多呼吸道病毒抗原特异性T细胞及其制备方法和治疗上的使用方法

多呼吸道病毒抗原特异性t细胞及其制备方法和治疗上的使用方法
1.对相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年3月25日提交的美国临时申请号62/823,446的优先权，该申请通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开的实施例至少涉及细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学领域。


背景技术：

4.病毒感染是同种异体造血干细胞移植(allo
‑
hsct)后发病和死亡的严重原因，同种异体造血干细胞移植是多种疾病的首选治疗方法。然而，移植后，移植物抗宿主病(gvhd)、原发疾病复发和病毒感染仍然是发病和死亡的主要原因。在多达40％的同种异体造血干细胞移植接受者中检测到由社区获得性呼吸道病毒(包括呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒和人偏肺病毒)引起的呼吸道感染，在这些接受者中他们引起肺炎和毛细支气管炎等严重症状，并可致命。其他呼吸道病毒，包括腺病毒(adv)、鼻病毒和冠状病毒株，包括sars
‑
cov、sars
‑
cov
‑
2、mers
‑
cov、以及通常感染免疫功能低下患者的地方性cov也会引起严重症状，尤其是在免疫功能低下的个体中，最近的sars
‑
cov2大流行清楚地暴露了我们在治疗和预防此类感染方面准备不足。鉴于缺乏有效的抗病毒以及我们组的数据表明过继转移的离体扩增的病毒特异性t细胞在临床上对治疗潜伏的(爱泼斯坦
‑
巴尔病毒、巨细胞病毒、bk病毒、人类疱疹病毒6)和裂解的(腺病毒)病毒都有益，我们研究了将这种免疫治疗方法扩展到呼吸道病毒的潜力。尽管可用于某些病毒，但抗病毒并不总是有效，这凸显了对新疗法的需求。治疗这些病毒感染的一种策略是采用过继性t细胞转移，即从健康供体的外周血离体扩增病毒特异性t细胞(vst)，然后注入感染病毒的个体，例如干细胞移植接受者。
5.已证明当将体外扩增的供体来源和第三方病毒特异性t细胞(靶向adv、ebv、cmv、bk、hhv6)过继转移到具有病毒感染的干细胞移植患者时是安全的。病毒特异性t细胞重建了adv、ebv、cmv、bk和hhv6的抗病毒免疫，可有效清除疾病，并在体内表现出相当大的扩增。过继转移体外扩增的病毒特异性t细胞也已被证明是安全的，并且当过继转移给患者时与临床益处相关。
6.本公开内容的实施方案通过施用离体扩增的、非遗传修饰的、病毒特异性t细胞来控制病毒感染和改善/消除一种或多种疾病症状来提供针对某些病毒的疗法，从而满足了本领域的长期需求。
7.实施方案概述
8.在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含识别多种病毒抗原的病毒特异性t淋巴细胞(vst)的多克隆群体，其中所述多种病毒抗原包含至少一种来自piv的第一抗原和至少一种来自一种或多种第二病毒的第二抗原。在一些实施方案中，病毒特异性t
细胞是通过将外周血单核细胞(pbmc)与多种肽混合物文库接触而产生的，每种肽混合物文库包含跨越病毒抗原的至少一部分的多种重叠肽，其中多种肽混合物文库中的至少一种跨越来自piv
‑
3的第一抗原，并且其中多种肽混合物文库中的至少一种额外的肽混合物文库跨越每种第二抗原。在一些实施例中，病毒特异性t细胞是通过将t细胞与用多种肽混合物文库引发的树突细胞(dc)接触而产生的，每种肽混合物文库包含跨越病毒抗原的至少一部分的多种重叠肽，其中多种肽混合物中的至少一种跨越来自piv
‑
3的第一抗原并且其中多种肽混合物文库中的至少一种额外的肽混合物文库跨越每种第二抗原。在一些实施方案中，通过将t细胞与用至少一种编码piv
‑
3抗原的dna质粒和至少一种编码每种第二抗原的dna质粒核转染的树突细胞(dc)接触来产生病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，质粒编码至少一种piv
‑
3抗原和第二抗原中的至少一种。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞包含cd4+t淋巴细胞和cd8+t淋巴细胞。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞表达αβt细胞受体。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞包含mhc限制性t淋巴细胞。在一些实施方案中，一种或多种第二病毒选自呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒、人偏肺病毒(hmpv)及其组合。在一些实施方案中，一种或多种第二病毒包括呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒、人偏肺病毒及其组合。在一些实施方案中，一种或多种第二病毒由呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒、人偏肺病毒及其组合组成。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3或4种第一抗原。在一些实施方案中，第一抗原选自piv
‑
3抗原m、piv
‑
3抗原hn、piv
‑
3抗原n、piv
‑
3抗原f及其组合。在一些实施方案中，4种第一抗原如下：piv
‑
3抗原m、piv
‑
3抗原hn、piv
‑
3抗原n和piv
‑
3抗原f。在一些实施方案中，组合物包含两种或三种第二病毒。在一些实施方案中，组合物包含三种第二病毒。在一些实施方案中，三种第二病毒是流感病毒、rsv和hmpv。在一些实施方案中，所述组合物对每种第二病毒包含至少两种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7或8种第二抗原。在一些实施方案中，第二抗原选自流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f、hmpv抗原n和及其组合。在一些实施方案中，第二抗原包括流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1或两者。在一些实施方案中，第二抗原包括rsv抗原n、rsv抗原f或两者。在一些实施方案中，第二抗原包括hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f、hmpv抗原n及其组合。在一些实施方案中，第二抗原包含流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f、hmpv抗原n中的每种。在一些实施方案中，多种抗原包括piv
‑
3抗原m、piv
‑
3抗原hn、piv
‑
3抗原n、piv
‑
3抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n。在一些实施方案中，多种抗原由或基本上由piv
‑
3抗原m、piv
‑
3抗原hn、piv
‑
3抗原n、piv
‑
3抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n组成。在一些实施方案中，在il
‑
7和il
‑
4两者存在的情况下离体培养病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，多病毒病毒特异性t细胞在培养的9
‑
18天内已充分扩增，以便它们准备好施用于受试者。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞表现出一种或多种选自以下的特性：(a)可忽略的同种异体反应性；(b)从患者采集的抗原特异性t细胞的活化诱导的细胞死亡比从同一患者采集、但没有在il
‑
7和il
‑
4两者存在下培养的相应抗原特异性t细胞更少；和(c)存活率大于70％。在一些实施方案中，组合物在培养中至少7天对细菌和真菌呈阴性；内毒素低于5eu/ml，支原体呈阴性。在一些实施方案中，前混合物是化学合成的，并且任选地>90％纯。在一
些实施方案中，病毒特异性t细胞是th1极化的。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞能够裂解表达病毒抗原的靶细胞。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞不会显著溶解未感染的自体或同种异体靶细胞。
9.本公开还提供了一种药物组合物，其包含本文公开的任一种组合物，配制用于静脉内递送，其中所述组合物在培养中至少7天对细菌和真菌呈阴性；内毒素低于5eu/ml，对支原体呈阴性。例如，在一些实施方案中，本公开提供了包含识别多种病毒抗原的病毒特异性t淋巴细胞(病毒特异性t细胞)的多克隆群体的药物组合物，其中所述多种病毒抗原包含至少一种来自piv的第一抗原和至少一种来自一种或多种第二病毒的第二抗原。在一些实施方案中，第二病毒包括呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒和人偏肺病毒。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞是通过将外周血单核细胞(pbmc)与多种肽混合物文库接触而产生的，每种肽混合物文库包含跨越病毒抗原的至少一部分的多种重叠肽，其中多种肽混合物文库中的至少一种跨越来自piv
‑
3的第一抗原，并且其中多种肽混合物文库中的至少一种额外的肽混合物文库跨越每种第二抗原，其中所述药物组合物被配制用于静脉内递送，其中所述组合物在培养中至少7天对细菌和真菌呈阴性；内毒素低于5eu/ml，支原体呈阴性。
10.本公开还提供了一种用本文公开的任何一种或多种组合物或药物组合物裂解靶细胞的方法。例如，在一些实施方案中，本公开提供了一种裂解靶细胞的方法，包括使靶细胞与识别多种病毒抗原的病毒特异性t淋巴细胞(病毒特异性t细胞)的多克隆群体接触，其中所述多种病毒抗原包含至少一种来自piv的第一抗原和至少一种来自一种或多种第二病毒的第二抗原。在一些实施方案中，第二病毒包括呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒和人偏肺病毒。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞是通过将外周血单核细胞(pbmc)与多种肽混合物文库接触而产生的，每种肽混合物文库包含跨越病毒抗原的至少一部分的多种重叠肽，其中所述多种肽混合物文库中的至少一种跨越来自piv
‑
3的第一抗原并且其中所述多种肽混合物的至少一种额外的肽混合物文库跨越每种第二抗原。在一些实施方案中，接触在受试者体内发生。在一些实施方案中，接触通过向受试者施用病毒特异性t细胞而在体内发生。
11.本公开还提供了一种治疗或预防病毒感染的方法，包括向有需要的受试者施用本文公开的任何一种或多种组合物或药物组合物。例如，在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗或预防病毒感染的方法，包括向有需要的受试者施用识别多种病毒抗原的病毒特异性t淋巴细胞(病毒特异性t细胞)的多克隆群体，其中多种病毒抗原包含至少一种来自piv的第一抗原和至少一种来自一种或多种第二病毒的第二抗原。在一些实施方案中，第二病毒包括呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒和人偏肺病毒。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞是通过将外周血单核细胞(pbmc)与多种肽混合物文库接触而产生的，每种肽混合物文库包含跨越病毒抗原的至少一部分的多种重叠肽，其中多种肽混合物文库中的至少一种跨越来自piv
‑
3的第一抗原，并且其中多种肽混合物文库中的至少一种额外的肽混合物文库跨越每种第二抗原。在一些实施方案中，向受试者施用5x106至5x107个病毒特异性t细胞/m2。在一些实施方案中，以多剂量向受试者施用病毒特异性t细胞。在一个实施方案中，向受试者施用病毒特异性t细胞，然后监测受试者的病毒载量，如果病毒载量增加，则向受试者施用第二剂病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，受试者免疫功能低下。在一些实施方案中，受试者患有急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性肉芽肿病。在一些实施方案中，受
试者在接受病毒特异性t细胞之前接受：(a)进行降低强度预处理(conditioning)的匹配的相关供体移植；(b)进行清髓预处理的匹配的无关供体移植；(c)进行降低强度预处理的半相合(haplo
‑
identical)移植；或(d)进行清髓预处理的匹配的相关供体移植。在一些实施方案中，受试者(a)已接受实体器官移植；(b)已接受化疗；(c)具有hiv感染；(d)有遗传免疫缺陷；和/或(e)已接受同种异体干细胞移植。在一些实施方案中，多次向受试者施用组合物。在一些实施方案中，组合物的施用有效治疗或预防受试者的病毒感染，其中病毒感染选自副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、流感病毒、人偏肺病毒及其组合。在一些实施方案中，受试者是人。
12.本公开还提供包含识别多种病毒抗原的病毒特异性t细胞的多克隆群体的组合物，其中所述多种病毒抗原包含至少一种选自以下的抗原：副流感病毒3型(piv
‑
3)、呼吸道合胞病毒、流感病毒、人偏肺病毒及其组合。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞识别多种病毒抗原，其中所述多种病毒抗原包含来自副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、流感病毒和人偏肺病毒中的每种的至少一种抗原。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞识别多种病毒抗原，其中多种病毒抗原包含来自副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、流感病毒和人偏肺病毒中的每种的至少两种抗原。在一些实施方案中，多种抗原包含下述、由以下组成或基本上由以下组成：piv
‑
3抗原m、piv
‑
3抗原hn、piv
‑
3抗原n、piv
‑
3抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n。在一些实施方案中，组合物是配制用于静脉内递送的药物组合物。在一些实施方案中，组合物在培养中至少7天对细菌和真菌呈阴性；内毒素低于5eu/ml，支原体呈阴性。
13.本公开还提供了裂解靶细胞的方法，包括使靶细胞与包含识别多种病毒抗原的病毒特异性t细胞的多克隆群体的组合物接触，其中多种病毒抗原包含选自副流感病毒3型(piv
‑
3)、呼吸道合胞病毒、流感病毒和人偏肺病毒的至少一种抗原。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，接触在受试者体内发生。在一些实施方案中，接触通过向受试者施用病毒特异性t细胞而在体内发生。
14.本公开还提供了一种治疗或预防病毒感染的方法，包括向有需要的受试者细胞施用包含识别多种病毒抗原的病毒特异性t细胞的多克隆群体的组合物，其中所述多种病毒抗原包含选自副流感病毒3型(piv
‑
3)、呼吸道合胞病毒、流感病毒和人偏肺病毒的至少一种抗原。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，向受试者多次施用组合物。在一些实施方案中，组合物的施用有效地治疗或预防受试者的病毒感染，其中病毒感染选自副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、流感病毒和人偏肺病毒。在一些实施方案中，受试者是人。
15.附图的简要说明
16.图1：从健康供体生成多克隆多呼吸道病毒特异性t细胞(多呼吸道病毒特异性t细胞)。图1a显示了多呼吸道病毒特异性t细胞生成方案的示意图。图1b显示了基于使用台盼蓝排除法的细胞计数(n＝12)在10天期间实现的倍数扩增。制备进行可能需要约10
‑
18天。图1c和图1d显示了扩增细胞(平均值
±
sem，n＝12)的表型。图1e显示扩增的cd4+t细胞群体中treg(cd4+cd25+foxp3+)的最小检测(平均值
±
sem，n＝8)。
17.图2：多呼吸道病毒特异性t细胞的特异性和富集。图2a显示了在暴露于来自每种靶病毒的个体刺激抗原之后扩增的t细胞系内的病毒反应性t细胞的特异性。数据表示为平
均值
±
sem sfc/2
×
105(n＝12)。图2b显示了特异性的倍数富集(pbmc与多呼吸道病毒特异性t细胞；n＝12)。图2c显示了ifnγ产生，如在1个代表性供体中通过病毒刺激后来自cd4辅助(顶部)和cd8细胞毒性t细胞(底部)的ics评估的(点图在cd3+细胞上圈门)，而图2d显示了筛选的9个供体的汇总结果(平均值
±
sem)。图2e显示响应个体刺激抗原的供体衍生的病毒特异性t细胞细胞系的数目。图2f显示了在暴露于来自每种靶病毒的汇合刺激抗原的滴定浓度后，扩增的t细胞系内的病毒反应性t细胞的特异性。数据表示为平均值
±
sem sfc/2
×
105(n＝7)。图2g显示了在暴露于来自每种靶病毒的个体刺激性抗原后健康供体的外周血中carv特异性t细胞的频率。数据表示为平均值
±
sem sfc/5
×
105(n＝12)。
18.图3：多呼吸道病毒特异性t细胞是多克隆和多功能的。图3a显示了在1个代表性供体中通过ics评估的从cd3+t细胞产生的双重ifnγ和tnfα，而图3b显示了来自筛选的9个供体的汇总结果(平均值
±
sem)。图3c显示了通过多重珠阵列测量的多呼吸道病毒特异性t细胞的细胞因子谱，而图3d通过elispot测定评估颗粒酶b的产生。结果报告为sfc/2x105个输入病毒特异性t细胞(平均值
±
sem，n＝9)。
19.图4：多呼吸道病毒特异性t细胞对病毒感染的靶标具有反应性。图4a显示了使用自体肽混合物脉冲pha母细胞作为靶标(e:t为40:1；n＝8)，以未装载的pha母细胞作为对照，通过标准4小时cr51释放测定评估的多呼吸道病毒特异性t细胞的细胞溶解潜力。结果表示为特定裂解的百分比(平均值
±
sem)。图4b表明，如通过cr51释放测定评估的，多呼吸道病毒特异性t细胞对未感染的自体或同种异体pha母细胞显示出可忽略的活性。图4c显示了使用自体肽混合物脉冲pha母细胞作为靶标(e:t为40:1、20:1、10:1、5:1)，以未装载的pha母细胞作为对照，通过标准4小时cr51释放测定评估的多呼吸道病毒特异性t细胞的细胞毒性活性。结果表示为特定裂解的百分比(平均值
±
sem，n＝8)。
20.图5：hsct接受者外周血中呼吸道合胞病毒(rsv)和人偏肺病毒(hmpv)特异性t细胞的检测。从具有3种感染的2个hsct接受者分离的pbmc针对所述感染的病毒的特异性进行了测试，使用ifnγelispot作为读出。图5a和图5b显示了2名患有rsv相关urti的患者(其为对照)的结果，与内源rsv特异性t细胞的可检测增加一致，而图5c显示随着内源hmpv特异性t细胞的扩增，hmpv
‑
lrti的清除。alc：绝对淋巴细胞计数。
21.图6：检测hsct接受者外周血中的rsv和副流感病毒(piv
‑
3)特异性t细胞。从具有3种感染的3个hsct接受者分离的pbmc针对所述感染的病毒的特异性进行了测试，使用ifnγelispot作为读出。图6a和图6b显示了2名患有rsv和piv相关urti和lrti的患者(其为对照)的结果，与内源病毒特异性t细胞的可检测增加一致。图6c显示了一名患有进行中的piv相关严重urti的患者的结果，该患者未能对病毒产生t细胞反应。alc：绝对淋巴细胞计数。
22.图7.rsv基因组的结构和形态。
23.图8.rsv
‑
病毒特异性t细胞生成方案的示意图。
24.图9.rsv
‑
病毒特异性t细胞的表征。图9a显示了基于使用台盼蓝排除法的细胞计数在10天期间内实现的倍数扩增。图9b和图9c显示了扩增细胞的表型。
25.图10.rsv
‑
病毒特异性t细胞是多功能的。图10a显示了通过elispot测定法评估的从cd3+t细胞产生的ifnγ。图10b显示了颗粒酶b的产生(通过elispot测定法)。结果报告为sfc/2x105个输入病毒特异性t细胞(平均值
±
sem，n＝9)。
26.图11.rsv
‑
病毒特异性t细胞的细胞因子谱，由多重珠阵列测量。
27.发明详述
28.定义
29.如本文所用，当与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，“一个/种”一词的使用可能意味着“一个/种”，但也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。本发明的一些实施方案可以由或基本上由本发明的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。预期本文描述的任何方法或组合物可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物实施。
30.紧接在数值之前的术语“约”是指数值的
±
0％至10％、
±
0％至10％、
±
0％至9％、
±
0％至8％、
±
0％至7％、
±
0％至6％、
±
0％至5％、
±
0％至4％、
±
0％至3％、
±
0％至2％、
±
0％至1％、
±
0％至小于1％，或其中的任何其他值或值范围。例如，“约40”表示40的
±
0％到10％(即，从36到44)。
31.权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指替代方案的定义以及“和/或”。
32.如本文所用，术语“病毒抗原”是指本质上是蛋白质性质的抗原。在特定实施方案中，病毒抗原是外壳蛋白。病毒抗原的具体实例包括来自至少一种选自以下的病毒的抗原：ebv、cmv、adv、bk、jc病毒、hhv6、rsv、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、lcmv、腮腺炎、麻疹、hmpv、细小病毒b、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、hpv、hiv、htlv1、hhv8、丙型肝炎、乙型肝炎、htlv1、单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒。
33.术语“抗原特异性t细胞系”或“病毒特异性t细胞”或“病毒特异性t细胞系”在本文中可互换使用，是指对一种或多种目的病毒具有特异性和效力的多克隆t细胞系.如本文所述，病毒抗原或几种病毒抗原被呈递给外周血单核细胞中的天然t细胞，并且天然cd4+和cd8+t细胞群响应于所述病毒抗原而扩增。例如，ebv的抗原特异性t细胞系或病毒特异性t细胞可以识别ebv，从而扩增ebv特异性t细胞。在另一个例子中，腺病毒和bk的抗原特异性t细胞系或病毒特异性t细胞可以识别adv和bk，从而扩增腺病毒和bk特异性t细胞。
34.如本文所用，术语“患者”或“受试者”或“个体”在本文中可互换使用以指任何哺乳动物，包括人类、家畜和农场动物以及动物园、运动和宠物动物，例如狗、马、猫和农业用动物，包括牛、绵羊、猪和山羊。一种特定的哺乳动物是人，包括成人、儿童和老人。受试者还可以是宠物动物，包括狗、猫和马。农业动物的例子包括猪、牛、绵羊和山羊。
35.除非另有说明，本文所用的术语“治疗”、“治疗”、“治疗”等是指逆转、减轻、抑制该术语适用的疾病、病症或症状的过程或此类疾病、病症或症状的一种或多种症状，并且包括施用本文所述的任何组合物、药物组合物或剂型，以预防症状或并发症的发作，或减轻症状或并发症，或消除疾病、症状或病症。在某些情况下，治疗是治愈性的或改善的。
36.如本文所用，术语“施用”、“施用”、“施用”等是指将治疗剂转移、递送、引入或运输至需要用此类药剂治疗的受试者的任何模式。此类模式包括但不限于眼内、口服、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮内、鼻内和皮下施用。
37.如本文所用，术语“包含”、“包含”、“包括”、“包括”、“具有”、“具有”、“包含”、“含有”、“特征在于”或其任何其他变体是意在包括所列举的组件的非排他性包含，受另外明确指出的任何限制。例如，“包含”一系列要素(例如，组件或特征或步骤)的组合物和/或方法
不一定仅限于那些要素(或组件或特征或步骤)，而是可以包括未明确列出或组合物和/或方法固有的其他要素(或成分或特征或步骤)。
38.如本文所用，短语“由
……
组成”和“由
……
组成”排除未指定的任何要素、步骤或组件。例如，权利要求中使用的“由
……
组成”或“由
……
组成”会将权利要求限制在权利要求中具体列举的成分、材料或步骤，但通常与之相关的杂质(即，给定成分中的杂质)除外。当“由
……
组成”或“由
……
组成”一词出现在权利要求正文的从句中时，而不是紧接在导言之后，“由
……
组成”或“由
……
组成”一词仅限制该从句中规定的要素(或组件或步骤)；其他要素(或组件)不排除在权利要求(作为整体)之外。
39.本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应当理解，详细说明和具体实施例虽然指示了本发明的具体实施方案，但仅作为说明给出，因为从此详细描述中，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
40.以下讨论针对本发明的各种实施方案。术语“发明”无意指代任何特定实施方案或以其他方式限制本公开的范围。尽管可以采用这些实施方案中的一个或多个，但所公开的实施方案不应被解释或以其他方式使用为限制本公开(包括权利要求)的范围。此外，本领域技术人员将理解以下描述具有广泛的应用，并且对任何实施方案的讨论仅旨在作为该实施方案的示例，并不旨在暗示本公开(包括权利要求)的范围，限于该实施方案。
41.概述
42.在各种实施方案中，本公开提供用于治疗或预防病毒感染(例如，呼吸道病毒感染)和相关疾病的组合物和方法。本公开涉及通过施用离体扩增的、非遗传修饰的病毒特异性t细胞(病毒特异性t细胞)以控制病毒感染和消除症状来预防或治疗此类感染。不希望受任何理论束缚，病毒特异性t细胞通过其天然t细胞受体(tcr)识别并杀死病毒感染的细胞，tcr与在呈递病毒衍生肽的靶细胞上表达的主要组织相容性复合体(mhc)分子结合。
43.在多达40％的同种异体造血干细胞移植(allo
‑
hsct)接受者中检测到由社区获得性呼吸道病毒(carv)(包括呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒、副流感病毒(piv)和人偏肺病毒(hmpv))引起的呼吸道病毒感染，在这些接受者中他们可引发可致命的严重疾病如毛细支气管炎和肺炎。rsv诱发的毛细支气管炎是1岁以下儿童入院的最常见原因，而疾控中心(cdc)估计，每年流感病毒在全球造成的疾病高达3560万，140000至710000住院治疗，每年的疾病管理费用约为871亿美元(仅美国)，死亡人数在12000至56000之间。
44.因此，carv是全球发病率和死亡率的主要原因，免疫系统幼稚(例如幼儿)或受损的个体最容易受到伤害。例如，在同种异体造血干细胞移植(hsct)接受者中，carv相关呼吸道病毒性疾病的发病率高达40％(5)。虽然大多数患者最初表现为流鼻涕、咳嗽和发烧，但在大约50％的病例中，感染会进展到下呼吸道，并以包括肺炎和毛细支气管炎的严重症状为特征，死亡率为23
‑
50％(6
‑
9)。既没有批准的预防性疫苗也没有针对hmpv(10)和piv(11)的抗病毒药物，对于流感病毒，除非患者在hsct后至少6个月，否则没有指明预防性疫苗(12)。雾化利巴韦林(rbv)已获得fda批准用于治疗rsv，但其成本极高(5天疗程＝149756美元)且在设置上难以施用，需要一个专门的雾化装置连接到围绕患者的气雾帐(13
‑
16)。因此，对许多临床上有问题的carv缺乏经批准的抗病毒药物，以及施用雾化rbv的高成本和复杂性强调了对替代治疗策略的需求。
45.其他呼吸道病毒包括腺病毒(adv)、鼻病毒和冠状病毒株sars
‑
cov、sars
‑
cov
‑
2、mers
‑
cov，以及影响免疫功能正常和免疫功能低下患者的地方性cov。这些会导致严重的症状，尤其是在免疫功能低下的个体中，而2020年的sars
‑
cov2大流行清楚地暴露了人类在治疗和预防这种感染和相关疾病方面准备不足。这场可怕的大流行已经导致全球千万人死亡、医疗保健系统崩溃以及数十年来未见的全球经济崩溃。因此，显然迫切需要治疗这些病毒的新疗法。本公开提供了这样的疗法。
46.在一些实施方案中，本公开提供了由从健康的、预筛选的、血清阳性供体获得的外周血单核细胞(pbmc)产生的病毒特异性t细胞，其可作为部分hla匹配的“现成”产品获得。因此，本公开提供包含对一种或多种病毒具有特异性的病毒特异性t细胞的病毒特异性t细胞产品以及使用此类病毒特异性t细胞治疗或预防病毒感染的方法。
47.在一些实施方案中，本文所述的病毒特异性t细胞响应(或“特异于”)一种或多种病毒(例如，一种或多种呼吸道病毒)或更具体地由病毒表达的一种或多种抗原。在一些实施方案中，本文所述的病毒特异性t细胞仅对一种病毒有反应。例如，在一个实施方案中，本公开提供了对一种或多种rsv抗原具有特异性的病毒特异性t细胞的多克隆群体。在一些情况下，此类rsv特异性病毒特异性t细胞包含对多种rsv抗原具有特异性的t细胞。在一些实施方案中，本公开还提供了通过施用此类rsv特异性病毒特异性t细胞来治疗受试者的rsv感染的方法。在一些实施方案中，本公开还提供通过施用此类rsv特异性病毒特异性t细胞来预防受试者中rsv感染的方法。此类实践可以应用于除rsv之外的任何单一病毒。
48.在一些实施方案中，本文所述的病毒特异性t细胞对多于一种病毒(例如本文公开的任何一种或多种病毒)有反应。在特定实施方案中，本公开提供了对多于一种呼吸道病毒(例如，本文公开的任何一种或多种呼吸道病毒)有反应的多呼吸道病毒特异性t细胞(多呼吸道病毒特异性t细胞)。在某些方面，多呼吸道病毒特异性t细胞对由选自流感病毒、rsv、hmpv、piv及其组合的病毒表达的一种或多种呼吸道病毒抗原具有特异性。在特定实施方案中，多呼吸道病毒特异性t细胞对由流感病毒、rsv、hmpv和piv中的每种表达的抗原具有特异性。在某些方面，多呼吸道病毒特异性t细胞对由选自流感病毒、rsv、hmpv、piv3及其组合的病毒表达的一种或多种呼吸道病毒抗原具有特异性。在特定实施方案中，多呼吸道病毒特异性t细胞对由流感病毒、rsv、hmpv和piv3中的每种表达的抗原具有特异性。在一些实施方案中，流感病毒抗原是甲型流感病毒抗原np1。在一些实施方案中，流感病毒抗原是甲型流感病毒抗原mp1。在一些实施方案中，流感病毒抗原是np1和mp1的组合。在一些实施方案中，rsv抗原是rsv n。在一些实施方案中，rsv抗原是rsv f。
49.在一些实施方案中，rsv抗原是rsv n和f的组合。在一些实施方案中，hmpv抗原是f。在一些实施方案中，hmpv抗原是n。在一些实施方案中，hmpv抗原是m2
‑
1。在一些实施方案中，hmpv抗原是m。在一些实施方案中，hmpv抗原是f、n、m2
‑
1和m的组合。在一些实施方案中，piv抗原是m。在一些实施方案中，piv抗原是hn。在一些实施方式中，piv抗原是n。在一些实施方式中，piv抗原是f。在一些实施方式中，piv抗原是m、hn、n和f的组合。在一些实施方式中，本公开还提供了通过向受试者施用此类多呼吸道病毒特异性t细胞来治疗受试者的piv、流感病毒、rsv和/或hmpv感染的方法。在一些实施方案中，本公开还提供通过向受试者施用此类多呼吸道病毒特异性t细胞来预防受试者中piv、流感病毒、rsv和/或hmpv感染的方法。在一些实施方案中，piv3抗原是m。在一些实施方案中，piv3抗原是hn。在一些实施方
案中，piv3抗原是n。在一些实施方案中，piv3抗原是f。在一些实施方案中，piv3抗原是m、hn、n和f的组合。本公开还提供了通过向受试者施用此类多呼吸道病毒特异性t细胞来治疗受试者中的piv3、流感病毒、rsv和/或hmpv感染的方法。在一些实施方案中，本公开还提供了通过向受试者施用此类多呼吸道病毒特异性t细胞来预防受试者中piv3、流感病毒、rsv和/或hmpv感染的方法。此类实践可以应用于任何多病毒。
50.在一个特定的实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含对piv抗原m、piv抗原hn、piv抗原n、piv抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n中的每种具有特异性的多呼吸道病毒特异性t细胞的多克隆群体。多克隆群体可以包括cd4+和cd8+病毒特异性t细胞。多克隆群体可以施用于受试者。受试者可能患有piv、流感病毒、rsv和/或hmpv感染。一种预防受试者的piv、流感病毒、rsv和/或hmpv感染的方法可以包括向受试者施用多呼吸道病毒特异性t细胞的多克隆群体。
51.在一个特定的实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含对piv3抗原m、piv3抗原hn、piv3抗原n、piv3抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n中的每种具有特异性的多呼吸道病毒特异性t细胞的多克隆群体。多克隆群体可以包括cd4+和cd8+病毒特异性t细胞。多克隆群体可以施用于受试者。受试者可能患有piv3、流感病毒、rsv和/或hmpv感染。治疗受试者的piv3、流感病毒、rsv和/或hmpv感染的方法可以包括向受试者施用多呼吸道病毒特异性t细胞的多克隆群体。治疗受试者的piv3、流感病毒、rsv和/或hmpv感染的方法可以包括向受试者施用多呼吸道病毒特异性t细胞的多克隆群体。预防受试者的piv3、流感病毒、rsv和/或hmpv感染的方法可以包括向受试者施用多呼吸道病毒特异性t细胞的多克隆群体。
52.在一些实施方案中，本公开提供了包含识别多种病毒抗原的病毒特异性t细胞的多克隆群体的组合物，其中所述多种病毒抗原包含至少一种来自piv的第一抗原和至少一种来自一种或多种额外病毒的第二抗原。在一些特定实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含识别多种病毒抗原的病毒特异性t细胞的多克隆群体，其中所述多种病毒抗原包含至少一种来自piv3的第一抗原和至少一种来自一种或多种额外病毒的第二抗原。额外的病毒可包括流感病毒、rsv、hmpv、adv、冠状病毒或其组合。病毒特异性t细胞可识别由一种或多种额外病毒表达的额外抗原，其中额外抗原可包含由piv抗原m(例如piv3抗原m)、piv抗原hn(例如piv3抗原hn)、piv抗原n(例如piv3抗原n)、piv抗原f(例如piv3抗原f)、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f、hmpv抗原n，以及adv抗原hexon、adv抗原penton及其组合组成的组中的一种或多种。在一些实施方案中，额外的抗原可以包括一种或多种冠状病毒抗原。例如，额外的抗原可以包括一种或多种冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)抗原。在一些实施方案中，冠状病毒抗原包含一种或多种sars
‑
cov2抗原，其选自nsp1；nsp3；nsp4；nsp5；nsp6；nsp10；nsp12；nsp13；nsp14；nsp15；nsp16；spike(s)；包膜蛋白(e)；基质蛋白(m)；核衣壳蛋白(n)。在一些实施方案中，sars
‑
cov2抗原还包含一种或多种选自sars
‑
cov
‑
2(ap3a)；sars
‑
cov
‑
2(ns7)；sars
‑
cov
‑
2(ns8)；sars
‑
cov
‑
2(orf10)；sars
‑
cov
‑
2(orf9b)；和sars
‑
cov
‑
2(y14)的抗原。
53.在一些实施方案中，额外的抗原可以额外地或可替代地来自选自以下的病毒：ebv、cmv、adv、bk、jc病毒、hhv6、rsv、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、鼻病毒、冠状病毒、
lcmv、腮腺炎、麻疹、人偏肺病毒、细小病毒b、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、hpv、hiv、htlv1、hhv8、丙型肝炎、乙型肝炎、htlv1和西尼罗河病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒。在一些实施方案中，ebv抗原来自lmp2、ebna1、bzlf1及其组合。在一些实施方案中，cmv抗原来自ie1、pp65及其组合。在一些实施方案中，腺病毒抗原来自hexon、penton及其组合。在一些实施方案中，bk病毒抗原来自vp1、大t及其组合。在一些实施例中，hhv6抗原来自u90、u11、u14及其组合。
54.在一些实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自rsv、流感病毒、piv或hmpv的抗原(或抗原的一部分)。在一些实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自rsv、流感病毒、piv、hmpv、冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)或其组合的抗原(或抗原的一部分)。在一些实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自rsv、流感病毒、piv3、hmpv或其组合的抗原(或抗原的一部分)。在一些实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自rsv、流感病毒、piv3、hmpv、冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)或其组合的抗原(或抗原的一部分)。
55.在一些实施方案中，第一抗原是piv抗原。例如，在一些实施方案中，第一抗原可以是piv抗原m。在一些实施方案中，第一抗原可以是piv抗原hn。在一些实施方案中，第一抗原可以是piv抗原n。在一些实施方案中，第一抗原可以是piv抗原f。在一些实施方案中，第一抗原可以是piv抗原m、piv抗原hn、piv抗原n和piv抗原f的任意组合。在一些实施方案中，组合物可包含1种第一抗原。在一些实施方案中，组合物可包含2种第一抗原。在一些实施方案中，组合物可包含3种第一抗原。在一些实施方案中，组合物可包含4种第一抗原。在一些实施方案中，4种第一抗原可包括piv抗原m、piv抗原hn、piv抗原n和piv抗原f。
56.在一些实施方案中，第一抗原是piv3抗原。例如，在一些实施方案中，第一抗原可以是piv3抗原m。在一些实施方案中，第一抗原可以是piv3抗原hn。在一些实施方案中，第一抗原可以是piv3抗原n。在一些实施方案中，第一抗原可以是piv3抗原f。在一些实施方案中，第一抗原可以是piv3抗原m、piv3抗原hn、piv3抗原n、和piv3抗原f的任意组合。在一些实施方案中，组合物可包含1种第一抗原。在一些实施方案中，组合物可包含2种第一抗原。在一些实施方案中，组合物可包含3种第一抗原。在一些实施方案中，组合物可包含4种第一抗原。在一些实施方案中，4种第一抗原可包括piv3抗原m、piv3抗原hn、piv3抗原n和piv3抗原f。
57.在一些实施方案中，一种或多种第二病毒可以是rsv。在一些实施方案中，一种或多种第二病毒可以是流感病毒。在一些实施方案中，一种或多种第二病毒可以是hmpv。在一些实施方案中，一种或多种第二病毒可包括rsv、流感病毒和hmpv。在一些实施方案中，一种或多种第二病毒可由rsv、流感病毒和hmpv组成。在一些实施方案中，一种或多种第二病毒可选自如本文所述的任何合适的病毒。
58.在一些实施方案中，组合物可包含两种或三种第二病毒。在一些实施方案中，组合物可包含三种第二病毒。在一些实施方案中，三种第二病毒可包括流感病毒、rsv和hmpv。在一些实施方案中，组合物包含至少两种第二抗原/每种第二病毒。在一些实施方案中，组合物包含1种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含2种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含3种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含4种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含5种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含6种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含7种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含8种第二抗原。在一些实施方
案中，组合物包含9种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含10个第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含11种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含12种第二抗原。在一些实施方案中，组合物包含任意数量的适用于如本文所述的组合物的第二抗原。
59.在一些实施方案中，第二抗原可以是流感病毒抗原np1。在一些实施方案中，第二抗原可以是流感病毒抗原mp1。在一些实施方案中，第二抗原可以是rsv抗原n。在一些实施方案中，第二抗原可以是rsv抗原f。在一些实施方案中，第二抗原可以是hmpv抗原m。在一些实施方案中，第二抗原可以是hmpv抗原m2
‑
1。在一些实施方式中，第二抗原可以是hmpv抗原f。在一些实施方式中，第二抗原可以是hmpv抗原n。在一些实施方式中，第二抗原可以是流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n。
60.在一些实施方案中，第二抗原包括流感病毒抗原np1。在一些实施方案中，第二抗原包括流感病毒抗原mp1。在一些实施方案中，在一些实施方案中，第二抗原包括流感病毒抗原np1和流感病毒抗原mp1。在一些实施方案中，第二抗原包括rsv抗原n。在一些实施方案中，第二抗原包括rsv抗原f。在一些实施方案中，第二抗原包括rsv抗原n和rsv抗原f。
61.在一些实施方案中，第二抗原包括hmpv抗原m。在一些实施方案中，第二抗原包括hmpv抗原m2
‑
1。在一些实施方案中，第二抗原包括hmpv抗原f。在一些实施方案中，第二抗原包括hmpv抗原n。在一些实施方案中，第二抗原包括hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv的组合抗原n的组合。
62.在一些实施方案中，第二抗原包含流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n中的每种。在一些实施方案中，多种抗原包括piv抗原m、piv抗原hn、piv抗原n、piv抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n。在一些实施方案中，多种抗原由piv抗原m、piv抗原hn、piv抗原n、piv抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n组成。在一些实施方案中，多种抗原基本上由piv抗原m、piv抗原hn、piv抗原n、piv抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n组成。在一些实施方案中，第二抗原可包含任何适用于本文所述组合物的抗原。
63.在一些实施方案中，第二抗原包括流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n中的每种。在一些实施方案中，多种抗原包括piv3抗原m、piv3抗原hn、piv3抗原n、piv3抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n。在一些实施方案中，多种抗原由piv3抗原m、piv3抗原hn、piv3抗原n、piv3抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n组成。在一些实施方案中，多种抗原基本上由piv3抗原m、piv3抗原hn、piv3抗原n、piv3抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n组成。在一些实施方案中，第二抗原可包含任何适用于本文所述组合物的抗原。
64.在一些实施方案中，本文公开的组合物中的病毒特异性t细胞通过使pbmc与多种
肽混合物文库接触而产生。在一些实施方案中，每种肽混合物文库包含跨越病毒抗原的至少一部分的多种重叠肽。在一些实施方案中，多种肽混合物文库中的至少一种跨越来自piv的第一抗原。在一些实施方案中，多种肽混合物文库中的至少一种跨越来自piv3的第一抗原。
65.在一些实施方案中，多种肽混合物文库中的至少一种额外的肽混合物文库跨越每种第二抗原。
66.在一些实施方案中，本文公开的病毒特异性t细胞是通过将t细胞与抗原呈递细胞(apc)例如用至少一种dna质粒核转染的树突细胞(dc)接触而产生的。在一些实施方案中，dna质粒可以编码一种抗原的至少一部分。在一些实施方案中，dna质粒可以编码piv抗原(例如piv3抗原)。在一些实施方案中，至少一种dna质粒编码每种第二抗原。在一些实施方案中，质粒编码至少一种piv抗原和至少一种第二抗原。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含cd4+t淋巴细胞和cd8+t淋巴细胞。在一些实施方案中，组合物包含表达αβt细胞受体的病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，组合物包含受mhc限制的病毒特异性t细胞。
67.在一些实施方案中，本公开提供对选自流感病毒、rsv、hmpv、piv和一种或多种额外的病毒的一种或多种呼吸道病毒具有特异性的多呼吸道病毒特异性t细胞(多呼吸道病毒特异性t细胞)。piv抗原可以来自piv3。例如，在一些情况下，额外的病毒包括冠状病毒。冠状病毒可以是α冠状病毒。例如，在特定实施方案中，α冠状病毒选自hcov
‑
e229、hcov
‑
nl63及其组合。在特定实施方案中，α冠状病毒包含hcov
‑
e229和hcov
‑
nl63中的每种。冠状病毒可以是β冠状病毒。例如，在特定实施方案中，β冠状病毒选自sars
‑
cov、sars
‑
cov2、mers
‑
cov、hcov
‑
hku1、hcov
‑
oc43及其组合。在特定实施方案中，β冠状病毒包括sars
‑
cov、sars
‑
cov2、mers
‑
cov、hcov
‑
hku1、hcov
‑
oc43中的每种及其组合。在一些情况下，额外的病毒包括腺病毒。在一些情况下，额外的病毒选自ebv、cmv、adv、bk、jc病毒、hhv6、博卡病毒、鼻病毒、冠状病毒、lcmv、腮腺炎、麻疹、细小病毒b、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒病毒、hpv、hiv、htlv1、hhv8、丙型肝炎、乙型肝炎、htlv1、西尼罗河病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒及其组合。
68.在一个实施方案中，本公开提供了对流感病毒、rsv、hmpv、piv和冠状病毒(例如，sars
‑
cov2)具有特异性的多呼吸道病毒特异性t细胞。在一个实施方案中，本公开提供了对流感病毒、rsv、hmpv、piv、一种或多种adv和冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)具有特异性的多呼吸道病毒特异性t细胞。在一个实施方案中，本公开提供了对流感病毒、rsv、hmpv、piv3和冠状病毒(例如sars
‑
cov2)具有特异性的多呼吸道病毒特异性t细胞。在一个实施方案中，本公开提供了对流感病毒、rsv、hmpv、piv3、一种或多种adv和冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)具有特异性的多呼吸道病毒特异性t细胞。
69.在一些实施方案中，病毒特异性t细胞可以在il
‑
7和il
‑
4都存在的情况下离体培养。在一些实施方案中，多病毒病毒特异性t细胞在9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天，包括其间的所有范围和子范围内充分扩增培养，使得它们处于准备好的状态以施用于患者。典型的制备进行(在上述条件下培养/扩增)为10
‑
18天，更通常为14
‑
16天。在一些实施方案中，多病毒病毒特异性t细胞在适合本文所述组合物的任何天数内充分扩增。
70.本公开提供包含表现出可忽略的同种异体反应性的病毒特异性t细胞的组合物。
technologies(springfield,ca)或miltenyi biotec(auburn,ca)的那些。在特定实施方案中，例如，肽长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个或更多个氨基酸，并且例如在特定实施方案中存在至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸的重叠。
79.在一些实施方案中，用于肽混合物的氨基酸具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99、至少99.9％的纯度，包括所有范围和其间的子范围。在一些实施方案中，本文用于肽混合物中的氨基酸具有至少70％的纯度。
80.不同肽的混合物可以包括不同肽的任何比例，尽管但在一些实施方案中，每种特定肽在混合物中以与另一特定肽基本相同的数量存在。us2018/0187152中描述了制备和生产具有广泛特异性的多病毒细胞毒性t细胞的肽混合物的方法，该文献通过引用整体并入。
81.病毒特异性t细胞的产生
82.在一些实施方案中，产生病毒特异性t细胞的方法包括从由供体获得的血液中分离单核细胞(mnc)或获得分离的mnc。在一些实施方案中，mnc是pbmc。使用本领域技术人员已知的方法分离mnc和pbmc。例如，密度离心(梯度)(ficoll
‑
paque)可用于分离pbmc。在其他示例中，细胞制备管(cpt)和sepmate管(带有新鲜采集的血液)可用于分离pbmc。
83.在一些实施方案中，mnc是pbmc。例如，pbmc可包含淋巴细胞、单核细胞和树突细胞。例如，淋巴细胞可以包括t细胞、b细胞和nk细胞。在一些实施方案中，培养或冷冻保存如本文所用的mnc。在一些实施方案中，培养或冷冻保存细胞的过程可包括在合适的培养条件下使培养中的细胞与一种(或一种的一部分)或多种抗原接触以刺激和扩增抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，一种或多种抗原可包括一种或多种病毒抗原。
84.在一些实施方案中，培养或冷冻保存细胞的过程可包括在合适的培养条件下使培养中的细胞与一种或多种来自一种或多种抗原的表位接触。在一些实施方案中，将mnc或pbmc与一种或多种抗原、或一种或多种来自一种或多种抗原的表位接触，刺激和扩增来自各个供体的mnc或pmbc中的每种的抗原特异性t细胞的多克隆群体。在一些实施方案中，抗原特异性t细胞系可以被冷冻保存。
85.在一些实施方案中，一种或多种抗原可以是完整蛋白质的形式。在一些实施方案中，一种或多种抗原可以是包含一系列重叠肽(其跨越每种抗原的部分或整个序列)的肽混合物。在一些实施方案中，一种或多种抗原可以是完整蛋白质和包含一系列重叠肽(其跨越每种抗原的部分或整个序列)的肽混合物的组合。
86.在一些实施方案中，pbmc或mnc的培养在包含透气性培养表面的容器中进行。在一个实施方案中，容器是具有透气部分的输液袋或刚性容器。在一个实施方案中，容器是生物反应器。在一个实施方案中，容器可以是适合于培养如本文所述的pbmc或mnc的任何容器、生物反应器等。
87.在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子的存在下培养pbmc或mnc。在一些实施方案中，细胞因子是il4。在一些实施方案中，细胞因子是il7。在一些实施方案中，细胞因子是il4和il7。在一些实施方案中，细胞因子包括il4和il7，但不包括il2。在一些实施方案中，细胞因子可以是适合于培养如本文所述的pbmc或mnc的细胞因子的任何组合。
88.在一些实施方案中，可以在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种不同的肽混合物的存在下培养mnc或pbmc。肽混合物，即多种肽，包含一系列重叠肽(其跨越抗原的部分或整个序列)。在一些实施方案中，可以在多种肽混合物的存在下培养mnc或pbmc。在这种情况下，每种肽混合物覆盖至少一种抗原，该抗原不同于多种肽混合物中的每种其他肽混合物所覆盖的抗原。在一些实施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种不同的抗原被多种肽混合物覆盖。在一些实施方案中，至少一种抗原(来自至少2种不同病毒)被多种肽混合物覆盖。
89.在一些实施方案中，肽混合物包含15聚肽。在一些实施方案中，肽混合物包含适用于如本文所述的方法的肽。在一些实施方案中，肽混合物中跨越抗原的肽在序列上重叠8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸。在一些实施方案中，肽混合物中跨越抗原的肽在序列上重叠11个氨基酸。
90.在一些实施方案中，在跨越甲型流感病毒抗原np1和甲型流感病毒抗原mp1、rsv抗原n和f、hmpv抗原f、n、m2
‑
1和m以及piv抗原m、hn、n和f的肽混合物的存在下培养pbmc或mnc。在一些实施方案中，在跨越本文公开的甲型流感病毒抗原np1和甲型流感病毒抗原mp1、rsv抗原n和f、hmpv抗原f、n、m2
‑
1和m、和piv抗原m、hn、n和f以及一种或多种冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)抗原的存在下培养pbmc或mnc。在一些实施方案中，在跨越ebv抗原lmp2、ebna1和bzlf1、cmv抗原ie1和pp65、腺病毒抗原hexon和penton、bk病毒抗原vp1和大t以及hhv6抗原u90、u11和u14的存在下培养pbmc或mnc。在一些实施方案中，测试抗原特异性t细胞的抗原特异性细胞毒性。
91.本公开提供裂解靶细胞的方法，包括使靶细胞与本文所述的组合物或药物组合物接触。在一些实施方案中，靶细胞与组合物或药物组合物之间的接触在受试者体内发生。在一些实施方案中，靶细胞与组合物或药物组合物之间的接触通过向受试者施用病毒特异性t细胞在体内发生。在一些实施方案中，受试者是人。
92.本公开提供治疗或预防病毒感染的方法，包括向有需要的受试者施用如本文所述的组合物或药物组合物。在一些实施方案中，向受试者施用5x103个至5x109个病毒特异性t细胞/m2、5x104个至5x108个病毒特异性t细胞/m2、5x105个至5x107个病毒特异性t细胞/m2、5x104个至5x108个病毒特异性t细胞/m2、5x106个病毒特异性t细胞/m2至5x109个病毒特异性t细胞/m2之间(包括所有范围和其间的子范围)的病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，向受试者施用病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，受试者免疫功能低下。在一些实施方案中，对患有piv感染的受试者施用本文公开的对piv、rsv、hmpv和流感病毒特异的多呼吸道病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，多呼吸道病毒特异性t细胞具有交叉特异性，使得它们对不同于产生它们的病毒的病毒感染有效。例如，但不限于，在一些实施方案中，多呼吸道病毒特异性t细胞中的piv特异性病毒特异性t细胞是针对piv3抗原产生的。在一些实施方案中，治疗的piv感染是piv3。在一些实施方案中，治疗的piv感染是除piv3之外的血清型。在一些实施方案中，向患有rsv感染的受试者施用本文公开的对piv、rsv、hmpv和流感病毒特异的多呼吸道病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，对患有hmpv感染的受试者施用本文公开的对piv、rsv、hmpv和流感病毒特异的多呼吸道病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，向患有流感病毒感染的受试者施用本文公开的对piv、rsv、hmpv和流感病毒特异的多呼吸道病毒特异性t细胞。在一些实施方案中，向患有冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)
感染的受试者施用本文公开的对piv、rsv、hmpv、流感病毒和冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)特异的多呼吸道病毒特异性t细胞。
93.在一些实施方案中，受试者可具有一种或多种医学病症。在一些实施方案中，受试者在接受病毒特异性t细胞之前接受进行降低强度预处理的匹配的相关供体移植。在一些实施方案中，受试者在接受病毒特异性t细胞之前接受进行清髓预处理的匹配的无关供体移植。在一些实施方案中，受试者在接受病毒特异性t细胞之前接受进行降低强度预处理的半相合移植。在一些实施方案中，受试者在接受病毒特异性t细胞之前接受进行清髓预处理的匹配的相关供体移植。在一些实施方案中，受试者已接受实体器官移植。在一些实施方案中，受试者已接受化疗。在一些实施方案中，受试者患有hiv感染。在一些实施方案中，受试者有遗传免疫缺陷。在一些实施方案中，受试者已接受同种异体干细胞移植。在一些实施方案中，受试者具有使他们更容易受到病毒感染和/或在病毒感染后具有显著不利结果的预先存在的病症。例如，在一些实施方案中，受试你者患有心血管疾病。在一些实施方案中，受试者患有糖尿病。在一些实施方案中，受试者患有慢性呼吸系统疾病。在一些实施方案中，受试者患有高血压。在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，受试者肥胖。在一些实施方案中，受试者是老年人。在一些实施方案中，受试者具有多于一种如本段所述的医学状况。在一些实施方案中，受试者具有本段所述的所有医学状况。在一些实施方案中，患者感染了冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)。在一些实施方案中，患者已被诊断出患有covid
‑
19。在一些实施方案中，患者免疫功能低下。如本文所用，免疫受损是指具有减弱的免疫系统。例如，免疫功能低下的患者抵抗感染和其他疾病的能力下降。在一些实施方案中，患者由于接受治疗疾病或病症或另一种疾病或病症的治疗而免疫受损。在一些实施方案中，免疫受损的原因是由于年龄。在一些实施方案中，免疫受损的原因是由于低龄。在一些实施方案中，免疫受损的原因是由于高龄。在一些实施方案中，患者需要移植疗法。在一些实施方案中，受试者除了感染冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)外没有其他医学病症。在一些实施方案中，受试者患有急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性肉芽肿病。
94.在一些实施方案中，在施用病毒特异性t细胞细胞系后测量治疗功效。在其他实施方案中，治疗功效基于感染的病毒血症(viremic)消退(resolution)来测量。在其他实施方案中，治疗功效基于感染的病毒(viruric)消退来测量。在其他实施方案中，治疗功效基于来自患者的样品中病毒载量的消退来测量。在其他实施方案中，治疗功效通过胸部成像以跟踪肺部疾病的消退来测量。在一些实施例中，样品来自鼻拭子。在其他实施方案中治疗功效，基于来自患者的样品中的感染的病毒血症消退、感染的病毒消退和病毒载量消退来测量。在一些实施方案中，治疗功效通过监测可在患者外周血中检测到的病毒载量来测量。在一些实施方案中，治疗功效包括肉眼可见血尿(macroscopic hematuria)的消退。在一些实施方案中，治疗功效包括通过ctcae
‑
pro或检查患者的类似评估工具测量的出血性膀胱炎症状和/或临床医生报告的结果的减轻。
95.在一些实施方案中，样品选自患者的组织样品。在一些实施方案中，样品选自来自患者的液体样品。在一些实施方案中，样品选自患者的脑脊液(csf)。在一些实施方案中，样品选自患者的bal。在一些实施方案中，样品选自患者的粪便。
96.在一些实施方案中，将本文所述的组合物多次施用于受试者。在一些实施方案中，
向受试者施用本文所述的组合物多于一次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物多于两次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物多于三次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物多于四次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物多于五次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物多于六次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物多于七次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物多于八次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物多于九次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物多于十次。在一些实施方案中，以适合受试者的次数向受试者施用本文所述的组合物。当向个体多次施用组合物时，施用之间的持续时间可以是任何合适的长度，包括1
‑
24小时、1
‑
7天、1
‑
4周、1
‑
12个月或更长，且包括所有范围和其间的子范围。
97.在一些实施方案中，将两种或更多种本文所述的包含病毒特异性t细胞(例如，多呼吸道病毒特异性t细胞)多克隆群体的组合物组合施用于受试者。可以将两种或更多种组合物依次或同时施用于受试者。两种或更多种组合物可以合并并作为单一组合物施用。两种或更多种组合物可以在分开的时间作为分开的组合物施用。在一个实施方案中，向受试者施用包含对piv、流感病毒、rsv和hmpv具有特异性的病毒特异性t细胞的多克隆群体的第一多呼吸道病毒特异性t细胞组合物，并且还向受试者施用包含对另一种病毒具有特异性的病毒特异性t细胞的多克隆群体的第二单独病毒特异性t细胞组合物。在特定实施方案中，另一种病毒是冠状病毒(例如，sars
‑
cov2)。在一些实施方案中，向受试者施用单一组合物，其包含包含对piv、流感病毒、rsv和hmpv具有特异性的病毒特异性t细胞的多克隆群体的第一多呼吸道病毒特异性t细胞组合物和包含对另一种病毒具有特异性的病毒特异性t细胞的多克隆群体的第二单独组合物的汇合。在特定实施方案中，其他病毒是冠状病毒(例如，sars
‑
cov2)。在一些实施方案中，其他病毒选自bv、cmv、adv、bk、jc病毒、hhv6、rsv、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、lcmv、腮腺炎、麻疹、hmpv、细小病毒b、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、hpv、hiv、htlv1、hhv8、丙型肝炎、乙型肝炎、htlv1、单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒。
98.在一些实施方案中，组合物的施用有效地治疗或预防受试者的病毒感染。在一些实施方案中，病毒感染是piv。在一些实施方案中，病毒感染是piv3。在一些实施方案中，病毒感染是rsv。在一些实施方案中，病毒感染是流感病毒。在一些实施方案中，病毒感染是hmpv。在一些实施方案中，病毒感染是冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)。在一些实施方案中，病毒感染是sars
‑
cov。在一些实施方案中，病毒感染是mers
‑
cov。在一些实施方案中，病毒感染是hcov
‑
hku1。在一些实施方案中，病毒感染是hcov
‑
oc43。在一些实施方案中，病毒感染是hcov
‑
e229。在一些实施方案中，病毒感染是hcov
‑
nl63。
99.本公开提供包含识别多种病毒抗原的病毒特异性t细胞的多克隆群体的组合物。本公开提供了多种病毒抗原包含至少一种抗原。在一些实施方案中，至少一种抗原可以是冠状病毒(例如，sars
‑
cov或sars
‑
cov2)。在一些实施方案中，所述至少一种抗原可以来自piv。在一些实施方案中，所述至少一种抗原可以是rsv抗原。在一些实施方案中，所述至少一种抗原可以来自流感病毒。在一些实施方案中，所述至少一种抗原可以来自hmpv。
100.在一些实施方案中，本公开提供了识别多种病毒抗原的病毒特异性t细胞的多克隆群体，所述病毒抗原包括来自piv、rsv、流感病毒和hmpv中的每种的至少一种抗原。在一
些实施方案中，本公开提供识别多种病毒抗原的病毒特异性t细胞的多克隆群体，所述多种病毒抗原包含来自piv、rsv、流感病毒和hmpv中的每种的至少两种抗原。在一些实施方案中，多种抗原包括piv抗原m、piv抗原hn、piv抗原n、piv抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n。在一些实施方案中，多种抗原可以选自piv抗原m、piv抗原hn、piv抗原n、piv抗原f、流感病毒抗原np1、流感病毒抗原mp1、rsv抗原n、rsv抗原f、hmpv抗原m、hmpv抗原m2
‑
1、hmpv抗原f和hmpv抗原n种的任何一种。在一些实施方案中，将病毒特异性t细胞的多克隆群体施用于感染流感病毒、rsv、piv和/或hmpv的患者。
101.在本公开的至少一些方法中，将产生的病毒特异性t细胞施用于个体，例如免疫功能低下的个体。在某些情况下，个体已经或将要进行同种异体干细胞移植。在特定实施方案中，通过注射给施用于细胞，例如静脉内、肌肉内、皮内、皮下、腹膜内注射等。在一些实施方案中，个体患有淋巴瘤或白血病。在一些实施方案中，病毒特异性t细胞进一步定义为多克隆cd4+和cd8+病毒特异性t细胞。pbmc可以是个体同种异体的或个体自体的。在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括将病毒特异性t细胞暴露于一种或多种刺激细胞分裂的组合物例如植物血凝素的步骤；在一些方面，化合物是有丝分裂原。
102.在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含如本文所述的组合物，配制用于静脉内递送。在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的病毒特异性t细胞群体和一种或多种载体、赋形剂、稀释剂、缓冲剂和/或递送载体。在一些特定的实施方案中，本公开提供了包含一种或多种本文所述的病毒特异性t细胞组合物的药物组合物，其被配制用于静脉内递送。在某些实施方案中，配制用于静脉内递送的组合物可包含一种或多种悬浮或重悬浮在其培养基中的本文公开的扩增的病毒特异性t细胞。配制用于静脉内递送的组合物可以额外地或替代地包含一种或扩增的病毒特异性t细胞，其重悬在合适的载体、赋形剂、稀释剂、缓冲液和/或递送载体中。在某些实施方案中，配制用于静脉内递送的组合物可包含一种或多种本文公开的扩增的病毒特异性t细胞，其重悬于盐水中。在一些实施方案中，如本文所述的组合物对细菌是阴性的。在一些实施方案中，如本文所述的组合物对真菌是阴性的。在一些实施方案中，本文所述的组合物在培养中至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天，至少8天，至少9天，至少10天对细菌或真菌呈阴性。在一些实施方案中，本文所述的组合物在培养中至少7天对细菌或真菌呈阴性。
103.在一些实施方案中，配制用于静脉内递送的药物组合物表现出小于1eu/ml、小于2eu/ml、小于3eu/ml、小于4eu/ml、小于5eu/ml、小于6eu/ml、小于7eu/ml、小于8eu/ml、小于9eu/ml、小于10eu/ml的内毒素。在一些实施方案中，配制用于静脉内递送的药物组合物对支原体呈阴性。
实施例
104.实施例1
105.方法
106.除非另有说明，以下提供的实施例使用以下材料和方法。
107.流式细胞术
108.免疫分型
109.用针对以下的单克隆抗体对多呼吸道病毒特异性t细胞进行表面染色：cd3、cd25、cd28、cd45ro、cd279(pd
‑
1)[becton dickinson(bd),franklin lakes,nj]、cd4、cd8、cd16、cd62l、cd69(beckman coulter,brea,ca)和cd366(tim
‑
3)(biolegend,san diego,ca)。细胞在磷酸盐缓冲盐水(pbs)(sigma
‑
aldrich)中沉淀，然后加入饱和量(5μl)的抗体，然后在4℃下孵育15分钟。随后，洗涤细胞，重悬于300μlpbs中，并在gallios
tm
流式细胞仪上采集至少20000个活细胞并使用flowanalysis软件(beckmancoulter)进行分析。
[0110]
细胞内细胞因子染色(ics)
[0111]
收获多呼吸道病毒特异性t细胞，重悬在病毒特异性t细胞培养基(2x106/ml)中，并在96孔板的每孔中加入200μl。将细胞与200ng单个测试或对照(不相关的非病毒，例如survivin、wt1)肽混合物以及brefeldin a(1μg/ml)、莫能菌素(1μg/ml)、cd28和cd49d(1μg/ml)(bd)孵育过夜。接下来，病毒特异性t细胞用pbs洗涤，沉淀，用cd8和cd3(5μl/抗体/管)在4℃下表面染色15分钟，然后洗涤、沉淀、固定并用cytofix/cytoperm溶液(bd)在4℃在黑暗中渗透20分钟。用perm/washbuffer(bd)洗涤后，将细胞与10μlifnγ和tnfα抗体(bd)在4℃下避光孵育30分钟。然后用perm/washbuffer洗涤细胞两次，在gallios
tm
流式细胞仪上采集至少50000个活细胞，并用flowanalysis软件进行分析。
[0112]
foxp3染色
[0113]
使用ebiosciencefoxp3试剂盒(thermofisherscientific，waltham，ma)根据制造商的说明进行foxp3染色。简而言之，1x106个细胞用cd3、cd4和cd25抗体进行表面染色，然后洗涤，重悬在1ml固定/透化缓冲液中，并在4℃下在黑暗中孵育1小时。用pbs洗涤后，将细胞重悬在通透缓冲液中，与5μl同种型或foxp3抗体(clonepch101)在4℃下孵育30分钟，然后洗涤并在gallios
tm
流式细胞仪上采集，然后使用flowanalysis软件进行分析。
[0114]
功能研究
[0115]
酶联免疫斑点(elispot)
[0116]
elispot分析用于定量ifnγ和颗粒酶b分泌细胞的频率。简而言之，pbmc和多呼吸道病毒特异性t细胞分别以5x106和2x106个细胞/ml重悬在病毒特异性t细胞培养基中，并向每个elispot孔中加入100μl细胞。在用个体刺激[np1、mp1(流感病毒)；n,f(rsv)；f、n、m2
‑
1、m(hmpv)；m、hn、n、f(piv)]或对照肽混合物(survivin,wt1)直接刺激(500ng/肽/ml)后测量抗原特异性活性。葡萄球菌肠毒素b(seb)(1μg/ml)和pha(1μg/ml)分别用作pbmc和病毒特异性t细胞的阳性对照。孵育20小时后，将平板按前述方法显影，在室温下干燥过夜，然后送至zellnetconsulting(纽约)进行定量。绘制斑点形成细胞(sfc)和输入细胞数，并将病毒特异性t细胞的特异性阈值定义为≥30sfc/2x105个输入细胞。
[0117]
多重复用
[0118]
使用milliplex high sensitivity human cytokine panel(millipore,billerica,ma)评估多呼吸道病毒特异性t细胞细胞因子谱。2x105病毒特异性t细胞用肽混合物(np1、mp1、n、f、f、n、m2
‑
1、m、m、hn、n和f)(1μg/ml)刺激过夜。随后，收集上清液，接种在双孔中，与抗体固定的珠子在4℃下孵育过夜，然后洗涤并在室温下用生物素化检测抗体铺板(plate)1小时。最后，在室温下加入链霉亲和素
‑
藻红蛋白30分钟。洗涤样品并使用
xponent软件在luminex 200(xmap technology)上分析样品。
[0119]
铬释放测定
[0120]
使用标准的4小时铬(cr51)释放测定法来测量多呼吸道病毒特异性t细胞的特定细胞溶解活性，以载有自体抗原的pha母细胞为靶标(20ng/肽混合物/1x106靶细胞)。使用40:1、20:1、10:1和5:1的效应子:目标(e:t)比率来分析特异性裂解。计算特异性裂解的百分比[(实验释放
‑
自发释放)/(最大释放
‑
自发释放)]x100。为了测量多呼吸道病毒特异性t细胞系的自身反应和同种异体反应潜力，单独的自体和同种异体pha母细胞被用作靶标。
[0121]
实施例2
[0122]
从健康供体中生成多克隆多呼吸道病毒特异性t细胞
[0123]
在本研究中，我们探讨了使用体外扩增的t细胞靶向多种临床上有问题的呼吸道病毒的可行性。具体而言，我们产生了对流感病毒、rsv、hmpv和piv具有特异性的病毒特异性t细胞，并在移植接受者中证明了临床疗效，其成功控制了活动性感染。
[0124]
背景
[0125]
carv相关的急性上、下rti是一个主要的公共卫生问题，幼儿、老年人和免疫系统受到抑制或受损的人最容易受到伤害(1
‑
3)。这些感染与咳嗽、呼吸困难和喘息等症状相关，双重/多重共存感染很常见，在5岁以下儿童中的频率可能超过40％，并与发病率和住院风险增加有关(22
‑
26)。在免疫功能低下的同种异体hsct接受者中，高达40％的患者会经历carv感染，其范围从轻度(相关症状包括流鼻涕、咳嗽和发烧)到重度(毛细支气管炎和肺炎)，lrti患者的相关死亡率高达50％(5
‑
9)。治疗选择是有限的。对于hmpv和piv，目前没有批准的预防性疫苗或治疗性抗病毒药物，而核苷类似物rbv的标签外使用和das
‑
181(一种重组唾液酸酶融合蛋白)的研究使用具有有限的临床影响(10，11、27、28)。在移植后至少6个月内，不建议对同种异体hsct接受者接种预防性流感病毒疫苗(并且排除接受强化化疗或抗b细胞抗体的接受者)，而神经氨酸酶抑制剂对治疗活动性感染并不总是有效(12)。对于rsv，雾化rbv已获得fda批准用于治疗婴儿和儿童的严重毛细支气管炎，也可在标签外使用用于预防上或下rti和治疗hsct接受者中的rsv肺炎(13、15、16)。然而，它的广泛使用受到药物输送所需的笨重雾化装置和换气系统以及相当大的相关成本的限制。例如，2015年雾化rbv每天花费29953美元，而5天代表一个典型的治疗疗程(14)。因此，由于缺乏批准的治疗方法以及抗病毒药剂的高成本，我们开始探索使用过继转移的t细胞以预防和/或治疗该患者群体中的carv感染的潜力。
[0126]
功能性t细胞免疫在介导carv病毒控制中的关键作用直到最近才引起关注。例如，一项对181名患有rsvurti的hsct患者的回顾性研究报告称，淋巴细胞减少(定义为alc≤100/mm3)是识别感染会进展为lrti的患者的关键决定因素，而rsv中和抗体水平与疾病进展没有显著相关性(29)。此外，在最近对154名患有血液系统恶性肿瘤的接受或不接受hsct治疗rsvlrti的成年患者的回顾性分析中，淋巴细胞减少与较高的死亡率显著相关(30)。这两项研究都表明细胞免疫在介导体内保护性免疫中的重要性。
[0127]
供体和细胞系
[0128]
使用贝勒医学院irb批准的方案(h
‑
7634、h
‑
7666)从知情同意的健康志愿者和hsct接受者获得外周血单核细胞(pbmc)，并用于生成植物血凝素(pha)母细胞和多病毒
‑
病毒特异性t细胞。pha母细胞如先前报道的那样产生(20)并培养于病毒特异性t细胞培养基
[45％rpmi 1640(hyclone laboratories,logan,utah)、45％click's培养基(irvine scientific,santa ana,california)、2mm glutamax tm
‑
i(life technologies,grand island,new york)和10％人ab血清(valley biomedical,winchester,virginia)]，补充有白介素2(il2)(100u/ml；nih,bethesda,maryland)，每2天补充一次。病毒特异性t细胞产生
[0129]
多呼吸道病毒特异性t细胞的产生和表型表征
[0130]
我们通过以下方法生成了病毒特异性t细胞(病毒特异性t细胞)t细胞系，其包含对流感病毒、rsv、hmpv和piv具有反应性的细胞亚群：
[0131]
如上收获pbmc(2.5x107)，然后转移至g
‑
rex10(wilson wolf manufacturing corporation,st.paul,mn)，与100ml补充有il7(20ng/ml)、il4(800u/ml)的病毒特异性t细胞培养基(r&dsystems,minneapolis,mn)和肽混合物(2ng/peptide/ml)，并在37℃、5％co2下培养10
‑
13天(图1a)。
[0132]
肽混合物是肽文库(11个氨基酸重叠的15聚体)，涵盖甲型流感病毒抗原(np1、mp1)、rsv抗原(n、f)、hmpv抗原(f、n、m2
‑
1、m)(jptpeptidetechnologies，柏林，德国)和抗原piv抗原(m、hn、n、f)(genemedsynthesis,sanantonio,tx)。冻干的肽混合物在二甲基亚砜(dmso)(sigma
‑
aldrich)中重构并储存在
‑
80℃直至使用。
[0133]
结果
[0134]
在10
‑
13天内，我们实现了细胞平均增加8.5倍(图1b)[从0.25x107pbmc/cm2增加到平均1.9
±
0.2x107个细胞/cm2(中值：2.05x107，范围：0.6
‑
2.82x107个细胞/cm2；n＝12)。如上所述，我们使用流式细胞术对扩增的细胞进行免疫分型。扩增的细胞几乎完全由cd3+t细胞(96.2
±
0.6％；平均值
±
sem)以及细胞毒性(cd8+；18.1
±
1.3％)和辅助(cd4+；74.4
±
1.7％)t细胞的混合物组成[图1c]，没有调节性t细胞生长的证据，如通过cd4/cd25/foxp3+染色评估的[图1e]。此外，扩增的细胞显示出与效应子功能和长期记忆一致的表型，如通过激活标记cd25(50.2
±
3.8％)、cd69(52.8
±
6.3％)、cd28(85.8
±
2％)的上调以及中枢(cd45ro+/cd62l+:61.4
±
3％)和效应子记忆标记(cd45ro+/cd62l
‑
:20.3
±
2.3％)的表达所证明的，pd1(6.9
±
1.4％)或tim3(13.5
±
2.3％)表面表达极小[图1c
‑
1d]。
[0135]
因此，本文公开的方法导致活化的细胞毒性t细胞和辅助t细胞的多克隆群体快速扩增而没有衰竭迹象，表明对呼吸道病毒抗原具有特异性的病毒特异性t细胞的扩增。
[0136]
实施例3
[0137]
多呼吸道病毒特异性t细胞抗病毒特异性的表征
[0138]
为了接下来确定扩增的群体是否是抗原特异性的，我们进行了ifnγ和颗粒酶b分泌细胞elispot测定，使用每种单独的刺激抗原作为免疫原。如上所述进行elispot分析。产生的所有12个株系都证明对所有目标病毒都具有反应性[表1，图2e]。
[0139]
表1：扩增的病毒特异性t细胞株系对单个刺激抗原的反应性。
[0140][0141]
图2a总结了针对每种刺激抗原的活性量级，而图2f显示了我们扩增的病毒特异性t细胞对滴定浓度的病毒抗原的反应。值得注意的是，在培养的10
‑
13天中，我们实现了病毒特异性t细胞的富集，在14.6
±
4.3(piv
‑
hn)和50.4
±
9.9倍(rsv
‑
n)之间[图2b；供体pbmc内carv反应性t细胞的前体频率总结在图2g中]。综上所述，这些数据表明呼吸道病毒特异性t细胞驻留在记忆池中，并且可以使用符合gmp的制造方法容易地离体扩增。
[0142]
为了接下来评估病毒特异性是否包含在cd4+和cd8+或者两个t细胞亚群，我们进行ics，对cd4+和cd8+ifnγ产生细胞圈门。图2c显示了来自1名供体的代表性结果，具有在两个t细胞区室中均检测到的针对所有4种病毒的活性[(cd4+：流感病毒
–
5.28％；rsv
–
11％；hmpv
–
6.57％；piv
–
3.37％)，(cd8+：流感病毒
–
2.26％；rsv
–
4.36％；hmpv
–
2.69％；piv
–
2.16％)]，而图2d显示了筛选的9个供体的汇总结果，证实了我们的多呼吸道病毒特异性t细胞是多克隆和多特异性的。
[0143]
因此，这些数据证实这些方法产生多克隆且包含cd4+和cd8+t细胞的多呼吸道病毒特异性t细胞。
[0144]
实施例4
[0145]
评估多呼吸道病毒特异性t细胞的体外功效
[0146]
多种促炎细胞因子的产生和效应分子的表达已被证明与增强的细胞溶解功能和改善的体内t细胞活性相关。因此，我们接下来检查了抗原暴露后我们的多呼吸道病毒特异性t细胞的细胞因子谱。如图3所示，大部分ifnγ产生细胞除了gm
‑
csf(如通过luminex阵列测量的，[图3c
–
左图]，具有原型(prototypic)th2/抑制性细胞因子的基线水平[图3c
‑
右图])外，还产生tnfα[图3a
‑
来自1名供体的详细ics结果；9名供体的汇总结果；图3b]。此外，
在抗原刺激后，我们的细胞产生了效应分子颗粒酶b，表明这些扩增的细胞具有细胞溶解潜力[图3d，n＝9]。总之，这些数据证明了我们的多呼吸道病毒特异性t细胞的th1极化和多功能特性。
[0147]
为了在体外研究这些扩增细胞的细胞溶解潜力，我们将多呼吸道病毒特异性t细胞与自体cr
51
标记的pha母细胞共培养，所述pha母细胞装载有病毒肽混合物，未装载的pha母细胞作为对照。如图4a和4c所示，负载病毒抗原的靶标被我们的扩增的多呼吸道病毒特异性t细胞特异性识别和裂解(40:1e:t
‑
流感病毒：13
±
5％，rsv：36
±
8％，hmpv：26
±
7％，piv：22
±
5％，n＝8)。最后，即使这些病毒特异性t细胞仅接受单个刺激，没有证据表明对未感染的自体靶标有活性，也没有同种异体反应性(移植物抗宿主潜力)，使用hla错配的pha母细胞作为靶标[图4b]。如果要将这些细胞施用于同种异体hsct接受者，这是一个重要的考虑因素。
[0148]
因此，多呼吸道病毒特异性t细胞具有体外功效并且是安全的。
[0149]
实施例5
[0150]
评估多呼吸道病毒特异性t细胞的体内功效
[0151]
为了评估多呼吸道病毒特异性t细胞的潜在临床相关性，我们调查了活动性/近期carv感染的同种异体hsct接受者是否在活动性病毒发作期间/之后表现出反应性t细胞水平升高。图5a显示了患者#1的结果，该患者是一名患有急性髓性白血病(aml)的64岁男性，他接受了进行降低强度预处理的匹配的相关供体(mrd)移植。该患者在hsct后9个月出现严重的urti，经pcr分析证实与rsv相关。他在感染时没有接受任何免疫抑制治疗，但在感染诊断当天接受了泼尼松治疗以控制肺部炎症。在4周内，他的症状在没有特殊抗病毒治疗的情况下消失了。为了评估t细胞免疫是否有助于病毒清除，我们分析了他感染过程中rsv特异性t细胞的循环频率。就在感染前，该患者对rsv抗原n和f显示出非常弱的应答(6.5sfc/5x105pbmc)。然而，在病毒暴露一个月内，rsv特异性t细胞在体内扩增(527sfc/5x105pbmc)，代表反应性细胞增加了81倍，如图5a所示，此后下降，与病毒清除同时发生。值得注意的是，观察到的rsv特异性反应并未跟随淋巴细胞/cd4+计数的整体增加，因此表明t细胞扩增是病毒驱动的，而不是由于一般的免疫重建。同样，患者#2，一名患有急性淋巴细胞白血病(all)的23岁男性，接受了进行清髓预处理的匹配的无关供体(mud)移植，并在hsct后5个月逐渐减少他克莫司剂量期间发生了严重的rsv相关urti。他的感染症状在1周内消失，同时施用利巴韦林。为了研究内源性免疫是否也在病毒清除中起作用，我们随时间监测了反应性t细胞数量。如图所示。如图5b所示，病毒清除伴随着rsv特异性t细胞循环频率的增加(峰值93sfc/5x105个pbmc)，随后恢复到基线水平。同一患者在移植后7个月因随后的肺炎球菌肺炎住院，同时痰中检测到hmpv(通过pcr)。用抗生素治疗他的肺炎，随后疾病消退并且病毒清除，同时hmpv特异性t细胞(对f、n、m2
‑
1和m有反应)显著扩增，从4sfc增加到峰值70sfc，随后下降到基线水平[图5c]。同样，观察到的rsv和hmpv特异性反应与淋巴细胞/cd4+计数的总体增加无关。图6显示了另外3名发生carv感染的hsct接受者的结果。患者#3是一名患有aml的15岁女性，她接受了进行降低强度预处理的半相合移植，并在移植后5周接受他克莫司治疗期间出现了rsv诱导的urti和lrti。患者接受了利巴韦林治疗，感染在4周内消退。我们随时间监测了rsv反应性t细胞，如图6a所示，病毒清除与rsv特异性t细胞频率的显著增加(从0到506sfc/5x105个pbmc)相一致。类似地，患者4是一名10岁男性all患者，他
接受了进行清髓预处理的mud移植，在hsct后1个月接受他克莫司治疗期间出现了piv3相关的urti和lrti。他的感染在5周内症状消失，同时施用了利巴韦林。为了研究内源性免疫是否也在病毒清除中起作用，我们随时间监测了piv3反应性t细胞数量。如图6b所示，病毒清除伴随着piv3抗原m、hn、n和f特异性t细胞循环频率的增加(峰值38sfc/5x105pbmc)，随后下降。最后，我们展示了患者#5，一名患有慢性肉芽肿病的3岁男性，他接受了进行清髓预处理的mrd移植，并在hsct后4个月在环孢素治疗期间出现了严重的piv3相关urti。该患者接受了利巴韦林，但(在最后评估的时间点)继续表现出疾病症状并且未能证明piv3特异性t细胞(图6c)。综上所述，这些数据表明，carv特异性t细胞在控制免疫功能低下患者的病毒感染方面具有体内相关性。
[0152]
结论
[0153]
在多达40％的同种异体造血干细胞移植(allo
‑
hsct)接受者中检测到由社区获得性呼吸道病毒(carv)(包括呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒、副流感病毒(piv)和人偏肺病毒(hmpv))引起的呼吸道病毒感染，在这些接受者中他们可引发可致命的严重疾病如毛细支气管炎和肺炎。鉴于对于这些carv缺乏批准的抗病毒药剂，而且数据表明过继转移的离体扩增病毒特异性t细胞(病毒特异性t细胞)在临床上对治疗潜伏的[爱泼斯坦
‑
巴尔病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)、bk病毒(bkv)、人类疱疹病毒6(hhv6)]和裂解的[腺病毒(adv)]病毒都有益(在同种异体hsct接受者中)，考虑探索将这种方法扩展到至少流感病毒、rsv、hmpv和piv3的潜力。
[0154]
因此，发明人将来自健康供体的pbmc暴露于跨来自某些靶病毒[流感病毒
‑
np1和mp1；rsv
‑
n和f；hmpv
‑
f、n、m2
‑
1和m；piv3
‑
m、hn、n和f]的免疫原性抗原的肽混合物混合(重叠肽文库)，然后在存在活化细胞因子(在g
‑
rex中)的情况下扩增。在10
‑
13天内，发明人实现了平均8.5倍的扩增(从0.25x107pbmc/cm2增加到平均1.9
±
0.2x107个细胞/cm2；n＝12)。培养物几乎完全由cd3+t细胞(96.2
±
0.6％；平均值
±
sem)、细胞毒性(cd8+)和辅助(cd4+)t细胞的混合物组成，其表型与即时效应子功能和长期持久性一致，如激活标记cd25、cd69和cd28的上调以及中枢(cd45ro+/cd62l+)和效应记忆标记的表达所证明的，pd1或tim3极少。使用每种单独的刺激抗原作为免疫原，在ifnγelispot检测中检测多呼吸病毒特异性t细胞的抗病毒特异性。筛选的所有12个株系都对每种靶标病毒具有反应性[流感病毒：平均735
±
75.6sfc/2x105，rsv：758
±
69.8，hmpv：526
±
100.8，piv3：391
±
93.7]。扩增的病毒特异性t细胞是th1极化的效应细胞，如tnfa、gm
‑
csf和颗粒酶b的产生所证明的，th2/抑制性细胞因子只有基线水平。
[0155]
这些细胞在标准cr51释放试验中进行了测试，并且能够裂解装载病毒肽混合物的自体pha母细胞(40:1e:t
‑
流感病毒：13
±
5％，rsv：36
±
8％，hmpv：26
±
7％,piv:22
±
5％,n＝8)没有自身或同种异体反应性的证据，证明了它们的选择性和在hsct接受者中临床使用的安全性。
[0156]
最后，为了评估这些发现的临床意义，我们检查了5名患有活动性rsv、hmpv和piv3感染的同种异体hsct接受者的外周血。这些患者中的四名在1
‑
5周内成功控制了病毒，同时内源反应性t细胞扩增并随后在病毒清除后恢复到基线水平，而一名患者未能对感染病毒产生免疫反应，同样没能清除迄今的感染。该数据表明，离体扩增细胞的过继转移应该对缺乏自身细胞免疫的患者具有临床益处。
[0157]
总之，本发明人已经表明，快速生成多克隆(cd4+和cd8+)多呼吸道(多
‑
呼吸道)
‑
病毒特异性t细胞的单一制剂是可行的，该制剂对源自4种靶病毒(流感病毒、rsv、hmpv和piv3)的12种免疫显性抗原具有特异性(使用符合gmp的制造方法)。扩增的细胞是th1极化的、多功能的，能够选择性地与表达病毒抗原的靶细胞反应并杀死它们，对未感染的自体或同种异体靶标没有活性，证明了它们对病毒靶标的选择性和临床使用的安全性。在各种实施方案中，此类多呼吸道病毒靶向细胞(多呼吸道病毒特异性t细胞)将为具有不受控制的carv感染的免疫受损个体提供广谱益处(包括在免疫受损个体中)。
[0158]
实施例6
[0159]
从健康供体生成多克隆rsv特异性病毒特异性t细胞
[0160]
rsv是一种特别危险的呼吸道疾病。它导致美国每年有超过57000名幼儿(<5岁)住院，并导致美国每年有177000名成人(>65岁)住院和14,000人死亡(疾病控制和预防中心)。rsv常会发展为引起肺炎等疾病的下呼吸道感染，其可致命(paulsen和danziger
‑
isakov，clin chest med 38(2017))，并且它是引起免疫功能低下个体(包括接受同种异体造血干细胞或实体器官移植的患者)中疾病的主要原因。此外，虽然利巴韦林被fda批准用于治疗儿童的由rsv引起的严重肺炎，但这种治疗费用昂贵、难以施用、存在毒性问题，并且未被批准用于其他患者组。因此，本领域非常需要有效的rsv治疗。
[0161]
如图7所示，除了上述实施例中描述的多呼吸道病毒特异性t细胞中包含的rsv抗原n和f外，rsv基因组还包括其他抗原：g、m2
‑
1、m、ns1、ns2、m2
‑
2、p、l和sh(图7)。已经证明了我们的多呼吸道病毒特异性t细胞治疗rsv感染的功效(尽管它们只用肽混合物rsv抗原n和f生成)，我们试图研究我们是否可以生成对更广泛的rsv抗原具有特异性的病毒特异性t细胞。
[0162]
为此，如实施例1中所述分离pbmc，并且如图8所示，将2.5x106pbmc/cm2与il4、il7和覆盖所有上述rsv抗原的肽混合物一起培养10
‑
15天，如实施例1和2所述。
[0163]
结果
[0164]
10天后，我们实现了细胞平均增加约5倍(图9a)。如上所述，我们使用流式细胞术对扩增的细胞进行免疫分型。扩增的细胞几乎完全由cd3+t细胞以及细胞毒性(cd8+；～33％)和辅助(cd4+；～66％)t细胞的混合物组成[图9b]。此外，扩增的细胞显示出与效应子功能和长期记忆一致的表型，如激活标记cd25、cd69和cd28的上调所证明的，且具有极小的pd1或tim3表面表达[图9c]。
[0165]
我们检查了抗原暴露后rsv
‑
病毒特异性t细胞的细胞因子谱。如图10a所示，病毒特异性t细胞产生大量ifnγ响应rsv抗原n、f和g，以及通过添加其他rsv抗原诱导的弱反应。在肽混合物刺激后观察到颗粒酶b产生的相似特征，表明这些扩增细胞的细胞溶解潜力[图10b]。此外，对th1细胞因子gm
‑
csf、ifnγ和tnfα(图11a)和th2细胞因子il
‑
5、il
‑
6和il
‑
10(图11b)的分析清楚地表明rsv特异性病毒特异性t细胞是th1偏斜的。总之，这些数据证明了我们的多呼吸道病毒特异性t细胞的th1极化和多功能特性。
[0166]
因此，本文公开的方法导致活化的细胞毒性和辅助性t细胞的多克隆群体快速扩增而没有衰竭迹象，表明对rsv抗原具有特异性的病毒特异性t细胞扩增。
[0167]
可以组合上述各种实施方案以提供进一步的实施方案。在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外
国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。如果需要采用各种专利、申请和出版物的概念来提供另外的实施方案，则可以修改实施方案的方面。
[0168]
根据以上详细描述，可以对实施方案进行这些和其他改变。一般而言，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限于说明书和权利要求中公开的特定实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及其等效物的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
[0169]
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