna停留在染色体之外，而不并入宿主细胞的基因组。hsv‑1可包含多种菌株（例如kos和mckrae）。参见，wangetal.,(2013)virusres.173(2):436–440。在一个实施例中，hsv‑1是hsv‑1kos菌株。在另一实施例中，hsv‑1是hsv‑1mckrae菌株。[0097]有几种hsv突变体，例如17termahsv和rrp450hsv。术语“17termahsv”是指突变型hsv‑1病毒，包含整个icp34.5基因，但在编码区的100bp之前插入终止密码子，导致蛋白质表达提前终止和30个氨基酸截短的蛋白的表达。17termahsv突变体由于截短的icp34.5蛋白而显示生长缺陷。参见，orvedahletal.,(2007)cellhost&microbe,1:1,23‑25。术语“rrp450”是指在病毒编码的核糖核苷酸还原酶或icp6中缺乏的减毒单纯疱疹1载体。参见，aghimetal.,(1999)cancerres.,59(16):3861‑5。[0098]hsv基因组编码多种毒力蛋白，包括但不限于糖蛋白e（“ge”）、受感染的细胞蛋白0（“icp0”）、受感染的细胞蛋白6（“icp6”）、dna包装末端酶亚基1、受感染的细胞蛋白8（“icp8”）和受感染的细胞蛋白34.5（“icp34.5”）。示例性的hsv1基因组可在ncbi参考序列中找到：nc_001806.2，最后一次访问时间为2020年3月13日。[0099]术语“ge编码基因”是指编码ge蛋白的基因或其dna片段。示例性ge编码基因可在ncbi参考序列：nc_001806.2的hsv‑1基因组序列的位置33‑2555处识别。术语“icp6蛋白”是指由hsv基因组编码的受感染的细胞蛋白6。icp6是核糖核苷酸还原酶（“rr”）的一个亚基，是非分裂细胞中核苷酸代谢和病毒dna合成的关键酶。[0100]“功能失调的”蛋白质是指原蛋白质功能受损或无功能的蛋白质。在一个实施例中，功能失调的蛋白质是由编码序列中的缺失或置换引起。例如，如果icp6基因功能失调，缺失或失活，hsv无法在正常的非分裂细胞中复制。然而，在rr活性增加的活跃分裂细胞中，病毒缺乏的酶活性得到补偿，使病毒能够复制。icp34.5的dna和氨基酸序列在seqidno:1、2和5‑10中提供。ge的dna和氨基酸序列在seqidno:12‑19中提供。icp0的dna和氨基酸序列在seqidno:20‑26中提供。dna包装末端酶亚基1的dna和氨基酸序列在seqidno:35‑42中提供。icp8的dna和氨基酸序列在seqidno:27‑34中提供。icp6的dna和氨基酸序列在seqidno:43‑50中提供。[0101]术语“icp0编码基因”是指编码icp0蛋白质的基因或其dna片段。icp0的示例性dna和氨基酸序列在seqidno:20‑26中提供。术语“dna包装末端酶亚基1编码基因”是指编码dna包装末端酶亚基1蛋白质或肽的基因或其dna片段。dna包装末端酶亚单位1的示例性dna和氨基酸序列在seqidno:35‑42中提供。术语“icp8编码基因”是指编码icp8蛋白的基因或其dna片段。icp8的示例性dna和氨基酸序列在seqidno:27‑34中提供。术语“icp34.5编码基因”指编码icp34.5蛋白质的基因或其dna片段。icp34.5的示例性dna和氨基酸序列在seqidno:1、2和5‑10中提供。术语“糖蛋白e（“ge”）编码基因”是指编码ge蛋白的基因或其dna片段。ge的示例性dna和氨基酸序列在seqidno:12‑19中提供。[0102]术语“基因的缺失或失活”是指通过置换一些碱基、修饰、插入不必要的序列等来缺失全部或部分基因或抑制基因的表达。hsv基因（例如，ge、icp0和icp8）的缺失或失活可由本领域技术人员以已知方法或基于该方法的方法进行。例如，可以采取使用同源重组的方法。例如，可以通过在合适的质粒载体中克隆包含hsv基因的一部分和与hsv基因无关的序列的dna片段，然后将其导入hsv中，从而在hsv基因的某些区域中引起同源重组，从而分离和失活hsv基因。或者，hsv基因的突变或缺失可由病毒传代中的自发突变引起。[0103]在由dna病毒载体（例如单纯疱疹病毒）介导的基因转移方面，载体构建是指包含病毒基因组或其部分、或者基本上由其组成、或者由其组成的多核苷酸和转基因。因此，一方面，非天然hsv进一步包含编码治疗性多核苷酸或蛋白质的转基因。[0104]包含启动子和可操作地连接多核苷酸的克隆位点的载体在本领域是众所周知的。这种载体能够在体外或体内转录rna，并且可以从如agilenttechnologies（santaclara,calif.）和promegabiotech（madison,wis.）等来源购买。为了优化表达和/或体外转录，可能需要移除、添加或改变克隆的5′和/或3′未翻译部分，以消除额外的、潜在的不合适的替代翻译起始密码子或其他可能干扰或减少表达的序列，无论是在转录还是翻译层面。或者，可以将共有核糖体结合位点紧接插入起始密码子的5′以增强表达。[0105]基因递送载体还包括dna/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白dna复合物。还包含靶向抗体或其片段、或基本上由其组成、或由其组成、或基本上由其组成、或由其组成的脂质体可用于本文所公开的方法。除了向细胞或细胞群递送多核苷酸外，可通过非限制性蛋白质转染技术将本文所述蛋白质直接导入细胞或细胞群，或者可以增强本文所公开的蛋白质的表达和/或促进其活性的培养条件是其他非限制性技术。[0106]如本文所用，术语“信号肽”或“信号多肽”意指通常存在于新合成的分泌或膜多肽或蛋白质的n端的氨基酸序列。其作用是将多肽引导至特定的细胞位置，例如，穿过细胞膜、进入细胞膜或进入细胞核。在一些实施例中，在定位之后移除信号肽。信号肽的实例在本领域中是众所周知的。非限制性示例为美国专利号8,853,381、5,958,736和8,795,965中描述的示例。[0107]一方面，hsv被可检测地标记。如本文所用，术语“标记”是指与待检测的组合物直接或间接偶联的直接或间接可检测的化合物或组合物，例如多核苷酸或蛋白质，例如抗体，以生成“被标记的”组合物。该术语还包括与多核苷酸偶联的序列，其在插入序列表达时提供信号，例如绿色荧光蛋白（gfp）等。标记本身是可检测的（例如放射性同位素标记或荧光标记），或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。标记可适用于小规模检测或更适用于高通量筛选。因此，合适的标记包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。可简单地检测标记或对其进行量化。简单检测的响应通常包括仅证实其存在的响应、或基本上由其组成、或由其组成，而量化的响应通常包括具有可量化（例如，数字可报告）值的响应，例如强度、偏振和/或其他特性。在发光或荧光分析中，可以使用直接产生可检测响应的与实际参与结合的测定组分相关的发光团或荧光团，或间接使用与另一（例如，报告子或指示剂）组分相关联的发光体或荧光团产生。[0108]产生信号的发光标记示例包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光响应通常包括发光信号的变化或出现，或基本上由其组成，或由其组成。本领域已知用于发光标记分析组分的合适方法和发光体，例如在haugland,richardp.(1996)handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(6thed.)中所述。发光探针的示例包括但不限于水母发光蛋白和荧光素酶。[0109]合适荧光标签的示例包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、红色素、香豆素、甲基香豆素、芘、苹果绿、芪、路西法黄、cascade蓝tm.和德克萨斯红。其他合适的光学染料如haugland,richardp.(1996)handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(6thed.)中所述。[0110]另一方面，荧光标记功能化以促进共价附着到细胞或组织表面中或组织表面上存在的细胞组分，例如细胞表面标记物。合适的官能团包括但不限于异硫氰酸酯基、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤化物，所有这些都可用于将荧光标记附着到第二分子。荧光标记官能团的选择取决于接头、试剂、标记物或第二标记物的附着位置。[0111]荧光标记的附着可以直接附着到细胞组分或化合物上，或者也可以通过接头附着。用于将荧光标记间接连接到中间体的合适的结合对包括但不限于抗原/抗体，例如罗丹明/抗罗丹明、生物素/亲和素和生物素/链亲和素。[0112]短语“固体载体”指非水表面，例如“培养板”、“基因芯片”或“微阵列”。此类基因芯片或微阵列可通过本领域技术人员已知的许多技术用于诊断和治疗目的。在一种技术中，寡核苷酸连接并排列在基因芯片上，用于通过杂交方法确定dna序列，如美国专利号6,025,136和6,018,041中概述的方法。本发明的多核苷酸可被修饰为探针，进而可用于检测遗传序列。例如，美国专利号5,968,740和5,858,659中描述了此类技术。还可以将探针附着或固定到电极表面，用于核酸序列的电化学检测，如kayemetal.美国专利号952,172和kelleyetal.(1999)nucleicacidsres.27:4830‑4837所述。[0113]“组合物”是指活性多肽、多核苷酸或抗体与另一种惰性（例如，可检测的标签）或活性（例如，基因递送载体）化合物或组合物的组合。[0114]“药物组合物”是指包括活性多肽、多核苷酸或抗体与载体（惰性或活性载体，例如固体载体）的组合，使该组合物适合于离体、体内或体外的诊断或治疗用途。[0115]如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳液，例如油/水或水/油乳液、以及各种类型的润湿剂。所述组合物还可包括稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和辅药的例子，参见martin(1975)remington’spharm.sci.,15thed.(mackpubl.co.,easton)。[0116]诊断或治疗的“对象/受试者”是细胞或动物，如哺乳动物或人类。受试者不限于特定物种，包括受诊断或治疗的非人类动物，以及受感染或动物模型影响的动物，例如，猿猴、鼠类（如大鼠、小鼠、毛丝鼠）、犬科动物（例如狗）、兔类（如兔子）、家畜、运动动物和宠物。人类患者也包括在该术语中。[0117]如本文所用，术语“组织”指活的或已死的生物体的组织，或源自或设计用于模拟活的或已死的生物体的任何组织。组织可能是健康的、患病的和/或具有基因突变的。生物组织可包括任何单个组织（例如，可相互连接的细胞集合）或组成有机体器官或身体部分或区域的组织。该组织可包含均质细胞材料，或基本上由其组成，或由其组成，或可以是复合结构，例如在包括胸部在内的身体区域中发现的复合结构，该复合结构例如可包括肺组织、骨骼组织和/或肌肉组织。示例性组织包括但不限于来源于肝、肺、甲状腺、皮肤、胰腺、血管、膀胱、肾脏、大脑、胆道、十二指肠、腹主动脉、髂静脉、心脏和肠道的组织，包括其任意组合。[0118]如本文所用，“治疗”受试者的疾病是指（1）防止易感或尚未显示疾病症状的受试者出现症状或疾病；（2）抑制疾病或阻止其发展；或（3）改善或导致疾病或疾病症状消退。如本领域所理解，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果的方法，包括临床结果。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括一种或多种但不限于：减轻或改善一种或多种症状；病症（包括疾病）程度的减轻；稳定（即，不恶化）病症（包括疾病）的状态；病症（包括疾病）的延迟或减缓；病症（包括疾病）的进展、改善或缓解；状态和缓解（无论是部分还是全部），无论是否可检测。[0119]如本文所用，术语“有效量”是指足以实现预期效果所需的量。在治疗或预防应用的情况下，有效量将取决于所讨论疾病的类型和严重程度以及个体受试者的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。在基因治疗的背景下，在一些实施例中，有效量是足以导致受试者中缺乏的基因的部分或全部功能恢复的量。一方面，有效量是提供每个细胞0.001到1个感染性病毒颗粒的感染复数（moi）的量，其范围介于两者之间。非限制性示例包括感染复数（moi）为每个细胞至少0.001、或至少0.01、或至少0.1、或至少1、或0.01至1、或0.1至1、或约0.01至0.1、或小于1、或小于0.1、或小于0.01个感染性病毒颗粒。在其他实施例中，hsv病毒颗粒的有效量为足以导致受试者细胞裂解的量。在一些实施例中，有效量是增加有需要的受试者的半乳糖代谢所需的量。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的量。[0120]在一些实施例中，有效量将取决于所述应用的大小和性质。还取决于目标对象的性质和敏感性以及使用的方法。本领域技术人员将能够基于这些和其他考虑因素确定有效量。根据实施例，有效量可包括一次或多次施用组合物，或基本上由其组成，或由其组成，或基本上由其组成，或由其组成。[0121]如本文所用，术语“给药”或“施用”是指向受试者（如动物或人类）递送物质。在整个治疗过程中，可以一次施用、连续或间歇施用，例如瘤内或静脉内。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的以及被治疗对象的年龄、健康或性别而变化。单次或多次施用可由治疗医生选择剂量水平和模式，对于宠物和动物，可由治疗兽医选择剂量水平和模式。适当剂量的制剂和给药方法是本领域已知的。可以确定给药途径，并且确定最有效给药途径的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的、被治疗对象的健康状况或疾病阶段以及靶细胞或组织而变化。给药途径的非限制性示例包括直接的和全身的，例如静脉内、动脉内、肌肉内、心内、鞘内、脑室下、硬膜外、脑内、瘤内、颅内、脑室内、视网膜下、玻璃体内、关节内、眼内、腹腔内、宫内、皮内、皮下、经皮、经粘膜和吸入。[0122]溶瘤性单纯疱疹病毒（ohsv）ohsv对肿瘤的疗效来源于直接细胞杀伤（裂解期）和增强抗癌免疫（免疫期）。这些病毒已经以各种方式构建，以选择性地靶向癌细胞。为了实现癌症的选择性，最常见的突变是神经毒力基因γ134.5/rl1的缺失。由γ134.5/rl1编码的icp34.5的表达对于hsv‑1对抗宿主细胞抗病毒蛋白激酶rna激活（pkr）途径至关重要，该途径通常磷酸化e‑if2α以响应病毒感染并停止蛋白质翻译。icp34.5将细胞蛋白磷酸酶‑1（pp1）重定向至去磷酸化e‑if2α，允许高效病毒复制。许多癌细胞在pkr反应中存在缺陷，因此支持hsv载体的复制，包括γ134.5‑null突变体。一些载体是通过突变关键代谢病毒基因例如核糖核苷酸还原酶（rr，其大亚基由icp6/ul39基因编码）构建的。由于许多恶性细胞增加了rr的表达和活性，icp6‑null突变体由于存在大量的核糖核苷酸池而在高度增殖的癌细胞中选择性地复制。[0123]hsv进入、细胞间传播和合胞体形成hsv‑1的进入涉及病毒糖蛋白与细胞表面分子相互作用的一系列步骤。首先，糖蛋白b和c（gb和gc）附着在细胞硫酸乙酰肝素蛋白多糖上，随后gd结合到病毒进入受体（即，nectin‑1、疱疹病毒进入介体（hvem）或3‑o‑硫酸乙酰肝素硫酸酯（3‑os‑hs））。该过程进一步允许gh/gl与gb相互作用并触发病毒包膜与靶细胞膜的融合，导致病毒粒子衣壳和间层蛋白释放到细胞中。一些报告表明，膜融合对于病毒随后在相邻细胞之间的横向传播也至关重要。当病毒通过细胞接触区域从受感染细胞传播到相邻的未受感染细胞时，就会发生病毒细胞间传播，甚至可以在存在病毒中和抗体的情况下发生。ge/gi的存在增强了细胞间传播，而ge亚型突变体减少了细胞间融合和菌斑大小。合胞体是多个相邻细胞融合成多核巨细胞的结果。在至少四个hsv病毒基因（即，gb、gk、ul20和ul24）中发现了触发合胞体的突变。[0124]本发明提供了一种结合“定向进化”和crispr/cas9技术开发临床相关病毒载体的策略。这种有效的组合代表了对现有技术方法的实质性偏离。在不受理论约束的情况下，可以预期意想不到的机制会导致杀死肿瘤的病毒效力增加。预计这将揭示导致高融合表型和效力增强的以前未知的突变，以及发展下一代ohsv的垫脚石。由此产生的ohsv具有增强的溶解期、更长的可持续性和最大化的治疗效果，这符合国家癌症研究所临床和转化探索/发展研究的目的。[0125]尽管重点是病毒治疗的“裂解期”，但较长时间的持续病毒反应会促进体内的炎症反应，从而有利于后续病毒治疗的“免疫期”以达到最佳抗肿瘤效果。儿童癌症模型的疗效研究可以解决使用非天然hsv治疗儿童癌症的问题。由此产生的改良病毒预计也会在多种成人癌症中发挥作用。[0126]执行本发明的模式尽管hsv可以靶向或感染大范围的细胞以诱导裂解，但病毒感染本身已引起细胞毒性和其他疾病，如脑炎、食管炎和肺炎。大量的hsv基因影响致病性。例如，γ34.5（rl1）可引起神经病理性。icp6（ul39）、核糖核苷酸还原酶、胸苷激酶（ul23）、尿嘧啶dna糖苷酶（ul2）、dutpase（ul50）和dna聚合酶（ul30）涉及hsv的核苷酸代谢和毒力。因此，有制备减毒但具有复制能力的hsv颗粒的需要，以实现其抑制肿瘤的功能，同时将其副作用降至最低。[0127]本文提供了一种新的病毒，命名为mut‑3，其表现出巨大的合胞菌斑表型。申请人从在非允许系（“定向进化”）中混合17terma和rrp450的连续传代中分离出mut‑3，并通过基因编辑（“crispr/cas9”步骤）构建减毒突变体mut‑3δ34.5（图1a）。全基因组序列分析显示，mut‑3获得了γ134.5/rl1和ul39（其编码icp6）的完整拷贝，使其基因型类似于野生型（wt）病毒。在不受理论约束的情况下，申请人发现mut‑3的裂解活性甚至比许多wt病毒更高，这表明其效力的增强可能与其他基因组改变（除了其完整的病毒基因组）有关。在mut‑3中发现了五种不同于任一亲本病毒的非同义突变，包括编码ge的基因中151位的丙氨酸到苏氨酸突变（a151t）。提供了mut‑3病毒的减毒版本，通过crispr/cas9基因编辑用绿色荧光蛋白（gfp）替换γ134.5/rl1，命名为mut‑3δ34.5（图1a，底部，标记为“crispr/cas9”步骤）。参见，图1b显示了mut‑3与其亲本病毒的序列比较的结果总结。mut‑3中与任一亲本不同的非同义突变用反斜杠遮盖，包括ul15、ul29、us8、rl1和rl2。与17terma相同的基因组序列显示为空白框；与rrp450相同的部分用正斜杠遮盖。[0128]因此，本发明提供了一种非天然的单纯疱疹病毒（“hsv”），其中该病毒包含来自以下群组中的一个或多个的毒力基因中的突变，或基本上由其组成，或由其组成：（a）糖蛋白e（“ge”）编码基因、（b）受感染的细胞蛋白0（“icp0”）编码基因、（c）dna包装末端酶亚基1编码基因、（d）icp8编码基因或（e）icp34.5编码基因。在一个实施例中，hsv进一步包含以下基因，或基本上由以下基因组成，或由以下基因组成：编码功能失调的icp34.5蛋白的基因和/或编码功能失调的icp6蛋白的基因。在另一实施例中，编码功能失调的icp34.5蛋白的基因包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：具有与seqidno.1、5、7、9或51至少95%相同的序列的多核苷酸及其等效物，前提是该等效物保持突变或改变的氨基酸或核苷酸。在另一个实施例中，编码功能失调的icp6蛋白的基因包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：具有与seqidno.43、45、47或49至少95%相同的序列的多核苷酸及其等效物，前提是该等效物与wt序列相比保持突变或改变的氨基酸或核苷酸。[0129]在某些实施例中，非天然单纯疱疹病毒的ge编码基因包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：具有与seqidno:12、14、16、18至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的序列的多核苷酸及其等效物，前提是该等效物与wt序列相比保持突变或改变的氨基酸或核苷酸。在另一个实施例中，包含此类等效物的hsv以与包含具有seqidno:13的氨基酸序列的突变ge的非天然hsv相当的水平进入细胞和/或在细胞间传播和/或复制dna。评估hsv进入细胞、在细胞间传播和复制dna的非限制性示例可在实施例中找到。在另一实施例中，ge编码基因的多核苷酸编码具有选自seqidno:13、15、17和19的氨基酸序列的多肽。[0130]在某些实施例中，非天然单纯疱疹病毒的icp0编码基因包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：具有选自seqidno:20、22、24、25和53的序列，不含一个或两个内含子的seqidno:20、22、24、25和53中任何一个的序列，具有与seqidno:20、22、24、25和53至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的序列的多核苷酸及其等效物，前提是该等效物与wt序列相比保持突变或改变的氨基酸或核苷酸。在一个实施例中，内含子在序列表和以下中注明：seqidno:20的核苷酸（nt）58至nt861，seqidno:20的nt1529至nt1663，seqidno:22的nt58至nt822，seqidno:22的nt1490至nt1625，seqidno:24的58至nt862，seqidno:24的nt1530至nt1668，seqidno:25的nt58至nt861，seqidno:25的nt1529至nt1663，seqidno:53的nt58至nt822，seqidno:53的nt1490至nt1625。在另一实施例中，等效物编码具有与野生型icp0或具有seqidno:21的氨基酸序列的突变icp0相当的水平的功能（例如，促进病毒基因的转录，破坏称为核点的或早幼粒细胞白血病（pml）核体的细胞核结构，以及结合神经元特异性蛋白质改变宿主和病毒基因的表达）的icp0多肽。可以找到评估此类功能的示例，leehr,kimdj,leejm,etal.(june2004)."abilityofthehumancytomegalovirusie1proteintomodulatesumoylationofpmlcorrelateswithitsfunctionalactivitiesintranscriptionalregulationandinfectivityinculturedfibroblastcells".j.virol.78(12):6527–42；guh,liangy,mandelg,roizmanb(may2005)."componentsoftherest/corest/histonedeacetylaserepressorcomplexaredisrupted,modified,andtranslocatedinhsv‑1‑infectedcells".proc.natl.acad.sci.u.s.a.102(21):7571–6；以及pinnojirc,bedadalagr,georgeb,hollandtc,hilljm,hsiasc(2007)."repressorelement‑1silencingtranscriptionfactor/neuronalrestrictivesilencerfactor(rest/nrsf)canregulatehsv‑1immediate‑earlytranscriptionviahistonemodification".virol.j.4:56。另外或可选地，包含此类等效物的hsv以与包含具有seqidno:21氨基酸序列的突变icp0的非天然hsv相当的水平进入细胞和/或在细胞间传播和/或复制dna。评估hsv进入细胞、在细胞间传播和复制dna的非限制性示例可在实施例中找到。在另一实施例中，icp0编码基因的多核苷酸编码具有选自seqidno:21、23和26的氨基酸序列的多肽。[0131]在某些实施例中，非天然单纯疱疹病毒的icp8编码基因包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：具有选自seqidno:27、29、31、33的序列，具有与seqidno:27、29、31和33至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的序列的多核苷酸及其等效物，前提是该等效物与wt序列相比保持突变或改变的氨基酸或核苷酸。在另一实施例中，等效物编码具有与野生型icp8或具有seqidno:28的氨基酸序列的突变icp8相当的水平的功能（例如，退火为单链dna（ssdna），解旋双链dna的小片段，或在复制开始时破坏双链dna的稳定性）的icp8多肽。这类功能可通过本领域可用的方法进行评估，例如，boehmer,pe;lehman,ir(1993)."herpessimplexvirustype1icp8:helix‑destabilizingproperties".journalofvirology.67(2):711–5。另外或可选地，包含此类等效物的hsv以与包含具有seqidno:28氨基酸序列的突变icp8的非天然hsv相当的水平进入细胞和/或在细胞间传播和/或复制dna。评估hsv进入细胞、在细胞间传播和复制dna的非限制性示例可在实施例中找到。在另一实施例中，icp8编码基因的多核苷酸编码具有选自seqidno:28、30、32和34的氨基酸序列的多肽。[0132]在某些实施例中，非天然单纯疱疹病毒的dna包装末端酶亚基1编码基因包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：具有选自seqidno:35、37、39、41的序列，具有与seqidno:35、37、39和41至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的序列的多核苷酸及其等效物，前提是该等效物与wt序列相比保持突变或改变的氨基酸或核苷酸。在另一实施例中，包含此类等效物的hsv以与包含具有seqidno:36氨基酸序列的突变dna包装末端酶亚基1的非天然hsv相当的水平进入细胞和/或在细胞间传播和/或复制dna。评估hsv进入细胞、在细胞间传播和复制dna的非限制性示例可在实施例中找到。在另一实施例中，dna包装末端酶亚基1编码基因的多核苷酸编码具有选自seqidno:36、38、40和42的氨基酸序列的多肽。[0133]在某些实施例中，hsv包含具有选自seqidno:12、20、27和35的序列的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，hsv不具有功能性icp34.5（即，编码功能失调的icp34.5或不编码的icp34.5）。另外或可选地，hsv不具有功能性icp6（即，编码功能失调的icp6或不编码的icp6）。在另一实施例中，毒力基因中的突变包含以下突变，或基本上由以下突变组成，或由以下突变组成：插入、缺失、截断、移码、置换或点突变，例如，icp34.5基因和/或icp6基因的这些突变。在另一实施例中，hsv缺少编码功能性icp34.5蛋白和/或功能性icp6蛋白的基因。在另一实施例中，该突变是毒力基因中的非同义突变。[0134]在一个实施例中，本发明的非天然hsv上的突变编码以下中的一个或多个：（a）ge蛋白在位置151的丙氨酸到苏氨酸突变，（b）icp0蛋白在位置258的精氨酸到组氨酸突变，（c）dna包装末端酶亚基1蛋白在位置376的丙氨酸到苏氨酸突变，（d）icp8蛋白在位置1155的苏氨酸到蛋氨酸突变，或（e）icp34.5蛋白在位置119的脯氨酸到组氨酸突变。在另一实施例中，非天然hsv包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：seqidno.2、seqidno.13、seqidno.21、seqidno.28或seqidno.36中的一个或多个及其等效物，前提是该等效物与wt序列相比保持突变或改变的氨基酸或核苷酸。[0135]在某些实施例中，提供了一种非天然单纯疱疹病毒（“hsv”），其中该病毒包含以下中的一个或多个中的突变，或基本上由其组成，或由其组成：（a）ge，（b）icp0，（c）dna包装末端酶亚基1，（d）icp8，或（e）icp34.5。在某些实施例中，hsv不包含功能性icp34.5蛋白（例如，17terma菌株或rrp450菌株的icp34.5）。在另一实施例中，hsv不包含任何icp34.5蛋白。另外或可选地，hsv不包含功能性icp6蛋白（例如，17terma菌株或rrp450菌株的icp6）。在另一实施例中，hsv不包含任何icp6蛋白。[0136]在一个实施例中，本发明的非天然hsv上的突变是以下中的一个或多个：（a）ge蛋白在位置151的丙氨酸到苏氨酸突变，（b）icp0蛋白在位置258的精氨酸到组氨酸突变，（c）dna包装末端酶亚基1蛋白在位置376的丙氨酸到苏氨酸突变，（d）icp8蛋白在位置1155的苏氨酸到蛋氨酸突变，或（e）icp34.5蛋白在位置119的脯氨酸到组氨酸突变。[0137]在某些实施例中，非天然hsv的ge包含选自seqidno:13、15、17和19的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，非天然hsv还包含编码ge氨基酸序列的多核苷酸，例如，具有选自seqidno:12、14、16、18的序列的多核苷酸及其等效物。在某些实施例中，非天然hsv的icp0包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：选自seqidno:21、23和26的氨基酸序列。在另一实施例中，非天然hsv还包含编码icp0的氨基酸序列的多核苷酸，例如，具有选自seqidno:20、22、24、25、53的序列的多核苷酸及其等效物。在某些实施例中，非天然hsv的icp8包含选自seqidno:28、30、32和34的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，非天然hsv还包含编码icp8的氨基酸序列的多核苷酸，例如，具有选自seqidno:27、29、31、33的序列的多核苷酸及其等效物。在某些实施例中，非天然hsv的dna包装末端酶亚基1包含选自seqidno:36、38、40和42的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，非天然hsv进一步包含编码dna包装末端酶亚基1的氨基酸序列的多核苷酸，例如，具有选自seqidno:35、37、39、41或其等效物的序列的多核苷酸。[0138]在某些实施例中，非天然hsv包含具有选自seqidno:13、21、28和36的氨基酸序列的一个或多个多肽，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，非天然hsv包含编码选自seqidno:13、21、28和36一个或多个氨基酸序列的一个或多个多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。[0139]在某些实施例中，非天然hsv包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：（a）编码选自seqidno.2、6、8、10和52的氨基酸序列的多核苷酸，和/或具有选自seqidno.1、5、7、9和51的序列的多核苷酸；（b）具有选自seqidno.2、6、8、10和52的氨基酸序列的多肽；（c）编码选自seqidno.13、15、17和19的氨基酸序列的多核苷酸，和/或具有选自seqidno.12、14、16和18的序列的多核苷酸；（d）具有选自seqidno.13、15、17和19的氨基酸序列的多肽；（e）编码选自seqidno.21、23和26的氨基酸序列的多核苷酸，和/或具有选自seqidno.20、22、24、25和53的序列或其不含一个或两个或更多个内含子的序列的多核苷酸；（f）具有选自seqidno.21、23和26的氨基酸序列的多肽；（g）编码选自seqidno.28、30、32和34的氨基酸序列的多核苷酸，和/或具有选自seqidno.27、29、31和33的序列的多核苷酸；（h）具有选自seqidno.28、30、32和34的氨基酸序列的多肽；（i）编码选自seqidno.36、38、40和42的氨基酸序列的多核苷酸，和/或具有选自seqidno.35、37、39和41的序列的多核苷酸；（j）具有选自seqidno.36、38、40和42的氨基酸序列的多肽；（k）编码选自seqidno.44、46、48和50的氨基酸序列的多核苷酸，和/或具有选自seqidno.43、45、47和49序列的多核苷酸；（l）具有选自seqidno.44、46、48和50的氨基酸序列的多肽。[0140]在另一实施例中，非天然hsv包含具有与来自17termahsv及其等效物的毒力基因的至少一个片段相同的序列的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，非天然hsv包含具有与来自rrp450hsv及其等效物的毒力基因的至少一个片段相同的序列的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施例中，非天然hsv源自hsv1型（“hsv‑1”）或hsv2型（“hsv‑2”）菌株。在一个实施例中，非天然hsv源自hsv‑1kos菌株。在另一实施例中，非天然hsv进一步包含转基因，或基本上由转基因组成，或由转基因组成。[0141]由于本文所公开的hsv保留其裂解功能，在另一方面，本发明还提供了一种用于在有需要的受试者中治疗癌症或抑制癌细胞的生长或转移的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：向受试者施用有效量的本发明的非天然hsv、或包含非天然hsv或基本上由非天然hsv组成或由非天然hsv组成的组合物。一方面，癌症包括胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经癌、神经母细胞瘤、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌或黑色素瘤。接受治疗的受试者可以是成人或儿童患者，例如哺乳动物或人类患者。在另一实施例中，非天然hsv载体或组合物或药物组合物通过注射、输注、滴注和/或吸入而局部或全身给药。在另一实施例中，受试者为哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、非人灵长类、狗、猫、马、牛、猪、山羊或绵羊。在另一实施例中，受试者是人。[0142]另一方面，本发明提供了一种诱导细胞裂解的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：将细胞与非天然hsv或包含非天然hsv或基本上由非天然hsv组成或由非天然hsv组成的组合物接触。在一个实施例中，所述细胞为癌细胞。另一方面，所述细胞是培养细胞（用作临床前模型或临床前分析）或从受试者分离的细胞。细胞可以是培养的，或在分离的组织内。这类细胞的非限制性示例包括来自以下的细胞：胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经母细胞瘤、神经癌、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌或黑色素瘤。这些细胞可以从哺乳动物中分离，例如，人类可以是成人或少年（儿童）。[0143]另一方面，本发明提供了一种感染细胞的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：将细胞与非天然hsv接触。在一个实施例中，所述细胞是真核细胞。在另一实施例中，所述细胞为淋巴细胞。在一个实施例中，所述细胞是癌细胞，例如血癌或实体瘤细胞，例如癌或肉瘤。另一方面，所述细胞是培养细胞（用作临床前模型或临床前分析）或从受试者分离的细胞。细胞可以是培养的，或在分离的组织内。这类细胞的非限制性示例包括来自以下的细胞：胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经母细胞瘤、神经癌、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌或黑色素瘤。这些细胞可以从哺乳动物中分离，例如，人类可以是成人或少年（儿童）。[0144]申请人发现，常规的爱泼斯坦‑巴尔（epstein‑barr）病毒（“ebv”）感染的淋巴细胞对常规的溶瘤性hsv（“ohsv”）具有耐药性。在不受理论约束的情况下，这种耐药性至少部分是由于在ebv感染的淋巴细胞上hsv进入受体的低水平表达。令人惊讶的是，本发明要求保护的hsv能够在ebv感染的淋巴细胞中诱导裂解，这些淋巴细胞对野生型菌株17、kos和mckraehsv病毒具有耐药性。因此，在一个实施例中，所述细胞包含受ebv感染的细胞或可选地对ebv具有耐药性的细胞，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，所述细胞包含爱泼斯坦‑巴尔病毒（“ebv”）的毒力元件，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，所述细胞包含受ebv感染的淋巴细胞，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，与对照组相比，本发明要求保护的hsv对ebv感染的细胞具有更高的感染率。在一个实施例中，所述对照组包含常规ohsv，或基本上由常规ohsv组成，或由常规ohsv组成。在另一实施例中，常规ohsv包含野生型菌株17hsv、koshsv或mckraehsv。[0145]hsv突变体或衍生物的制备hsv突变体或衍生物的制备涉及由亲本hsv菌株编码的基因或基因组合的改变或突变。例如，衍生物可具有通过核苷酸置换（例如1、2或3到10、25、50或100个置换）修饰的hsv‑l或hsv‑2基因组序列。hsv‑l或hsv‑2基因组可以通过一个或多个插入和/或缺失和/或在一端或两端的延伸来选择性地或可替代地修饰。基因修饰方法是本领域已知的，例如crispr、重组构建或点突变。本领域普通技术人员知道如何根据需要制备hsv突变体。[0146]除了目标基因修饰方法外，还可以自发产生hsv突变体。例如，hsv等病毒的培养涉及一种称为连续传代的技术。为了培养和维持病毒，合适的细胞被病毒感染，病毒在细胞内复制，然后病毒被收获；然后新鲜细胞被再次感染，这个过程构成了一个连续传代的循环。例如，对于hsv，每个循环可能需要几天时间。如上所述，这种连续传代可能导致病毒株特性或基因序列的变化，在这种情况下，选择有利于hsv临床应用的特性。例如，增强的特性可以包括快速复制，或者沿着轴突传播以感染人类细胞的能力。此外，自发突变可通过用一种或一种以上的hsv感染细胞制备。[0147]因此，本发明提供了一种通过突变hsv中的基因来制备hsv或其突变体或衍生物的方法。在另一实施例中，所述方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：向非天然hsv诱导转基因。[0148]另一方面，本文提供了一种制备hsv病毒颗粒的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：（a）将17termahsv载体和rrp450hsv载体引入宿主细胞；（b）使宿主细胞生长至少3代；和（c）分离由宿主细胞产生的hsv颗粒。在一个实施例中，通过转染、感染、转化、电穿孔、注射、微注射或其组合将hsv引入宿主细胞。在另一实施例中，宿主细胞生长至少3代、10代、20代、30代、40代或50代。在一些实施例中，宿主细胞包含互补基因产物以支持所引入hsv载体的复制，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，互补基因编码icp6蛋白和/或icp34.5蛋白。在另一个实施例中，这样产生的hsv颗粒包含本发明中的hsv载体，或基本上由其组成，或由其组成。[0149]在某些实施例中，本文提供了一种制备本发明的非天然hsv病毒颗粒的方法。该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：（a）将非天然hsv载体引入宿主细胞；（b）使宿主细胞生长；和（c）分离由宿主细胞产生的hsv颗粒。[0150]在某些实施例中，本文提供了一种制备本发明的非天然hsv病毒颗粒的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：（a）将编码非天然hsv载体的病毒基因组的多核苷酸引入宿主细胞；（b）使宿主细胞生长；和（c）收集并分离宿主细胞产生的hsv颗粒。在一个实施例中，通过转染、感染、转化、电穿孔、注射、微注射或其组合将编码病毒基因组的核酸序列引入宿主细胞。在一个实施例中，将编码病毒基因组的核酸序列引入载体中的宿主细胞。在另一实施例中，载体为病毒载体（例如hsv）或非病毒载体（例如质粒或纳米颗粒）。在另一实施例中，载体是hsv。在某些实施例中，宿主细胞包含互补基因产物以支持所引入的hsv载体的复制，或基本上由其组成，或由其组成。在一个实施例中，通过辅助病毒在宿主细胞中提供这种互补基因产物。在另一实施例中，互补基因编码icp6蛋白和/或icp34.5蛋白。在另一实施例中，这样产生的hsv颗粒包含本发明的hsv载体，或基本上由本发明的hsv载体组成，或由本发明的hsv载体组成。[0151]在一个实施例中，分离步骤是指通过例如离心、过滤、色谱或其任意组合，将hsv与其他材料（如宿主细胞、细胞碎片、培养基或培养宿主细胞时使用的任何其他试剂）基本分离的过程。非限制性示例可在siaetal,optimalpurificationmethodforherpes‑basedviralvectorsthatconfersminimalcytotoxicityforsystemicrouteofvectoradministration.jvirolmethods.2007feb;139(2):166‑74中找到。[0152]组合物另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含本文所述的非天然hsv，或基本上由本文所述的非天然hsv组成，或由本文所述的非天然hsv组成。可通过常规混合、溶解、制粒、研磨、乳化、封装、包埋或冻干工艺，制造包含本文所述试剂或病毒颗粒或基本上由其组成或由其组成的组合物（包含药物组合物）。所述组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、辅药或佐剂以常规方式配制，其有助于将本文提供的病毒颗粒加工成药学上可使用的制剂。[0153]该技术的试剂和病毒颗粒可通过肠胃外（例如，肌内、腹腔内、静脉内、脑室内（“icv”）、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、口服、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如尿道栓剂）或外用给药途径（例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）给药，并且可以单独或一起配制成合适的剂量单位制剂，其包含适合每种给药途径的常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂、辅药和溶剂。[0154]在一个实施例中，本发明涉及一种组合物，其包含如本文所述的非天然hsv病毒颗粒和载体，或基本上由其组成，或由其组成。[0155]在另一实施例中，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的非天然病毒颗粒和药学上可接受的载体，或基本上由其组成，或由其组成。在另一实施例中，所述组合物其包含促进非天然hsv的冷冻和解冻而不显著损失毒性的冷冻保护剂，或基本上由其组成，或由其组成。[0156]在另一实施例中，本发明涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的如本文所述的非天然hsv病毒颗粒和药学上可接受的载体，或基本上由其组成，或由其组成。[0157]用于施用hsv病毒颗粒的药物组合物可以方便地以剂量单位形式呈现，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。例如，可通过将本文提供的hsv病毒颗粒均匀且紧密地与液体载体、精细分割的固体载体或两者结合，然后，如有必要，将产品成型为所需的剂型来制备药物组合物。在药物组合物中，本文提供的化合物以足以产生所需治疗效果的量包含在内。例如，本发明的药物组合物可以采用适合于几乎任何给药方式的形式，包括例如外用、眼部、口服、粘膜、全身、鼻腔、注射、输注、透皮、直肠和阴道给药，或者适合通过吸入或吹入给药的形式。[0158]对于外用给药，非天然hsv病毒颗粒可以配制成溶液、凝胶、软膏、乳膏、悬浮液等，这在本领域是众所周知的。[0159]全身制剂包括设计用于注射给药的制剂（例如皮下、静脉内、输注、肌肉内、硬膜内或腹腔内注射），以及设计用于经皮、经粘膜、口服或肺部给药的制剂。[0160]有效的可注射制剂包括本文提供的hsv病毒颗粒在水性或油性溶剂中的无菌悬浮液、溶液或乳剂。所述组合物还可包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。注射用制剂可以单位剂型呈现，例如安瓿或多剂量容器，并且可能含有添加的防腐剂。[0161]或者，可注射制剂可以粉末形式提供，以便在使用前用合适的溶剂进行重组，所述溶剂包括但不限于无菌无热游离水、缓冲液和葡萄糖溶液。为此，本文提供的hsv病毒颗粒可通过任何本领域已知技术（例如冻干）干燥，并在使用前重组。[0162]对于经粘膜给药，制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域已知的。[0163]对于口服给药，药物组合物可以采用例如通过常规方法制备的锭剂、片剂或胶囊的形式，其使用医药上可接受的辅药，例如粘合剂（例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素）；填充剂（如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙）；润滑剂（例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅）；崩解剂（如马铃薯淀粉或乙醇酸淀粉钠）；或润湿剂（如十二烷基硫酸钠）。片剂可通过本领域已知的方法用例如糖、薄膜或肠溶包衣来包衣。[0164]可根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法制备用于口服的组合物，且这类组合物可包含选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的制剂，以提供药学上精美且适口的制剂。片剂含有本文提供的hsv病毒颗粒，与适于制造片剂的无毒的药学上可接受的辅药混合。这些辅药可以是：例如，惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂（如玉米淀粉或褐藻酸）；粘合剂（如淀粉、明胶或阿拉伯胶）；和润滑剂（例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石）。片剂可以不包衣，也可以通过已知的技术包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长时间内提供持续作用。例如，可以使用例如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯的延时材料。它们也可以通过本领域技术人员熟知的技术包衣。该技术的药物组合物也可以是水包油乳液的形式。[0165]用于口服给药的液体制剂可以采用例如酏剂、溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者可以作为使用前干燥产品的形式与水或其他合适的溶剂一起呈现。这类液体制剂可通过常规方法使用药学上可接受的添加剂，例如悬浮剂（例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪）；乳化剂（如卵磷脂或阿拉伯胶）；非水性溶剂（如杏仁油、油酯、乙醇、cremophoretm或分馏植物油）；和防腐剂（例如，甲基或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸）制备。所述制剂还可任选地包含缓冲盐、防腐剂、调味剂、着色剂和甜味剂。[0166]在一个实施例中，提供了一种制备本发明的非天然hsv的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：突变非天然hsv病毒颗粒中的基因，或者将转基因导入非天然hsv。另一方面，制备非天然hsv载体的方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：（a）向宿主细胞导入17termahsv载体和rrp450hsv载体；（b）使宿主细胞生长至少3代；和（c）分离由宿主细胞产生的hsv颗粒。[0167]还提供了一种抑制癌细胞或转移性癌细胞的生长或转移的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：如本文所述，将细胞与有效量的非天然hsv载体或含有非天然hsv载体的组合物或药物组合物接触。接触是体外或体内的。一方面，所述接触是通过向受试者施用非天然hsv或组合物或药物组合物在体内进行的。在体外，通过将非天然hsv与细胞接触来实施所述方法。所述体外方法可用于测试新疗法，或作为个性化分析以确定该疗法是否适合待治疗的癌症。额外的癌症疗法可与可以与本发明所公开方法同时或按顺序进行的治疗相结合。[0168]待治疗的癌细胞可以是实体瘤或血癌，例如癌或肉瘤，并且其非限制性示例包括胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经母细胞瘤、神经癌、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌或黑色素瘤。所述细胞属于任何物种，例如哺乳动物和人类，并且当在体外进行时，它可以来自培养的细胞系或原代细胞，例如来自组织活检。所述细胞可以是成体或幼年细胞或癌症干细胞（即，具有与正常干细胞相关的特征的癌细胞，特别是产生在特定癌症样本中发现的所有细胞类型的能力）或不具有与正常干细胞相关的特征的癌细胞。在一个实施例中，细胞表达n‑myc原癌基因蛋白（mycn），和/或以高于非癌细胞的水平表达mycn。[0169]此外，本发明还提供了一种用于在有需要的受试者中治疗癌症或抑制癌细胞的生长或转移的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：向受试者施用有效量的本发明的非天然hsv、组合物或药物组合物。待治疗的受试者可以是任何物种，例如哺乳动物和人类，例如犬、马、牛、猫、猿猴、大鼠或小鼠。给药可作为一线疗法、二线疗法、三线疗法、四线疗法或五线疗法。额外的癌症疗法可与可以与本发明所公开方法同时或按顺序进行的治疗相结合。待治疗的癌细胞可以是实体瘤或血癌，例如癌或肉瘤，并且其非限制性示例包括胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经母细胞瘤、神经癌、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌或黑色素瘤。[0170]本发明所述方法可与适当的诊断相结合，以监测疾病的缓解或进展。本领域已知用于此类监测的几种方法。[0171]进一步提供了一种诱导细胞裂解的方法，该方法包含以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：将细胞与有效量的本发明的非天然hsv、组合物或药物组合物接触。所述接触是体外或体内的。一方面，所述接触是通过向受试者施用非天然hsv或组合物或药物组合物在体内进行的。在体外，通过将非天然hsv与细胞接触来实施所述方法。所述体外方法可用于测试新疗法，或作为个性化分析以确定该疗法是否适合待治疗的受试者。额外的细胞溶解疗法可与可以与本发明所公开方法同时或按顺序进行的治疗相结合。[0172]待治疗的细胞可以是实体瘤或血癌，例如癌或肉瘤，并且其非限制性示例包括胰腺癌、肾癌、小细胞肺癌、脑癌、神经母细胞瘤、神经癌、骨癌、淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、子宫癌、乳腺癌、白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌或黑色素瘤。所述细胞属于任何物种，例如哺乳动物和人类，并且当在体外进行时，它可以来自培养的细胞系或原代细胞，例如来自组织活检。所述细胞可以是成体或幼年细胞，或癌症干细胞，或不具有与正常干细胞相关的特征的癌细胞。该疗法可与适当的分析相结合，以测验该疗法的有效性，例如癌症缓解或进展。[0173]hsv病毒颗粒在制备药物中的应用本发明的hsv和组合物也可用于制备用于治疗本文所述各种病理的药物。用于制备组合物的药物的方法和技术是本领域已知的。仅出于说明目的，本文详述了药物制剂和递送途径。[0174]因此，本领域技术人员将容易理解，上述任何一种或多种组合物，包括许多具体实施例，可通过应用标准药物制造程序来制备药物用于治疗本文所述的多种疾病。这类药物可通过使用药学领域已知的递送方法递送给受试者。[0175]额外的治疗剂的施用本文所公开的方法可以包含施用有效量的额外的治疗剂，或基本上由其组成，或由其组成，以增强或提高本发明所公开方法的治疗效果。在一个实施例中，额外的治疗剂包含肿瘤的外科切除、抗肿瘤剂（例如小分子或免疫疗法或细胞溶解疗法），或基本上由其组成，或由其组成。[0176]考虑到治疗的毒性（如果有的话），向患者施用本发明的疗法或物质将遵循特定的主要或次要治疗的一般给药方案。预计治疗周期将在必要时重复。还考虑各种标准疗法以及外科干预可与所述疗法组合应用。[0177]如本领域技术人员显而易见的，联合疗法可以采用于同时或顺序给药的形式联合治疗。[0178]试剂盒在一些实施例中，本文所述的试剂或非天然hsv可组装成药物或诊断或研究试剂盒，以促进其在治疗、诊断或研究应用中的使用。试剂盒可包括本文所述的一种或多种试剂，以及描述这些试剂的预期应用和正确使用的说明书。具体地，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并应用于受试者的说明。在某些实施例中，试剂盒中的试剂为适合于特定应用和施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可能包含用于进行各种实验的适当浓度或数量的成分。[0179]试剂盒的设计可以促进本文所述方法的使用，并可采用多种形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物可以液体形式（如溶液）或固体形式（如干粉）提供。在某些情况下，例如通过添加合适的溶剂或其他种类（例如，水或细胞培养基），一些组合物可以是可组合的或以其他方式可加工的（例如，成为活性形式），其可以与试剂盒一起提供，也可以不与试剂盒一起提供。在一些实施例中，所述组合物可在保存溶液（例如，低温保存溶液）中提供。保存溶液的非限制性示例包括dmso、多聚甲醛和cryostor®（stemcelltechnologies，vancouver,canada）。在一些实施例中，保存溶液包含一定量的金属蛋白酶抑制剂。[0180]如本文所用，“说明/说明书”可定义说明和/或宣传的组成部分，且通常涉及对所述方法、重组载体或组合物的包装或与之相关的书面说明。说明还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明，以使得用户将清楚地认识到说明将与试剂盒相关联，例如，视听（例如，录像带、dvd等）、互联网和/或基于网络的通信等。书面说明可以采用监管药品或生物产品制造、使用或销售的政府机构规定的格式，该说明也可反映经动物管理机构批准的制造、使用或销售。[0181]在一些实施例中，试剂盒在一种或多种容器中包含本文所述的任何一种或多种组件。例如，在一个实施例中，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并应用于受试者的说明。试剂盒可包括容纳本文所述试剂的容器。hsv可以是液体、凝胶或固体（粉末）的形式。hsv可无菌制备、包装在注射器中并冷藏运输。或者，可以将其置于小瓶或其他容器中进行储存。第二种容器可装有经灭菌制备的其它试剂。或者，试剂盒可包括预混合的活性剂，并在注射器、小瓶、试管或其他容器中运输。试剂盒可具有向受试者施用药剂所需的一种或多种或所有组件，例如注射器、局部施用装置或iv针管和袋子。[0182]筛选试验本发明还提供筛选试验，以确定已知的和新的化合物及组合的潜在治疗剂。例如，本领域技术人员还可以通过将hsv与待治疗的样本细胞或组织接触来确定hsv是否在体外提供治疗益处。细胞或组织可以来自任何物种，例如猿猴、犬、牛、羊、大鼠、小鼠或人类。[0183]接触也可在适当的动物模型或人类患者体内进行。在体外进行时，hsv可直接添加到细胞培养基中。当在体外进行时，该方法可用于在对动物或人类患者给药之前筛选新的联合疗法、制剂或治疗方案。[0184]另一方面，试验需要将包含适当细胞或组织的第一样本（“对照样本”）与本文所公开的有效量的hsv接触，并将适当细胞或组织的第二样本（“测试样本”）与待分析的hsv、试剂或组合接触。一方面，在癌症的情况下，确定第一和第二细胞样本的生长抑制。如果第二样本的生长抑制基本上与第一样本相同或大于第一样本，则该试剂是潜在的治疗药物。一方面，基本上相同或更大的细胞生长抑制是差异小于约1%、或小于约5%、或小于约10%、或大于约10%、或大于约20%、或大于约50%、或者大于约90%。接触可在体外或体内进行。确定细胞生长抑制的方法是本领域众所周知的。[0185]另一方面，试验试剂与包含对照和试验样本的正常对应的细胞或组织的第三样本接触，并选择治疗了第二细胞或组织样本但不会对第三个样本产生不利影响的试剂。为了本文所述试验的目的，本文描述了合适的细胞或组织，例如癌症或本文所述的其他疾病。这类示例包括但不限于通过活检或血液获得的癌细胞或组织。[0186]使用本领域已知的方法（包括但不限于细胞活力测定）测定试验组合物的功效。[0187]另一个方面，试验需要至少两种细胞类型，第一种是合适的对照细胞。[0188]这些试验还可用于预测受试者是否会受到本发明的适当治疗，通过将hsv递送至含有待治疗细胞的样本并进行治疗分析（这将随病理变化），或用于筛选新的药物和组合。一方面，通过活检从受试者或患者获得细胞或组织。本发明还通过提供至少一种本发明的组合物和使用说明，确定病理细胞或患者是否将通过该疗法得到适当治疗的试剂盒。[0189]试验细胞可在小型多孔板中生长，并用于检测试验化合物的生物活性。就本发明而言，成功的hsv或其他制剂将阻止癌细胞生长或杀死癌细胞，但对照细胞类型不受伤害。[0190]以下实施例用于说明而非限制本发明。实施例[0191]hsv突变体的产生用17terma和rrp450（“定向进化”）感染非允许细胞系，并在连续传代后培养，以分离含有wt样基因型的hsvmut‑3突变体。然后通过基因编辑（标记为“crispr/cas9”）用hsvmut‑3突变体构建减毒突变体mut‑3∆34.5（图1a）。图1b显示了mut‑3与其亲本病毒的序列比较。mut‑3中与任一亲本不同的非同义突变用反斜杠表示，包括ul15、ul29、us8、rl1和rl2。与17terma相同的基因组序列显示为空白框；与rrp450相同的部分用正斜杠表示。[0192]分离出含有wt样基因型的有效的ohsv突变体mut‑3。mut‑3和减毒版本mut‑3∆34.5都依赖于典型的hsv进入蛋白、nectin‑1或疱疹病毒进入介体（hvem），以实现成功感染（未显示）。与17∆34.5（通过相同的crispr/cas9基因编辑策略从野生型菌株17衍生的∆34.5‑null病毒）相比，通过可检测的gfp阳性区域的开始测量的mut‑3∆34.5病毒基因转移动力学要早得多。此外，mut‑3∆34.5感染可导致更多的细胞死亡，如通过其较小的细胞融合面积测量的那样。然而，与17∆34.5或mut‑3∆34.5‑null的亲本病毒17terma相比，mut‑3∆34.5的复制性似乎更低。这些结果表明，即使在减毒mut‑3∆34.5版本中，独特的基因组改变也会导致合胞体表型（未显示），并且效力仍然增强。在一项表皮生长因子受体（egfr）重定位hsv的研究中，有报道称引入合胞体突变不会损害进入和传播的特异性。在不受理论约束的情况下，申请人认为mut‑3∆34.5中合胞体表型的根本原因可能导致病毒融合到细胞膜时的动力学改变，从而影响进入和/或病毒介导的细胞间融合，从而导致更快的细胞杀伤并减少病毒颗粒的产生。[0193]在参与hsv‑1进入的典型糖蛋白gb、gd、gh和gl中未发现突变。然而，不同于任何一个亲本，有五个基因在mut‑3中含有非同义（ns）突变：rl1、rl2、ul15、ul29和us8/ge。mut‑3及其减毒版本mut‑3∆34.5两者均显示融合表型，表明该现象与rl1无关。全基因组分析还表明，该表型与先前报道的突变无关，因为mut‑3的氨基酸序列要么与rrp450和gk/ul53和ul20中的参考菌株17基因组（非合胞病毒）相同，要么与gb/ul27和ul24中的17terma（非合胞病毒）相同。ge/us8的a151t突变是mut‑3中唯一与其亲本病毒相比具有ns改变的糖蛋白（病毒粒子表面蛋白）。尽管ge与病毒附着或进入均无关联，但ge/gi二聚化介导了病毒的细胞间传播，因为ge中的突变与较小的菌斑大小有关。**申请人假设mut‑3∆34.5中ge的a151t可能是其合胞体表型和增效表型的根本原因。根据申请人的研究优先级（从上到下），表1中申请人列出了在mut‑3的五个基因中发现的所有五个ns突变，以及每个基因的相应功能，与mut‑3增效表型相关的可能作用和申请人提出的研究。其他三种突变（rl1除外）也可以确定，就像对gea151t做的一样。[0194]表1hsv蛋白突变及其功能，nt：核苷酸；a.a：氨基酸。[0195]hsv突变体的比较同时对图1a所示的四种病毒进行菌斑分析，并在3天后通过keyencehs多功能荧光显微镜bz‑ii分析仪扫描和分析菌斑图像。如图1a和1b所示，mut‑3和mut‑3δ34.5的菌斑大小明显大于亲本病毒rrp450和17terma。cho细胞集的体外细胞毒性/mts检测中，cho‑k1、cho‑nectin‑1、cho‑nectin‑2和cho‑hvem被四种病毒以不同的感染复数（moi）感染。相对于未经处理的对照组，在病毒感染后（pvi）3天通过比色法细胞增殖和mts测定测量了细胞存活率。只有cho‑nectin‑1和cho‑hvem而不是cho‑k1或cho‑nectin‑2（主要用于hsv‑2进入）对四种病毒的处理敏感（图2c）。在不受理论约束的情况下，结果表明mut‑3和mut‑3δ34.5没有绕过受体屏障，仍然依赖典型的hsv进入受体以感染细胞。[0196]与17terma相比，mut‑3δ34.5在杀死人类和小鼠神经母细胞瘤细胞方面的效力增加并非由于感染性病毒产量增加（图3）。透射电子显微镜（“tem”）分析还显示，感染神经母细胞瘤细胞后，mut‑3δ34.5病毒粒子主要存在于内吞囊泡中，而17terma病毒粒子主要存在于内吞囊泡中（图4）。[0197]通过crispr‑cas9基因编辑技术生成减毒17δ34.5突变体，以用egfp表达盒替换野生型菌株17+中的g134.5基因。17δ34.5突变体的效力低于其野生型菌株17+，但与17terma相当（图5）。与17δ34.5相比，当mut‑3δ34.5显示出更快的病毒基因转移和细胞杀伤时，17δ34.5的衰减进一步得到证实（图6）。此外，mut‑3δ34.5比17terma更有效地控制人神经母细胞瘤体内生长（图7）。[0198]用于功能丧失研究的mut‑3δ34.5中的us8/ge回复子仅通过crispr/cas9技术在hsv基因组中导入单核苷酸变化是困难的，因为在病毒复制过程中基因组有多个拷贝，并且无法选择标记伴随该基因编辑。一个构建体可以是结合crispr/cas9技术的两步过程的结果：用报告基因（如mcherry或红色荧光蛋白（rfp））替换整个ge编码区以构建ge‑nullmut‑3∆34.5；然后2）用wt‑ge编码区替换报告基因，产生ge‑wtmut‑3∆34.5回复子。如上所述，可以观察到ge‑null中间体和该ge回复子mut‑3∆34.5丧失表型的程度。本发明也提供了这种构建体。[0199]用于功能获得的mut‑3亲本17terma中的us8/gea151t突变如上所述，ge突变体17terma可分两步构建：1）完全敲除ge编码区并用报告基因（例如gfp）替换它；然后2）通过敲入包含a151t突变的ge编码区替换报告基因。将会确定mut‑3∆34.5的表型。本发明也提供了这种构建体。[0200]如果gea151t仅对部分或未观察到的表型负责，或者即使如此，本发明还提供了mut‑3的其他突变。突变体是通过系统地单独或组合采用如本文所述并且如表1所示的类似的功能获得和功能丧失的方法构建的。减毒mut‑3∆34.5的安全性和有效性可在小鼠模型中测试。因此，本发明提供了用于测试突变体的动物模型以及测试方法。[0201]mut‑3株是一种有效的wt样hsv突变体，由17terma和rrp450重组构建。通过缺失病毒毒力蛋白γ134.5/rl1，创建了减毒版本mut‑3δ34.5，以确保其临床使用的安全性。在申请人的试点毒理学研究中，在静脉内注射高达1e8菌斑形成单位（pfu）超过85天后，未观察到balb/c小鼠出现不良临床症状或体重显著变化（未显示）。此外，与17terma相比，mut‑3δ34.5在体外（图3a）和体内（图7）的高度侵袭性神经母细胞瘤模型中也显示出抗肿瘤功效。[0202]mut‑3δ34.5在幼稚型非荷瘤小鼠中的生物分布申请人自己的研究表明，幼稚型balb/c小鼠能够耐受高达1e8pfu的静脉内注射（iv）递送的mut‑3∆34.5病毒，且在超过85天没有任何疾病迹象。生物分布研究开始于对两种性别的（每种性别30只）幼稚型非荷瘤balb/c小鼠静脉内注射先前测试的最高剂量（每只小鼠1e8pfu的mut‑3∆34.5病毒）。采集外周血，然后处死小鼠。在pvi24小时、14天、28天、56天和85天（每个时间点n=6）采集睾丸、卵巢、脾脏、肺、肾脏、心脏、肺和大脑。一半的器官被埋入福尔马林中保存以进行病理分析，另一半被均质化用于hsv基因组的qpcr分析和菌斑分析以获得每个器官中的病毒载量。在给药后的两周内每天观察小鼠，然后每周观察两次，直到计划的处死日。在病毒感染前和感染后每周测量每只小鼠的体重。处死小鼠以显示是否存在不良临床症状或体重减轻>20%，并如上所述分析器官中的病毒活性。同时，将野生型kos病毒[剂量范围：每只小鼠1x105至1x107pfu（n=3）]作为阳性（非安全）对照施用至各组小鼠。申请人先前发现，1x106pfu的kos病毒剂量在2至3天内在fvbn小鼠中具有一律的致死性。qpcr用于分析hsv基因组拷贝，菌斑分析用于评估病毒活性，并对显示疾病迹象的阳性对照组小鼠的器官进行病理分析。这些结果可作为评估从经mut‑3∆34.5处理的小鼠收集的数据的阳性指标/阈值。进一步评估mut‑3∆34.5处理组中组织/器官的病理变化，以显示与阳性对照组相当的病毒载量。每个性别每组6只小鼠用于评估不同时期的生物分布和安全性和耐受性。mut‑3∆34.5的生物分布通过不同时间内不同器官中每纳克基因组dna的hsv基因组拷贝数进行测量，采用描述性统计，并与单变量分析（如适用）进行比较。[0203]mut‑3∆34.5与其他γ134.5/rl1病毒（17terma和t‑vec）在各种儿童癌症细胞系中的体外细胞毒性与人和小鼠神经母细胞瘤细胞中的17terma相比，观察到mut‑3∆34.5具有更好的杀伤作用（图3a）。使用图3a所示的体外检测中相同的mts，相同的检测用于其他儿童癌症细胞，如肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤（mpnst）和脑肿瘤（申请人可获得多种模型），以确定增加的效力表型是否适用于不同的肿瘤类型。每种细胞类型中最有效的细胞系用于进行体内疗效研究。[0204]与其他ohsv疗法17terma和t‑vec相比，检验mut‑3∆34.5在人类儿童肿瘤模型中的疗效选择每种肿瘤类型（共三种）的高效应模型之一，以使用5至6周龄雌性无胸腺裸鼠进行异种移植中的疗效研究。当肿瘤达到150‑300mm3时，将小鼠集中并随机分为3组（每组n=11）：i）磷酸盐缓冲盐水（pbs）对照组，ii）mut‑3∆34.5病毒，或iii）17terma或t‑vec病毒。对于病毒之间的疗效，每组至少使用11只小鼠，以最小的80%功效检测存活率和肿瘤生长的巨大差异（20%vs80%，在第20天）。根据申请人先前的研究，每隔一天对每只小鼠进行在100μlpbs中的1x107pfu的病毒或仅pbs（对照组）的瘤内治疗，共注射三次。在注射病毒后的80天内，监测小鼠的肿瘤体积（每周两次）和体重（每周一次）。终点指标包括肿瘤体积超过2500mm3，肿瘤直径达到2cm，或体重减轻>20%。可通过kaplan‑meier曲线显示动物存活率，并通过对数秩检验在各组之间进行比较。[0205]与其他ohsv疗法（17terma和t‑vec）相比，mut‑3δ34.5在小鼠儿童肿瘤模型中的疗效选择每种肿瘤类型（共两种）的高效应模型之一，以在（5至6）周龄性别匹配的c57bl6小鼠中进行申请人疗效研究。相似地，将小鼠集中并随机分为3组，每组，n=11：i）pbs，ii）mut‑3∆34.5，iii）17terma或t‑vec。每隔一天对每只小鼠进行1x108pfu的病毒或仅pbs的瘤内治疗，共注射三次，作为申请人先前的研究。终点指标包括肿瘤体积超过2500mm3，肿瘤直径达到2cm，或体重减轻>20%。可通过kaplan‑meier曲线显示动物存活率，并通过对数秩检验在各组之间进行比较。[0206]病理分析总结通过osu比较病理学和小鼠表型共享资源（comparativepathology&mousephenotypingsharedresource）提交来自4只野生型kos注射小鼠（1e6和1e7pfu，每种剂量2只小鼠）的组织进行病理分析。随后提交来自mut‑3d34.5/c8g5和mut‑3dicp6/d7‑1注射小鼠（pvi时间点24小时和14天，每个时间点2只小鼠）的组织进行病理分析。[0207]病理报告（雌性）：kos注射小鼠脑干发淋巴浆细胞性脑炎与已公开的注射hsv‑1的balb/c小鼠中枢神经系统病理学报告一致。本次提交的所有受检小鼠都有这种病变，尽管一只提交的大脑仅包括脑干的一小部分，因此病变似乎比其他三只小鼠更轻。肾上腺切片和两只小鼠的肾脏切片一起保存。这些小鼠的肾上腺皮质和髓质都有明显的坏死。[0208]病理报告（雌性）：24小时和14天的mut‑3∆34.5/c8g5和mut‑3∆icp6/d7‑1注射小鼠hsv感染后24小时处死的小鼠样本均具有以下中度至显著严重程度的病变：门静脉周围至肝中带坏死，包括单个肝细胞和局部弥漫性肝索坏死；明显的脾红髓坏死和中度白髓坏死，滤泡小于预期。数只24小时小鼠的卵泡和卵巢组织的黄体细胞凋亡/坏死增加。在几个月前评估的对照组小鼠中，并没有注意到其超出预期量，但在这里提到的小鼠中超出了预期量。[0209]在14天小鼠中，卵圆细胞增生是肝脏受损的常见慢性反应，可能是对感染的反应。少数肺样本具有在24小时动物中未发现的坏死和炎症病变。总体而言，14天小鼠比24小时小鼠具有更少和更轻微的损伤。[0210]实验室研制的突变病毒可能导致多种细胞类型的坏死，特别是在24小时内，包括肝细胞、红髓和白髓中的脾细胞以及卵巢中的细胞。[0211]等效物除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。[0212]此处说明性描述的实施例可在不存在此处未具体公开的任何要素、限制或约束的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“含有”、“包含”等应被广泛地而非限制地解读。此外，本文中使用的术语和表达已被用作描述性而非限制性的术语，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和描述的特征或其部分的任何等效物，但应当认识到在本公开的范围内可以进行各种修改。[0213]因此，应当理解，虽然本公开已经通过特定实施方案和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可以求助于本文公开的实施例的修改、改进和变化，并且此类修改、改进和变化被认为在本公开的范围内。这里提供的材料、方法和示例是特定实施方案的代表，是示例性的，并不旨在限制本公开的范围。[0214]本公开的范围已经在本文中广泛和一般地进行了描述。属于通用公开内容的每个更窄的种类和亚通用组也构成本公开内容的一部分。这包括具有从属中去除任何主题的附带条件或否定限制的通用描述，无论此处是否具体引用了所切除的材料。[0215]本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，包括所有公式和附图，均通过引用的方式整体并入，其程度与单独通过引用的方式并入相同。如有冲突，以本说明书（包括定义）为准。[0216]在以下权利要求中阐述了其他实施例。[0217]seqidno.1：mut3和mut‑3∆icp6病毒株中icp34.5的dna序列。c356a突变在下面的序列中以粗体和斜体显示。[0218]atggcccgccgccgccgccatcgcggcccccgccgcccccggccgcccgggcccacgggcgcggtcccaaccgcacagtcccaggtaacctccacgcccaactcggaacccgtggtcaggagcgcgcccgcggccgccccgccgccgccccccgccagtgggcccccgccttcttgttcgctgctgctgcgccagtggctccacgttcccgagtccgcgtccgacgacgacgacgacgactggccggacagccccccgcccgagccggcgccagaggcccggcccaccgccgccgccccccgcccccggtccccaccgcccggcgcgggcccggggggcggggctaacccctcccaccccccctcacgccccttccgccttccgccgcgcctcgccctccgcctgcgcgtcaccgcagagcacctggcgcgcctgcgcctgcgacgcgcgggcggggagggggcgccgaagccccccgcgacccccgcgacccccgcgacccccacgcgggtgcgcttctcgccccacgtccgggtgcgccacctggtggtctgggcctcggccgcccgcctggcgcgccgcggctcgtgggcccgcgagcgggccgaccgggctcggttccggcgccgggtggcggaggccgaggcggtcatcgggccgtgcctggggcccgaggcccgtgcccgggccctggcccgcggagccggcccggcgaactcggtctaaseqidno.2：mut3和mut‑3∆icp6中icp34.5的氨基酸序列。p119h突变在下面的序列中以粗体和斜体显示。[0219]marrrrhrgprrprppgptgavptaqsqvtstpnsepvvrsapaaapppppasgpppscslllrqwlhvpesasddddddwpdspppepapearptaaaprprspppgagpggganpshppsrpfrlpprlalrlrvtaehlarlrlrraggegapkppatpatpatptrvrfsphvrvrhlvvwasaarlarrgswareradrarfrrrvaeaeavigpclgpeararalargagpansvseqidno.3：egfp的dna编码序列。icp34.5编码区被mut3∆ic34.5中的egfp表达盒（图5c，seqidno.11）替换。[0220]atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagaagcttagccatggcttcccgccggaggtggaggagcaggatgatggcacgctgcccatgtcttgtgcccaggagagcgggatggaccgtcaccctgcagcctgtgcttctgctaggatcaatgtgtagseqidno.4：egfp的氨基酸编码序列。[0221]mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelykklshgfppeveeqddgtlpmscaqesgmdrhpaacasarinvseqidno.5：17terma菌株中icp34.5的dna序列。[0222]atggcccgccgccgccgccatcgcggcccccgccgcccccggccgcccgggcccacgggcgccgtcccaaccgcacagtcccaggtaacctagactagtctagcgtaacctccacgcccaactcggaacccgcggtcaggagcgcgcccgcggccgccccgccgccgccccccgccggtgggcccccgccttcttgttcgctgctgctgcgccagtggctccacgttcccgagtccgcgtccgacaacgacgatgacgacgactggccggacagccccccgcccgagccggcgccagaggcccggcccaccgccgccgccccccggccccggcccccaccgcccggcgtgggcccggggggcggggctgacccctcccaccccccctcgcgccccttccgccttccgccgcgcctcgccctccgcctgcgcgtcaccgcggagcacctggcgcgcctgcgcctgcgacgcgcgggcggggagggggcgccggagccccccgcgacccccgcgacccccgcgacccccgcgacccccgcgacccccgcgcgggtgcgcttctcgccccacgtccgggtgcgccacctggtggtctgggcctcggccgcccgcctggcgcgccgcggctcgtgggcccgcgagcgggccgaccgggctcggttccggcgccgggtggcggaggccgaggcggtcatcgggccgtgcctggggcccgaggcccgtgcccgggccctggcccgcggagccggcccggcgaactcggtctaaseqidno.6：17terma菌株中icp34.5的氨基酸序列。[0223]marrrrhrgprrprppgptgavptaqsqvt*（*终止密码子——预测*后的序列不表达）seqidno.7：rrp450菌株中icp34.5的dna序列。[0224]atggcccgccgccgccatcgcggcccccgccgcccccggccgcccgggcccacgggcgcggtcccaaccgcacagtcccaggtaacctccacgcccaactcggaacccgtggtcaggagcgcgcccgcggccgccccgccgccgccccccgccagtgggcccccgccttcttgttcgctgctgctgcgccagtggctccacgttcccgagtccgcgtccgacgacgacgacgacgactggccggacagccccccgcccgagccggcgccagaggcccggcccaccgccgccgccccccgcccccggtccccaccgcccggcgcgggcccggggggcggggctaacccctccccccccccctcacgccccttccgccttccgccgcgcctcgccctccgcctgcgcgtcaccgcagagcacctggcgcgcctgcgcctgcgacgcgcgggcggggagggggcgccgaagccccccgcgacccccgcgacccccgcgacccccacgcgggtgcgcttctcgccccacgtccgggtgcgccacctggtggtctgggcctcggccgcccgcctggcgcgccgcggctcgtgggcccgcgagcgggccgaccgggctcggttccggcgccgggtggcggaggccgaggcggtcatcgggccgtgcctggggcccgaggcccgtgcccgggccctggcccgcggagccggcccggcgaactcggtctaaseqidno.8：rrp450菌株中icp34.5的氨基酸序列。[0225]marrrhrgprrprppgptgavptaqsqvtstpnsepvvrsapaaapppppasgpppscslllrqwlhvpesasddddddwpdspppepapearptaaaprprspppgagpggganpspppsrpfrlpprlalrlrvtaehlarlrlrraggegapkppatpatpatptrvrfsphvrvrhlvvwasaarlarrgswareradrarfrrrvaeaeavigpclgpeararalargagpansvseqidno.9：野生型17菌株中icp34.5的dna序列。[0226]atggcccgccgccgccgccatcgcggcccccgccgcccccggccgcccgggcccacgggcgcggtcccaaccgcacagtcccaggtaacctccacgcccaactcggaacccgtggtcaggagcgcgcccgcggccgccccgccgccgccccccgccagtgggcccccgccttcttgttcgctgctgctgcgccagtggctccacgttcccgagtccgcgtccgacgacgacgacgacgactggccggacagccccccgcccgagccggcgccagaggcccggcccaccgccgccgccccccgcccccggtccccaccgcccggcgcgggcccggggggcggggctaacccctcccaccccccctcacgccccttccgccttccgccgcgcctcgccctccgcctgcgcgtcaccgcagagcacctggcgcgcctgcgcctgcgacgcgcgggcggggagggggcgccgaagccccccgcgacccccgcgacccccgcgacccccacgcgggtgcgcttctcgccccacgtccgggtgcgccacctggtggtctgggcctcggccgcccgcctggcgcgccgcggctcgtgggcccgcgagcgggccgaccgggctcggttccggcgccgggtggcggaggccgaggcggtcatcgggccgtgcctggggcccgaggcccgtgcccgggccctggcccgcggagccggcccggcgaactcggtctaaseqidno.51：野生型17菌株中icp34.5的dna序列。[0227]atggcccgccgccgccgccatcgcggcccccgccgcccccggccgcccgggcccacgggcgccgtcccaaccgcacagtcccaggtaacctccacgcccaactcggaacccgcggtcaggagcgcgcccgcggccgccccgccgccgccccccgccggtgggcccccgccttcttgttcgctgctgctgcgccagtggctccacgttcccgagtccgcgtccgacgacgacgatgacgacgactggccggacagccccccgcccgagccggcgccagaggcccggcccaccgccgccgccccccggccccggcccccaccgcccggcgtgggcccggggggcggggctgacccctcccaccccccctcgcgccccttccgccttccgccgcgcctcgccctccgcctgcgcgtcaccgcggagcacctggcgcgcctgcgcctgcgacgcgcgggcggggagggggcgccggagccccccgcgacccccgcgacccccgcgacccccgcgacccccgcgacccccgcgcgggtgcgcttctcgccccacgtccgggtgcgccacctggtggtctgggcctcggccgcccgcctggcgcgccgcggctcgtgggcccgcgagcgggccgaccgggctcggttccggcgccgggtggcggaggccgaggcggtcatcgggccgtgcctggggcccgaggcccgtgcccgggccctggcccgcggagccggcccggcgaactcggtctaaseqidno.10：野生型17菌株中icp34.5的氨基酸序列。[0228]marrrrhrgprrprppgptgavptaqsqvtstpnsepvvrsapaaapppppasgpppscslllrqwlhvpesasddddddwpdspppepapearptaaaprprspppgagpggganpshppsrpfrlpprlalrlrvtaehlarlrlrraggegapkppatpatpatptrvrfsphvrvrhlvvwasaarlarrgswareradrarfrrrvaeaeavigpclgpeararalargagpansvseqidno.52：野生型17菌株中icp34.5的氨基酸序列。[0229]marrrrhrgprrprppgptgavptaqsqvtstpnsepavrsapaaapppppaggpppscslllrqwlhvpesasdddddddwpdspppepapearptaaaprprppppgvgpgggadpshppsrpfrlpprlalrlrvtaehlarlrlrraggegapeppatpatpatpatpatparvrfsphvrvrhlvvwasaarlarrgswareradrarfrrrvaeaeavigpclgpeararalargagpansvseqidno:11：egfp表达盒的dna序列。[0230]aacacattaattaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgctcgaagcggccggccgccccgactctagactacacattgatcctagcagaagcacaggctgcagggtgacggtccatcccgctctcctgggcacaagacatgggcagcgtgccatcatcctgctcctccacctccggcgggaagccatggctaagcttcttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgttggggtctttgctcagggcggactgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacggggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttcagggtcagcttgccgtaggtggcatcgccctcgccctcgccggacacgctgaacttgtggccgtttacgtcgccgtccagctcgaccaggatgggcaccaccccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatccgggaattgcggccgcgggtacaattccgcagcttttagagcagaagtaacacttccgtacaggcctagaagtaaaggcaacatccactgaggagcagttctttgatttgcaccaccaccggatccgggacctgaaataaaagacaaaaagactaaacttaccagttaactttctggtttttcagttcctcgagtaccggatcctctagagtccggaggctggatcggtcccggtgtcttctatggaggtcaaaacagcgtggatggcgtctccaggcgatctgacggttcactaaacgagctctgcttatatagacctcccaccgtacacgcctaccgcccatttgcgtcaatggggcggagttgttacgacattttggaaagtcccgttgattttggtgccaaaacaaactcccattgacgtcaatggggtggagacttggaaatccccgtgagtcaaaccgctatccacgcccattgatgtactgccaaaaccgcatcaccatggtaatagcgatgactaatacgtagatgtactgccaagtaggaaagtcccataaggtcatgtactgggcataatgccaggcgggccatttaccgtcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatgatacacttgatgtactgccaagtgggcagtttaccgtaaatactccacccattgacgtcaatggaaagtccctattggcgttactatgggaacatacgtcattattgacgtcaatgggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgacctgcaggcatgcaagctcgaattcgaacacgcagatgcagtcggggcggcagatcttaattaatggctggttgtttgttgtseqidno:12：mut‑3、mut‑3∆34.5或mut‑3∆icp6病毒株中ge（糖蛋白e）的dna序列。g451a突变在下面的序列中以粗体和斜体显示。[0231]atggatcgcggggcggtggtggggtttcttctcggtgtttgtgttgtatcgtgcttggcgggaacgcccaaaacgtcctggagacgggtgagtgtcggcgaggacgtttcgttgcttccagctccggggcctacggggcgcggcccgacccagaaactactatgggccgtggaacccctggatgggtgcggccccttacacccgtcgtgggtctcgctgatgccccccaagcaggtgcccgagacggtcgtggatgcggcgtgcatgcgcgctccggtcccgctggcgatggcgtacgcccccccggccccatctgcgaccgggggtctacgaacggacttcgtgtggcaggagcgcgcggccgtggttaaccggagtctggttattcacggggtccgagagacggacagcggcctgtataccctgtccgtgggcgacataaaggacccgactcgccaagtggcctcggtggtcctggtggtgcaaccggccccagttccgaccccacccccgaccccagccgattacgacgaggatgacaatgacgagggcgaggacgaaagtctcgccggcactcccgccagcgggaccccccggctcccgcctccccccgcccccccgaggtcttggcccagcgcccccgaagtctcacatgtgcgtggggtgaccgtgcgtatggagactccggaagctatcctgttttcccccggggagacgttcagcacgaacgtctccatccatgccatcgcccacgacgaccagacctactccatggacgtcgtctggttgaggttcgacgtgccgacctcgtgtgccgagatgcgaatatacgaatcgtgtctgtatcacccgcagctcccagaatgtctgtccccggccgacgcgccgtgcgccgcgagtacgtggacgtctcgcctggccgtccgcagctacgcggggtgttccagaacaaaccccccaccgcgctgttcggccgaggctcacatggagcccgtcccggggctggcgtggcaggcggcctccgtcaatctggagttccgggacgcgtccccacaacactccggcctgtatctgtgtgtggtgtacgtcaacgaccatattcacgcctggggccacattaccatcagcaccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcccctcccacagcgcggcgcggatttggccgagcccacccacccgcacgtcggggcccctccccacgcgcccccaacccacggcgccctgcggttaggggcggtgatgggggccgccctgctgctgtctgcgctggggttgtcggtgtgggcgtgtatgacctgttggcgcaggcgtgcctggcgggcggttaaaagcagggcctcgggtaaggggcccacgtacattcgcgtggccgacagcgagctgtacgcggactggagctcggacagcgagggagaacgcgaccaggtcccgtggctggcccccccggagagacccgactctccctccaccaatggatccggctttgagatcttatcaccaacggctccgtctgtatacccccgtagcgacgggcatcaatctcgccgccagctcacaacctttggatccggaaggcccgatcgccgttactcccaggcctccgattcgtccgtcttctggtaaseqidno:13：mut‑3、mut‑3∆34.5或mut‑3∆icp6病毒株中ge（糖蛋白e）的氨基酸序列。a151t突变在下面的序列中以粗体和斜体显示。[0232]mdrgavvgfllgvcvvsclagtpktswrrvsvgedvsllpapgptgrgptqkllwavepldgcgplhpswvslmppkqvpetvvdaacmrapvplamayappapsatgglrtdfvwqeraavvnrslvihgvretdsglytlsvgdikdptrqvasvvlvvqpapvptppptpadydeddndegedeslagtpasgtprlppppapprswpsapevshvrgvtvrmetpeailfspgetfstnvsihaiahddqtysmdvvwlrfdvptscaemriyesclyhpqlpeclspadapcaastwtsrlavrsyagcsrtnppprcsaeahmepvpglawqaasvnlefrdaspqhsglylcvvyvndhihawghitistaaqyrnavveqplpqrgadlaepthphvgapphappthgalrlgavmgaalllsalglsvwacmtcwrrrawravksrasgkgptyirvadselyadwssdsegerdqvpwlapperpdspstngsgfeilsptapsvyprsdghqsrrqlttfgsgrpdrrysqasdssvfwseqidno:14：17terma菌株中ge的dna序列。[0233]atggatcgcggggcggtggtggggtttcttctcggtgtttgtgttgtatcgtgcttggcgggaacgcccaaaacgtcctggagacgggtgagtgtcggcgaggacgtttcgttgcttccagctccggggcctacggggcgcggcccgacccagaaactactatgggccgtggaacccctggatgggtgcggccccttacacccgtcgtgggtctcgctgatgccccccaagcaggtgcccgagacggtcgtggatgcggcgtgcatgcgcgctccggtcccgctggcgatggcgtacgcccccccggccccatctgcgaccgggggtctacgaacggacttcgtgtggcaggagcgcgcggccgtggttaaccggagtctggttattcacggggtccgagagacggacagcggcctgtataccctgtccgtgggcgacataaaggacccggctcgccaagtggcctcggtggtcctggtggtgcaaccggccccagttccgaccccacccccgaccccagccgattacgacgaggatgacaatgacgagggcgaggacgaaagtctcgccggcactcccgccagcgggaccccccggctcccgcctccccccgcccccccgaggtcttggcccagcgcccccgaagtctcacatgtgcgtggggtgaccgtgcgtatggagactccggaagctatcctgttttcccccggggagacgttcagcacgaacgtctccatccatgccatcgcccacgacgaccagacctactccatggacgtcgtctggttgaggttcgacgtgccgacctcgtgtgccgagatgcgaatatacgaatcgtgtctgtatcacccgcagctcccagaatgtctgtccccggccgacgcgccgtgcgccgcgagtacgtggacgtctcgcctggccgtccgcagctacgcggggtgttccagaacaaaccccccaccgcgctgttcggccgaggctcacatggagcccgtcccggggctggcgtggcaggcggcctccgtcaatctggagttccgggacgcgtccccacaacactccggcctgtatctgtgtgtggtgtacgtcaacgaccatattcacgcctggggccacattaccatcagcaccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcccctcccacagcgcggcgcggatttggccgagcccacccacccgcacgtcggggcccctccccacgcgcccccaacccacggcgccctgcggttaggggcggtgatgggggccgccctgctgctgtctgcactggggttgtcggtgtgggcgtgtatgacctgttggcgcaggcgtgcctggcgggcggttaaaagcagggcctcgggtaaggggcccacgtacattcgcgtggccgacagcgagctgtacgcggactggagctcggacagcgagggagaacgcgaccaggtcccgtggctggcccccccggagagacccgactctccctccaccaatggatccggctttgagatcttatcaccaacggctccgtctgtatacccccgtagcgatgggcatcaatctcgccgccagctcacaacctttggatccggaaggcccgatcgccgttactcccaggcctccgattcgtccgtcttctggtaaseqidno:15：17terma菌株中ge的氨基酸序列。[0234]mdrgavvgfllgvcvvsclagtpktswrrvsvgedvsllpapgptgrgptqkllwavepldgcgplhpswvslmppkqvpetvvdaacmrapvplamayappapsatgglrtdfvwqeraavvnrslvihgvretdsglytlsvgdikdparqvasvvlvvqpapvptppptpadydeddndegedeslagtpasgtprlppppapprswpsapevshvrgvtvrmetpeailfspgetfstnvsihaiahddqtysmdvvwlrfdvptscaemriyesclyhpqlpeclspadapcaastwtsrlavrsyagcsrtnppprcsaeahmepvpglawqaasvnlefrdaspqhsglylcvvyvndhihawghitistaaqyrnavveqplpqrgadlaepthphvgapphappthgalrlgavmgaalllsalglsvwacmtcwrrrawravksrasgkgptyirvadselyadwssdsegerdqvpwlapperpdspstngsgfeilsptapsvyprsdghqsrrqlttfgsgrpdrrysqasdssvfwseqidno.16：rrp450菌株中ge的dna序列。[0235]atggatcgcggggcggtggtggggtttcttctcggtgtttgtgttgtatcgtgcttggcgggaacgcccaaaacgtcctggagacgggtgagtgtcggcgaggacgtttcgttgcttccagctccggggcctacggggcgcggcccgacccagaaactactatgggccgtggaacccctggatgggtgcggccccttacacccgtcgtgggtctcgctgatgccccccaagcaggtgcccgagacggtcgtggatgcggcgtgcatgcgcgctccggtcccgctggcgatggcgtacgcccccccggccccatctgcgaccgggggtctacgaacggacttcgtgtggcaggagcgcgcggccgtggttaaccggagtctggttattcacggggtccgagagacggacagcggcctgtataccctgtccgtgggcgacataaaggacccggctcgccaagtggcctcggtggtcctggtggtgcaaccggccccagttccgaccccacccccgaccccagccgattacgacgaggatgacaatgacgagggcgaggacgaaagtctcgccggcactcccgccagcgggaccccccggctcccgcctccccccgcccccccgaggtcttggcccagcgcccccgaagtctcacatgtgcgtggggtgaccgtgcgtatggagactccggaagctatcctgttttcccccggggagacgttcagcacgaacgtctccatccatgccatcgcccacgacgaccagacctactccatggacgtcgtctggttgaggttcgacgtgccgacctcgtgtgccgagatgcgaatatacgaatcgtgtctgtatcacccgcagctcccagaatgtctgtccccggccgacgcgccgtgcgccgcgagtacgtggacgtctcgcctggccgtccgcagctacgcggggtgttccagaacaaaccccccaccgcgctgttcggccgaggctcacatggagcccgtcccggggctggcgtggcaggcggcctccgtcaatctggagttccgggacgcgtccccacaacactccggcctgtatctgtgtgtggtgtacgtcaacgaccatattcacgcctggggccacattaccatcagcaccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcccctcccacagcgcggcgcggatttggccgagcccacccacccgcacgtcggggcccctccccacgcgcccccaacccacggcgccctgcggttaggggcggtgatgggggccgccctgctgctgtctgcgctggggttgtcggtgtgggcgtgtatgacctgttggcgcaggcgtgcctggcgggcggttaaaagcagggcctcgggtaaggggcccacgtacattcgcgtggccgacagcgagctgtacgcggactggagctcggacagcgagggagaacgcgaccaggtcccgtggctggcccccccggagagacccgactctccctccaccaatggatccggctttgagatcttatcaccaacggctccgtctgtatacccccgtagcgacgggcatcaatctcgccgccagctcacaacctttggatccggaaggcccgatcgccgttactcccaggcctccgattcgtccgtcttctggtaaseqidno.17：rrp450菌株中ge的氨基酸序列。[0236]mdrgavvgfllgvcvvsclagtpktswrrvsvgedvsllpapgptgrgptqkllwavepldgcgplhpswvslmppkqvpetvvdaacmrapvplamayappapsatgglrtdfvwqeraavvnrslvihgvretdsglytlsvgdikdparqvasvvlvvqpapvptppptpadydeddndegedeslagtpasgtprlppppapprswpsapevshvrgvtvrmetpeailfspgetfstnvsihaiahddqtysmdvvwlrfdvptscaemriyesclyhpqlpeclspadapcaastwtsrlavrsyagcsrtnppprcsaeahmepvpglawqaasvnlefrdaspqhsglylcvvyvndhihawghitistaaqyrnavveqplpqrgadlaepthphvgapphappthgalrlgavmgaalllsalglsvwacmtcwrrrawravksrasgkgptyirvadselyadwssdsegerdqvpwlapperpdspstngsgfeilsptapsvyprsdghqsrrqlttfgsgrpdrrysqasdssvfwseqidno.18：野生型17菌株中ge的dna序列。[0237]atggatcgcggggcggtggtggggtttcttctcggtgtttgtgttgtatcgtgcttggcgggaacgcccaaaacgtcctggagacgggtgagtgtcggcgaggacgtttcgttgcttccagctccggggcctacggggcgcggcccgacccagaaactactatgggccgtggaacccctggatgggtgcggccccttacacccgtcgtgggtctcgctgatgccccccaagcaggtgcccgagacggtcgtggatgcggcgtgcatgcgcgctccggtcccgctggcgatggcgtacgcccccccggccccatctgcgaccgggggtctacgaacggacttcgtgtggcaggagcgcgcggccgtggttaaccggagtctggttattcacggggtccgagagacggacagcggcctgtataccctgtccgtgggcgacataaaggacccggctcgccaagtggcctcggtggtcctggtggtgcaaccggccccagttccgaccccacccccgaccccagccgattacgacgaggatgacaatgacgagggcgaggacgaaagtctcgccggcactcccgccagcgggaccccccggctcccgcctccccccgcccccccgaggtcttggcccagcgcccccgaagtctcacatgtgcgtggggtgaccgtgcgtatggagactccggaagctatcctgttttcccccggggagacgttcagcacgaacgtctccatccatgccatcgcccacgacgaccagacctactccatggacgtcgtctggttgaggttcgacgtgccgacctcgtgtgccgagatgcgaatatacgaatcgtgtctgtatcacccgcagctcccagaatgtctgtccccggccgacgcgccgtgcgccgcgagtacgtggacgtctcgcctggccgtccgcagctacgcggggtgttccagaacaaaccccccaccgcgctgttcggccgaggctcacatggagcccgtcccggggctggcgtggcaggcggcctccgtcaatctggagttccgggacgcgtccccacaacactccggcctgtatctgtgtgtggtgtacgtcaacgaccatattcacgcctggggccacattaccatcagcaccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcccctcccacagcgcggcgcggatttggccgagcccacccacccgcacgtcggggcccctccccacgcgcccccaacccacggcgccctgcggttaggggcggtgatgggggccgccctgctgctgtctgcgctggggttgtcggtgtgggcgtgtatgacctgttggcgcaggcgtgcctggcgggcggttaaaagcagggcctcgggtaaggggcccacgtacattcgcgtggccgacagcgagctgtacgcggactggagctcggacagcgagggagaacgcgaccaggtcccgtggctggcccccccggagagacccgactctccctccaccaatggatccggctttgagatcttatcaccaacggctccgtctgtatacccccgtagcgacgggcatcaatctcgccgccagctcacaacctttggatccggaaggcccgatcgccgttactcccaggcctccgattcgtccgtcttctggtaaseqidno.19：野生型17菌株中ge的氨基酸序列。[0238]mdrgavvgfllgvcvvsclagtpktswrrvsvgedvsllpapgptgrgptqkllwavepldgcgplhpswvslmppkqvpetvvdaacmrapvplamayappapsatgglrtdfvwqeraavvnrslvihgvretdsglytlsvgdikdparqvasvvlvvqpapvptppptpadydeddndegedeslagtpasgtprlppppapprswpsapevshvrgvtvrmetpeailfspgetfstnvsihaiahddqtysmdvvwlrfdvptscaemriyesclyhpqlpeclspadapcaastwtsrlavrsyagcsrtnppprcsaeahmepvpglawqaasvnlefrdaspqhsglylcvvyvndhihawghitistaaqyrnavveqplpqrgadlaepthphvgapphappthgalrlgavmgaalllsalglsvwacmtcwrrrawravksrasgkgptyirvadselyadwssdsegerdqvpwlapperpdspstngsgfeilsptapsvyprsdghqsrrqlttfgsgrpdrrysqasdssvfwseqidno.20：mut3、mut‑3∆34.5和mut‑3∆icp6病毒株中icp0的dna序列。a848c（内含子内）和g1712a（用于r258h）突变在以下序列中以粗体和斜体显示。包括两个内含子（即以下序列的核苷酸（nt）58至nt861和nt1529至nt1663，也可参见括号内的序列）。[0239]atggagccccgccccggagcgagtacccgccggcctgagggccgcccccagcgcgag(gtgaggggccgggcgccatgtctggggcgccatgtctggggcgccatgtctggggcgccatgtctggggcgccatgttggggggcgccatgttggggggcgccatgttgggggacccccgacccttacactggaaccggccgccatgttgggggacccccactcatacacgggagccgggcgccatgttggggcgccatgttagggggcgtggaaccccgtgacactatatatacagggaccgggggcgccatgttagggggcgcggaaccccctgaccctatatatacagggaccggggtcgccctgttaggggtcgccatgtgaccccctgactttatatatacagacccccaacacctacacatggcccctttgactcagacgcagggcccggggtcgccgtgggacccccctgactcatacacagagacacgcccccacaacaaacacacagggaccggggtcgccgtgttagggggcgtggtccccactgactcatacgcagggcccccttactcacacgcatctaggggggtggggaggagccgcccgccatatttgggggacgccgtgggacccccgactccggtgcgtctggagggcgggagaagagggaagaagaggggtcgggatccaaaggacggacccagaccacctttggttgcagacccctttctcccccctcttccgaggccagcaggggggcaggactttgtgaggcggggggggagggggaactcgtgggcgctgattgacgcgggaaatccccccattcttacccgccccccctttttcccctcag)cccgccccggatgtctgggtgtttccctgcgaccgagacctgccggacagcagcgactcggaggcggagaccgaagtgggggggcggggggacgccgaccaccatgacgacgactccgcctccgaggcggacagcacggacacggaactgttcgagacggggctgctggggccgcagggcgtggatgggggggcggtctcgggggggagccccccccgcgaggaagaccccggcagttgcgggggcgccccccctcgagaggacggggggagcgacgagggcgacgtgtgcgccgtgtgcacggatgagatcgcgccccacctgcgctgcgacaccttcccgtgcatgcaccgcttctgcatcccgtgcatgaaaacctggatgcaattgcgcaacacctgcccgctgtgcaacgccaagctggtgtacctgatagtgggcgtgacgcccagcgggtcgttcagcaccatcccgatcgtgaacgacccccagacccgcatggaggccgaggaggccgtcagggcgggcacggccgtggactttatctggacgggcaatcagcggttcgccccgcggtacctgaccctgggggggcacacggtgagggccctgtcgcccacccacccggaacccaccacggacgaggatgacgacgacctggacgacg(gtgaggcggggggcggcaaggaccctgggggaggaggaggaggaggggggggagggaggaataggcgggcgggcgaggaaagggcgggccggggagggggcgtaacctgatcgcgccccccgttgtctcttgcag)cagactacgtaccgcccgccccccgccggacgccccgcgcccccccacacagaggcgccgccgcgccccccgtgacgggcggggcgtctcacgcagccccccagccggccgcggctcggacagcgcccccctcggcgcccatcgggccacacggcagcagtaacaccaacaccaccaccaacagcagcggcggcggcggctcccgccagtcgcgagccgcggcgccgcggggggcgtctggcccctccgggggggttggggttggggttggggttgttgaagcggaggcggggcggccgaggggccggacgggcccccttgtcaacagacccgccccccttgcaaacaacagagaccccatagtgatcagcgactcccccccggcctctccccacaggccccccgcggcgcccatgccaggctccgccccccgccccgggccccccgcgtccgcggccgcgtcgggacccgcgcgcccccgcgcggccgtggccccgtgcgtgcgagcgccgcctccggggcccggcccccgcgccccggcccccggggcggagccggccgcccgccccgcggacgcgcgccgtgtgccccagtcgcactcgtccctggctcaggccgcgaaccaagaacagagtctgtgccgggcgcgtgcgacggtggcgcgcggctcgggggggccgggcgtggagggtgggcacgggccctcccgcggcgccgccccctccggcgccgccccgctcccctccgccgcctctgtcgagcaggaggcggcggtgcgtccgaggaagaggcgcgggtcgggccaggaaaacccctccccccagtccacgcgtccccccctcgcgccggcaggggccaagagggcggcgacgcaccccccctccgactcagggccgggggggcgcggccagggtgggcccgggacccccctgacgtcctcggcggcctccgcctcttcctcctctgcctcttcctcctcggccccgacccccgcgggggccgcctcttccgccgccggggccgcgtcctcctccgcttccgcctcctcgggcggggccgtcggtgccctgggagggagacaagaggaaacctccctcggcccccgcgctgcttctgggccgcgggggccgaggaagtgtgcccggaagacgcgccacgcggaga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gagatcatcgggggccaggccagggagaccggcgacgaccggcccgttctgaccaagtctgcgggggagcggtttctgttgtaccgcccctcgaccaccaccaacagcggcctcatggcccccgatttgtacgtgtacgtggatcccgcgttcacggccaacacccgagcctccgggaccggcgtcgctgtcgtcgggcggtaccgcgacgattatatcatcttcgccctggagcacttttttctccgcgcgctcacgggctcggcccccgccgacatcgcccgctgcgtcgtccacagtctgacgcaggtcctggccctgcatcccggggcgtttcgcggcgtccgggtggcggtcgagggaaatagcagccaggactcggccgtcgccatcgccacgcacgtgcacacagagatgcaccgcctactggcctcggagggggccgacgcgggctcgggccccgagcttctcttctaccactgcgagcctcccgggagcgcggtgctgtacccctttttcctgctcaacaaacagaagacgcccgcctttgaacactttattaaaaagtttaactccgggggcgtcatggcctcccaggagatcgtttccgcgacggtgcgcctgcagaccgacccggtcgagtatctgctcgagcagctaaataacctcaccgaaaccgtctcccccaacactgacgtccgtacgtattccggaaaacggaacggcgcctcggatgaccttatggtcgccgtcattatggccatctacctcgcggcccaggccggacctccgcacacattcgctcctatcatacgcgtctcgtgaseqidno.36：mut‑3、mut‑3∆34.5和mut‑3∆icp6病毒株的dna包装末端酶亚基1的氨基酸序列。a376t突变在下面的序列中以粗体和斜体显示。[0256]mfgqqlasdvqqylerlekqrqlkvgadeasagltmggdalrvpfldfatatpkrhqtvvpgvgtlhdccehsplfsavarrllfnslvpaqlkgrdfggdhtakleflapelvravarlrfkecapadvvpqrnayysvlntfqalhrseafrqlvhfvrdfaqllktsfrassltettgppkkrakvdvathgrtygtlelfqkmilmhatyflaavllgdhaeqvntflrlvfeiplfsdaavrhfrqratvflvprrhgktwflvplialslasfrgikigytahirkatepvfeeidaclrgwfgsarvdhvkgetisfsfpdgsrstivfasshntngirgqdfnllfvdeanfirpdavqtimgflnqtnckiifvsstntgkastsflynlrgaadellnvvtyicddhmprvvthtnatacscyilnkpvfitmdgavrrtadlfladsfmqeiiggqaretgddrpvltksagerfllyrpstttnsglmapdlyvyvdpaftantrasgtgvavvgryrddyiifalehfflraltgsapadiarcvvhsltqvlalhpgafrgvrvavegnssqdsavaiathvhtemhrllasegadagsgpellfyhceppgsavlypffllnkqktpafehfikkfnsggvmasqeivsatvrlqtdpveylleqlnnltetvspntdvrtysgkrngasddlmvavimaiylaaqagpphtfapiirvsseqidno.37：17terma病毒株dna包装末端酶亚基1的dna序列。[0257]atgtttggtcagcagctggcgtccgacgtccagcagtacctggagcgcctcgagaaacagaggcaacttaaggtgggcgcggacgaggcgtcggcgggcctcaccatgggcggcgatgccctacgagtgccctttttagatttcgcgaccgcgacccccaagcgccaccagaccgtggtccctggcgtcgggacgctccacgactgctgcgagcactcgccgctcttctcggccgtggcgcggcggctgctgtttaatagcctggtgccggcgcaactaaaggggcgtgatttcgggggcgaccacacggccaagctggaattcctggcccccgagttggtacgggcggtggcgcgactgcggtttaaggagtgcgcgccggcggacgtggtgcctcagcgtaacgcctactatagcgttctgaatacgtttcaggccctccaccgctccgaagcctttcgccagctggtgcactttgtgcgggactttgcccagctgctcaaaacctccttccgggcctccagcctcacggagaccacgggcccccccaaaaaacgggccaaggtggacgtggccacccacggccggacgtacggcacgctggagctgttccaaaaaatgatccttatgcacgccacctactttctggccgccgtgctcctcggggaccacgcggagcaggtcaacacgttcctgcgtctcgtgtttgagatccccctgtttagcgacgcggccgtgcgccacttccgccagcgcgccaccgtgtttctcgtcccccggcgccacggcaagacctggtttctggtgcccctcatcgcgctgtcgctggcctcctttcgggggatcaagatcggctacacggcgcacatccgcaaggcgaccgagccggtgtttgaggagatcgacgcctgcctgcggggctggttcggttcggcccgagtggaccacgttaaaggggaaaccatctccttctcgtttccggacgggtcgcgcagtaccatcgtgtttgcctccagccacaacacaaacggaatccgaggccaggactttaacctgctctttgtcgacgaggccaactttattcgcccggatgcggtccagacgattatgggctttctcaaccaggccaactgcaagattatcttcgtgtcgtccaccaacaccgggaaggccagtacgagctttttgtacaacctccgcggggccgcagacgagcttctcaacgtggtgacctatatatgcgatgatcacatgccgagggtggtgacgcacacaaacgccacggcctgttcttgttatatcctcaacaagcccgttttcatcacgatggacggggcggttcgccggaccgccgatttgtttctggccgattccttcatgcaggagatcatcgggggccaggccagggagaccggcgacgaccggcccgttctgaccaagtctgcgggggagcggtttctgttgtaccgcccctcgaccaccaccaacagcggcctcatggcccccgatttgtacgtgtacgtggatcccgcgttcacggccaacacccgagcctccgggaccggcgtcgctgtcgtcgggcggtaccgcgacgattatatcatcttcgccctggagcacttttttctccgcgcgctcacgggctcggcccccgccgacatcgcccgctgcgtcgtccacagtctgacgcaggtcctggccctgcatcccggggcgtttcgcggcgtccgggtggcggtcgagggaaatagcagccaggactcggccgtcgccatcgccacgcacgtgcacacagagatgcaccgcctactggcctcggagggggccgacgcgggctcgggccccgagcttctcttctaccactgcgagcctcccgggagcgcggtgctgtacccctttttcctgctcaacaaacagaagacgcccgcctttgaacactttattaaaaagtttaactccgggggcgtcatggcctcccaggagatcgtttccgcgacggtgcgcctgcagaccgacccggtcgagtatctgctcgagcagctaaataacctcaccgaaaccgtctcccccaacactgacgtccgtacgtattccggaaaacggaacggcgcctcggatgaccttatggtcgccgtcattatggccatctacctcgcggcccaggccggacctccgcacacattcgctcctatcatacgcgtctcgtgaseqidno.38：17terma病毒株dna包装末端酶亚基1的氨基酸序列。[0258]mfgqqlasdvqqylerlekqrqlkvgadeasagltmggdalrvpfldfatatpkrhqtvvpgvgtlhdccehsplfsavarrllfnslvpaqlkgrdfggdhtakleflapelvravarlrfkecapadvvpqrnayysvlntfqalhrseafrqlvhfvrdfaqllktsfrassltettgppkkrakvdvathgrtygtlelfqkmilmhatyflaavllgdhaeqvntflrlvfeiplfsdaavrhfrqratvflvprrhgktwflvplialslasfrgikigytahirkatepvfeeidaclrgwfgsarvdhvkgetisfsfpdgsrstivfasshntngirgqdfnllfvdeanfirpdavqtimgflnqanckiifvsstntgkastsflynlrgaadellnvvtyicddhmprvvthtnatacscyilnkpvfitmdgavrrtadlfladsfmqeiiggqaretgddrpvltksagerfllyrpstttnsglmapdlyvyvdpaftantrasgtgvavvgryrddyiifalehfflraltgsapadiarcvvhsltqvlalhpgafrgvrvavegnssqdsavaiathvhtemhrllasegadagsgpellfyhceppgsavlypffllnkqktpafehfikkfnsggvmasqeivsatvrlqtdpveylleqlnnltetvspntdvrtysgkrngasddlmvavimaiylaaqagpphtfapiirvsseqidno.39：rrp450病毒株的dna包装末端酶亚基1的dna序列。[0259]atgtttggtcagcagctggcgtccgacgtccagcagtacctggagcgcctcgagaaacagaggcaacttaaggtgggcgcggacgaggcgtcggcgggcctcacaatgggcggcgatgccctacgagtgccctttttagatttcgcgaccgcgacccccaagcgccaccagaccgtggtcccgggcgtcgggacgctccacgactgctgcgagcactcgccgctcttctcggccgtggcgcggcggctgctgtttaatagcctggtgccggcg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列。[0262]mfgqqlasdvqqylerlekqrqlkvgadeasagltmggdalrvpfldfatatpkrhqtvvpgvgtlhdccehsplfsavarrllfnslvpaqlkgrdfggdhtakleflapelvravarlrfkecapadvvpqrnayysvlntfqalhrseafrqlvhfvrdfaqllktsfrassltettgppkkrakvdvathgrtygtlelfqkmilmhatyflaavllgdhaeqvntflrlvfeiplfsdaavrhfrqratvflvprrhgktwflvplialslasfrgikigytahirkatepvfeeidaclrgwfgsarvdhvkgetisfsfpdgsrstivfasshntngirgqdfnllfvdeanfirpdavqtimgflnqanckiifvsstntgkastsflynlrgaadellnvvtyicddhmprvvthtnatacscyilnkpvfitmdgavrrtadlfladsfmqeiiggqaretgddrpvltksagerfllyrpstttnsglmapdlyvyvdpaftantrasgtgvavvgryrddyiifalehfflraltgsapadiarcvvhsltqvlalhpgafrgvrvavegnssqdsavaiathvhtemhrllasegadagsgpellfyhceppgsavlypffllnkqktpafehfikkfnsggvmasqeivsatvrlqtdpveylleqlnnltetvspntdvrtysgkrngasddlmvavimaiylaaqagpphtfapiirvsseqidno.43：mut‑3和mut‑3∆34.5病毒株中icp6的dna序列。该序列与在野生型17菌株中的序列相同。[0263]atggccagccgcccagccgcatcctctcccgtcgaagcgcgggccccggttgggggacaggaggccggcggccccagcgcagccacccagggggaggccgccggggcccctctcgcccacggccaccacgtgtactgccagcgagtcaatggcgtgatggtgctttccgacaagacgcccgggtccgcgtcctaccgcatcagcgatagcaactttgtccaatgtggttccaactgcaccatgatcatcgacggagacgtggtgcgcgggcgcccccaggacccgggggccgcggcatcccccgctcccttcgttgcggtgacaaacatcggagccggcagcgacggcgggaccgccgtcgtggcattcgggggaaccccacgtcgctcggcggggacgtctaccggtacccagacggccgacgtccccaccgaggcccttgggggcccccctcctcctccccgcttcaccctgggtggcggctgttgttcctgtcgcgacacacggcgccgctctgcggtattcgggggggagggggatccagtcggccccgcggagttcgtctcggacgaccggtcgtccgattccgactcggatgactcggaggacacggactcggagacgctgtcacacgcctcctcggacgtgtccggcggggccacgtacgacgacgcccttgactccgattcgtcatcggatgactccctgcagatagatggccccgtgtgtcgcccgtggagcaatgacaccgcgcccctggatgtttgccccgggacccccggcccgggcgccgacgccggtggtccctcagcggtagacccacacgcgccgacgccagaggccggcgctggtcttgcggccgatcccgccgtggcccgggacgacgcggaggggctttcggacccccggccacgtctgggaacgggcacggcctaccccgtccccctggaactcacgcccgagaacgcggaggccgtggcgcgctttctgggagatgccgtgaaccgcgaacccgcgctcatgctggagtacttttgccggtgcgcccgcgaggaaaccaagcgtgtcccccccaggacattcggcagcccccctcgcctcacggaggacgactttgggcttctcaactacgcgctcgtggagatgcagcgcctgtgtctggacgttcctccggtcccgccgaacgcatacatgccctattatctcagggagtatgtgacgcggctggtcaacgggttcaagccgctggtgagccggtccgctcgcctttaccgcatcctgggggttctggtgcacctgcggatccggacccgggaggcctcctttgaggagtggctgcgatccaaggaagtggccctggattttggcctgacggaaaggcttcgcgagcacgaagcccagctggtgatcctggcccaggctctggaccattacgactgtctgatccacagcacaccgcacacgctggtcgagcgggggctgcaatcggccctgaagtatgaggagttttacctaaagcgttttggcgggcactacatggagtccgtcttccagatgtacacccgcatcgccggctttttggcctgccgggccacgcgcggcatgcgccacatcgccctggggcgagaggggtcgtggtgggaaatgttcaagttctttttccaccgcctctacgaccaccagatcgtaccgtcgacccccgccatgctgaacctggggacccgcaactactacacctccagctgctacctggtaaacccccaggccaccacaaacaaggcgaccctgcgggccatcaccagcaacgtcagtgccatcctcgcccgcaacgggggcatcgggctatgcgtgcaggcgtttaacgactccggccccgggaccgccagcgtcatgcccgccctcaaggtccttgactcgctggtggcggcgcacaacaaagagagcgcgcgtccgaccggcgcgtgcgtgtacctggagccgtggcacaccgacgtgcgggccgtgctccggatgaagggggtcctcgccggcgaagaggcccagcgctgcgacaatatcttcagcgccctctggatgccagacctgtttttcaagcgcctgattcgccacctggacggcgagaagaacgtcacatggaccctgttcgaccgggacaccagcatgtcgctcgccgactttcacggggaggagttcgagaagctctaccagcacctcgaggtcatggggttcggcgagcagatacccatccaggagctggcctatggcattgtgcgcagtgcggccacgaccgggagccccttcgtcatgttcaaagacgcggtgaaccgccactacatctacgacacccagggggcggccatcgccggctccaacctctgcaccgagatcgtccatccggcctccaagcgatccagtggggtctgcaacctgggaagcgtgaatctggcccgatgcgtctccaggcagacgtttgactttgggcggctccgcgacgccgtgcaggcgtgcgtgctgatggtgaacatcatgatcgacagcacgctacaacccacgccccagtgcacccgcggcaacgacaacctgcggtccatgggaatcggcatgcagggcctgcacacggcctgcctgaagctggggctggatctggagtctgtcgaatttcaggacctgaacaaacacatcgccgaggtgatgctgctgtcggcgatgaagaccagcaacgcgctgtgcgttcgcggggcccgtcccttcaaccactttaagcgcagcatgtatcgcgccggccgctttcactgggagcgctttccggacgcccggccgcggtacgagggcgagtgggagatgctacgccagagcatgatgaaacacggcctgcgcaacagccagtttgtcgcgctgatgcccaccgccgcctcggcgcagatctcggacgtcagcgagggctttgcccccctgttcaccaacctgttcagcaaggtgacccgggacggcgagacgctgcgccccaacacgctcctgctaaaggaactggaacgcacgtttagcgggaagcgcctcctggaggtgatggacagtctcgacgccaagcagtggtccgtggcgcaggcgctcccgtgcctggagcccacccaccccctccggcgattcaagaccgcgtttgactacgaccagaagttgctgatcgacctgtgtgcggaccgcgccccctacgtcgaccatagccaatccatgaccctgtatgtcacggagaaggcggacgggaccctcccagcctccaccctggtccgccttctggtccacgcatataagcgcggactaaaaacagggatgtactactgcaaggttcgcaaggcgaccaacagcggggtctttggcggcgacgacaacattgtctgcacgagctgcgcgctgtgaseqidno.44：mut3和mut‑3∆34.5病毒株中icp6的氨基酸序列。[0264]masrpaasspvearapvggqeaggpsaatqgeaagaplahghhvycqrvngvmvlsdktpgsasyrisdsnfvqcgsnctmiidgdvvrgrpqdpgaaaspapfvavtnigagsdggtavvafggtprrsagtstgtqtadvptealggppppprftlgggccscrdtrrrsavfggegdpvgpaefvsddrssdsdsddsedtdsetlshassdvsggatyddaldsdsssddslqidgpvcrpwsndtapldvcpgtpgpgadaggpsavdphaptpeagaglaadpavarddaeglsdprprlgtgtaypvpleltpenaeavarflgdavnrepalmleyfcrcareetkrvpprtfgspprlteddfgllnyalvemqrlcldvppvppnaympyylreyvtrlvngfkplvsrsarlyrilgvlvhlrirtreasfeewlrskevaldfglterlreheaqlvilaqaldhydclihstphtlverglqsalkyeefylkrfgghymesvfqmytriagflacratrgmrhialgregswwemfkfffhrlydhqivpstpamlnlgtrnyytsscylvnpqattnkatlraitsnvsailarnggiglcvqafndsgpgtasvmpalkvldslvaahnkesarptgacvylepwhtdvravlrmkgvlageeaqrcdnifsalwmpdlffkrlirhldgeknvtwtlfdrdtsmsladfhge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krglktgmyyckvrkatnsgvfggddnivcmscalseqidno.47：rrp450菌株中大鼠细胞色素p4502b1的dna序列。[0267]gaaccccttcgccatggagcccagtatcttgctcctccttgctctccttgtgggcttcttgttactcttagtcaggggacacccaaagtcccgtggcaacttcccaccaggacctcgtccccttcccctcttggggaacctcctgcagttggacagagggggcctcctcaattccttcatgcagcttcgagaaaaatatggagatgtgttcacagtacacctgggaccaaggcctgtggtcatgctatgtgggacagacaccataaaggaggctctggtgggccaagctgaggatttctctggtcggggaacaatcgctgtgattgagccaatcttcaaggaatatggtgtgatctttgccaatggggaacgctggaaggcccttcggcgattctctctggctaccatgagagactttgggatgggaaagaggagtgtggaagaacggattcaggaggaagcccaatgtttggtggaggaactgcggaaatcccagggagccccactggatcccaccttcctcttccagtgcatcacagccaacatcatctgctccattgtgtttggagagcgctttgactacacagaccgccagttcctgcgcctgttggagctgttctaccggaccttttccctcctaagttcattctccagccaggtgtttgagttcttctctgggttcctgaaatactttcctggtgcccacagacaaatctccaaaaacctccaggaaatcctcgattacattggccatattgtggagaagcacagggccaccttagacccaagcgctccacgagacttcatcgacacttaccttctgcgcatggagaaggagaagtcgaaccaccacacagagttccatcatgagaacctcatgatctccctgctctctctcttctttgctggcactgagaccagcagcaccacactccgctatggtttcctgctgatgctcaagtacccccatgtcgcagagaaagtccaaaaggagattgatcaggtgatcggctcacaccggctaccaacccttgatgaccgcagtaaaatgccatacactgatgcagttatccatgagattcagaggttttcagatcttgtccctattggagtaccacacagagtcaccaaagacaccatgttccgagggtacctgcttcccaagaacactgaagtgtaccccatcctgagttcagctctccatgacccacagtactttgaccacccagacagcttcaatcctgaacacttcctggatgccaatggggcactgaaaaagagtgaagctttcatgcccttctccacaggaaagcgcatttgtcttggcgaaggcattgcccgaaatgaattgttcctcttcttcaccaccatcctccagaacttctctgtgtcaagccatttggctcccaaggacattgacctcacgcccaaggagagtggcattggaaaaatacctccaacgtaccagatctgcttctcagctcggtgatccggctgaggcagccatgtgccccagttctgttgggaatggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatccccgggcgagctcgaattcctcctttgaggagtggctgcgatccaaggaagtggccctggactttggcctgacggaaaggcttcgcgagcacgaagcccagctggtgatcctggcccaggctctggaccattacgactgtctgatccacagcacaccgcacacgctggtcgagcgggggctgcaatcggccctgaagtatgaggagttttacctaaagcgctttggcgggcactacatggagtccgtcttccagatgtacacccgcatcgccggctttttggcctgccgggccacgcgcggcatgcgccacatcgccctggggcgagaggggtcgtggtgggaaatgttcaagttctttttccaccgcctctacgaccaccagatcgtaccgtcgacccccgccatgctgaacctggggacccgcaactactacacctccagctgctacctggtaaacccccaggccaccacaaacaaggcgaccctgcgggccatcaccagcaacgtcagcgccatcctcgcccgcaacgggggcatcgggctatgcgtgcaggcgtttaacgactccggccccgggaccgctagcgtcatacccgccctcaaggtcctcgactcgctggtggcggcgcacaacaaagagagcgcgcgtccaaccggcgcgtgcgtgtacctggagccgtggcacaccgacgtgcgggccgtgctccggatgaagggggtcctcgccggcgaagaggcccagcgctgcgacaatatcttcagcgccctctggatgccagacctgtttttcaagcgcctgattcgccacctggacggcgagaagaacgtcacatggaccctgttcgaccgggacaccagcatgtcgctcgccgactttcacggggaggagttcgagaagctctaccagcacctcgaggtcatggggttcggcgagcagatacccatccaggagctggcctatggcattgtgcgcagtgcggccacgaccgggagccccttcgtcatgttcaaagacgcggtgaaccgccactacatctacgacacccagggggcggccatcgccggctccaacctctgcaccgagatcgtccatccggcctccaagcgatccagtggggtctgcaatctgggaagcgtgaatctggcccgatgcgtctccaggcagacgtttgactttgggcggctccgcgacgccgtgcaggcgtgcgtgctgatggtgaacatcatgatcgacagcacgctacaacccacgccccagtgcacccgcggcaacgacaacctgcggtccatgggaatcggcatgcagggcctgcacacggcctgcctgaagctggggctggatctggagtctgtcgaatttcaggacctgaacaaacacatcgccgaggtgatgctgctgtcggcgatgaagaccagcaacgcgctgtgcgttcgcggggcccgtcccttcaaccactttaagcgcagcatgtatcgcgccggccgctttcactgggagcgctttccggacgcccggccgcggtacgagggcgagtgggagatgctacgccagagcatgatgaaacacggcctgcgcaacagccagtttgtcgcgctgatgcccaccgccgcctcggcgcagatctcggacgtcagcgagggctttgcccccctgttcaccaacctgttcagcaaggtgacccgggacggcgagacgctgcgccccaacacgctcctgctaaaggaactggaacgcacgtttagcgggaagcgcctcctggaggtgatggacagtctcgacgccaagcagtggtccgtggcgcaggcgctcccgtgcctggagcccacccaccccctccggcgattcaagaccgcgtttgactacgaccagaagttgctgatcgacctgtgtgcggaccgcgccccctacgtcgaccatagccaatccatgaccctgtatgtcacggagaaggcggacgggaccctcccagcctccaccctggtccgccttctggtccacgcatataagcgcggactaaaaacagggatgtactactgcaaggttcgcaaggcgaccaacagcggggtctttggcggcgacgacaacattgtctgcacgagctgcgcgctgtgaseqidno.48：rrp450菌株中大鼠细胞色素p4502b1的氨基酸序列。[0268]mepsillllallvgfllllvrghpksrgnfppgprplpllgnllqldrggllnsfmqlrekygdvftvhlgprpvvmlcgtdtikealvgqaedfsgrgtiaviepifkeygvifangerwkalrrfslatmrdfgmgkrsveeriqeeaqclveelrksqgapldptflfqcitaniicsivfgerfdytdrqflrllelfyrtfsllssfssqvfeffsgflkyfpgahrqisknlqeildyighivekhratldpsaprdfidtyllrmekeksnhhtefhhenlmisllslffagtetssttlrygfllmlkyphvaekvqkeidqvigshrlptlddrskmpytdaviheiqrfsdlvpigvphrvtkdtmfrgyllpkntevypilssalhdpqyfdhpdsfnpehfldangalkkseafmpfstgkriclgegiarnelflffttilqnfsvsshlapkdidltpkesgigkipptyqicfsar**终止密码子–预测*之后的序列不表达seqidno.49：野生型17菌株中icp6的dna序列。[0269]atggccagccgcccagccgcatcctctcccgtcgaagcgcgggccccggttgggggacaggaggccggcggccccagcgcagccacccagggggaggccgccggggcccctctcgcccacggccaccacgtgtactgccagcgagtcaatggcgtgatggtgctttccgacaagacgcccgggtccgcgtcctaccgcatcagcgatagcaactttgtccaatgtggttccaactgcaccatgatcatcgacggagacgtggtgcgcgggcgcccccaggacccgggggccgcggcatcccccgctcccttcgttgcggtgacaaacatcggagccggcagcgacggcgggaccgccgtcgtggcattcgggggaaccccacgtcgctcggcggggacgtctaccggtacccagacggccgacgtccccaccgaggcccttgggggcccccctcctcctccccgcttcaccctgggtggcggctgttgttcctgtcgcgacacacggcgccgctctgcggtattcgggggggagggggatccagtcg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